CN102906268A - 用6-磷酸葡萄糖酸内酯酶(pgl)来增加异戊二烯及其他产物的产量的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本文提供用于增大异戊二烯产量的改良组合物和方法。本文还提供用于增大能够具有生物活性的异源多肽产量的改良组合物和方法。
Description
相关专利申请的交叉引用
本专利申请要求2009年12月23日提交的美国临时专利申请No.61/289,959的优先权,该专利申请的公开内容据此全文以引用方式并入本文中。
技术领域
本公开涉及用于增加大肠杆菌(E.coli)中生物化学物质的产量的改良组合物和方法、以及用于增加大肠杆菌中异戊二烯产量的改良组合物和方法。
背景技术
异戊二烯(2-甲基-1,3-丁二烯)是广泛应用的重要有机化合物。例如,在合成多种化学组合物和聚合物时,异戊二烯被用作中间材料或原料。异戊二烯还是通过许多植物和动物天然合成的重要生物材料。
当异戊二烯的立构规整聚合在二十世纪六十年代早期进入市场时,异戊二烯成为用于合成顺式-1,4-聚丁二烯的重要单体。通过这种立构规整聚合所制备的顺式-1,4-聚异戊二烯的结构和性质类似于天然橡胶。尽管它与天然橡胶不完全相同,但它在许多应用中可用作天然橡胶的替代品。例如,合成的顺式-1,4-聚异戊二烯橡胶被广泛用于制备车辆轮胎和其他橡胶产品。对合成的顺式-1,4-聚异戊二烯橡胶的该需求消耗了大部分在世界市场上可获得的异戊二烯。剩余的异戊二烯被用于制备其他合成橡胶、嵌段共聚物和其他化学产品。例如,异戊二烯被用于制备丁二烯-异戊二烯橡胶、苯乙烯-异戊二烯共聚物橡胶、苯乙烯-异戊二烯-丁二烯橡胶、苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物和苯乙烯-异戊二烯嵌段共聚物。
在工业应用中使用的异戊二烯通常作为石油或石脑油热裂解的副产物而产生,或以其他方式从石化流体中提取。这是相对昂贵的能源密集型过程。世界范围内对基于石油化工的产品的需求持续增加,与此同时预计长期内对异戊二烯的消耗将上升到高得多的水平,并且在任何情况下它的可获得性受到限制。存在未来从基于石油化工来源的异戊二烯供应将不足以满足计划的需求、且其价格将上升到前所未有的水平的担忧。因此,存在从环境友好的、低成本、可再生资源中获得异戊二烯来源的需求。本文所述的改良方法和组合物即提供异戊二烯的这种来源,其能够以低成本从可再生资源中获得。
最近在由可再生来源产生异戊二烯方面取得了一些进展(参见例如国际专利申请公开No.WO 2009/076676A2)。这些产生异戊二烯的方法在速率、滴度和纯度上可能足以符合对一个正常的商业方法的要求,然而需要改良方法以降低与源于生物来源的异戊二烯的生产相关的操作成本并增大异戊二烯的产量,例如用于增大异戊二烯和本文所提供的能够具有生物活性的其他异源多肽的产量的改良组合物和方法。
所有专利、专利申请、文档、核苷酸和蛋白质序列数据库记录号、以及本文中引用的文章均全文以引用方式并入本文中。
发明内容
本文公开用于增大异戊二烯产量的改良组合物和方法。本文还提供用于增大能够具有生物活性的异源多肽产量的改良组合物和方法。本发明部分地基于观察到将6-磷酸葡萄糖酸内酯酶(PGL)染色体整合到缺乏编码PGL多肽的核酸的大肠杆菌菌株内会增大诸如异戊二烯或甲羟戊酸的不同种类产物的产量。
因此,在一个方面,本发明提供能够产生异戊二烯的大肠杆菌菌株的重组细胞或其子代,该细胞包含:(a)编码PGL多肽的异源核酸的一个或多个拷贝,其中所述核酸整合在大肠杆菌染色体中;以及(b)编码异戊二烯合酶的一种或多种异源核酸;其中在所述整合之前,所述大肠杆菌细胞不包含编码PGL多肽的核酸,并且其中所得的重组细胞产生的异戊二烯的滴度大于不包含(a)和(b)的相同细胞的滴度。
在本文的任何方面,编码钼摄取多肽的异源核酸的一个或多个拷贝被额外整合在所述大肠杆菌染色体中。在本文的任何方面,所述钼摄取多肽选自modF、modE、modA、modB和modC。在本文的任何方面,编码半乳糖代谢多肽的异源核酸的一个或多个拷贝被额外整合在所述大肠杆菌染色体中。在本文的任何方面,所述半乳糖代谢多肽选自galM、galK、galT和galE。在本文的任何方面,编码半乳糖代谢多肽的异源核酸的一个或多个拷贝和编码钼摄取多肽的异源核酸的一个或多个拷贝被额外整合在所述大肠杆菌染色体中。在本文的任何方面,(a)所述PGL多肽是大肠杆菌PGL多肽;(b)所述钼摄取多肽选自modF、modE、modA、modB和modC;并且(c)所述半乳糖代谢多肽选自galM、galK、galT和galE。在本文的任何方面,编码所述PGL多肽、半乳糖代谢多肽和钼摄取多肽的核酸是如图20所示的17,257碱基对片段的一部分。在本文的任何方面,所述重组细胞产生异戊二烯的比产率高于不包含(a)和(b)的相同细胞。
在本文的任何方面,所述重组细胞具有至少为15mg/OD/h的比产率。在本文的任何方面,编码PGL多肽、钼摄取多肽和/或半乳糖代谢多肽的核酸来自大肠杆菌菌株K12MG1655或所述大肠杆菌菌株K12MG1655的衍生物。在本文的任何方面,所述细胞属于大肠杆菌菌株B。在本文的任何方面,所述细胞属于大肠杆菌菌株BL21。在本文的任何方面,所述细胞属于大肠杆菌菌株BL21(DE3)。
在本文的任何方面,所述重组大肠杆菌细胞还包含(c)编码甲羟戊酸(MVA)途径上游的多肽和/或MVA途径下游的多肽的异源核酸。
在本文的任何方面,所述重组大肠杆菌细胞还包含(d)编码甲羟戊酸(MVA)途径上游的多肽和/或MVA途径下游的多肽的异源核酸。在本文的任何方面,所述MVA途径上游的多肽选自:(i)乙酰乙酰基辅酶A合酶(硫解酶)多肽;(ii)3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶多肽;以及(iii)3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶多肽。在本文的任何方面,所述MVA途径下游的多肽选自:(i)甲羟戊酸激酶(MVK);(ii)磷酸甲羟戊酸激酶(PMK);(iii)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD);以及(iv)异戊烯基二磷酸异构酶(IDI)。在本文的任何方面,(a)所述PGL多肽是大肠杆菌PGL多肽;(b)所述钼摄取多肽选自modF、modE、modA、modB和modC;并且(c)所述半乳糖代谢多肽选自galM、galK、galT和galE。在本文的任何方面,所述异戊二烯合酶多肽来自银白杨(Populus alba)。
本发明还提供产生异戊二烯的方法,所述方法包括:(a)在适于产生异戊二烯的培养条件下培养包含本文所述任何重组细胞的组合物,以及(b)产生异戊二烯。在一些方面,所述方法还包括回收所述异戊二烯。在其他方面,所述重组细胞具有大于约15mg/OD/h的异戊二烯比产率。
本发明还提供产生甲羟戊酸的方法,所述方法包括:(a)在适于产生甲羟戊酸的培养条件下培养包含权利要求15所述重组细胞的组合物,以及(b)产生甲羟戊酸。在一些方面,所述方法还包括回收所述甲羟戊酸。
本发明还提供制备本文所述任何重组细胞的方法,包括:(a)将编码PGL多肽的异源核酸转导至大肠杆菌细胞内,其中在所述整合之前,所述大肠杆菌细胞不包含编码PGL多肽的核酸;(b)使所述编码PGL多肽的核酸整合在大肠杆菌染色体中;以及(c)将编码异戊二烯合酶的一种或多种异源核酸引入大肠杆菌细胞内。
本发明还提供包含本文所述任何重组细胞的组合物。
在其他方面,本文提供不编码PGL多肽的大肠杆菌菌株细胞,其中所述大肠杆菌细胞包含使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝和编码能够具有生物活性的异源多肽的核酸,并且其中当将所述细胞培养在基本培养基中时,所述细胞产生能够具有生物活性的异源多肽的比产率大于缺乏使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝的相同细胞的该比产率。在一些方面,使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝是染色体拷贝(如,整合到大肠杆菌染色体中)。在一些方面,大肠杆菌细胞在培养物中。在一些方面,所述细胞属于大肠杆菌菌株B。在一些方面,所述细胞属于大肠杆菌菌株BL21。在一些方面,所述细胞属于大肠杆菌菌株BL21(DE3)。在一些方面,使用0.1%(w/v)或更少的酵母提取物来补充所述基本培养基。在一些方面,使用1%(w/v)或更少的葡萄糖来补充所述基本培养基。在一些方面,使用0.1%(w/v)或更少的酵母提取物以及1%(w/v)或更少的葡萄糖来补充所述基本培养基。在一些方面,编码PGL多肽的异源基因来自大肠杆菌菌株K12MG1655或大肠杆菌菌株K12MG1655的衍生物。在一些方面,编码PGL多肽的异源基因来自假单胞菌属(Pseudomonas)。在一些方面,所述假单胞菌为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。
在一些方面,能够具有生物活性的异源多肽包括在生物合成萜类化合物(类异戊二烯)或类胡萝卜素化合物的过程中所涉及的一种或多种多肽,并且当将所述细胞培养在基本培养基中时,所述细胞产生萜类化合物或类胡萝卜素的比产率高于缺乏使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝的相同细胞的该比产率。在一些方面,所述萜类化合物选自半萜、单萜、倍半萜、二萜、二倍半萜、三萜、四萜和更高级的多萜。在一些方面,所述半萜是异戊烯醇(即,3-甲基-2-丁烯-1-醇)、异戊二烯醇(即,3-甲基-3-丁烯-1-醇)、2-甲基-3-丁烯-2-醇、或异戊酸。在一些方面,所述单萜是香叶基焦磷酸、桉叶油素、柠檬烯、或蒎烯。在一些方面,所述倍半萜是法尼基焦磷酸、青蒿素、或红没药醇。在一些方面,所述二萜是香叶基香叶基焦磷酸、视黄醇、视黄醛、叶绿醇、紫杉酚、毛喉素、或阿非迪霉素。在一些方面,所述三萜是角鲨烯或羊毛甾醇。在一些方面,所述四萜是番茄红素或胡萝卜素。在一些方面,所述类胡萝卜素选自叶黄素和胡萝卜素。在一些方面,所述叶黄素为叶黄质或玉米黄质。在一些方面,所述胡萝卜素是α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、β-隐黄质或番茄红素。
在另一方面,本文提供不编码PGL多肽的大肠杆菌菌株细胞,其中所述大肠杆菌细胞包含使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝和编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸,并且其中当将所述细胞培养在基本培养基中时,所述细胞产生异戊二烯的比产率大于缺乏使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝的相同细胞的该比产率。在一些方面,使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝是染色体拷贝(如,整合到大肠杆菌染色体中)。在一些方面,大肠杆菌细胞在培养物中。在一些方面,所述细胞还包含编码MVA途径多肽的异源核酸。在一些方面,MVA途径多肽是MVA途径上游的多肽。在一些方面,MVA途径多肽是MVA途径下游的多肽。
在一些方面,MVA途径上游的多肽选自:(i)乙酰乙酰基辅酶A合酶(硫解酶)多肽;(ii)3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶多肽;以及(iii)3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶多肽。在一些方面,MVA途径上游的多肽来自肠球菌属(Enterococcus)。在一些方面,MVA途径上游的多肽来自粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。在一些方面,MVA途径下游的多肽选自:(i)甲羟戊酸激酶(MVK);(ii)磷酸甲羟戊酸激酶(PMK);(iii)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD);以及(iv)异戊烯基二磷酸异构酶(IDI)。在一些方面,MVA途径下游的多肽是MVK多肽。在一些方面,所述MVK多肽来自甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)。在一些方面,所述MVK多肽来自马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)。
在一些方面,所述细胞属于大肠杆菌菌株B。在一些方面,所述细胞属于大肠杆菌菌株BL21。在一些方面,所述细胞属于大肠杆菌菌株BL21(DE3)。在一些方面,使用0.1%(w/v)或更少的酵母提取物来补充所述基本培养基。在一些方面,使用1%(w/v)或更少的葡萄糖来补充所述基本培养基。在一些方面,使用0.1%(w/v)或更少的酵母提取物以及1%(w/v)或更少的葡萄糖来补充所述基本培养基。在一些方面,编码PGL多肽的异源基因来自大肠杆菌菌株K12MG1655或大肠杆菌菌株K12MG1655的衍生物。在一些方面,编码PGL多肽的异源基因来自假单胞菌属。在一些方面,所述假单胞菌为铜绿假单胞菌。
在一些方面,所述细胞具有大于约20mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,所述细胞具有大于约25mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸可操作地连接至启动子,并且所述细胞具有大于约20mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸可操作地连接至启动子,并且所述细胞具有大于约25mg/OD/h的异戊二烯比产率。
在一些方面,所述异戊二烯合酶多肽是植物异戊二烯合酶多肽。在一些方面,所述细胞还包含编码IDI多肽的异源核酸。在一些方面,所述细胞还包含编码IDI多肽的内源核酸的染色体拷贝。在一些方面,所述细胞还包含编码DXS多肽的异源核酸。在一些方面,所述细胞还包含编码DXS多肽的内源核酸的染色体拷贝。在一些方面,所述细胞还包含编码IDI多肽和DXS多肽的一种或多种核酸。在一些方面,一种核酸编码所述异戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽。在一些方面,一种质粒编码所述异戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽。
在一些方面,所述异戊二烯合酶多肽是来自葛属(Pueraria)的天然存在的多肽。在一些方面,所述异戊二烯合酶多肽是来自山葛(Puerariamontana)的天然存在的多肽。在一些方面,所述异戊二烯合酶多肽是来自杨属(Populus)的天然存在的多肽。在一些方面,所述异戊二烯合酶多肽是来自银白杨的天然存在的多肽。
在一些方面,所述细胞包含:(i)包含葡萄糖异构酶启动子、编码来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的MVA途径下游的整合核酸以及编码甲羟戊酸激酶(MVK)的核酸;编码磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)的核酸;编码二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)的核酸;以及编码异戊烯基二磷酸异构酶(IDI)的核酸;(ii)编码银白杨(P.alba)异戊二烯合酶的核酸;(iii)编码马氏甲烷球菌(M.mazei)甲羟戊酸激酶的核酸;以及(iv)编码来自粪肠球菌的MVA途径上游的核酸,所述核酸包括编码乙酰乙酰基辅酶A合酶(硫解酶)多肽的核酸;编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶多肽的核酸;以及编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶多肽的核酸。
在另一方面,本文提供产生能够具有生物活性的异源多肽的改良方法,所述方法包括:(a)培养不编码PGL多肽的大肠杆菌菌株细胞,其中所述大肠杆菌细胞包含使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝和编码能具有生物活性的异源多肽的核酸;以及(b)产生能够具有生物活性的异源多肽,其中当将所述细胞培养在基本培养基中时,细胞产生异源多肽的比产率大于缺乏使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝的相同细胞的该比产率。在一些方面,使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝是染色体拷贝(如,整合到大肠杆菌染色体中)。在一些方面,本方法还包括回收能够具有生物活性的异源多肽的步骤。
在一些方面,所述细胞属于大肠杆菌菌株B。在一些方面,所述细胞属于大肠杆菌菌株BL21。在一些方面,所述细胞属于大肠杆菌菌株BL21(DE3)。在一些方面,使用0.1%(w/v)或更少的酵母提取物来补充所述基本培养基。在一些方面,使用1%(w/v)或更少的葡萄糖来补充所述基本培养基。在一些方面,使用0.1%(w/v)或更少的酵母提取物以及1%(w/v)或更少的葡萄糖来补充所述基本培养基。在一些方面,具有PGL活性的异源多肽来自大肠杆菌菌株K12MG1655或大肠杆菌菌株K12MG1655的衍生物。在一些方面,具有PGL活性的异源多肽来自假单胞菌属。在一些方面,所述假单胞菌为铜绿假单胞菌。
在一些方面,能够具有生物活性的异源多肽包括在生物合成萜类化合物(类异戊二烯)或类胡萝卜素化合物的过程中所涉及的一种或多种多肽,并且当将所述细胞培养在基本培养基中时,所述细胞产生萜类化合物或类胡萝卜素的比产率高于缺乏使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝的相同细胞的该比产率。在一些方面,所述萜类化合物选自半萜、单萜、倍半萜、二萜、二倍半萜、三萜、四萜和更高级的多萜。在一些方面,所述半萜是异戊烯醇(即,3-甲基-2-丁烯-1-醇)、异戊二烯醇(即,3-甲基-3-丁烯-1-醇)、2-甲基-3-丁烯-2-醇、或异戊酸。在一些方面,所述单萜是香叶基焦磷酸、桉叶油素、柠檬烯、或蒎烯。在一些方面,所述倍半萜是法尼基焦磷酸、青蒿素、或红没药醇。在一些方面,所述二萜是香叶基香叶基焦磷酸、视黄醇、视黄醛、叶绿醇、紫杉酚、毛喉素、或阿非迪霉素。在一些方面,所述三萜是角鲨烯或羊毛甾醇。在一些方面,所述四萜是番茄红素或胡萝卜素。在一些方面,所述类胡萝卜素选自叶黄素和胡萝卜素。在一些方面,所述叶黄素为叶黄质或玉米黄质。
在另一方面,本文提供产生异戊二烯的改良方法,所述方法包括:(a)培养不编码PGL多肽的大肠杆菌菌株细胞,其中所述大肠杆菌细胞包含使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝和编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸;以及(b)产生异戊二烯,其中当将所述细胞培养在基本培养基中时,所述细胞具有的异戊二烯比产率大于缺乏使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝的相同细胞的异戊二烯比产率。在一些方面,使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝是染色体拷贝(如,整合到大肠杆菌染色体中)。在一些方面,所述改良方法还包括回收异戊二烯的步骤。在一些方面,所述细胞还包含编码MVA途径多肽的异源核酸。在一些方面,MVA途径多肽是MVA途径上游的多肽。在一些方面,MVA途径多肽是MVA途径下游的多肽。
在一些方面,MVA途径上游的多肽选自:(i)乙酰乙酰基辅酶A合酶(硫解酶)多肽;(ii)3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶多肽;以及(iii)3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶多肽。在一些方面,MVA途径上游的多肽来自肠球菌属。在一些方面,MVA途径上游的多肽来自粪肠球菌。在一些方面,MVA途径下游的多肽选自:(i)甲羟戊酸激酶(MVK);(ii)磷酸甲羟戊酸激酶(PMK);(iii)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD);以及(iv)异戊烯基二磷酸异构酶(IDI)。在一些方面,MVA途径下游的多肽是MVK多肽。在一些方面,所述MVK多肽来自甲烷八叠球菌属。在一些方面,所述MVK多肽来自马氏甲烷八叠球菌。在一些方面,所述细胞属于大肠杆菌菌株B。在一些方面,所述细胞属于大肠杆菌菌株BL21。在一些方面,所述细胞属于大肠杆菌菌株BL21(DE3)。在一些方面,使用0.1%(w/v)或更少的酵母提取物来补充所述基本培养基。在一些方面,使用1%(w/v)或更少的葡萄糖来补充所述基本培养基。在一些方面,使用0.1%(w/v)或更少的酵母提取物以及1%(w/v)或更少的葡萄糖来补充所述基本培养基。在一些方面,编码PGL多肽的异源基因来自大肠杆菌菌株K12MG1655或大肠杆菌菌株K12MG1655的衍生物。在一些方面,编码PGL多肽的异源基因来自假单胞菌属。在一些方面,所述假单胞菌为铜绿假单胞菌。
在一些方面,所述细胞具有大于约20mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,所述细胞具有大于约25mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸可操作地连接至启动子,并且其中所述细胞具有大于约20mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸可操作地连接至启动子,并且其中所述细胞具有大于约25mg/L肉汤/h的异戊二烯比产率。
在一些方面,所述异戊二烯合酶多肽是植物异戊二烯合酶多肽。在一些方面,所述细胞还包含编码IDI多肽的异源核酸。在一些方面,所述细胞还包含编码IDI多肽的内源核酸的染色体拷贝。在一些方面,所述细胞还包含编码DXS多肽的异源核酸。在一些方面,所述细胞还包含编码DXS多肽的内源核酸的染色体拷贝。在一些方面,所述细胞还包含编码IDI多肽和DXS多肽的一种或多种核酸。在一些方面,一种核酸编码所述异戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽。在一些方面,一种质粒编码所述异戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽。在一些方面,所述异戊二烯合酶多肽是来自葛属的天然存在的多肽。在一些方面,所述异戊二烯合酶多肽是来自山葛的天然存在的多肽。在一些方面,所述异戊二烯合酶多肽是来自杨属的天然存在的多肽。在一些方面,所述异戊二烯合酶多肽是来自银白杨的天然存在的多肽。
在一些方面,所述细胞包含:(i)包含葡萄糖异构酶启动子、编码来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的MVA途径下游的整合核酸以及编码甲羟戊酸激酶(MVK)的核酸;编码磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)的核酸;编码二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)的核酸;以及编码异戊烯基二磷酸异构酶(IDI)的核酸;(ii)编码银白杨异戊二烯合酶的核酸;(iii)编码马氏甲烷球菌甲羟戊酸激酶的核酸;以及(iv)编码来自粪肠球菌的MVA途径上游的核酸,所述核酸包括编码乙酰乙酰基辅酶A合酶(硫解酶)多肽的核酸;编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶多肽的核酸;以及编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶多肽的核酸。
附图说明
图1A显示异戊二烯的MVA和DXP代谢途径(基于F.Bouvier et al.,Progress in Lipid Res.44:357-429,2005(F.Bouvier等人,《脂类研究进展》,第44卷第357-429页,2005年))。以下说明包括途径中每种多肽的别名以及公开对所示多肽的活性进行测量的检测分析法的参考文献。甲羟戊酸途径:AACT;乙酰辅酶A乙酰转移酶,MvaE,EC 2.3.1.9。检测分析法:J.Bacteriol.184:2116-2122,2002(《细菌学杂志》,第184卷第2116-2122页,2002年);HMGS;羟甲基戊二酰辅酶A合酶,MvaS,EC 2.3.3.10。检测分析法:J.Bacteriol.184:4065-4070,2002(《细菌学杂志》,第184卷第4065-4070页,2002年);HMGR;3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶,MvaE,EC 1.1.1.34。检测分析法:J.Bacteriol.184:2116-2122,2002(《细菌学杂志》,第184卷第2116-2122页,2002年);MVK;甲羟戊酸激酶,ERG12,EC 2.7.1.36。检测分析法:CurrGenet 19:9-14,1991(《当代遗传学》,第19卷第9-14页,1991年)。PMK;磷酸甲羟戊酸激酶,ERG8,EC 2.7.4.2,检测分析法:Mol Cell Biol.11:620-631,1991(《分子细胞生物学报》,第11卷第620-631页,1991年);DPMDC;二磷酸甲羟戊酸脱羧酶,MVD1,EC 4.1.1.33。检测分析法:Biochemistry 33:13355-13362,1994(《生物化学杂志》,第33卷第13355-13362页,1994年);IDI;异戊烯二磷酸δ异构酶,IDI1,EC5.3.3.2。检测分析法:J.Biol.Chem.264:19169-19175,1989(《生物化学杂志》,第264卷第19169-19175页,1989年)。DXP途径:DXS;1-脱氧-5-磷酸木酮糖合酶,dxs,EC 2.2.1.7。检测分析法:PNAS 94:12857-62,1997(《美国国家科学院院刊》,第94卷第12857-62页,1997年);DXR;1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶,dxr,EC 2.2.1.7。检测分析法:Eur.J.Biochem.269:4446-4457,2002(《欧洲生物化学杂志》,第269卷第4446-4457页,2002年);MCT;4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇合酶,IspD,EC 2.7.7.60。检测分析法:PNAS 97:6451-6456,2000(《美国国家科学院院刊》,第97卷第6451-6456页,2000年);CMK;4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇激酶,IspE,EC 2.7.1.148。检测分析法:PNAS97:1062-1067,2000(《美国国家科学院院刊》,第97卷第1062-1067页,2000年);MCS;2C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶,IspF,EC4.6.1.12。检测分析法:PNAS 96:11758-11763,1999(《美国国家科学院院刊》,第96卷第11758-11763页,1999年);HDS;1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶,IspG,EC 1.17.4.3。检测分析法:J.Org.Chem.70:9168-9174,2005(《有机化学杂志》,第70卷第9168-9174页,2005年);HDR;1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸还原酶,IspH,EC1.17.1.2。检测分析法:JACS,126:12847-12855,2004(《美国化学会志》,第126卷第12847-12855页,2004年)。
图1B示出经典的和改进的MVA途径。1,乙酰辅酶A乙酰转移酶(AACT);2,HMG辅酶A合酶(HMGS);3,HMG辅酶A还原酶(HMGR);4,甲羟戊酸激酶(MVK);5,磷酸甲羟戊酸激酶(PMK);6,二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD或DPMDC);7,异戊烯基二磷酸异构酶(IDI);8,磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC);9,异戊烯基磷酸激酶(IPK)。经典的MVA途径通过反应5和6来从反应1进行到反应7,而改进的MVA途径经过反应8和9。在结构式中的P和PP分别是磷酸根和焦磷酸根。该图取自Koga和Morii的Microbiology and Mol.Biology Reviews 71:97-120,2007(《微生物学与分子生物学评论》,第71卷第97-120页,2007年)。改进的MVA途径存在于例如一些古细菌有机体(例如马氏甲烷八叠球菌)中。
图2是质粒pET24P.alba HGS的图谱。
图3A-B是质粒pET24P.alba HGS的核苷酸序列(序列标识号1)。
图4是显示用于内切酶消化以构建质粒EWL230和介于BspHI和NcoI位点之间的相容粘性末端的限制性位点的示意图。
图5是质粒EWL230的图谱。
图6A-B是质粒EWL230的核苷酸序列(序列标识号2)。
图7是显示用于内切酶消化以构建质粒EWL244和介于NsiI和PstI位点之间的相容粘性末端的限制性位点的示意图。
图8是质粒EWL244的图谱。
图9A-B是质粒EWL244的核苷酸序列(序列标识号3)。
图10A是马氏产甲烷球菌古细菌的下游操纵子的图谱。
图10B-C是马氏产甲烷球菌古细菌下游操纵子的核苷酸序列(序列标识号4)。
图11A是来自马氏产甲烷球菌古细菌pET200D下游的MCM376-MVK的图谱。
图11B-C是来自马氏产甲烷球菌古细菌pET200D下游的MCM376-MVK的核苷酸序列(序列标识号5)。
图12是质粒pBBRCMPGI1.5-pgl的图谱。
图13A-B是质粒pBBRCMPGI1.5-pgl的核苷酸序列(序列标识号6)。
图14A-F是通过大肠杆菌菌株来产生异戊二烯的曲线图,该大肠杆菌菌株表达马氏产甲烷球菌甲羟戊酸激酶、银白杨异戊二烯合酶、以及pgl(RHM111608-2),并且在15L规模的分批补料培养物中生长。图14A显示在使用葡萄糖填充的15L生物反应器内的光密度的时间进程。图14B显示在使用葡萄糖填充的15L生物反应器内的异戊二烯滴度的时间进程。滴度定义为每升发酵肉汤所产生的异戊二烯的量。计算异戊二烯的方法:在59小时内累积产生的异戊二烯,g/在59小时时刻的发酵罐体积,L[=]g/L肉汤。图14C也显示在使用葡萄糖填充的15L生物反应器内的异戊二烯滴度的时间进程。计算异戊二烯的方法:∫(异戊二烯的瞬时产率,g/L/h)dt(从t=0至59小时)[=]g/L肉汤。图14D显示由使用葡萄糖填充的15L生物反应器产生的总异戊二烯的时间进程。图14E显示在使用葡萄糖填充的15L生物反应器内的体积产率。图14F显示在使用葡萄糖填充的15L生物反应器内的二氧化碳释放率(CER)、或代谢活性分布。
图15A-B是显示对15L生物反应器中的发酵尾气进行分析的曲线图。样品A是在64.8小时取样的菌株RM111608-2。样品B是在34.5小时取样的菌株EWL256,该菌株为大肠杆菌BL21(DE3),pCL upper,cmR-gi1.2-yKKDyI,pTrcAlba-mMVK。测得两个样品的氢在基线(0.95×10-8乇)以上。
图16A显示示例性的异戊二烯回收装置。
图16B显示示例性的异戊二烯解吸/冷凝设置。
图17显示异戊二烯产物的GC/FID色谱图。测得材料的纯度为99.7%。
图18A-C显示在(A)之前以及在使用氧化铝(B)或二氧化硅(C)处理后的异戊二烯样品的GC/FID色谱图。异戊二烯峰未显示在这些色谱图中。
图19A显示质粒pDW34的图谱,该质粒pDW34在PTrc启动子和马氏产甲烷球菌MVK的控制下编码银白杨异戊二烯合酶的截短形式(MEA变体)。图19B-D显示质粒pDW34的完整核苷酸序列(序列标识号7)。
图20显示大肠杆菌K12菌株MG1655在pgl基因座周围的染色体结构(该图从www.ecocyc.com导入)。在括号中显示与大肠杆菌K12MG655相比在大肠杆菌BL21(DE3)中删掉的区域,并且该区域在菌株CMP215和CMP258中恢复。用圆圈标记ybgS基因的预测开放阅读框。正向箭头(→)指示galMF引物的退火位点(序列标识号8)。反向箭头(←)指示galMR引物的退火位点(序列标识号9)。
图21显示使用PGL+(CMP312)和PGL-(CMP323)培养物进行的微型发酵实验的光密度(OD)曲线图。沿着X轴的黑色三角形指示进行离线取样的时刻。其他OD值为内插值。
图22显示使用PGL+(CMP312)和PGL-(CMP323)培养物进行的微型发酵实验的异戊二烯比产率曲线图。沿着X轴的黑色三角形指示进行离线取样的时刻。其他OD值为内插值。
图23显示使用葡萄糖填充的15L生物反应器内的光密度的时间进程。
图24显示使用葡萄糖填充的15L生物反应器内的异戊二烯滴度的时间进程。将异戊二烯滴度定义为每升发酵肉汤所产生的异戊二烯的量。计算异戊二烯滴度的公式为:∫(异戊二烯的瞬时产率,g/L/h)dt(从t=0至t小时)[=]g/L肉汤。
图25显示使用葡萄糖填充的15L生物反应器产生的总异戊二烯的时间进程。
图26显示在使用葡萄糖填充的15L生物反应器内的异戊二烯比产率。计算比产率水平的公式为:(mg异戊二烯t-mg异戊二烯to)/[(OD550t*L肉汤t-OD550to*L肉汤to)/(2.7OD*L/g细胞)]/(t-t0)[=]mg异戊二烯/g细胞/h。
图27显示使用葡萄糖填充的15L生物反应器内的光密度的时间进程。pgl+样品是菌株CMP312的培养物。pgl-样品是菌株CMP323的培养物。
图28显示在使用葡萄糖填充的15L生物反应器内的异戊二烯滴度的时间进程。将滴度定义为每升发酵肉汤所产生的异戊二烯的量。pgl+样品是菌株CMP312的培养物。pgl-样品是菌株CMP323的培养物。计算异戊二烯滴度的公式为:∫(异戊二烯的瞬时产率,g/L/h)dt(从t=0至20小时)[=]g/L肉汤。
图29显示在使用葡萄糖填充的15L生物反应器内的异戊二烯比产率。pgl+样品是菌株CMP312的培养物。pgl-样品是菌株CMP323的培养物。计算比产率水平的公式为:(mg异戊二烯t-mg异戊二烯to)/[(OD550t*L肉汤t-OD550to*L肉汤to)/(2.7OD*L/g细胞)]/(t-t0)[=]mg异戊二烯/g细胞/h
图30显示使用葡萄糖填充的含有大肠杆菌K12菌株MG1655的15L生物反应器内的光密度的时间进程。
图31显示使用葡萄糖填充的含有大肠杆菌K-12菌株MG1655的15L生物反应器内的异戊二烯滴度的时间进程。将滴度定义为每升发酵肉汤所产生的异戊二烯的量。计算异戊二烯滴度的公式为:∫(异戊二烯的瞬时产率,g/L/h)dt(从t=0至t小时)[=]g/L肉汤。
图32显示由使用葡萄糖填充的含有大肠杆菌K-12菌株MG1655的15L生物反应器产生的总异戊二烯的时间进程。
图33显示使用葡萄糖填充的含有大肠杆菌菌株K12MG1655的15L生物反应器中异戊二烯比产率的时间进程。计算比产率的公式为:(mg异戊二烯t-mg异戊二烯to)/[(OD550t*L肉汤t-OD550to*L肉汤to)/(2.7OD*L/g细胞)]/(t-t0)[=]mg异戊二烯/g细胞/h。
图34A显示表达来自粪肠球菌的MVA途径上游的多肽mvaE和mvaS的质粒pDW15的图谱。图34B-D显示质粒pDW15的完整核苷酸序列(序列标识号10)。
图35显示包含0.1%酵母提取物和1%葡萄糖的TM3基本培养基中细菌菌株的甲羟戊酸比产率。对独特的菌落进行三重平行实验。菌株在表29中有更详细的描述。BL21+pCL pTrcUpper=菌株MCM870;BL21pgl+pCL pTrcUpper=菌株MCM874;BL21+pBBR pTrcUpper=菌株MCM871;BL21pgl+pBBR pTrcUpper=菌株MCM875;BL21+pTrcUpper=MCM872;BL21pgl+pTrcUpper=MCM876。
图36显示在包含0.02%酵母提取物和1%葡萄糖的TM3基本培养基中大肠杆菌菌株MCM872和MCM876的生长。
图37显示在包含0.02%酵母提取物和1%葡萄糖的TM3基本培养基中大肠杆菌菌株MCM872(BL21pTrc-Upper)和MCM876(BL21pgl pTrc-Upper)的甲羟戊酸产生速率。
图38显示在两个不同的时间点从具有0.02%酵母提取物的TM3基本培养基中取出的大肠杆菌菌株MCM872(BL21pTrc-Upper)和MCM876(BL21pgl pTrc-Upper)中的MvaS蛋白浓度/OD。
图39显示在具有0.02%酵母提取物的TM3基本培养基中生长的大肠杆菌菌株MCM872(BL21pTrc-Upper)和MCM876(BL21pgl pTrc-Upper)中的MvaE浓度/OD。
图40A显示来自大肠杆菌K12MG1655的6-磷酸葡萄糖酸内酯酶(PGL)的氨基酸序列(序列标识号11)。图40B显示来自铜绿假单胞菌的PGL的氨基酸序列(序列标识号12)。图40C显示来自酿酒酵母的PGL的氨基酸序列(序列标识号13)。图40D显示大肠杆菌PGL和铜绿假单胞菌PGL的氨基酸序列比对。相同的氨基酸以灰色突出显示。保守性氨基酸取代以黑色突出显示。
图41A-B显示BL21(Novagen)和标记为BL21pgl的菌株CMP258(实例6)的生长速率。所述生长在包含0.4%(w/v)葡萄糖的M9基本培养基(6g/L Na2HPO4、3g/L KH2PO4、0.5g/L NaCl、0.5g/L NH4Cl、0.1mMCaCl2、2mM MgSO4)中评估。所述生长在OD600处测量。图41A显示BL21和菌株CMP258(标记为BL21pgl)的生长。图41B显示具有和不具有pgl的BL21的比生长速率(μ)。在BL21中恢复包含17,257bp缺失的pgl导致菌株具有约15%的比生长速率增长。
图42A显示使用葡萄糖填充的15L生物反应器内的异戊二烯滴度的时间进程。将异戊二烯滴度定义为每升发酵肉汤所产生的异戊二烯的量。计算异戊二烯滴度的公式为:∫(异戊二烯的瞬时产率,g/L/h)dt(从t=0至t小时)[=]g/L肉汤。图42B显示在使用葡萄糖填充的15L生物反应器内的异戊二烯比产率。计算比产率水平的公式为:(mg异戊二烯t-mg异戊二烯to)/[(OD550t*L肉汤t-OD550to*L肉汤to)/(2.7OD*L/g细胞)]/(t-t0)[=]mg异戊二烯/g细胞/h。
具体实施方式
大肠杆菌BL21和BL21(DE3)被广泛用作产生重组蛋白的宿主。它们也能用于产生其他产物,例如异戊二烯。通过增大戊糖磷酸途径(对细胞生长很重要的代谢途径)的活性可改善此类大肠杆菌菌株中重组蛋白、生物化学物质和其他产物的收率。使用亿明达公司的基因组分析仪II(Illumina Genome Analyzer II(GA II))测序体系,对由Codon Genomics公司(位于密苏里州圣路易斯市(St.Louis,MO))制备的大肠杆菌BL21的基因序列和大肠杆菌MG1655(GenBank登录号:U00096)的基因序列的比较显示:大肠杆菌BL21基因组在编码利用半乳糖时所涉及的基因以及如本文中较为详细地描述的其他基因的区域中携带17,257bp的缺失。出乎意料地,该缺失还涵盖编码6-磷酸葡萄糖酸内酯酶(PGL)(戊糖磷酸途径中的第二种酶)的ybhE基因(Thomason,L.,Court,D.,Datta,A.,Khanna,R.andRosner,J.,“Identification of the Escherichia coli K-12ybhE gene as pgl,encoding 6-phosphogluconolactonase,”J.Bact.186:8248-8253(2004)(Thomason,L.、Court,D.、Datta,A.、Khanna,R.和Rosner,J.,“将编码6-磷酸葡萄糖酸内酯酶的大肠杆菌K-12ybhE基因识别为pgl”,《细菌学杂志》,第186卷第8248-8253页,2004年))。该缺失通过对大肠杆菌BL21的亲本菌株进行紫外线辐照来制备并通过P1转导传递(Studier F.,Daegelen,P.,Lenski,R.,Maslov,S.,Kim,J.F.,“Understanding the differencesbetween genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 andBL21(DE3)and comparison of the E.coli B and K-12genomes,”J.Mol.Biol.published ahead of print Sept.15,2009(Studier F.、Daegelen,P.、Lenski,R.、Maslov,S.、Kim,J.F.,“理解大肠杆菌B菌株REL606和BL21(DE3)的基因组序列之间的差异并比较大肠杆菌B和K-12基因组”,《分子生物学杂志》,在2009年9月15日早于印刷版出版))。因此,大肠杆菌BL21和BL21(DE3)不仅缺乏PGL活性,还缺乏利用半乳糖作为碳源的能力。(Aon et al.,“Suppressing posttranslational gluconoylation ofheterologous proteins by metabolic engineering of Escherichia coli,”Appl.Environ.Microbiol.74:950-958(2008)(Aon等人,“通过大肠杆菌的代谢工程抑制异种蛋白的翻译后葡萄糖酸化”,《应用与环境微生物学》,第74卷第950-958页,2008年))。
此外,所述缺失还包含高亲和力钼酸盐转运所需的基因。尽管体内仅需要痕量的钼,但钼在所有生物体的数种代谢途径中扮演重要角色。钼酸盐在通过细菌进行的许多氧化/还原反应中用作酶的辅因子、在氮代谢中起着关键作用,并且特别是在厌氧呼吸的情况下有助于产生能量。(参见例如Self et al.,Res Microbiol.152:311-321(2001)(Self等人,《微生物学研究》,第152卷第311-321页,2001年);Grunden & Shanmugam,ArchMicrobiol.168:345-354(1997)(Grunden和Shanmugam,《微生物学文献集》,第168卷第345-354页,1997年))。
在生长期间使用戊糖磷酸途径(PPP)提供NADPH和戊糖(五碳糖)(Neidhart,F.,Ingraham,J.,and Schaechter,M.,1990,Physiology of thebacterial cell:a molecular approach(Sinauer Associates,Inc.Sunderland,MA)(Neidhart,F.、Ingraham,J.和Schaechter,M.,1990年,《细菌细胞生理学:分子途径》,由位于马萨诸塞州桑德兰的Sinauer Associates有限公司出版))。PPP具有两个不同的阶段:(1)氧化阶段,其中生成了NADPH;以及(2)非氧化阶段,其中合成五碳糖。PPP是糖酵解的替代方式,并且虽然PPP不涉及葡萄糖的氧化,但其主要作用是合成代谢而非分解代谢。该途径的主要结果是:(1)生成在细胞内的还原性生物合成反应(诸如脂肪酸合成反应)中使用的NADPH形式的还原等价物;(2)产生在核苷酸和核酸的合成中使用的5-磷酸核糖(R5P);以及(3)产生在芳香族氨基酸的合成中使用的4-磷酸赤藓糖(E4P)。芳香族氨基酸继而是许多生物合成途径的前体。源自核酸消化的膳食戊糖可通过戊糖磷酸途径代谢,并且膳食碳水化合物的碳骨架可转变为糖酵解或糖异生的中间体。在哺乳动物体内,PPP只在细胞质中发生,并且是身体产生具有还原力的分子的三种主要方式之一,人体中大约60%的NADPH通过其产生。
在大肠杆菌BL21和BL21(DE3)菌株中修复PGL基因及其相关的表达控制序列传达了可观的生长收益,这是因为戊糖磷酸途径提供了在细胞内的还原性生物合成反应(诸如脂肪酸合成反应)中使用的还原当量、在核苷酸和核酸的合成中使用的5-磷酸核糖(R5P)、以及(3)在芳香族氨基酸的合成中使用的4-磷酸赤藓糖(E4P)。此外,具有能够利用半乳糖的同源菌株(如,大肠杆菌BL21或BL21(DE3)菌株),从而可用碳源的范围,这对于工业目的而言将是有用的。
另外,编码高亲和力钼酸盐转运蛋白的恢复基因将提供额外的生长收益,这是因为细胞将能够在需要钼作为辅因子的那些代谢反应中更有效地利用钼酸盐。本发明涵盖表达编码整合到细菌染色体内的PGL多肽的异源核酸的重组细菌细胞的改良方法和组合物。单独的PGL整合或联合编码用于半乳糖代谢和/或钼转运的多肽的一种或多种其他异源核酸的PGL整合可改善重组细菌细胞产生异戊二烯的能力。
因此,在一个方面,本发明涵盖能够产生异戊二烯的大肠杆菌菌株的重组细胞,其中所述细胞包含:(a)编码PGL多肽的异源核酸的一个或多个拷贝,其中所述核酸整合在大肠杆菌染色体中;以及(b)编码异戊二烯合酶的一种或多种异源核酸;其中在整合之前,所述大肠杆菌细胞不包含(a)编码PGL多肽的核酸,并且其中所得的重组细胞产生的异戊二烯的滴度大于不包含(a)和(b)的相同细胞的滴度。在一些情况下,重组大肠杆菌细胞能使用其自身的内源性启动子和/或其他调节体系来调节整合的PGL核酸的转录和随后的表达。在这种情况下,异源核酸的表达(如,PGL或异戊二烯)不是被质粒或质粒上的因子驱动的组成型表达。在其他情况下,重组大肠杆菌细胞能使用已引入大肠杆菌细胞的启动子和/或其他调节体系来调节整合的PGL核酸的转录和随后的表达。
本发明还涵盖不编码6-磷酸葡萄糖酸内酯酶(PGL)多肽的大肠杆菌菌株细胞,其中所述大肠杆菌细胞包含使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝和编码能具有生物活性的异源多肽的核酸。在一个方面,PGL多肽不通过质粒上的核酸编码。在一些方面,当将所述大肠杆菌细胞培养在基本培养基中时,所述细胞产生能具有生物活性的多肽的比产率大于缺乏使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝的相同细胞的该比产率。本文还提供产生能具有生物活性的异源多肽的改良方法,包括在基本培养基中培养不编码PGL多肽的大肠杆菌细胞和产生异源多肽的步骤,其中所述细胞包含使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝和编码能具有生物活性的异源多肽的核酸。在一些方面,当将所述细胞培养在基本培养基中时,所述细胞产生异源多肽的比产率大于缺乏使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝的相同细胞的该比产率。
在另一方面,本文提供不编码PGL多肽的大肠杆菌菌株细胞,其中所述大肠杆菌细胞包含使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝和编码甲羟戊酸(MVA)途径上游的多肽、MVA途径下游的多肽和/或异戊二烯合酶多肽的异源核酸。在一些方面,当将所述大肠杆菌细胞培养在基本培养基中时,所述细胞具有的异戊二烯比产率大于缺乏使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝的相同细胞的异戊二烯比产率。本发明还提供产生异戊二烯的改良方法,包括在基本培养基中培养不编码PGL多肽的大肠杆菌细胞和产生异戊二烯的步骤,其中所述细胞包含使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝和编码甲羟戊酸(MVA)途径上游的多肽、MVA途径下游的多肽或异戊二烯合酶多肽的异源核酸。在一些方面,当将所述细胞培养在基本培养基中时,所述细胞具有的异戊二烯比产率大于缺乏使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝的相同细胞的异戊二烯比产率。
通用技术
除非另外指明,否则对本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学领域的常规技术,这些技术均为本领域的现有技术。这些技术在以下文献中有完整解释:“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,second edition(Sambrook et al.,1989)(《分子克隆:实验手册》第二版,Sambrook等人,1989年);“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait,ed.,1984)(《寡核苷酸合成》,M.J.Gait编辑,1984年);“Animal Cell Culture”(R.I.Freshney,ed.,1987)(《动物细胞培养》,R.I.Freshney编辑,1987年);“Methods inEnzymology”(Academic Press,Inc.)(《酶学方法》,美国学术出版社);“Current Protocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel et al.,eds.,1987,and periodic updates)(《分子生物学实验室指南》,F.M.Ausubel等人编辑,1987年,周期性更新);“PCR:The Polymerase Chain Reaction”,(Mullis et al.,eds.,1994)(《聚合酶链反应》,Mullis等人编辑,1994年)。Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nded.,J.Wiley&Sons(New York,N.Y.1994)(Singleton等人,《微生物学和分子生物学词典》第二版,约翰·威利父子公司,纽约州纽约市,1994年)和March,Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms andStructure 4th ed.,John Wiley&Sons(New York,N.Y.1992)(March,《高等有机化学:反应、机理和结构》第4版,约翰·威利父子公司,纽约州纽约市,1992年)向本领域的技术人员提供对本申请中使用的许多术语的一般性指导。
定义
术语“异戊二烯”是指2-甲基-1,3-丁二烯(CAS号78-79-5)。其可以是由3,3-二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)消除焦磷酸酯所得的直接和最终挥发性C5碳氢化合物产物。其可不涉及将IPP分子键合或聚合至DMAPP分子。除非本文中另外指明,否则术语“异戊二烯”通常不旨在受其产生方法的限制。
如本文所用,术语“6-磷酸葡萄糖酸内酯”是指6-磷酸-D-葡萄糖酸-1,5-内酯(CAS号2641-81-8)。如本文所用,术语“6-磷酸葡萄糖酸”是指6-磷酸-D-葡萄糖酸(CAS号921-62-0)。
如本文所用,术语“多肽”包括多肽、蛋白质、肽、多肽的片段和融合多肽。
如本文所用,“分离的多肽”不是多肽库(诸如2种、5种、10种、20种、50种或更多种不同多肽的库)的一部分,并且与和其一起存在于自然界中的至少一种组分分离。分离的多肽可例如通过编码多肽的重组核酸的表达来获得。分离的多肽可以为非天然存在的多肽。
所谓“异源多肽”,是指通过源自与宿主细胞不同的有机体、菌种或菌株的核酸序列编码的多肽。在一些方面,异源多肽不同于存在于自然界中的相同宿主细胞内的野生型多肽。
如本文所使用,“核酸”是指以单股或双股形式共价连接在一起的两个或更多个脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸。
所谓“重组核酸”,是指目标核酸由其而来的有机体的天然存在的基因组中目标核酸的侧面没有一个或多个核酸(如,基因)的目标核酸。因此,该术语包括(例如)整合到载体中、整合到自主复制的质粒或病毒中、或整合到原核生物或真核生物的基因组DNA中、或者独立于其他序列作为单独的分子(例如,cDNA、基因组DNA片段、或通过PCR或限制性内切酶消化制备的cDNA片段)存在的重组DNA。在一些方面,重组核酸是编码非天然存在的多肽的核酸。
所谓“异源核酸”,是指源自与宿主细胞不同的有机体、菌种或菌株的核酸序列。在一些方面,异源核酸不同于存在于自然界中的相同宿主细胞内的野生型核酸。例如,从大肠杆菌K12菌株MG1655或其衍生物分离、通过P1转导整合到大肠杆菌BL21(DE3)的染色体内并在细胞中表达的编码PGL多肽的核酸为异源核酸。在一个方面,“异源核酸”可意味着将核酸引入不具有该核酸的宿主细胞中。在一些情况下,异源核酸可以为异源基因。本领域的技术人员将会知道不同之处,并因此还能够使用所述教导的上下文。
如本文所用,“表达控制序列”是指指导目标核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以为启动子(例如组成型或诱导型启动子)或增强子。表达控制序列可以为“天然的”或异源的。天然表达控制序列源自与当前表达的基因相同的有机体、菌种或菌株。异源表达控制序列源自与当前表达的基因不同的有机体、菌种或菌株。“诱导型启动子”是在环境或发育调节下具有活性的启动子。表达控制序列可操作地连接至待转录的核酸片段。
如本文所用,术语“基本培养基”是指包含对细胞生长可能的最少营养物质的生长培养基,其通常不存在氨基酸。基本培养基通常包含:(1)用于细菌生长的碳源;(2)各种盐,其可根据细菌种类和生长条件而变化;以及(3)水。碳源可能有很大的差异,从简单的糖类(诸如葡萄糖)到其他生物质(诸如酵母提取物)的较为复杂的水解产物均可,如下文更为详细的讨论。盐通常提供必需元素,例如镁、氮、磷和硫,以使得细胞可合成蛋白质和核酸。基本培养基还可补充以诸如抗生素等选择性试剂,用于有选择地维持某些质粒等。例如,如果微生物对某种抗生素(例如氨苄青霉素或四环素)具有抗性,则可将该抗生素加入培养基以避免细胞在生长过程中缺乏抗性。如选择期望的生理或生化特性所必需的,培养基可补充以其他化合物,例如特定的氨基酸等。
如本文所用,术语“萜类化合物”或“类异戊二烯”是指类似于萜烯的一大类各种各样的天然存在的有机化学物质。萜类化合物源自以多种方式组装和修饰的五碳异戊二烯单元,并且以组成员中使用的异戊二烯单元的数目为基础进行分类。半萜具有一个异戊二烯单元。单萜具有两个异戊二烯单元。倍半萜具有三个异戊二烯单元。二萜具有四个异戊二烯单元。二倍半萜具有五个异戊二烯单元。三萜具有六个异戊二烯单元。四萜具有八个异戊二烯单元。多萜具有多于八个异戊二烯单元。
如本文所用,术语“类胡萝卜素”是指在植物、一些其他光合生物体(诸如藻类)的叶绿体和成色素细胞中、在一些类型的真菌中、以及在一些细菌中产生的一组天然存在的有机色素。类胡萝卜素包括含氧的叶黄素和不含氧的胡萝卜素。
除非本文另有定义,否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。
如本文所用,除非上下文另有明确说明,否则单数“一个”、“一种”和“该”包括复数含义。
在本说明书通篇中给出的每一个上限值旨在包括每一个下限值,仿佛此类下限值在本文中明确地写出一样。在本说明书通篇中给出的每一个下限值将包括每一个上限值,仿佛此类上限值在本文中明确地写出一样。在本说明书通篇中给出的每一个数值范围将包括落入此类较宽数值范围内的每一个较窄数值范围,仿佛此类较窄数值范围在本文中全部明确地写出一样。
修复至大肠杆菌Bl21或BL21(DE3)的编码多肽的基因
在大肠杆菌BL21和BL21(DE3)基因组中的17,257bp缺失包括yghE基因(PGL)、编码利用半乳糖作为碳源时所涉及的蛋白质的基因、编码钼转运时所涉及的蛋白质的基因,以及功能未知的几种其他基因。参见(例如)图20。利用半乳糖时所涉及的基因是编码半乳糖-1-差向异构酶的galM、编码半乳糖激酶的galK、编码半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的galT,以及编码UDP-葡萄糖-4-差向异构酶的galE。编码钼转运时所涉及的蛋白质的基因是编码ABC超家族的融合钼酸盐转运子亚基的modF、编码用于钼转运的modABC操纵子的阻遏蛋白的modE,以及各自编码钼酸盐转运子亚基蛋白质的modA、modB和modC。
因此,可将细菌(如,大肠杆菌)细胞设计为在大肠杆菌染色体中整合编码PGL多肽的核酸。引入编码异戊二烯合酶(如,银白杨异戊二烯合酶)的异源核酸可增大异戊二烯产生过程的总滴度和/或比活性。此外,除PGL整合之外,还可以将编码利用半乳糖作为碳源时所涉及的蛋白质或钼转运时所涉及的蛋白质的一种或多种基因引入大肠杆菌细胞以增大重组细胞的综合适应度,这继而可导致异戊二烯产量增大。
可以设想的是,单独整合的PGL或者与编码利用半乳糖作为碳源时所涉及的蛋白质或钼转运时所涉及的蛋白质的一种或多种基因相结合而整合PGL的各种选择均在本发明的范围之内。因此,在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL和galM。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL和galK。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL和galT。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL和galE。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galM和galK。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galM和galT。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galM和galE。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galK和galT。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galK和galE。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galT和galE。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galM、galK和galT。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galM、galK和galE。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galK、galT和galE。
在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL和modF。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL和modE。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、modA、modB和modC。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、modF和modE。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、modF、modA、modB和modC。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、modE、modA、modB和modC。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、modF、modE、modA、modB和modC。
在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galM和modF。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galM和modE。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galM、modA、modB和modC。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galK和modF。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galK和modE。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galK、modA、modB和modC。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galT和modF。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galT和modE。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galT、modA、modB和modC。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galK和modF。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galE和modE。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galE、modA、modB和modC。
在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galM、galK和modF。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galM、galK和modE。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galM、galK、modA、modB和modC。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galM、galT和modF。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galM、galT和modE。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galM、galT、modA、modB和modC。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galM、galE和modF。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galM、galE和modE。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galM、galE、modA、modB和modC。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galK、galT和modF。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galK、galT和modE。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galK、galT、modA、modB和modC。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galK、galE和modF。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galK、galE和modE。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galK、galE、modA、modB和modC。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galE、galT和modF。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galE、galT和modE。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galE、galT、modA、modB和modC。
在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galM、galK、galT和modF。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galM、galK、galT和modE。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galM、galK、galT、modA、modB和modC。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galM、galK、galE和modF。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galM、galK、galE和modE。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galM、galK、galE、modA、modB和modC。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galE、galK、galT和modF。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galE、galK、galT和modE。在一些方面,修复至BL21或BL21(DE3)基因组的基因是PGL、galE、galK、galT、modA、modB和modC。
在一些方面,将在17,257bp基因组片段上编码的一种或多种基因的一个或多个拷贝(除PGL外)修复至质粒上的大肠杆菌BL21或BL21(DE3)。在一些方面,将在17,257bp基因组片段上编码的一种或多种基因的一个或多个拷贝修复至组成型表达质粒上的大肠杆菌BL21或BL21(DE3)。在一些方面,将在17,257bp基因组片段上编码的一种或多种基因的一个或多个拷贝修复至诱导型质粒上的大肠杆菌BL21或BL21(DE3)。在一些方面,整个17,257bp基因组片段是被转染到大肠杆菌BL21或BL21(DE3)细胞内的质粒。在一些方面,通过染色体整合将在所述17,257bp基因组片段上编码的一种或多种基因的一个或多个拷贝修复(如图20中所示)至大肠杆菌BL21或BL21(DE3)。在一些方面,通过染色体整合将整个17,257bp基因组片段修复至大肠杆菌BL21或BL21(DE3)。
示例性PGL多肽和核酸
6-磷酸葡萄糖酸内酯酶(PGL)将6-磷酸葡萄糖酸内酯转化为6-磷酸葡萄糖酸。示例性PGL多肽包括具有PGL多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性PGL多肽和核酸包括具有PGL多肽的至少一种活性的来自本文所述的任何来源生物体的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何来源生物体的突变型多肽和核酸。
突变型PGL多肽包括其中一种或多种氨基酸残基经氨基酸取代但仍保留PGL活性(即,将6-磷酸葡萄糖酸内酯转化为6-磷酸葡萄糖酸的能力)的那些。氨基酸取代可以为保守性或非保守性的,并且此类取代的氨基酸残基可以被或可以不被遗传密码编码。已经基于氨基酸侧链的相似性将标准的二十种氨基酸“字母表”划分为各个化学家族。那些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(如,赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(如,天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(如,甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(如,丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-支化侧链的氨基酸(如,苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(如,酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。“保守性氨基酸取代”是其中氨基酸残基被替换为具有化学上相似的侧链的氨基酸残基(如,使用具有碱性侧链的另一种氨基酸替换具有碱性侧链的氨基酸)的一种取代。“非保守性氨基酸取代”是其中氨基酸残基被替换为具有化学上不同的侧链的氨基酸残基(如,使用具有芳香侧链的另一种氨基酸替换具有碱性侧链的氨基酸)的一种取代。
可在PGL多肽中引入氨基酸取代以改善分子的功能性。例如,可将增大PGL多肽对其基底的亲和力、或改善其将6-磷酸葡萄糖酸内酯转化为6-磷酸葡萄糖酸的能力的氨基酸取代引入到PGL多肽内。在一些方面,突变型PGL多肽包含一种或多种保守性氨基酸取代。在一些方面,突变型PGL多肽包含一种或多种非保守性氨基酸取代。
可使用标准方法,诸如通过A.Sinha and P.K.Maitra,“Induction ofspecific enzymes of the oxidative pentose phosphate pathway by glucono-delta-lactone in Saccharomyces cerevisiae,”J.Gen.Microbiol.138:1865-1873(1992)(A.Sinha和P.K.Maitra,“通过酿酒酵母中的葡萄糖酸-δ-内酯诱导特定酶的氧化戊糖磷酸途径”,《普通微生物学杂志》,第138卷第1865-1873页,1992年)所述的那些,通过测定多肽将NADP+还原至NADPH的能力来确定多肽是否具有PGL活性。在示例性检测分析中,PGL活性通过如下方式测定:预先温育包含50μM葡萄糖-6-磷酸、0.5mM NADP+、和溶于50mM MES缓冲液(pH=6.5)中的0.5单位葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、25mM KCl、10mM MgCl2的反应混合物,直至反应完成。随后加入1单位的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶,其导致荧光缓慢增加,这是因为在较早的反应中形成的内酯自发地水解。接着,加入无细胞提取物,从而通过由PGL催化的内酯酶反应导致NADP+还原为NADPH的速率增大。通过从该最终速率中减去之前的空白速率来计算实际的内酯酶速率。
作为另外一种选择,可通过核磁共振(NMR)光谱监测6-磷酸葡萄糖酸内酯向6-磷酸葡萄糖酸的转化。参见例如E.Miclet et al.,“NMRSpectroscopic Analysis of the First Two Steps of the Pentose-Phosphate PathwayElucidates the Role of 6-Phosphogluconolactonase,”J.Biol.Chem.276(37):34840-34846(2001)(Miclet等人,“对戊糖磷酸途径的前两个步骤的核磁共振光谱分析阐明6-磷酸葡萄糖酸内酯酶的作用”,《生物化学杂志》,第276卷第37期第34840-34846页,2001年)。
示例性PGL核酸包括编码具有PGL多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性异戊二烯合酶多肽和核酸包括来自本文所述的任何来源生物体的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何来源生物体的突变型多肽和核酸。示例性PGL核酸包括(例如)从大肠杆菌K12MG1655或其衍生物(EcoGene登录号:EG13231;其为参考GenBank登录号U0096的大肠杆菌K12MG1655基因序列的一部分;还可参见UniProtKB/Swiss-Prot登录号P52697(PGL多肽))中分离的PGL(参见图40A和序列标识号11);从铜绿假单胞菌菌株PAO1L(GenBank登录号AE004091的基因座标签PA3182;还可参见GenBank登录号AAG06570.1(PGL多肽))中分离的PGL(参见图40B和序列标识号12);以及从酿酒酵母(GenBank登录号NC_001140的基因座标签YHR163W;还可参见UNIProtKB/Swiss-Prot登录号P38858(PGL多肽))中分离的PGL(参见图40C和序列标识号13)。其他示例性PGL核酸可从肠杆菌(Enterobacteriaceae)科的任何属中分离,包括例如Alishewanella、交替球菌属(Alterococcus)、Aquamonas、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、克罗诺杆菌属(Cronobacter)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)(如,肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae))、泛菌属(Pantoea)(如,柠檬泛菌(Pantoeacitroea))、变形杆菌属(Proteus)(如,普通变形杆菌(Proteus vulgaris))、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)(如,粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens))、志贺氏菌属(Shigella)、以及耶尔森菌属(Yersinia)(如,鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis))。
示例性半乳糖代谢多肽和核酸
半乳糖-1-差向异构酶(galM)催化β-D-半乳糖向α-D-半乳糖的转化。示例性的半乳糖-1-差向异构酶多肽包括具有半乳糖-1-差向异构酶多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性半乳糖-1-差向异构酶多肽和核酸包括具有半乳糖-1-差向异构酶多肽的至少一种活性的来自本文所述的任何来源生物体的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何来源生物体的突变型多肽和核酸。
半乳糖激酶(galK)催化D-半乳糖向D-半乳糖-1-磷酸的磷酸化。示例性半乳糖激酶多肽包括具有半乳糖激酶多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性半乳糖激酶多肽和核酸包括具有半乳糖激酶多肽的至少一种活性的来自本文所述的任何来源生物体的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何来源生物体的突变型多肽和核酸。
半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(galT)催化通过将UDP-葡萄糖和半乳糖-1-磷酸转化为葡萄糖-1-磷酸和UDP-半乳糖的半乳糖代谢的Leloir途径的第二步。示例性半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶多肽包括具有半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶多肽和核酸包括具有半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶多肽的至少一种活性的来自本文所述的任何来源生物体的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何来源生物体的突变型多肽和核酸。
UDP-半乳糖-4-差向异构酶(galE)催化UDP-半乳糖向UDP-葡萄糖的可逆转化。示例性UDP-半乳糖-4-差向异构酶多肽包括具有UDP-半乳糖-4-差向异构酶多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性UDP-半乳糖-4-差向异构酶多肽和核酸包括具有UDP-半乳糖-4-差向异构酶多肽的至少一种活性的来自本文所述的任何来源生物体的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何来源生物体的突变型多肽和核酸。
示例性半乳糖代谢核酸包括编码具有半乳糖代谢多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性半乳糖代谢核酸包括(例如)从大肠杆菌K12MG1655或其衍生物中分离的半乳糖代谢基因;从铜绿假单胞菌菌株PAO1中分离的半乳糖代谢基因;以及从酿酒酵母中分离的半乳糖代谢基因。其他示例性的半乳糖代谢核酸可从肠杆菌科的任何属中分离,包括例如Alishewanella、交替球菌属、Aquamonas、柠檬酸杆菌属、克罗诺杆菌属、爱德华氏菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属(如,肺炎克雷伯氏菌)、泛菌属(如,柠檬泛菌)、变形杆菌属(如,普通变形杆菌)、沙门氏菌属、沙雷氏菌属(如,粘质沙雷氏菌)、志贺氏菌属、以及耶尔森菌属(如,鼠疫耶尔森菌)。
示例性钼转运子多肽和核酸
由modF基因编码的多肽是ABC超家族的融合钼酸盐转运子亚基的非特征性成员。示例性的由modF编码的多肽包括具有由modF编码的多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性的由modF编码的多肽和核酸包括具有由modF编码的多肽的至少一种活性的来自本文所述的任何来源生物体的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何来源生物体的突变型多肽和核酸。
钼转运(modE)多肽的modABC操纵子的阻遏蛋白是调节蛋白,据信在存在钼酸盐的情况下,该调节蛋白反馈性抑制modABC操纵子的转录。示例性的由modE编码的多肽包括具有由modE编码的多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性的由modE编码的多肽和核酸包括具有由modE编码的多肽的至少一种活性的来自本文所述的任何来源生物体的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何来源生物体的突变型多肽和核酸。
通过modA、modB和modC编码的高亲和力三聚体钼转运子蛋白是用于将钼摄取进入细胞的膜相关ABC型转运子体系。当modABC基因中的任何一者发生突变或缺失时,钼酸盐转运通过ABC型硫酸盐转运体系或通过非特异性阴离子转运子来完成,但效率低约100倍。(Self et al.,2001,Res.Microbiol.152:311-321(Self等人,2001年,《微生物学研究》,第152卷第311-321页))。示例性的由modABC编码的多肽包括具有由modABC编码的多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性的由modABC编码的多肽和核酸包括具有由modABC编码的多肽的其中之一的至少一种活性的来自本文所述的任何来源生物体的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何来源生物体的突变型多肽和核酸。
示例性的钼转运核酸包括编码具有钼转运多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性的钼转运核酸包括例如从大肠杆菌K12MG1655或其衍生物中分离的钼转运基因;从铜绿假单胞菌菌株PAO1中分离的钼转运基因;以及从酿酒酵母中分离的半乳糖代谢基因。其他示例性的钼转运核酸可从肠杆菌科的任何属中分离,包括例如Alishewanella、交替球菌属、Aquamonas、柠檬酸杆菌属、克罗诺杆菌属、爱德华氏菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属(如,肺炎克雷伯氏菌)、泛菌属(如,柠檬泛菌)、变形杆菌属(如,普通变形杆菌)、沙门氏菌属、沙雷氏菌属(如,粘质沙雷氏菌)、志贺氏菌属、以及耶尔森菌属(如,鼠疫耶尔森菌)。
示例性宿主细胞
可使用大肠杆菌宿主细胞来表达本文所述方法中的异戊二烯合酶、PGL多肽、DXP途径多肽、IDI和MVA途径多肽。在一个方面,宿主细胞是能够产生异戊二烯的大肠杆菌菌株的重组细胞或其子代,所述细胞包含:(a)编码PGL多肽的异源核酸的一个或多个拷贝,其中所述核酸整合在大肠杆菌染色体中;以及(b)编码异戊二烯合酶的一种或多种异源核酸;其中在所述整合之前,所述大肠杆菌细胞不包含编码PGL多肽的核酸,并且其中所得的重组细胞产生的异戊二烯的滴度大于不包含(a)和(b)的相同细胞的滴度。在一些方面,宿主细胞是不编码6-磷酸葡萄糖酸内酯酶(PGL)多肽的大肠杆菌菌株的细菌细胞,该细胞还包含使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝和编码能具有生物活性的异源多肽的核酸。在一些方面,当将所述细菌细胞培养在基本培养基中时,所述细胞产生异源多肽的比产率大于缺乏使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝的相同细胞的该比产率。在一些方面,使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝是染色体拷贝(如,整合到大肠杆菌染色体中)。在一些方面,大肠杆菌细胞在培养物中。
在一些方面,能够具有生物活性的异源多肽包括在生物合成萜类化合物(类异戊二烯)或类胡萝卜素化合物的过程中所涉及的一种或多种多肽,并且当将所述细胞培养在基本培养基中时,所述细胞产生萜类化合物或类胡萝卜素的比产率高于缺乏使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝的相同细胞的该比产率。在一些方面,所述方法还包括回收萜类化合物或类胡萝卜素的步骤。
在一些方面,宿主细胞是不编码6-磷酸葡萄糖酸内酯酶(PGL)多肽的大肠杆菌菌株的细菌细胞,该细胞还包含使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝和编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸。在一些方面,当将所述细菌细胞培养在基本培养基中时,所述细胞产生异戊二烯的比产率大于缺乏使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝的相同细胞的该比产率。
在一些方面,该细胞还包含MVA途径多肽。在一些方面,MVA途径多肽是MVA途径上游的多肽。在一些方面,MVA途径多肽是MVA途径下游的多肽。在一些方面,MVA途径上游的多肽选自:(i)乙酰乙酰基辅酶A合酶(硫解酶)多肽;(ii)3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶多肽;以及(iii)3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶多肽。在一些方面,MVA途径上游的多肽来自肠球菌属。在一些方面,MVA途径上游的多肽来自粪肠球菌。在一些方面,MVA途径下游的多肽选自:(i)甲羟戊酸激酶(MVK);(ii)磷酸甲羟戊酸激酶(PMK);(iii)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD);以及(iv)异戊烯基二磷酸异构酶(IDI)。在一些方面,MVA途径下游的多肽是MVK多肽。在一些方面,所述MVK多肽来自甲烷八叠球菌属。在一些方面,所述MVK多肽来自马氏甲烷八叠球菌。
在一些方面,使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝是染色体拷贝(如,整合到大肠杆菌染色体中)。在一些方面,大肠杆菌细胞在培养物中。在一些方面,所述细菌细胞属于大肠杆菌菌株B。在一些方面,所述细菌菌株属于大肠杆菌菌株BL21。在一些方面,所述细菌细胞属于大肠杆菌菌株BL21(DE3)。
示例性细胞培养基
如本文所用,术语“基本培养基”是指包含对细胞可能生长的最少营养物质的生长培养基,其通常(但并非总是)不存在一种或多种氨基酸(如,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种氨基酸)。基本培养基通常包含:(1)用于细菌生长的碳源;(2)各种盐,其可根据细菌种类和生长条件而变化;以及(3)水。碳源可能有很大的差异,从简单的糖类(诸如葡萄糖)到其他生物质(诸如酵母提取物)的较为复杂的水解产物均可,如下文更为详细的讨论。盐通常提供必需元素,例如镁、氮、磷和硫,以使得细胞可合成蛋白质和核酸。基本培养基还可补充以诸如抗生素等选择性试剂,用于有选择地维持某些质粒等。例如,如果微生物对某种抗生素(例如氨苄青霉素或四环素)具有抗性,则可将该抗生素加入培养基以避免细胞在生长过程中缺乏抗性。如选择期望的生理或生化特性所必需的,培养基可补充以其他化合物,例如特定的氨基酸等。
可使用任何基本培养基配方来培养宿主细胞。示例性的基本培养基配方包括(例如)M9基本培养基和TM3基本培养基。每升的M9基本培养基包含:(1)200ml无菌M9盐(每升有64g Na2HPO4-7H2O、15g KH2PO4、2.5g NaCl和5.0g NH4Cl);(2)2ml的1M MgSO4(无菌);(3)20ml的20%(w/v)葡萄糖(或其他碳源);以及(4)100μl的1M CaCl2(无菌)。每升的TM3基本培养基包含:(1)13.6g K2HPO4;(2)13.6g KH2PO4;(3)2gMgSO4*7H2O;(4)2g一水柠檬酸;(5)0.3g柠檬酸铁铵;(6)3.2g(NH4)2SO4;(7)0.2g酵母提取物;以及(8)1ml的1000×痕量元素溶液;将pH调节到约6.8,随后将溶液过滤灭菌。每1000升中微量元素包含:(1)40g一水柠檬酸;(2)30g MnSO4*H2O;(3)10g NaCl;(4)1g FeSO4*7H2O;(4)1g CoCl2*6H2O;(5)1g ZnSO4*7H2O;(6)100mg CuSO4*5H2O;(7)100mg H3BO3;以及(8)100mg NaMoO4*2H2O;将pH调节至约3.0。
任何碳源都可用于培养宿主细胞。术语“碳源”是指能够被宿主细胞或生物体代谢的一种或多种含碳化合物。例如,用于培养宿主细胞的细胞培养基可包含任何适于维持生存能力或使宿主细胞生长的碳源。在一些方面,碳源是碳水化合物(例如单糖、二糖、低聚糖或多糖)、或转化糖(如,通过酶促方法处理的蔗糖糖浆)。
示例性的单糖包括葡萄糖和果糖;示例性的低聚糖包括乳糖和蔗糖,并且示例性的多糖包括淀粉和纤维素。示例性的碳水化合物包括C6糖(如,果糖、甘露糖、半乳糖、或葡萄糖)和C5糖(如,木糖或阿拉伯糖)。
示例性细胞培养条件
适于本发明的重组细胞的维持和生长的材料和方法在下文(如,在实例部分)中有所描述。适于细菌培养物的维持和生长的其他材料和方法是本领域众所周知的。示例性的技术可在国际专利公开No.WO2009/076676、美国专利申请No.12/335,071(美国专利公开No.2009/0203102)、WO 2010/003007、美国专利公开No.2010/0048964、WO2009/132220、美国专利公开2010/0003716、Manual of Methods for GeneralBacteriology Gerhardt et al.,eds,American Society for Microbiology,Washington,D.C.(1994)(《普通细菌学方法手册》,Gerhardt等人编辑,美国微生物学会出版,华盛顿哥伦比亚特区,1994年)或Brock的Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology,Second Edition(1989)Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,MA(工业微生物学教材《生物技术》,第二版(1989年),由位于马萨诸塞州桑德兰的Sinauer Associates有限公司出版)中找到。在一些方面,所述细胞在容许通过插入宿主细胞的核酸编码的一种或多种异戊二烯合酶、DXS、IDI、DXP途径多肽或MVA途径多肽表达的条件下的培养基中培养。
可使用标准的细胞培养条件来培养细胞(参见例如WO 2004/033646和其中所引用的参考文献)。在一些方面,细胞在适当的温度、气体混合物和pH下(例如在约20℃至约37℃、在约6%至约84%的CO2以及在介于约5至约9的pH下)生长并保持在所述条件下。在一些方面,细胞在适当的细胞培养基中于35℃下生长。在一些方面,发酵的pH范围介于约pH 5.0至约pH 9.0之间(例如,约pH 6.0至约pH 8.0、或约pH 6.5至约7.0)。根据宿主细胞的需求,所述反应可在有氧、缺氧或无氧条件下进行。
可以使用的标准培养条件和发酵方式(诸如分批发酵、分批补料发酵或连续发酵)在国际专利公开No.WO 2009/076676、美国专利申请No.12/335,071(美国专利公开No.2009/0203102)、WO 2010/003007、美国专利公开No.2010/0048964、WO 2009/132220、美国专利公开No.2010/0003716中有所描述。分批发酵和分批补料发酵是常见的,并且为本领域所熟知,其实例可在Brock的Biotechnology:ATextbook of IndustrialMicrobiology,Second Edition(1989)Sinauer Associates,Inc.(工业微生物学教材《生物技术》,第二版(1989年),Sinauer Associates有限公司)中找到。
在一些方面,细胞在葡萄糖受限制的条件下培养。所谓“葡萄糖受限制的条件”,是指加入的葡萄糖的量小于或为约105%(例如约100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、或10%)被细胞消耗的葡萄糖的量。在特定的方面,加入培养基的葡萄糖的量与在特定的时间内细胞所消耗的葡萄糖的量大致相同。在一些方面,通过限制加入的葡萄糖的量来控制细胞生长的速率,使得细胞以能够被细胞培养基中的葡萄糖的量所支持的速率生长。在一些方面,葡萄糖没有在培养细胞的时间内积累。在各种方面,细胞在葡萄糖受限制的条件下培养超过或约1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60或70小时。在各种方面,细胞在葡萄糖受限制的条件下培养超过或约5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、95或100%的细胞培养总时间长度。尽管无意于受任何具体理论的限制,但据信葡萄糖受限制的条件可更有利于对细胞进行管理。
在一些方面,碳源包括酵母提取物或酵母提取物的一种或多种组分。在一些方面,酵母提取物的浓度是0.1%(w/v)、0.09%(w/v)、0.08%(w/v)、0.07%(w/v)、0.06%(w/v)、0.05%(w/v)、0.04%(w/v)、0.03%(w/v)、0.02%(w/v)或0.01%(w/v)酵母提取物。在一些方面,碳源不仅包括酵母提取物(或其一种或多种组分),还包括另外的碳源(诸如葡萄糖)。
在一些方面,大肠杆菌细胞在分批培养物中生长。在一些方面,大肠杆菌细胞在分批补料培养物中生长。在一些方面,大肠杆菌细胞在连续培养物中生长。在一些方面,大肠杆菌细胞被培养在基本培养基中。在一些方面,基本培养基是M9培养基或TM3培养基。在一些方面,基本培养基是M9培养基。在一些方面,基本培养基是TM3培养基。在一些方面,使用1.0%(w/v)或更少的葡萄糖来补充基本培养基。在一些方面,使用1%(w/v)、0.9%(w/v)、0.8%(w/v)、0.7%(w/v)、0.6%(w/v)、0.5%(w/v)、0.4%(w/v)、0.3%(w/v)、0.2%(w/v)或0.1%(w/v)的葡萄糖来补充基本培养基。在某些方面,使用0.1%(w/v)或更少的酵母提取物来补充基本培养基。在一些方面,使用0.1%(w/v)、0.09%(w/v)、0.08%(w/v)、0.07%(w/v)、0.06%(w/v)、0.05%(w/v)、0.04%(w/v)、0.03%(w/v)、0.02%(w/v)、或0.01%(w/v)的酵母提取物来补充基本培养基。在一些方面,使用1%(w/v)或更少的葡萄糖以及0.1%(w/v)或更少来补充基本培养基。在一些方面,使用1%(w/v)、0.9%(w/v)、0.8%(w/v)、0.7%(w/v)、0.6%(w/v)、0.5%(w/v)、0.4%(w/v)、0.3%(w/v)、0.2%(w/v)或0.1%(w/v)的葡萄糖和0.1%(w/v)、0.09%(w/v)、0.08%(w/v)、0.07%(w/v)、0.06%(w/v)、0.05%(w/v)、0.04%(w/v)、0.03%(w/v)、0.02%(w/v)或0.01%(w/v)的酵母提取物来补充基本培养基。在一些方面,编码PGL多肽的异源基因来自大肠杆菌菌株K12MG1655。在一些方面,编码PGL多肽的异源基因来自大肠杆菌菌株K12MG1655的衍生物。在一些方面,编码PGL多肽的异源基因来自假单胞菌属。在一些方面,所述假单胞菌为铜绿假单胞菌。
本发明涵盖能够产生异戊二烯的大肠杆菌菌株的重组细胞,所述细胞包含:(a)编码PGL多肽的异源核酸的一个或多个拷贝,其中所述核酸整合在大肠杆菌染色体中;以及(b)编码异戊二烯合酶的一种或多种异源核酸;其中在整合之前,大肠杆菌细胞不包含编码PGL多肽的核酸,并且其中所得的重组细胞产生的异戊二烯的滴度大于不包含(a)和(b)的相同细胞的该滴度。
在一些方面,宿主细胞是不编码6-磷酸葡萄糖酸内酯酶(PGL)多肽的大肠杆菌菌株的细菌细胞,该细胞还包含使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝和编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸。在一些方面,宿主细胞是不编码6-磷酸葡萄糖酸内酯酶(PGL)多肽、由半乳糖代谢基因转录的多肽(例如,galM、galK、galT和galE)或由钼酸盐转运基因转录的多肽(例如,modF、modE、modA、modB和modC)的大肠杆菌菌株的细菌细胞,该细胞还包含使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝、编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸、编码一种或多种半乳糖代谢多肽的一个或多个拷贝的异源核酸,以及编码一种或多种钼酸盐转运子多肽的一个或多个拷贝的异源核酸。在一些方面,使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝是染色体拷贝(如,整合到大肠杆菌染色体中)。在一些方面,编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝、编码一种或多种半乳糖代谢多肽的异源基因的一个或多个拷贝、和/或编码一种或多种钼酸盐转运多肽的异源基因的一个或多个拷贝是染色体拷贝(如,整合到大肠杆菌染色体中)。
在一些方面,所述细菌细胞属于大肠杆菌菌株B。在一些方面,所述细菌菌株属于大肠杆菌菌株BL21。在一些方面,所述细菌细胞属于大肠杆菌菌株BL21(DE3)。在一些方面,使用0.1%(w/v)或更少的酵母提取物来补充所述基本培养基。在一些方面,使用1.0%(w/v)或更少的葡萄糖来补充基本培养基。在一些方面,使用1%(w/v)、0.9%(w/v)、0.8%(w/v)、0.7%(w/v)、0.6%(w/v)、0.5%(w/v)、0.4%(w/v)、0.3%(w/v)、0.2%(w/v)或0.1%(w/v)的葡萄糖来补充基本培养基。在某些方面,使用0.1%(w/v)或更少的酵母提取物来补充基本培养基。在一些方面,使用0.1%(w/v)、0.09%(w/v)、0.08%(w/v)、0.07%(w/v)、0.06%(w/v)、0.05%(w/v)、0.04%(w/v)、0.03%(w/v)、0.02%(w/v)、或0.01%(w/v)的酵母提取物来补充基本培养基。在一些方面,使用1%(w/v)或更少的葡萄糖以及0.1%(w/v)或更少来补充基本培养基。在一些方面,使用1%(w/v)、0.9%(w/v)、0.8%(w/v)、0.7%(w/v)、0.6%(w/v)、0.5%(w/v)、0.4%(w/v)、0.3%(w/v)、0.2%(w/v)或0.1%(w/v)的葡萄糖和0.1%(w/v)、0.09%(w/v)、0.08%(w/v)、0.07%(w/v)、0.06%(w/v)、0.05%(w/v)、0.04%(w/v)、0.03%(w/v)、0.02%(w/v)或0.01%(w/v)的酵母提取物来补充基本培养基。在一些方面,基本培养基是M9培养基或TM3培养基。在一些方面,基本培养基是M9培养基。在一些方面,基本培养基是TM3培养基。在一些方面,基本培养基是M9培养基。在一些方面,基本培养基是TM3培养基。在一些方面,编码PGL多肽的异源基因来自大肠杆菌菌株K12MG1655。在一些方面,编码PGL多肽的异源基因来自大肠杆菌菌株K12MG1655的衍生物。在一些方面,编码PGL多肽的异源基因来自假单胞菌属。在一些方面,所述假单胞菌为铜绿假单胞菌。
在一些方面,该细胞还包含MVA途径多肽。在一些方面,MVA途径多肽是MVA途径上游的多肽。在一些方面,MVA途径多肽是MVA途径下游的多肽。在一些方面,MVA途径上游的多肽选自:(i)乙酰乙酰基辅酶A合酶(硫解酶)多肽;(ii)3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶多肽;以及(iii)3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶多肽。在一些方面,MVA途径上游的多肽来自肠球菌属。在一些方面,MVA途径上游的多肽来自粪肠球菌。在一些方面,MVA途径下游的多肽选自:(i)甲羟戊酸激酶(MVK);(ii)磷酸甲羟戊酸激酶(PMK);(iii)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD);以及(iv)异戊烯基二磷酸异构酶(IDI)。在一些方面,MVA途径下游的多肽是MVK多肽。在一些方面,所述MVK多肽来自甲烷八叠球菌属。在一些方面,所述MVK多肽来自马氏甲烷八叠球菌。
当将本文所述的重组细菌细胞培养在基本培养基中时,所述细胞产生异戊二烯的比产率大于缺乏使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝的相同细胞的该比产率。在一些情况下,编码PGL多肽的异源基因是整合到宿主细胞的染色体内的编码PGL多肽的异源核酸。在一些方面,当将所述细菌细胞培养在基本培养基中时,所述细胞产生异戊二烯的比产率大于缺乏使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝、编码一种或多种半乳糖代谢多肽的异源基因的一个或多个拷贝、和/或编码一种或多种钼酸盐转运多肽的异源基因的一个或多个拷贝的相同细胞的该比产率。
在一些方面,所述大肠杆菌细胞具有大于约5、6、7、8、9、10、11、12、13或14mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,所述大肠杆菌细胞具有大于约15mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,所述大肠杆菌细胞具有大于约16mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,所述大肠杆菌细胞具有大于约17mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,所述大肠杆菌细胞具有大于约18mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,所述大肠杆菌细胞具有大于约19mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,所述大肠杆菌细胞具有大于约20mg/L肉汤/h的异戊二烯比产率。在一些方面,所述大肠杆菌细胞具有大于约21mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,所述大肠杆菌细胞具有大于约22mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,所述大肠杆菌细胞具有大于约23mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,所述大肠杆菌细胞具有大于约24mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,所述大肠杆菌细胞具有大于约25mg/OD/h的异戊二烯比产率。
在其他方面,所述大肠杆菌细胞具有约25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、或5mg/OD/h的异戊二烯比产率的上限。在其他方面,所述大肠杆菌细胞具有约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25mg/OD/h的异戊二烯比产率的下限。
在一些方面,编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸可操作地连接至启动子,并且细胞具有大于约15mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸可操作地连接至启动子,并且细胞具有大于约16mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸可操作地连接至启动子,并且细胞具有大于约17mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸可操作地连接至启动子,并且细胞具有大于约18mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸可操作地连接至启动子,并且细胞具有大于约19mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸可操作地连接至启动子,并且细胞具有大于约20mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸可操作地连接至启动子,并且细胞具有大于约21mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸可操作地连接至启动子,并且细胞具有大于约22mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸可操作地连接至启动子,并且细胞具有大于约23mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸可操作地连接至启动子,并且细胞具有大于约24mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸可操作地连接至启动子,并且细胞具有大于约25mg/OD/h的异戊二烯比产率。
在一些方面,所述大肠杆菌细胞还包含编码IDI多肽的异源核酸。在一些方面,所述大肠杆菌细胞还包含编码IDI多肽的内源核酸的染色体拷贝。在一些方面,所述大肠杆菌细胞还包含编码DXS多肽或其他DXP途径多肽的异源核酸。在一些方面,所述大肠杆菌细胞还包含编码DXS多肽或其他DXP途径多肽的内源核酸的染色体拷贝。在一些方面,所述大肠杆菌细胞还包含编码IDI多肽和DXS多肽或其他DXP途径多肽的一种或多种核酸。在一些方面,一种核酸编码异戊二烯合酶多肽、IDI多肽,以及DXS多肽或其他DXP途径多肽。在一些方面,一种质粒编码异戊二烯合酶多肽、IDI多肽,以及DXS多肽或其他DXP途径多肽。在一些方面,多种质粒编码异戊二烯合酶多肽、IDI多肽,以及DXS多肽或其他DXP途径多肽。
在一些方面,所述大肠杆菌细胞还包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸。在一些情况下,异戊二烯合酶多肽可以是内源异戊二烯合酶的一个或多个拷贝。在一些方面,所述异戊二烯合酶多肽是植物异戊二烯合酶多肽。在一些方面,所述异戊二烯合酶多肽是来自葛属的天然存在的多肽。在一些方面,所述异戊二烯合酶多肽是来自山葛的天然存在的多肽。在一些方面,所述异戊二烯合酶多肽是来自杨属的天然存在的多肽。在一些方面,所述异戊二烯合酶多肽是来自银白杨的天然存在的多肽。可用于实践本发明的其他异戊二烯合酶多肽或异戊二烯合酶变体包括但不限于如在WO 2009/132220或WO 2010/124146中所述的异戊二烯合酶、其变体和/或异戊二烯合酶突变体(所述专利的内容全文以引用方式并入,特别是与异戊二烯合酶、其变体和/或异戊二烯合酶突变体相关的内容)。
增大异戊二烯产量的方法
生物反应器中的遗传工程细胞培养物更有效地产生异戊二烯,所述异戊二烯的量更大、纯度更高和/或具有独特的杂质分布,由可再生资源产生商业用途量的异戊二烯的方法在例如国际专利申请公开No.WO2009/076676A2、美国专利申请公开No.US2009/0203102A1、US2010/0003716A1、US2010/0048964A1、US2010/0086978A1、US2010/0167370A1、US2010/0113846A1、US2010/0184178A1、US2010/0167371A1、US2010/0196977A1、US2010/0196977A1、以及美国临时专利申请No.61/187,930、61/187,941和61/187,959中进行描述和例证。
本文还提供用于产生异戊二烯的改良方法。在一些方面,产生异戊二烯的改良方法包括:(a)培养能够产生异戊二烯的包含大肠杆菌菌株的重组细胞或其子代的组合物,所述细胞包含:(i)编码PGL多肽的异源核酸的一个或多个拷贝,其中所述核酸整合在大肠杆菌染色体中;以及(ii)编码异戊二烯合酶的一种或多种异源核酸;其中在所述整合之前,所述大肠杆菌细胞不包含编码PGL多肽的核酸,并且其中所得的重组细胞产生的异戊二烯的滴度大于不包含(i)和(ii)的相同细胞的该滴度,以及(b)产生异戊二烯。在一些方面,产生异戊二烯的改良方法包括以下步骤:(a)在基本培养基中培养不编码6-磷酸葡萄糖酸内酯酶(PGL)多肽的大肠杆菌菌株的细菌细胞,其中所述大肠杆菌细胞包含使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝和编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸;以及(b)产生异戊二烯,其中将所述大肠杆菌细胞培养在基本培养基中时,所述细胞具有的异戊二烯比产率大于缺乏使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝的相同细胞的该比产率。在一些方面,使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝是染色体拷贝(如,整合到大肠杆菌染色体中)。在一些方面,产生异戊二烯的改良方法还包括回收异戊二烯的步骤。
在一些方面,产生异戊二烯的改良方法包括在适于产生异戊二烯的条件下培养本文所述的重组细胞以及使所述重组细胞产生异戊二烯的步骤。在一些方面,产生异戊二烯的改良方法还包括回收异戊二烯的步骤。
不受理论的约束,具有编码PGL多肽的染色体整合的异源核酸的重组细胞产生的异戊二烯的滴度和比产率高于异源PGL核酸位于质粒上的细胞的该滴度和比产率。出人意料地,包含染色体整合的PGL多肽的一个或多个拷贝、以及任选地具有通过染色体整合的半乳糖代谢基因(例如,galM、galK、galT和galE)编码的一种或多种多肽的一个或多个拷贝、和/或通过染色体整合的钼转运基因(例如,modF、modE、modA、modB和modC)编码的一种或多种多肽的一个或多个拷贝的重组细胞传达了可观的细胞生长收益:相比质粒上包含异源PGL核酸的细胞,其产生滴度更高的异戊二烯、和/或比产量更高的异戊二烯。
因此,在一个方面,产生异戊二烯的改良方法包括以下步骤:(a)培养不编码6-磷酸葡萄糖酸内酯酶(PGL)多肽、通过用于半乳糖代谢的基因(例如,galM、galK、galT和galE)编码的一种或多种多肽和/或通过用于钼转运的基因(例如,modF、modE、modA、modB和modC)编码的一种或多种多肽的大肠杆菌菌株的细菌细胞,其中所述大肠杆菌细胞包含使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的染色体整合的异源基因的一个或多个拷贝、编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸、编码一种或多种半乳糖代谢多肽和/或一种或多种钼转运多肽的染色体整合的异源核酸的一个或多个拷贝;以及(b)产生异戊二烯,其中所述大肠杆菌细胞较之其中编码PGL的异源基因位于质粒上的相同细胞,具有更高的比生长速率、异戊二烯比产率、和/或产生的异戊二烯的滴度。
在一些方面,该细胞还包含MVA途径多肽。在这种情况下,本发明还设想了制备甲羟戊酸的组合物和方法。使用染色体整合的PGL宿主细胞体系来产生甲羟戊酸的方法可任选地包括回收甲羟戊酸。在一些方面,MVA途径多肽是MVA途径上游的多肽。在一些方面,MVA途径多肽是MVA途径下游的多肽。
在一些方面,MVA途径上游的多肽选自:(i)乙酰乙酰基辅酶A合酶(硫解酶)多肽;(ii)3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶多肽;以及(iii)3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶多肽。在一些方面,MVA途径上游的多肽是乙酰乙酰基辅酶A合酶(硫解酶)。在一些方面,MVA途径上游的多肽是3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶多肽。在一些方面,MVA途径上游的多肽是3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶。在一些方面,MVA途径上游的多肽来自细菌。在一些方面,细菌来自肠球菌属。在一些方面,细菌来自粪肠球菌。
在一些方面,MVA途径下游的多肽选自:(i)甲羟戊酸激酶(MVK);(ii)磷酸甲羟戊酸激酶(PMK);(iii)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD);以及(iv)异戊烯基二磷酸异构酶(IDI)。在一些方面,MVA途径下游的多肽是MVK。在一些方面,所述MVK来自甲烷八叠球菌属。在一些方面,所述甲烷八叠球菌是马氏甲烷八叠球菌。在一些方面,MVA途径下游的多肽是PMK、MVD或IDI。在一些方面,PMK、MVD或IDI来自酵母属(Saccharomyces)。在一些方面,所述酵母是酿酒酵母。在一些方面,MVA途径下游的多肽是PMK。在一些方面,PMK来自酵母属。在一些方面,所述酵母是酿酒酵母。在一些方面,MVA途径下游的多肽是MVD。
在一些方面,MVD来自酵母属。在一些方面,所述酵母是酿酒酵母。在一些方面,MVA途径下游的多肽是IDI。在一些方面,MVA途径下游的多肽来自酵母属。在一些方面,所述酵母是酿酒酵母。
在一些方面,异戊二烯合酶多肽来自植物。在一些方面,该植物是野葛(kudzu)。在一些方面,该植物是杨树(poplar)(银白杨x欧洲山杨(tremula)CAC35696)。在一些方面,该植物是白杨(aspen)(美洲山杨(Populus tremuloides))。在一些方面,该植物是英国橡树(欧洲栎(Quercus robur))。在一个方面,该植物是银白杨。可用于实践本发明的其他异戊二烯合酶多肽或异戊二烯合酶变体包括但不限于如在WO2009/132220或WO 2010/124146中所述的异戊二烯合酶、其变体和/或异戊二烯合酶突变体(所述专利的内容全文以引用方式并入,特别是与异戊二烯合酶、其变体和/或异戊二烯合酶突变体相关的内容)。
在一些方面,大肠杆菌细胞还包含编码IDI多肽的异源核酸。在一些方面,大肠杆菌细胞还包含编码IDI多肽的内源核酸的一个或多个拷贝。在一些方面,所述大肠杆菌细胞还包含编码IDI多肽的内源核酸的染色体拷贝。在一些方面,所述大肠杆菌细胞还包含编码DXS多肽或其他DXP途径多肽的异源核酸。在一些方面,所述大肠杆菌细胞还包含编码DXS多肽或其他DXP途径多肽的内源核酸的染色体拷贝。在一些方面,所述大肠杆菌细胞还包含编码IDI多肽和DXS多肽或其他DXP途径多肽的一种或多种核酸。在一些方面,一种核酸编码所述异戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽。在一些方面,一种质粒编码异戊二烯合酶多肽、IDI多肽,以及DXS多肽或其他DXP途径多肽。在一些方面,多种质粒编码异戊二烯合酶多肽、IDI多肽,以及DXS多肽或其他DXP途径多肽。
在一些方面,编码PGL多肽的异源基因来自大肠杆菌菌株K12MG1655。在一些方面,编码PGL多肽的异源基因来自大肠杆菌菌株K12MG1655的衍生物。在一些方面,具有PGL活性的大肠杆菌K12菌株MG1655多肽为序列标识号11。在一些方面,具有PGL活性的大肠杆菌K12菌株MG1655多肽与序列标识号11相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个氨基酸取代。在一些方面,所述氨基酸取代是保守性的。在一些方面,所述氨基酸取代是非保守性的。在一些方面,具有PGL活性的大肠杆菌K12菌株MG1655多肽与序列标识号11相比具有99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%或85%的氨基酸序列同一性。
在一些方面,编码PGL多肽的异源基因来自假单胞菌属。在一些方面,所述假单胞菌为铜绿假单胞菌。在一些方面,具有PGL活性的铜绿假单胞菌多肽为序列标识号12。在一些方面,具有PGL活性的铜绿假单胞菌多肽与序列标识号12相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个氨基酸取代。在一些方面,所述氨基酸取代是保守性的。在一些方面,所述氨基酸取代是非保守性的。在一些方面,具有PGL活性的大肠杆菌K12菌株MG1655多肽与序列标识号12相比具有99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%或85%的氨基酸序列同一性。
在一些方面,编码PGL多肽的异源基因来自酵母属。在一些方面,所述酵母是酿酒酵母。在一些方面,具有PGL活性的酿酒酵母多肽为序列标识号13。在一些方面,具有PGL活性的酿酒酵母多肽与序列标识号13相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个氨基酸取代。在一些方面,所述氨基酸取代是保守性的。在一些方面,所述氨基酸取代是非保守性的。在一些方面,具有PGL活性的大肠杆菌K12菌株MG1655多肽与序列标识号13相比具有99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%或85%的氨基酸序列同一性。
在一些方面,不编码PGL多肽的大肠杆菌菌株的细菌细胞属于大肠杆菌菌株B。在一些方面,所述细菌细胞属于大肠杆菌菌株BL21。在一些方面,所述细菌细胞属于大肠杆菌菌株BL21(DE3)。
在一些方面,大肠杆菌细胞被培养在基本培养基中。在一些方面,大肠杆菌菌株B的大肠杆菌细胞被培养在基本培养基中。在一些方面,大肠杆菌菌株BL21的大肠杆菌细胞被培养在基本培养基中。在一些方面,大肠杆菌菌株BL21(DE3)的大肠杆菌细胞被培养在基本培养基中。在一些方面,使用1%(w/v)或更少的葡萄糖来补充所述基本培养基。在一些方面,使用1%(w/v)、0.9%(w/v)、0.8%(w/v)、0.7%(w/v)、0.6%(w/v)、0.5%(w/v)、0.4%(w/v)、0.3%(w/v)、0.2%(w/v)或0.1%(w/v)的葡萄糖来补充基本培养基。在某些方面,使用0.1%(w/v)或更少的酵母提取物来补充基本培养基。在一些方面,使用0.1%(w/v)、0.09%(w/v)、0.08%(w/v)、0.07%(w/v)、0.06%(w/v)、0.05%(w/v)、0.04%(w/v)、0.03%(w/v)、0.02%(w/v)、或0.01%(w/v)的酵母提取物来补充基本培养基。在一些方面,使用1%(w/v)或更少的葡萄糖以及0.1%(w/v)或更少来补充基本培养基。在一些方面,使用1%(w/v)、0.9%(w/v)、0.8%(w/v)、0.7%(w/v)、0.6%(w/v)、0.5%(w/v)、0.4%(w/v)、0.3%(w/v)、0.2%(w/v)或0.1%(w/v)的葡萄糖和0.1%(w/v)、0.09%(w/v)、0.08%(w/v)、0.07%(w/v)、0.06%(w/v)、0.05%(w/v)、0.04%(w/v)、0.03%(w/v)、0.02%(w/v)或0.01%(w/v)的酵母提取物来补充基本培养基。在一些方面,基本培养基是M9培养基或TM3培养基。在一些方面,基本培养基是M9培养基。在一些方面,基本培养基是TM3培养基。
在一些方面,所述大肠杆菌细胞具有大于约15mg/L肉汤/h的异戊二烯比产率。在一些方面,所述大肠杆菌细胞具有大于约16mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,所述大肠杆菌细胞具有大于约17mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,所述大肠杆菌细胞具有大于约18mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,所述大肠杆菌细胞具有大于约19mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,所述大肠杆菌细胞具有大于约20mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,所述大肠杆菌细胞具有大于约21mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,所述大肠杆菌细胞具有大于约22mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,所述大肠杆菌细胞具有大于约23mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,所述大肠杆菌细胞具有大于约24mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,所述大肠杆菌细胞具有大于约25mg/OD/h的异戊二烯比产率。
在一些方面,编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸可操作地连接至启动子,并且大肠杆菌细胞具有大于约15mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸可操作地连接至启动子,并且大肠杆菌细胞具有大于约16mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸可操作地连接至启动子,并且大肠杆菌细胞具有大于约17mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸可操作地连接至启动子,并且大肠杆菌细胞具有大于约18mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸可操作地连接至启动子,并且大肠杆菌细胞具有大于约19mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸可操作地连接至启动子,并且大肠杆菌细胞具有大于约20mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸可操作地连接至启动子,并且大肠杆菌细胞具有大于约21mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸可操作地连接至启动子,并且大肠杆菌细胞具有大于约22mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸可操作地连接至启动子,并且大肠杆菌细胞具有大于约23mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸可操作地连接至启动子,并且大肠杆菌细胞具有大于约24mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸可操作地连接至启动子,并且大肠杆菌细胞具有大于约25mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸可操作地连接至启动子,并且大肠杆菌细胞具有大于约25mg/OD/h至约100mg/OD/h的异戊二烯比产率。在一些方面,编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸可操作地连接至启动子,并且大肠杆菌细胞具有大于约15mg/OD/h至约100mg/OD/h的异戊二烯比产率。
本发明还提供已被工程化以产生异戊二烯的具有PGL整合的重组大肠杆菌细胞,由于它们具有提高的综合适应度,故也具有较佳的生长。本领域的技术人员可以认识到,生长速率增大可导致异戊二烯产量提高,例如更高的比活性、在一段时间内产生更多的异戊二烯、或更高的异戊二烯滴度。在一个方面,已被工程化以产生异戊二烯的具有PGL整合的重组大肠杆菌细胞同不具有PGL整合和/或如本文所述修复的17,257碱基对片段(参见例如图20)的那些细胞相比具有至少10%增加的生长。在其他方面,已被工程化以产生异戊二烯的具有PGL整合的重组大肠杆菌细胞同不具有PGL整合和/或如本文所述修复的17,257碱基对片段的那些细胞相比具有至少约11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%或25%的生长。
增大能够具有生物活性的其他异源多肽产量的方法
本文还提供用于产生能够具有生物活性的其他异源多肽或其他产物的改良方法。产物的一个非限制性例子是甲羟戊酸。本领域的技术人员可通过以下步骤制备甲羟戊酸:(a)培养能够产生异戊二烯的包含大肠杆菌菌株的重组细胞或其子代的组合物,所述细胞包含:(i)编码PGL多肽的异源核酸的一个或多个拷贝,其中所述核酸整合在大肠杆菌染色体中;(ii)编码异戊二烯合酶的一种或多种异源核酸;以及(iii)(c)编码甲羟戊酸(MVA)途径上游的多肽和/或MVA途径下游的多肽的异源核酸;其中在所述整合之前,所述大肠杆菌细胞不包含编码PGL多肽的核酸,并且其中所得的重组细胞在适于产生甲羟戊酸的培养条件下产生的异戊二烯的滴度大于不包含(i)和(ii)的相同细胞的该滴度,以及(b)产生甲羟戊酸。
在一些方面,产生能具有生物活性的异源多肽的改良方法包括以下步骤:(a)培养不编码6-磷酸葡萄糖酸内酯酶(PGL)多肽的大肠杆菌菌株的细胞,该细胞还包含使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝和编码能具有生物活性的异源多肽的核酸;以及(b)产生异源多肽,其中当将所述大肠杆菌细胞培养在基本培养基中时,所述细胞产生异源多肽的比产率大于缺乏使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝的相同细胞的该比产率。在一些方面,使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝是染色体拷贝(如,整合到大肠杆菌染色体中)。在一些方面,大肠杆菌细胞在培养物中。在一些方面,产生能够具有生物活性的异源多肽的改良方法还包括回收多肽的步骤。
在一些方面,不编码PGL多肽的大肠杆菌菌株的细菌细胞属于大肠杆菌菌株B。在一些方面,所述细菌细胞属于大肠杆菌菌株BL21。在一些方面,所述细菌细胞属于大肠杆菌菌株BL21(DE3)。
在一些方面,编码PGL多肽的异源基因来自大肠杆菌菌株K12MG1655。在一些方面,编码PGL多肽的异源基因来自大肠杆菌菌株K12MG1655的衍生物。在一些方面,具有PGL活性的大肠杆菌K12菌株MG1655多肽为序列标识号11。在一些方面,具有PGL活性的大肠杆菌K12菌株MG1655多肽与序列标识号11相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个氨基酸取代。在一些方面,所述氨基酸取代是保守性的。在一些方面,所述氨基酸取代是非保守性的。在一些方面,具有PGL活性的大肠杆菌K12菌株MG1655多肽与序列标识号11相比具有99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%或85%的氨基酸序列同一性。
在一些方面,编码PGL多肽的异源基因来自假单胞菌属。在一些方面,所述假单胞菌为铜绿假单胞菌。在一些方面,具有PGL活性的铜绿假单胞菌多肽为序列标识号12。在一些方面,具有PGL活性的铜绿假单胞菌多肽与序列标识号12相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个氨基酸取代。在一些方面,所述氨基酸取代是保守性的。在一些方面,所述氨基酸取代是非保守性的。在一些方面,具有PGL活性的铜绿假单胞菌多肽与序列标识号12相比具有99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%或85%的氨基酸序列同一性。
在一些方面,编码PGL多肽的异源基因来自酵母属。在一些方面,所述酵母是酿酒酵母。在一些方面,具有PGL活性的酿酒酵母多肽为序列标识号13。在一些方面,具有PGL活性的酿酒酵母多肽与序列标识号13相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个氨基酸取代。在一些方面,所述氨基酸取代是保守性的。在一些方面,所述氨基酸取代是非保守性的。在一些方面,具有PGL活性的大肠杆菌K12菌株MG1655多肽与序列标识号13相比具有99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%或85%的氨基酸序列同一性。
在一些方面,不编码6-磷酸葡萄糖酸内酯酶(PGL)多肽的大肠杆菌菌株的细菌细胞被培养在基本培养基中。在一些方面,大肠杆菌菌株B的细菌细胞被培养在基本培养基中。在一些方面,大肠杆菌菌株BL21的细菌细胞被培养在基本培养基中。在一些方面,大肠杆菌菌株BL21(DE3)的细菌细胞被培养在基本培养基中。在一些方面,使用1%(w/v)或更少的葡萄糖来补充所述基本培养基。在一些方面,使用1%(w/v)、0.9%(w/v)、0.8%(w/v)、0.7%(w/v)、0.6%(w/v)、0.5%(w/v)、0.4%(w/v)、0.3%(w/v)、0.2%(w/v)或0.1%(w/v)的葡萄糖来补充基本培养基。在某些方面,使用0.1%(w/v)或更少的酵母提取物来补充基本培养基。在一些方面,使用0.1%(w/v)、0.09%(w/v)、0.08%(w/v)、0.07%(w/v)、0.06%(w/v)、0.05%(w/v)、0.04%(w/v)、0.03%(w/v)、0.02%(w/v)、或0.01%(w/v)的酵母提取物来补充基本培养基。在一些方面,使用1%(w/v)或更少的葡萄糖以及0.1%(w/v)或更少来补充基本培养基。在一些方面,使用1%(w/v)、0.9%(w/v)、0.8%(w/v)、0.7%(w/v)、0.6%(w/v)、0.5%(w/v)、0.4%(w/v)、0.3%(w/v)、0.2%(w/v)或0.1%(w/v)的葡萄糖和0.1%(w/v)、0.09%(w/v)、0.08%(w/v)、0.07%(w/v)、0.06%(w/v)、0.05%(w/v)、0.04%(w/v)、0.03%(w/v)、0.02%(w/v)或0.01%(w/v)的酵母提取物来补充基本培养基。在一些方面,基本培养基是M9培养基或TM3培养基。在一些方面,基本培养基是M9培养基。在一些方面,基本培养基是TM3培养基。
本文还提供产生能够具有生物活性的其他异源多肽的改良方法。在一些方面,产生能具有生物活性的异源多肽的改良方法包括以下步骤:(a)培养不编码6-磷酸葡萄糖酸内酯酶(PGL)多肽、编码一种或多种半乳糖代谢多肽的基因(例如,galM、galK、galT和galE)和/或编码一种或多种钼转运子多肽的基因(例如,modF、modE、modA、modB和modC)的大肠杆菌菌株的细胞,该细胞还包含使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝和编码能够具有生物活性的异源多肽的核酸、编码一种或多种半乳糖代谢多肽的异源基因的一个或多个拷贝、和/或编码一种或多种钼转运多肽的异源基因的一个或多个拷贝;以及(b)产生异源多肽,其中当将所述大肠杆菌细胞培养在基本培养基中时,所述细胞具有的异源多肽比产率大于缺乏使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝、编码一种或多种半乳糖代谢多肽的异源基因的一个或多个拷贝、和/或编码一种或多种钼转运多肽的异源基因的一个或多个拷贝的相同细胞的该比产率。在一些方面,使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝、编码一种或多种半乳糖代谢多肽的异源基因的一个或多个拷贝、和/或编码一种或多种钼转运子多肽的异源基因的一个或多个拷贝是染色体拷贝(如,整合到大肠杆菌染色体中)。在一些方面,大肠杆菌细胞在培养物中。在一些方面,产生能够具有生物活性的异源多肽的改良方法还包括回收多肽的步骤。
在一些方面,不编码PGL多肽、一种或多种半乳糖代谢基因、和/或一种或多种钼转运基因的大肠杆菌菌株的细菌细胞属于大肠杆菌菌株B。在一些方面,所述细菌细胞属于大肠杆菌菌株BL21。在一些方面,所述细菌细胞属于大肠杆菌菌株BL21(DE3)。
在一些方面,编码PGL多肽、一种或多种半乳糖代谢基因、和/或一种或多种钼转运基因的异源基因来自大肠杆菌菌株K12MG1655。在一些方面,编码PGL多肽、一种或多种半乳糖代谢基因、和/或一种或多种钼转运基因的异源基因来自大肠杆菌菌株K12MG1655的衍生物。在一些方面,具有PGL活性、半乳糖代谢活性、和/或钼转运活性的大肠杆菌K12菌株MG1655多肽与天然的大肠杆菌K12菌株MG1655多肽相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个氨基酸取代。在一些方面,所述氨基酸取代是保守性的。在一些方面,所述氨基酸取代是非保守性的。在一些方面,具有PGL活性、半乳糖代谢活性、和/或钼转运活性的大肠杆菌K12菌株MG1655多肽与天然的大肠杆菌K12菌株MG1655多肽相比具有99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%或85%的氨基酸序列同一性。
在一些方面,编码PGL多肽、一种或多种半乳糖代谢多肽、和/或一种或多种钼转运多肽的异源基因来自假单胞菌属。在一些方面,所述假单胞菌为铜绿假单胞菌。在一些方面,具有PGL活性、半乳糖代谢活性、和/或钼转运活性的铜绿假单胞菌多肽与天然的铜绿假单胞菌多肽相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个氨基酸取代。在一些方面,所述氨基酸取代是保守性的。在一些方面,所述氨基酸取代是非保守性的。在一些方面,具有PGL活性、半乳糖代谢活性、和/或钼转运活性的铜绿假单胞菌多肽与天然的铜绿假单胞菌多肽相比具有99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%或85%的氨基酸序列同一性。
在一些方面,编码PGL多肽、一种或多种半乳糖代谢多肽、和/或一种或多种钼转运多肽的异源基因来自酵母属。在一些方面,所述酵母是酿酒酵母。在一些方面,具有PGL活性、半乳糖代谢活性、和/或钼转运活性的酿酒酵母多肽与天然的酿酒酵母相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个氨基酸取代。在一些方面,所述氨基酸取代是保守性的。在一些方面,所述氨基酸取代是非保守性的。在一些方面,具有PGL活性的酿酒酵母多肽与天然的酿酒酵母多肽相比具有99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%或85%的氨基酸序列同一性。
在一些方面,不编码6-磷酸葡萄糖酸内酯酶(PGL)多肽、一种或多种半乳糖代谢多肽、和/或一种或多种钼转运多肽的大肠杆菌菌株的细菌细胞被培养在基本培养基中。在一些方面,大肠杆菌菌株B的细菌细胞被培养在基本培养基中。在一些方面,大肠杆菌菌株BL21的细菌细胞被培养在基本培养基中。在一些方面,大肠杆菌菌株BL21(DE3)的细菌细胞被培养在基本培养基中。在一些方面,使用1%(w/v)或更少的葡萄糖来补充所述基本培养基。在一些方面,使用1%(w/v)、0.9%(w/v)、0.8%(w/v)、0.7%(w/v)、0.6%(w/v)、0.5%(w/v)、0.4%(w/v)、0.3%(w/v)、0.2%(w/v)或0.1%(w/v)的葡萄糖来补充基本培养基。在某些方面,使用0.1%(w/v)或更少的酵母提取物来补充基本培养基。在一些方面,使用0.1%(w/v)、0.09%(w/v)、0.08%(w/v)、0.07%(w/v)、0.06%(w/v)、0.05%(w/v)、0.04%(w/v)、0.03%(w/v)、0.02%(w/v)、或0.01%(w/v)的酵母提取物来补充基本培养基。在一些方面,使用1%(w/v)或更少的葡萄糖以及0.1%(w/v)或更少来补充基本培养基。在一些方面,使用1%(w/v)、0.9%(w/v)、0.8%(w/v)、0.7%(w/v)、0.6%(w/v)、0.5%(w/v)、0.4%(w/v)、0.3%(w/v)、0.2%(w/v)或0.1%(w/v)的葡萄糖和0.1%(w/v)、0.09%(w/v)、0.08%(w/v)、0.07%(w/v)、0.06%(w/v)、0.05%(w/v)、0.04%(w/v)、0.03%(w/v)、0.02%(w/v)或0.01%(w/v)的酵母提取物来补充基本培养基。在一些方面,基本培养基是M9培养基或TM3培养基。在一些方面,基本培养基是M9培养基。在一些方面,基本培养基是TM3培养基。
在一些方面,能够具有生物活性的异源多肽包括在生物合成萜类化合物(类异戊二烯)或类胡萝卜素化合物的过程中所涉及的一种或多种多肽,并且当将所述细胞培养在基本培养基中时,所述细胞产生萜类化合物或类胡萝卜素的比产率高于缺乏使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝的相同细胞的该比产率。在一些方面,所述方法还包括回收萜类化合物或类胡萝卜素的步骤。
如本文所用,术语“萜类化合物”或“类异戊二烯”是指类似于萜烯的一大类各种各样的天然存在的有机化学物质。萜类化合物源自以多种方式组装和修饰的五碳异戊二烯单元,并且以组成员中使用的异戊二烯单元的数目为基础进行分类。半萜具有一个异戊二烯单元。单萜具有两个异戊二烯单元。倍半萜具有三个异戊二烯单元。二萜具有四个异戊二烯单元。二倍半萜具有五个异戊二烯单元。三萜具有六个异戊二烯单元。四萜具有八个异戊二烯单元。多萜具有多于八个异戊二烯单元。本领域的普通技术人员将能识别能够具有生物活性(如,能够通过组装适当数量的异戊二烯单元并根据情况对它们进行修饰而制备各种类型的萜类化合物)的异源多肽。
如本文所用,术语“类胡萝卜素”是指在植物、一些其他光合生物体(诸如藻类)的叶绿体和成色素细胞中、在一些类型的真菌中、以及在一些细菌中产生的一组天然存在的有机色素。类胡萝卜素包括含氧的叶黄素和不含氧的胡萝卜素。
在一些方面,所述萜类化合物选自半萜、单萜、倍半萜、二萜、二倍半萜、三萜、四萜和更高级的多萜。在一些方面,所述半萜是异戊烯醇(即,3-甲基-2-丁烯-1-醇)、异戊二烯醇(即,3-甲基-3-丁烯-1-醇)、2-甲基-3-丁烯-2-醇、或异戊酸。在一些方面,所述单萜是香叶基焦磷酸、桉叶油素、柠檬烯、或蒎烯。在一些方面,所述倍半萜是法尼基焦磷酸、青蒿素、或红没药醇。在一些方面,所述二萜是香叶基香叶基焦磷酸、视黄醇、视黄醛、叶绿醇、紫杉酚、毛喉素、或阿非迪霉素。在一些方面,所述三萜是角鲨烯或羊毛甾醇。在一些方面,所述四萜是番茄红素或胡萝卜素。在一些方面,所述类胡萝卜素选自叶黄素和胡萝卜素。在一些方面,所述叶黄素为叶黄质或玉米黄质。在一些方面,所述胡萝卜素是α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、β-隐黄质或番茄红素。
在一些方面,能具有生物活性的异源多肽的来源生物体是真菌。在一些方面,真菌是诸如米曲霉(A.oryzae)和黑曲霉(A.niger)的曲霉属菌种、诸如酿酒酵母的酵母属菌种、诸如裂殖酵母(S.pombe)的裂殖酵母属菌种、或诸如瑞氏木霉(T.reesei)的木霉属菌种。在一些方面,能具有生物活性的异源多肽的来源生物体是丝状真菌细胞。在一些方面,所述丝状真菌细胞来自长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、绿色木霉(T.viride)、康氏木霉(T.koningii)、哈茨木霉(T.harzianum)、海泥青霉(Penicillium sp.)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(H.lanuginose)、灰腐质霉(H.grisea)、金孢霉(Chrysosporium sp.)、C.lucknowense、粘帚霉(Gliocladiumsp.),曲霉属诸如米曲霉、黑曲霉、酱油曲霉(A.sojae)、日本曲霉(A.japonicus)、构巢曲霉(A.nidulans)或泡盛曲霉(A.awamori),镰孢菌属(Fusarium sp.)诸如粉红镰刀菌(F.roseum)、禾谷镰刀菌(F.graminum)、F.cerealis、大豆根腐病菌(F.oxysporuim)或腐皮镰刀菌(F.venenatum),链孢霉菌属(Neurospora sp.)诸如粗糙链孢霉(N.crassa)、肉座菌属(Hypocreasp.)、毛霉属(Mucor sp.)诸如米黑毛霉(M.miehei)、根霉属菌(Rhizopus sp.)或泡波曲霉属(Emericella sp.)。在一些方面,真菌是构巢曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、棘孢曲霉(A.aculeatus)、黑曲霉、日本曲霉、瑞氏木霉、绿色木霉、尖镰孢霉(F.oxysporum)或腐皮镰孢霉(F.solani)。在一些方面,来源生物体是酵母,例如酵母属(Saccharomyces sp.)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces sp.)、毕赤酵母属(Pichia sp.)或假丝酵母属(Candidasp.)。在一些方面,所述酵母属是酿酒酵母。
在一些方面,能具有生物活性的异源多肽的来源生物体是细菌。在一些方面,细菌属于:芽孢杆菌属(Bacillus),诸如地衣芽孢杆菌(B.lichenformis)或枯草芽孢杆菌(B.subtilis);泛菌属,诸如柠檬假交替单胞菌(P.citrea);假单胞菌属,诸如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)、恶臭假单胞菌(P.putida)或萤光假单胞菌(P.fluorescens);链霉菌属(Streptomyces),诸如变铅青链霉菌(S.lividans)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、灰色链霉菌(S.griseus)或锈赤链霉菌(S.rubiginosus);棒状杆菌属(Corynebacterium),诸如谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum);红假单胞菌属(Rhodopseudomonas),诸如沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris);或埃希氏菌属(Escherichia),诸如大肠杆菌。在一些方面,细菌选自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、耐碱芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。
在一些方面,来源生物体是植物,例如来自豆科(Fabaceae)(诸如蝶形花亚科(Faboideae))的植物。在一些方面,来源生物体是野葛、杨树(例如银白杨或银白杨x欧洲山杨CAC35696)、白杨(例如美洲山杨)或欧洲栎。在一些方面,来源生物体是藻类,例如绿藻(green algae)、红藻(red algae)、灰藻(glaucophytes)、chlorarachniophytes、眼虫藻(euglenids)、假菌界(chromista)或沟鞭藻类(dinoflagellates)。在一些方面,来源生物体是蓝细菌(cyanobacterium),例如基于形态归类到以下任意组的蓝细菌:绿球藻目(Chlorococcales)、宽球藻目(Pleurocapsales)、颤藻目(Oscillatoriales)、念珠藻目(Nostocales)或多列藻目(Stigonematales)。
由可再生资源产生的异戊二烯组合物
由可再生资源产生的异戊二烯组合物有别于石油-异戊二烯组合物,这是因为由可再生资源产生的异戊二烯是与其他生物副产物(源自生物来源和/或与伴随异戊二烯一起获得的生物过程相关的化合物)一起产生的,所述生物副产物诸如醇、醛、酮等在石油-异戊二烯组合物中不存在或以低得多的含量存在。所述生物副产物可包括但不限于:乙醇、丙酮、甲醇、乙醛、甲基丙烯醛、甲基乙烯酮、2-甲基-2-乙烯基噁丙环、顺式和反式3-甲基-1,3-戊二烯、C5异戊烯醇(例如3-甲基-3-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁烯-1-醇)、2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2,4,5-三甲基吡啶、2,3,5-三甲基吡嗪、香茅醛、甲硫醇、乙酸甲酯、1-丙醇、二乙酰、2-丁酮、2-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-2-丁酮、1-丁醇、2-戊酮、3-甲基-1-丁醇、异丁酸乙酯、3-甲基-2-丁烯醛、乙酸丁酯、乙酸异戊酯、3-甲基-3-丁烯-1-基乙酸酯、3-甲基-2-丁烯-1-基乙酸酯、3-己烯-1-醇、3-己烯-1-基乙酸酯、柠檬烯、香叶醇(反式-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇)、香茅醇(3,7-二甲基-6-辛烯-1-醇)、(E)-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯、(Z)-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯、或线性异戊二烯聚合物(例如源自多个异戊二烯单元的聚合反应的线性异戊二烯二聚体或线性异戊二烯三聚体)。衍生自由可再生资源产生的异戊二烯的产物包含生物副产物或由任意所述副产物衍生的化合物中的一种或多种。此外,衍生自由可再生资源产生的异戊二烯的产物可包含在随后的化学转化过程中由这些副产物所形成的化合物。此类化合物的例子包括衍生自亲二烯体至异戊二烯的Diels-Alder环加成反应、或异戊二烯的氧化的那些化合物。
由可再生资源产生的、包含特定副产物或杂质的异戊二烯组合物在美国临时专利申请No.61/187,959和WO 2010/14825中有更详细地描述。
通过将编码异戊二烯合酶多肽(如,植物异戊二烯合酶多肽)、DXS多肽、其他DXP途径多肽和/或MVA途径多肽的异源核酸引入到细胞内能大大地增加由细胞产生的异戊二烯的量,例如,如国际专利申请公开No.WO2009/076676A2、美国专利申请No.12/335,071、美国专利申请No.12/429,143、12/496,573、12/560,390、12/560,317、12/560,370、12/560,305和12/560,366,美国临时专利申请No.61/187,930、61/187,941、61/187,959,以及美国专利公开No.2010/0196977和WO 2010/078457中所述。
示例性的异戊二烯合酶多肽(如,植物异戊二烯合酶多肽)、DXS、DXP途径或MVA途径多肽和核酸包括来自本文所述任何来源生物体的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何来源生物体的突变型多肽和核酸。
示例性异戊二烯合酶多肽和核酸
在一些方面,大肠杆菌细胞包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸。在一些方面,异戊二烯合酶多肽或核酸来自豆科,例如蝶形花亚科。在一些方面,异戊二烯合酶多肽或核酸是来自以下植物的多肽或核酸:山葛(野葛)(Sharkey et al.,Plant Physiology 137:700-712,2005(Sharkey等人,《植物生理学》,第137卷第700-712页,2005年))、葛根(Pueraria lobata)、杨树(例如银白杨、黑杨(Populus nigra)、毛果杨(Populus trichocarpa)、或银白杨x欧洲山杨(CAC35696)(Miller et al.,Planta 213:483-487,2001(Miller等人,《植物学》,第213卷第483-487页,2001年))、白杨(例如美洲山杨)(Silver et al.,JBC270(22):13010-1316,1995(Silver等人,《生物化学杂志》,第270卷第22期第13010-1316页,1995年))、或者英国橡树(欧洲栎)(Zimmer等人,WO 98/02550)。在一些方面,异戊二烯合酶多肽或核酸是天然存在的异戊二烯合酶多肽或核酸。在一些方面,异戊二烯合酶多肽或核酸是非天然存在的异戊二烯合酶多肽或核酸。示例性的异戊二烯合酶多肽和核酸以及测量异戊二烯合酶活性的方法在国际专利公开No.WO2009/076676、美国专利申请No.12/335,071(美国专利公开No.2009/0203102)、WO 2010/003007、美国专利公开No.2010/0048964、WO2009/132220以及美国专利公开No.2010/0003716中有更详细地描述。
示例性DXS多肽和核酸
示例性DXS多肽包括具有DXS多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。可使用标准方法(例如本文所述的那些)通过测量多肽在体外、细胞提取物内或体内将丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸转化为1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸的能力来确定多肽是否具有DXS多肽活性。示例性的DXS多肽和核酸以及测量DXS活性的方法在国际专利公开No.WO2009/076676、美国专利申请No.12/335,071(美国专利公开No.2009/0203102)、WO 2010/003007、美国专利公开No.2010/0048964、WO2009/132220以及美国专利公开No.2010/0003716中有更详细地描述。
示例性DXP途径多肽和核酸
示例性DXP途径多肽包括但不限于下列多肽中的任何一种:DXS多肽、DXR多肽、MCT多肽、CMK多肽、MCS多肽、HDS多肽、HDR多肽、IDI多肽以及具有DXP途径多肽的一种、两种、或多种活性的多肽(如,融合多肽)。具体地讲,DXP途径多肽包括具有DXP途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性DXP途径核酸包括编码具有DXP途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性DXP途径多肽和核酸包括来自本文所述的任何来源生物体的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何来源生物体的突变型多肽和核酸。
示例性DXS多肽包括具有DXS多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。可使用标准方法(例如本文所述的那些)通过测量多肽在体外、细胞提取物内或体内将丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸转化为1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸的能力来确定多肽是否具有DXS多肽活性。示例性的DXS多肽和核酸以及测量DXS活性的方法在国际专利公开No.WO2009/076676、美国专利申请No.12/335,071(美国专利公开No.2009/0203102)、WO 2010/003007、美国专利公开No.2010/0048964、WO2009/132220以及美国专利公开No.2010/0003716中有更详细地描述。
具体地讲,DXS多肽将丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸转化为1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸(DXP)。可使用标准方法通过测量多肽在体外、细胞提取物内或体内转化丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸的能力来确定多肽是否具有DXS多肽活性。
DXR多肽将1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸(DXP)转化为2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸(MEP)。可使用标准方法通过测量多肽在体外、细胞提取物内或体内转化DXP的能力来确定多肽是否具有DXR多肽活性。
MCT多肽将2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸(MEP)转化为4-(胞苷-5′-二磷酸)-2-甲基-D-赤藓醇(CDP-ME)。可使用标准方法通过测量多肽在体外、细胞提取物内或体内转化MEP的能力来确定多肽是否具有MCT多肽活性。
CMK多肽将4-(胞苷-5′-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇(CDP-ME)转化为2-二磷酸4-(胞苷-5′-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇(CDP-MEP)。可使用标准方法通过测量多肽在体外、细胞提取物内或体内转化CDP-ME的能力来确定多肽是否具有CMK多肽活性。
MCS多肽将2-磷酸-4-(胞苷-5′-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇(CDP-MEP)转化为2-C-甲基-D-赤藓醇-2,4-环二磷酸(ME--CPP或cMEPP)。可使用标准方法通过测量多肽在体外、细胞提取物内或体内转化CDP-MEP的能力来确定多肽是否具有MCS多肽活性。
HDS多肽将2-C-甲基-D-赤藓醇-2,4-环二磷酸转化为(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸(HMBPP或HDMAPP)。可使用标准方法通过测量多肽在体外、细胞提取物内或体内转化ME-CPP的能力来确定多肽是否具有HDS多肽活性。
HDR多肽将(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸转化为异戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)。可使用标准方法通过测量多肽在体外、细胞提取物内或体内转化HMBPP的能力来确定多肽是否具有HDR多肽活性。
IDI多肽将异戊烯基二磷酸转化为二甲基烯丙基二磷酸。可使用标准方法通过测定多肽在体外、细胞提取物内或体内转化异戊烯基二磷酸的能力来确定多肽是否具有IDI多肽活性。
示例性IDI多肽和核酸
异戊烯基二磷酸异构酶多肽(异戊烯基二磷酸-δ-异构酶或IDI)促成异戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)的互变(如,将IPP转化为DMAPP和/或将DMAPP转化为IPP)。示例性IDI多肽包括具有IDI多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。可使用标准方法(例如本文所述的那些)通过测量多肽在体外、细胞提取物内或体内使IPP和DMAPP互变的能力来确定多肽是否具有IDI多肽活性。示例性的IDI多肽和核酸以及测量IDI活性的方法在国际专利公开No.WO2009/076676、美国专利申请No.12/335,071(美国专利公开No.2009/0203102)、WO 2010/003007、美国专利公开No.2010/0048964、WO2009/132220以及美国专利公开No.2010/0003716中有更详细地描述。
示例性MVA途径多肽和核酸
示例性MVA途径多肽包括乙酰辅酶A乙酰转移酶(AA-CoA硫解酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶(HMG-CoA合酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶)多肽、甲羟戊酸激酶(MVK)多肽、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)多肽、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)多肽、磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)多肽、异戊烯基磷酸激酶(IPK)多肽、IDI多肽,以及具有两种或更多种MVA途径多肽的活性的多肽(例如,融合多肽)。具体地讲,MVA途径多肽包括具有MVA途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性MVA途径多肽和核酸以及测量IDI活性的方法在国际专利公开No.WO 2009/076676、美国专利申请No.12/335,071(美国专利公开No.2009/0203102)、WO2010/003007、美国专利公开No.2010/0048964、WO 2009/132220以及美国专利公开No.2010/0003716中有更详细地描述。
在一些方面,所述细胞包含MVA途径上游,所述MVA途径上游包含AA-CoA硫解酶、HMG-CoA合酶以及HMG-CoA还原酶核酸。在一些方面,所述细胞包含MVA途径下游,所述MVA途径下游包含MVK、PMK、MVD和IDI核酸。在一些方面,所述细胞包含整个MVA途径,所述整个MVA途径包含AA-CoA硫解酶、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、MVK、PMK、MVD和IDI核酸。在一些方面,所述细胞包含整个MVA途径,所述整个MVA途径包含AA-CoA硫解酶、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、MVK、PMDC、IPK和IDI核酸。
本文所述的大肠杆菌细胞也可用于产生异戊二烯和副产物(诸如氢气、乙醇、或丙二醇(如,1,2-丙二醇或1,3-丙二醇))的改良方法。示例性氢化酶多肽和核酸、与产生发酵副产物有关的基因的多肽和核酸、以及与氢气再摄取相关的基因的多肽和核酸也可与本文所述的组合物和方法一起使用。这些多肽和核酸在美国专利公开No.2010/0196977和WO2010/078457中有所描述。
公离核酸的示例性方法
使用标准方法可分离异戊二烯合酶、DXS、IDI、DXP途径、MVA途径、PGL、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸。从所关注的来源生物体(例如细菌基因组)中获得期望的核酸的方法是分子生物学领域常见和众所周知的(参见例如WO 2004/033646和其中所引用的参考文献)。分离核酸的标准方法,包括已知序列的PCR扩增、核酸的合成、基因组文库的筛选、粘粒文库的筛选,在国际专利公开No.WO 2009/076676、美国专利申请No.12/335,071(美国专利公开No.2009/0203102)、WO2010/003007、美国专利公开No.2010/0048964、WO 2009/132220以及美国专利公开No.2010/0003716中有所描述。
示例性的启动子和载体
本文所述的异戊二烯合酶、DXS、DXP途径、IDI、MVA途径、PGL、氢化酶、氢化酶成熟、转录因子、半乳糖代谢和/或钼转运核酸中的任一者能包含在一种或多种载体内。因此,具有编码本文所述的异戊二烯合酶、DXS、IDI、DXP途径、MVA途径、PGL、氢化酶、氢化酶成熟、转录因子多肽、半乳糖代谢多肽和/或钼转运多肽中的任一者的一种或多种核酸的载体也描述在本文中。在一些方面,载体包含受表达控制序列控制的核酸。在一些方面,表达控制序列是天然的表达控制序列。在一些方面,表达控制序列是非天然的表达控制序列。在一些方面,载体包含选择性标记或可选择标记。在一些方面,异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、PGL、氢化酶、氢化酶成熟、转录调节、半乳糖代谢和/或钼转运核酸整合到不具有可选择标记的细胞的染色体内。在一些方面,异戊二烯合酶、DXS、IDI、DXP途径、MVA途径、PGL、氢化酶、氢化酶成熟、转录调节、半乳糖代谢、和/或钼转运核酸整合到具有可选择标记的细胞的染色体内。
合适的载体是与所采用的宿主细胞相容的那些。合适的载体可源自例如细菌、病毒(例如源自噬菌体的抗菌素T7或M-13)、粘粒、酵母或植物。合适的载体可在宿主细胞中维持低、中或高拷贝数。获得和使用这些载体的方案为本领域的技术人员所知(参见例如Sambrook et al.,MolecularCloning:A Laboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor,1989(Sambrook等人,《分子克隆实验指南》第2版,冷泉港实验室出版社,1989年))。与本文所述的细胞和方法相容的合适的载体在国际专利公开No.WO 2009/076676、美国专利申请No.12/335,071(美国专利公开No.2009/0203102)、WO 2010/003007、美国专利公开No.2010/0048964、WO2009/132220以及美国专利公开No.2010/0003716中有所描述。
启动子为本领域所熟知。在宿主细胞中起作用的任何启动子能用于表达宿主细胞中的异戊二烯合酶、DXS、IDI、DXP途径、MVA途径、PGL、氢化酶、氢化酶成熟、转录因子、半乳糖代谢和/或钼转运核酸。有多种用于驱动各种宿主细胞中的异戊二烯合酶、DXS、IDI、DXP途径、MVA途径、PGL、氢化酶、氢化酶成熟、转录因子、半乳糖代谢和/或钼转运核酸表达的初始控制区域或启动子,并且这些为本领域的技术人员所熟知(参见例如WO 2004/033646和其中所引用的参考文献)。实际上,可使用能够驱动这些核酸的任何启动子,包括葡萄糖异构酶启动子(参见例如美国专利No.7,132,527和其中所引用的参考文献)。与本文所述的细胞和方法相容的合适的启动子在国际专利公开No.WO 2009/076676A2和美国专利申请公开No.US2009/0203102A1中有所描述。
在一些方面,表达载体还包括终止序列。终止控制区域还可源自宿主细胞中天然存在的各种基因。在一些方面,终止序列和启动子序列源自相同的源。与本文所述的细胞和方法相容的合适的终止序列在国际专利公开No.WO 2009/076676A2和美国专利申请公开No.US2009/0203102A1中有所描述。
使用标准技术可将异戊二烯合酶、DXS、IDI、DXP途径、MVA途径、PGL、氢化酶、氢化酶成熟、转录因子、半乳糖代谢和/或钼核酸整合到载体(诸如表达载体)内(Sambrook et al.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor,1982(Sambrook等人,《分子克隆实验指南》,冷泉港实验室出版社,1982年))。与本文所述的细胞和方法相容的合适的技术在国际专利公开No.WO 2009/076676A2和美国专利申请公开No.US2009/0203102A1中有所描述。
在一些方面,以远高于目前在天然存在的细胞中所发现的水平过表达异戊二烯合酶、DXP途径、IDI、MVA途径、PGL、氢化酶、氢化酶成熟、转录因子、半乳糖代谢和/或钼转运核酸可能是有利的。在一些方面,以远低于目前在天然存在的细胞中所发现的水平以受限方式表达(如,突变、失活、或缺失)异戊二烯合酶、DXP途径、IDI、MVA途径、PGL、氢化酶、氢化酶成熟、转录因子多肽、半乳糖代谢多肽和/或编码钼转运多肽的核酸可能是有利的。与本文所述的细胞和方法相容的过表达或受限表达异戊二烯合酶、DXP途径、IDI、MVA途径、PGL、氢化酶、氢化酶成熟、转录因子、半乳糖代谢和/或钼转运核酸的合适的方法在国际专利公开No.WO 2009/076676A2和美国专利申请公开No.US2009/0203102A1中有所描述。
示例性来源生物体
异戊二烯合酶、DXP途径、IDI、MVA途径、PGL、氢化酶、氢化酶成熟、转录因子、半乳糖代谢和/或钼转运核酸(以及它们所编码的多肽)能从天然包含异戊二烯合酶、DXP途径、IDI、MVA途径、PGL、氢化酶、氢化酶成熟、转录因子、半乳糖代谢和/或钼转运核酸的任何生物体中获得。如上所述,异戊二烯由多种生物体(例如细菌、酵母、植物和动物)天然地形成。生物体包含MVA途径、DXP途径、或MVA和DXP途径两者来产生异戊二烯(图1A和1B)。因此,DXP途径核酸能从例如包含DXP途径或包含MVA和DXP途径两者的任何生物体中获得。IDI和异戊二烯合酶核酸能从例如包含MVA途径、DXP途径、或MVA和DXP途径两者的任何生物体中获得。MVA途径核酸能从例如包含MVA途径或包含MVA和DXP途径两者的任何生物体中获得。氢化酶核酸能从例如使氢氧化或使氢离子还原的任何生物体中获得。发酵副产物基因能从例如经历氧受限或厌氧呼吸(例如糖酵解)的任何生物体中获得或识别。
异戊二烯合酶、DXP途径、IDI、MVA途径、PGL、氢化酶、氢化酶成熟、转录因子、半乳糖代谢和/或钼转运核酸的核酸序列能从细菌、真菌、植物、藻类或蓝细菌中分离。示例性来源生物体包括例如酵母,例如酵母属(如,酿酒酵母);细菌,例如埃希氏菌属(如,大肠杆菌)、或甲烷八叠球菌属(如,马氏甲烷八叠球菌);植物,例如野葛或杨树(如,银白杨或银白杨x欧洲山杨CAC35696)或白杨(如,美洲山杨)。示例性的宿主生物体在国际专利公开No.WO 2009/076676、美国专利申请No.12/335,071(美国专利公开No.2009/0203102)、WO2010/003007、美国专利公开No.2010/0048964、WO 2009/132220以及美国专利公开No.2010/0003716中有所描述。
示例性转化方法
可使用用于将DNA构建体或载体引入宿主细胞内的标准技术,例如转化、电穿孔、细胞核显微注射、转导、转染(如,脂质体介导转染或DEAE葡聚糖介导转染、或者使用重组噬菌体病毒的转染)、使用磷酸钙-DNA沉淀进行孵育、使用包覆DNA的微粒进行高速轰击、以及原生质体融合,来将异戊二烯合酶、DXP途径、IDI、MVA途径、PGL、氢化酶、氢化酶成熟、转录因子、半乳糖代谢和/或钼转运核酸或含有它们的载体插入宿主细胞(如,本文所述的植物细胞、真菌细胞、酵母细胞或细菌细胞)内。常规的转化技术是本领域已知的(参见例如Current Protocols inMolecular Biology(F.M.Ausubel et al.(eds)Chapter 9,1987(《分子生物学实验室指南》,F.M.Ausubel等人编辑,第9章,1987年);Sambrook etal.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor,1989(Sambrook等人,《分子克隆实验指南》第2版,冷泉港实验室出版社,1989年);以及Campbell et al.,Curr.Genet.16:53-56,1989(Campbell等人,《当代遗传学》,第16卷第53-56页,1989年))。引入的核酸可整合到染色体DNA内,或维持为染色体外复制序列。转化株可通过本领域中已知的任何方法选择。选择转化株的合适的方法在国际专利公开No.WO 2009/076676、美国专利申请No.12/335,071(美国专利公开No.2009/0203102)、WO 2010/003007、美国专利公开No.2010/0048964、WO2009/132220以及美国专利公开No.2010/0003716中有所描述。
示例性纯化方法
在一些方面,本文所述的任何方法还包括回收产生的化合物的步骤。在一些方面,本文所述的任何方法还包括回收异戊二烯的步骤。在一些方面,通过吸收与汽提法来回收异戊二烯(参见例如美国临时申请No.61/288,142或美国专利申请No.12/969,440)。在一些方面,本文所述的任何方法还包括回收异源多肽的步骤。在一些方面,本文所述的任何方法还包括回收萜类化合物或类胡萝卜素的步骤。
合适的纯化方法在美国专利申请公开US2010/0196977A1和美国临时专利申请No.61/187,959中有更详细地描述。
其他技术
产生和回收异戊二烯与副产物(诸如氢气)的有效方法的另外的实例在美国专利申请公开No.US2010/0196977中有所描述。
可与本文所述的细胞和方法一起使用的其他技术的实例(如,从细胞生长培养物中分离产生的异戊二烯、在安全操作范围内产生异戊二烯的方法、在高异戊二烯滴度下的细胞活性、用于产生和回收异戊二烯和副产物(如,氢气、乙醇或1,3-丙二醇)的有效方法)在国际专利公布No.WO2009/076676A2,美国专利申请公开No.US2010/0048964A1、US2010/0086978A1、US2010/0113846A1、US2010/0184178A1和US2010/0167371A1、US2010/0196977A1,美国临时专利申请No.61/187,930、61/187,959和61/187,941以及国际专利申请公开No.WO2004/033646A2以及WO 1996/035796A2中有所描述。
通过参照以下实例能进一步理解本发明,这些实例以举例说明的方式提供而非旨在进行限制。
实例
实例1:构建表达酿酒酵母gi1.2KKDyI操纵子、银白杨异戊二烯合
酶、马氏产甲烷球菌甲羟戊酸激酶、pCL上游MVA(粪肠球菌mvaE和
mvaS)以及ybhE (pgl)的大肠杆菌菌株
(i)构建菌株EWL201(BL21,Cm-GI1.2-KKDyI)
大肠杆菌BL21(Novagen品牌,来自EMD生命科学有限公司(EMDBiosciences,Inc.))是受体菌株,使用MCM331P1溶菌产物(根据Ausubel等人在Current Protocols in Molecular Biology.John Wiley and Sons,Inc.(《分子生物学实验室指南》,约翰·威利父子出版公司)中所述的方法制备的溶菌产物)转导。MCM331细胞包含编码酿酒酵母甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶、以及IPP异构酶的染色体构建体gi1.2KKDyI(即,来自酿酒酵母的gi1.2-KKDyI操纵子;其构建在国际专利公开No.WO 2009/076676A2的实例10和美国专利申请No.12/335,071(美国专利公开No.2009/0203102)中有所描述)。将细胞铺展到L琼脂和20μg/μl氯霉素上,对转导子进行选择。将平板在30℃下温育过夜。对转导子的分析显示在对照平板(用于回复突变的水+细胞对照平板,以及用于溶菌产物污染的水+P1溶菌产物对照平板)上没有菌落。
挑选四种转导子并用于接种5ml L-肉汤和20μg/μl氯霉素。在30℃和200rpm的振荡下使培养物生长过夜。对1.5mL的过夜细胞培养物进行离心,以获得用于PCR分析的各种转导子的基因组DNA制备物。将细胞沉淀置于400μl重悬缓冲液(20mM Tris、1mM EDTA、50mM NaCl,pH7.5)中重新悬浮,并加入不含DNase(脱氧核糖核酸酶)的4μl RNase(核糖核酸酶)(来自罗氏公司(Roche))。将管在37℃下温育30分钟,随后加入4μl 10%SDS和4μl 10mg/ml的蛋白酶K储备液(来自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))。将管在37℃下温育1小时。将细胞裂解液转移至2ml Phase Lock Light Gel管(来自艾本德公司(Eppendorf))中,随后分别加入200μl的pH 7.9饱和酚(来自Ambion有限公司)和氯仿。将各管充分混匀并微量离心5分钟。使用400μl氯仿进行第二次萃取,并将水层转移至新的Eppendorf管中。通过加入1ml的100%乙醇并离心5分钟来使基因组DNA沉淀。使用1ml 70%乙醇来洗涤基因组DNA沉淀。移除乙醇,然后使基因组DNA沉淀短暂风干。使用200μl TE将基因组DNA沉淀重新悬浮。
使用Pfu Ultra II DNA聚合酶(来自Stratagene公司)和200ng/μl的基因组DNA作为模板,根据制造商的方案制备两组不同的PCR反应管。对于第1组,使用引物MCM130和GB Cm-Rev(表1)确保转导子被成功整合进attTn7基因座。第1组的PCR参数为:95℃下2分钟(仅第一次循环)、95℃下25秒、55℃下25秒、72℃下25秒(重复步骤2到4,循环28次)、72℃下1分钟。对于第2组,使用引物MVD For和MVD Rev(表1)确保gi1.2-KKDyI操纵子被恰当地整合。第2组的PCR参数为:95℃下2分钟(仅第一次循环)、95℃下25秒、55℃下25秒、72℃下10秒(重复步骤2到4,循环28次)、72℃下1分钟。对1.2%E-凝胶(来自英杰公司(Invitrogen Corp.))上的PCR扩增子的分析显示全部4种转导克隆均是恰当的。挑选一个菌落并命名为菌株EWL201。
(ii)构建菌株EWL204(BL21,环出GI1.2-KKDyI)
使用质粒pCP20将氯霉素标记从菌株EWL201中环出,如Datsenko和Wanner(2000年)(Datsenko et al.,Proc Natl.Acad.Sci USA 97:6640-6645,2000(Datsenko等人,《美国国家科学院院刊》,第97卷第6640-6645页,2000年))所述。使EWL201细胞在L-肉汤中生长至对数中期,然后在冰冷的无菌水中洗涤三次。将50μl细胞悬液的等分试样与1μl的pCP20混合,然后将细胞悬液混合物置于2mm比色皿(来自英杰公司)中使用Gene Pulser电穿孔仪(来自伯乐有限公司(Bio-Rad Inc.))在2.5伏特和25μFd下进行电穿孔。将1ml的LB立即加入细胞,然后转移至具有金属盖的14ml聚丙烯管(来自莎斯特公司(Sarstedt))中。通过使细胞在30℃下生长1小时而使其恢复。在L琼脂和20μg/μl氯霉素以及50μg/μl羧苄青霉素上挑选转化株,并且在30℃下温育过夜。次日,使单克隆在10ml L-肉汤和50μg/μl羧苄青霉素中于30℃下生长直至对数早期。然后使生长的培养物的温度变为42℃并维持2小时。进行连续稀释,然后将细胞铺展到LA平板上(无抗生素选择性),并在30℃下温育过夜。次日,挑选20个菌落,并影印到L琼脂(无抗生素)和LA与20μg/μl氯霉素平板上。然后将平板在30℃下温育过夜。能够在LA平板而非LA与20μg/μl氯霉素平板上生长的细胞被认为其氯霉素标记被环出(挑出一个并命名为菌株EWL204)。
(iii)构建质粒pEWL230(pTrc P.alba)
将编码银白杨异戊二烯合酶(P.alba HGS)的合成基因的生成外包给位于加利福尼亚州门洛帕克市(Menlo Park,CA)的DNA2.0公司,因为该公司拥有大肠杆菌表达的密码子优化方法。将所述合成基因定制克隆为质粒pET24a(Novagen品牌,来自EMD生命科学有限公司),并以冻干形式递送(图2、3A-B;序列标识号1)。
根据制造商的方案使用pET24P.alba HGS作为模板、引物MCM182和MCM192、以及Herculase II融合型DNA聚合酶(来自Stratagene公司)来进行PCR反应,从而扩增银白杨异戊二烯合酶(P.alba HGS)基因。PCR条件如下:95℃下2分钟(仅第一次循环)、95℃下25秒、55℃下20秒、72℃下1分钟,重复这样的循环25次,最后在72℃下延伸3分钟。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(来自凯杰公司(Qiagen Inc.))对银白杨异戊二烯合酶PCR产物进行纯化。
银白杨异戊二烯合酶PCR产物然后在包含1μl BspHI核酸内切酶(来自纽英伦生物技术公司(New England Biolabs))和2μl 10×NEB缓冲液4的20μl反应物中进行消化。将该反应物在37℃下温育2小时。然后使用QIAquick PCR纯化试剂盒来纯化已消化的PCR片段。在包含1μl PstI核酸内切酶(来自罗氏公司)和2μl 10×缓冲液H的20μl反应物中进行第二次限制酶切消化。将该反应在37℃下温育2小时。然后使用QIAquick PCR纯化试剂盒来纯化已消化的PCR片段。质粒pTrcHis2B(来自英杰公司)在包含1μl NcoI核酸内切酶(来自罗氏公司)、1μl PstI核酸内切酶和2μl10×缓冲液H的20μl反应物中进行消化。将反应在37℃下温育2小时。已消化的pTrcHis2B载体使用1.2%E-凝胶(来自英杰公司)来凝胶纯化,并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(来自凯杰公司)进行提取(图4)。使用BspHI和NcoI位点的相容粘性末端,制备包含5μl银白杨异戊二烯合酶插入子、2μl pTrc载体、1μl T4DNA连接酶(来自纽英伦生物技术公司)、2μl 10×连接酶缓冲液和10μl ddH2O的20μl连接反应物。将连接混合物在室温下温育40分钟。通过在ddH2O的有盖培养皿中悬浮0.025μm硝化纤维膜过滤膜(来自密理博公司(Millipore))并在室温下将连接混合物轻轻地施加到硝化纤维膜过滤膜之上30分钟来对连接混合物进行脱盐。使MCM446细胞在LB中生长至对数中期,然后在冰冷的无菌水中洗涤三次。将50μl细胞悬液的等分试样与5μl的脱盐pTrc P.alba HGS连接混合物混合。将细胞悬液混合物置于2mm比色皿中使用Gene Pulser电穿孔仪在2.5伏特和25μFd下进行电穿孔。将1ml的LB立即加入细胞,然后转移至具有金属盖的14ml聚丙烯管(来自莎斯特公司)中。通过使细胞在30℃下生长2小时而使其恢复。在L琼脂和50μg/μl羧苄青霉素以及10mM甲羟戊酸上挑选转化株,并在30℃下温育。次日,挑选6个转化株,并使其在5ml L-肉汤和50μg/μl羧苄青霉素的管中于30℃下生长过夜。使用QIAquick Spin Miniprep试剂盒(来自凯杰公司)对过夜的培养物进行质粒提取。由于使用了BL21细胞来繁殖质粒,所以将使用PB缓冲液5×和PE缓冲液3×来洗涤吸附柱的修改形式并入标准制造商方案以便得到高质量的质粒DNA。使用在20μl反应物中的PstI来消化质粒以确保线性片段的尺寸正确。全部6种质粒均为正确的尺寸,将其装运至位于加里福利亚州伯克利市的昆塔纳生物科学公司(Quintara Biosciences(Berkeley,CA)),以便使用引物MCM65、MCM66、EL1000(表1)进行测序。DNA测序结果显示全部6种质粒均是正确的。挑出一种质粒并命名为质粒EWL230(图5、6A-B;序列标识号2)。
iv)构建质粒pEWL244(pTrc P.alba-mMVK)
根据制造商的方案使用MCM376作为模板、引物MCM165和MCM177(参见表1)以及Pfu Ultra II融合型DNA聚合酶(来自Stratagene公司)来进行PCR反应,从而扩增马氏甲烷八叠球菌(M.mazei)MVK基因。PCR条件如下:95℃下2分钟(仅第一次循环)、95℃下25秒、55℃下25秒、72℃下18秒,重复28次循环,最后在72℃下延伸1分钟。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(来自凯杰公司)来纯化马氏产甲烷球菌MVK PCR产物。
马氏产甲烷球菌MVK PCR产物然后在包含8μl PCR产物、2μl PmeI核酸内切酶(来自纽英伦生物技术公司)、4μl 10×NEB缓冲液4、4μl10×NEB BSA以及22μl ddH2O的40μl反应物中进行消化。将该反应物在37℃下温育3小时。然后使用QIAquick PCR纯化试剂盒来纯化已消化的PCR片段。在包含2μl NsiI核酸内切酶(来自罗氏公司)、4.7μl 10×缓冲液H以及40μl经PmeI消化的马氏产甲烷球菌MVK片段的47μl反应物中进行第二次限制酶切消化。将该反应物在37℃下温育3小时。已消化的PCR片段然后使用1.2%E-凝胶来凝胶纯化,并使用QIAquick凝胶提取试剂盒进行提取。质粒EWL230在包含10μl质粒、2μl PmeI核酸内切酶、4μl 10×NEB缓冲液4、4μl 10×NEB BSA和20μl ddH2O的40μl反应物中进行消化。将该反应在37℃下温育3小时。然后使用QIAquick PCR纯化试剂盒来纯化已消化的PCR片段。在包含2μl PstI核酸内切酶、4.7μl 10×缓冲液H以及40μl经PmeI消化的EWL230线性片段的47μl反应物中进行第二次限制酶切消化。将反应在37℃下温育3小时。已消化的PCR片段然后使用1.2%E-凝胶来凝胶纯化,并使用QIAquick凝胶提取试剂盒进行提取(图7)。使用NsiI和PstI位点的相容粘性末端,制备包含8μl马氏产甲烷球菌MVK插入子、3μl EWL230质粒、1μl T4DNA连接酶、2μl 10×连接酶缓冲液和6μl ddH2O的20μl连接反应物。将连接混合物在16℃下温育过夜。次日,通过在ddH2O的有盖培养皿中悬浮0.025μm硝化纤维膜过滤膜并在室温下将连接混合物轻轻地施加到硝化纤维膜过滤膜之上30分钟来对连接混合物进行脱盐。使MCM446细胞在LB中生长至对数中期,然后在冰冷的无菌水中洗涤三次。将50μl细胞悬液的等分试样与5μl的脱盐pTrc P.alba-mMVK连接混合物混合。将细胞悬液混合物置于2mm比色皿中使用Gene Pulser电穿孔仪在2.5伏特和25μFd下进行电穿孔。将1ml的LB立即加入细胞,然后将细胞转移至具有金属盖的14ml聚丙烯管。通过使细胞在30℃下生长2小时而使其恢复。在LA和50μg/μl羧苄青霉素以及5mM甲羟戊酸平板上选择转化株,并在30℃下温育。次日,挑选6个转化株,并使其在5ml LB和50μg/μl羧苄青霉素的管中于30℃下生长过夜。使用QIAquick Spin Miniprep试剂盒对过夜的培养物进行质粒提取。由于使用了BL21细胞来繁殖质粒,所以将使用PB缓冲液5×和PE缓冲液3×来洗涤吸附柱的修改形式并入标准制造商方案以便得到高质量的质粒DNA。使用在20μl反应物中的PstI来消化质粒以确保线性片段的尺寸正确。6种质粒中的3种为正确的尺寸,将其装运至昆塔纳生物科学公司以便使用引物MCM65、MCM66、EL1000、EL1003和EL1006(表1)进行测序。DNA测序结果显示全部3种质粒均是正确的。挑选一种并命名为质粒EWL244(图8和9A-B;序列标识号3)。
v)构建来自马氏产甲烷球菌古细菌pET200D下游的质粒MCM376- MVK。
使用英杰公司的Platinum HiFi PCR混合物、使用引物MCM161和MCM162(表1)对来自马氏产甲烷球菌古细菌下游操纵子(图10A-C;序列标识号4)的MVK ORF进行PCR扩增。将45μL的PCR混合物与1μL模板、1μL引物(每种引物的浓度分别为10μM)以及2μL水合并。对反应进行如下循环:在94℃下2:00分钟;在94℃下0:30分钟、在55℃下0:30分钟,并且在68℃下1:15分钟,循环30次;然后72℃下7:00分钟,并且在4℃下直至冷却。根据制造商的方案将3μL的该PCR反应物连接至英杰公司的pET200D质粒。将3μL的该连接体引入英杰公司的TOP10细胞,并且在LA/kan50上选择转化株。分离来自转化株的质粒,并对插入子测序,得到MCM376(图11A-C)。
vi)构建菌株EWL251(BL21(DE3)、Cm-GI1.2-KKDyI、pTrc P.alba-
mMVK)
使MCM331细胞(其包含编码酿酒酵母甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶和IPP异构酶的染色体构建体gi1.2KKDyI)在LB中生长至对数中期,然后在冰冷的无菌水中洗涤三次。将50μl的细胞悬液与1μl的质粒EWL244混合。将细胞悬液混合物置于2mm比色皿中使用Gene Pulser电穿孔仪在2.5伏特和25μFd下进行电穿孔。将1ml的LB立即加入细胞,然后将细胞转移至具有金属盖的14ml聚丙烯管。通过使细胞在30℃下生长2小时而使其恢复。在LA和50μg/μl羧苄青霉素以及5mM甲羟戊酸的平板上选择转化株,并在37℃下温育。选择一个菌落并命名为菌株EWL251。
vii)构建菌株EWL256(BL21(DE3)、Cm-GI1.2-KKDyI、pTrc P.alba- mMVK、pCL上游MVA)。
使EWL251细胞在LB中生长至对数中期,然后在冰冷的无菌水中洗涤三次。使50μl的细胞悬液与1μl的质粒MCM82(包含pCL Ptrc上游途径(也称为“pCL上游MVA”),编码粪肠球菌mvaE和mvaS)混合。如国际专利公开No.WO 2009/076676A2的实例8和美国专利申请No.12/335,071(美国专利公开No.2009/0203102)中所述构建质粒pCL Ptrc上游途径。将细胞悬液混合物置于2mm比色皿中使用Gene Pulser电穿孔仪在2.5伏特和25μFd下进行电穿孔。将1ml的LB立即加入细胞中。然后将细胞转移至具有金属盖的14ml聚丙烯管。通过使细胞在30℃下生长2小时而使其恢复。在LA和50μg/μl羧苄青霉素以及50μg/μl大观霉素的平板上选择转化株,并在37℃下温育。挑选一个菌落并命名为菌株EWL256。
表1:引物序列
viii)构建菌株RM111608-2(Cm-GI1.2-KKDyI,pTrc P.alba-
mMVK,pCL上游MVA、pBBRCMPGI1.5-pgl)
使用复制质粒pBBR1MCS5(庆大霉素)(由路易斯安那州立大学的K.Peterson博士获得)时的ybhE基因(编码大肠杆菌6-磷酸葡萄糖酸内酯酶)的组成型表达来构建产生异戊二烯的大肠杆菌BL21菌株(EWL256)。
从德国的基因桥股份有限公司(Gene Bridges GmbH)获得基于FRT的重组表达盒、用于Red/ET介导的整合及抗生素标记环出的质粒。根据基因桥公司的方案使用这些材料来执行工序。根据制造商的方案使用Stratagene Herculase II融合试剂盒将引物Pgl-F(序列标识号29)和PglGI1.5-R(序列标识号30)用于扩增得自FRT-gb2-Cm-FRT模板的抗性表达盒。PCR反应(50μL的最终体积)包含:5μL缓冲液、1μL模板DNA(得自基因桥公司的FRT-gb2-Cm-F)、10皮摩尔的每种引物,以及1.5μL 25mM dNTP混合物,使用dH2O将体积增至50μL。对反应进行如下循环:1×2分钟,95℃,然后进行(在95℃下30秒、在63℃下30秒、在72℃下3分钟)的30次循环。
所得的PCR产物使用PCR纯化试剂盒(来自凯杰公司)来纯化,并通过电穿孔进入如下具有包含pRed-ET重组酶的质粒的电感受态MG1655细胞内。如下制备细胞:使其在5ml L-肉汤中于30℃下生长至OD600为约0.6。通过加入4%阿拉伯糖来诱导细胞进行重组酶表达,并使细胞在30℃下生长30分钟,随后在37℃下生长30分钟。将1.5ml细胞的等分试样在冰冷的dH2O中洗涤3至4次。将最终的细胞沉淀重新悬浮在40μL的冰冷dH2O中,并加入2至5μL的PCR产物。在1mm间隙的比色皿中,使用Gene Pulser电穿孔仪(来自伯乐有限公司)在1.3kV下进行电穿孔。将细胞在30℃下恢复1至2小时,然后使其平铺在含有氯霉素(5μg/mL)的L琼脂上。通过PCR来分析五个转化株,并使用与整合位点侧面相接的引物来测序(2个引物组:pgl和49rev以及3′EcoRV-pglstop;底部Pgb2和顶部GB’s CMP(946))。选择正确的转化株,并将该菌株命名为MG1655GI1.5-pgl::CMP。
使用MG1655GI1.5-pgl::CMP的染色体DNA作为模板以产生包含FRT-CMP-FRT-GI1.5-ybhE构建体的PCR片段。将该构建体如下克隆到pBBR1MCS5(庆大霉素)中。使用5′引物Pglconfirm-F(序列标识号31)和3′引物3′EcoRV-pglstop(序列标识号32)将在此称为CMP-GI1.5-pgl的片段扩增。按照制造商的建议,使用英杰公司的TOPO-Blunt克隆试剂盒将所得的片段克隆到质粒载体pCR-Blunt II-TOPO中。将包含CMP-GI1.5-pgl片段的NsiI片段克隆到pBBR1MCS5(庆大霉素)的PstI位点中。制备包含5μl CMP-GI1.5-pgl插入片段、2μl pBBR1MCS5(庆大霉素)载体、1μl T4DNA连接酶(来自纽英伦生物技术公司)、2μl 10×连接酶缓冲液以及10μl ddH2O的20μl连接反应物。将连接混合物在室温下温育40分钟,然后使用以上公开的参数通过电穿孔使2至4μL所述连接混合物进入电感受态Top10细胞(来自英杰公司)内。在含有10μg/ml氯霉素和5μg/ml庆大霉素的L琼脂上挑选转化株。使用许多以上所述的引物以及由位于加利福尼亚州的Sequetech公司(Sequetech,CA)提供的内部引物T3和反向引物来确定所选克隆的序列。将该质粒命名为pBBRCMPGI1.5-pgl(图12、13A-B,序列标识号6)。
如本文所述将质粒pBBRCMPGI1.5-pgl电穿孔到EWL256内,并且将转化株平铺在含有氯霉素(10μg/mL)、庆大霉素(5μg/mL)、大观霉素(50μg/mL)和羧苄青霉素(50μg/mL)的L琼脂上。选择一个转化株并命名为菌株RM111608-2。
引物:
Pgl-F
5’-ACCGCCAAAAGCGACTAATTTTAGCTGTTACAGTCAGTTGAATTAACCCTCACTAAAGGGCGGCCGC-3’(序列标识号29)
PglGI1.5-R
5’-GCTGGCGATATAAACTGTTTGCTTCATGAATGCTCCTTTGGGTTACCTCCGGGAAACGCGGTTGATTTGTTTAGTGGTTGAATTATTTGCTCAGGATGTGGCATAGTCAAGGGCGTGACGGCTCGCTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAG-3’(序列标识号30)
3′EcoRV-pglstop:
5’-CTT GAT ATC TTA GTG TGC GTT AAC CAC CAC(序列标识号31)
pgl+49rev:CGTGAATTTGCTGGCTCTCAG(序列标识号32)
Bottom Pgb2:GGTTTAGTTCCTCACCTTGTC(序列标识号33)
Top GB’s CMP(946):ACTGAAACGTTTTCATCGCTC(序列标识号34)
Pglconfirm-F
5’-ACCGCCAAAAGCGACTAATTTTAGCT-3’(序列标识号35)
实例2:通过来自大肠杆菌的质粒的ybhE(pgl)的组成型表达来改进异
戊二烯的生产
此实例显示与以野生型水平表达ybhE的对照菌株(即EWL256)相比在组成型表达大肠杆菌ybhE(pgl)的菌株中异戊二烯的生成。基因ybhE(pgl)编码抑制异源表达的蛋白质的转译后葡糖酰化的大肠杆菌6-磷酸葡萄糖酸内酯酶并改进产物的溶解度和收率,同时还提高通过磷酸戊糖途径的生物质收率和流量(Aon et al.,Applied and Environmental Micrrobiology74(4):950-958,2008(Aon等人,《应用与环境微生物学》第74卷第4期第950-958页,2008年))。
i)小规模分析
培养基配方(每升发酵培养基):K2HPO413.6g、KH2PO413.6g、MgSO4*7H2O 2g、一水柠檬酸2g、柠檬酸铁铵0.3g、(NH4)2SO43.2g、酵母提取物1g、1000×痕量金属溶液1ml。将所有组分一起加入并溶解在去离子水中。使用氢氧化铵(30%)将pH调节至6.8,然后定容。使用0.22微米过滤膜对培养基进行过滤灭菌。在灭菌和调节pH后加入葡萄糖5.0g和抗生素。
1000×痕量金属溶液(每升发酵培养基):一水柠檬酸40g、MnSO4*H2O 30g、NaCl 10g、FeSO4*7H2O 1g、CoCl2*6H2O 1g、ZnSO4*7H2O 1g、CuSO4*5H2O 100mg、H3BO3 100mg、NaMoO4*2H2O100mg。以每次溶解一种组分的方式将各组分溶解在去离子水中。使用HCl/NaOH来将pH调节至3.0,然后将溶液定容,并使用0.22微米过滤膜来过滤灭菌。
(a)实验程序
通过使菌株在得自MicroReactor Technologies有限公司的CelleratorTM中生长来分析异戊二烯的生成。24孔的每一个中的工作容积为4.5mL。将温度维持在30℃下,pH设定值为7.0,氧气流量设定值为20sccm并且搅拌速率为800rpm。将从冷冻小瓶中取出的大肠杆菌菌株的接种物划线接种到LB肉汤琼脂平板(具有抗生素)上,然后在30℃下温育。将单个菌落接种到具有抗生素的培养基中,并使其生长过夜。将细菌稀释到具有抗生素的4.5mL培养基中,达到在550nm处测得的0.05光密度。
使用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)(来自安捷伦公司(Agilent))顶空分析法来进行异戊二烯的尾气分析。样品的制备如下:将100μL的全部肉汤放置于密封的GC小瓶中,并在30℃下温育30分钟的固定时间。在由70℃下温育5分钟组成的加热杀菌步骤之后,将样品加载到GC上。
在运行过程中使用酶标仪(Spectramax)获得550nm波长处的光密度(OD)。通过将异戊二烯浓度(μg/L)除以OD读数和时间(小时)来获得比产率。
在200和400μM IPTG诱导水平下评估两种菌株EWL256和RM11608-2。在诱导后1、2.5、4.75和8小时分析样品的异戊二烯产量和细胞生长(OD550)。制备双份试样。
(b)结果
实验表明,与对照菌株相比,在2种不同浓度的IPTG下,表达ybhE(pgl)的菌株的异戊二烯比产率具有显著的2到3倍的增长。
ii)在15L规模下来自表达Cm-GI1.2-KKDyI、马氏产甲烷球菌甲羟
戊酸激酶、银白杨异戊二烯合酶以及ybhE(pgl)(RM111608-2)且分批补料
的培养物中生长的大肠杆菌的异戊二烯发酵。
培养基配方(每升发酵培养基):K2HPO47.5g、MgSO4*7H2O 2g、一水柠檬酸2g、柠檬酸铁铵0.3g、酵母提取物0.5g、1000×改进的痕量金属溶液1ml。将所有组分一起加入并溶解在去离子水中。对该溶液进行高压灭菌。使用氢氧化铵(30%)将pH调节至7.0,然后定容。在灭菌和调节pH之后加入葡萄糖10g、盐酸硫胺素0.1g和抗生素。
1000×改进的痕量金属溶液:一水柠檬酸40g、MnSO4*H2O 30g、NaCl 10g、FeSO4*7H2O 1g、CoCl2*6H2O 1g、ZnSO4*7H2O 1g、CuSO4*5H2O 100mg、H3BO3 100mg、NaMoO4*2H2O 100mg。以每次溶解一种组分的方式将各组分溶解在去离子水中,用HCl/NaOH将pH调节为3.0,然后定容,并使用0.22微米过滤膜来过滤灭菌。
在具有BL21(DE3)大肠杆菌细胞的15L生物反应器中进行发酵,该BL21(DE3)大肠杆菌细胞包含甲羟戊酸(MVA)途径上游(pCL上游)、整合的MVA途径下游(gi1.2KKDyI)、来自马氏产甲烷球菌的甲羟戊酸激酶和来自银白杨的异戊二烯合酶(pTrcAlba-mMVK)的高效表达、以及大肠杆菌pgl(pBBR-pgl)的高效表达。进行该实验以监测在期望的发酵pH 7.0和温度34℃下从葡萄糖中形成的异戊二烯。将冷冻小瓶的大肠杆菌菌株解冻并接种至胰蛋白胨-酵母提取物培养基中。在种菌生长至OD为1.0(在550nm处测量)之后,将500mL用于在15L生物反应器中接种,使初始体积为5L。
以指数速率进料葡萄糖,直至细胞达到静止期。在此之后,减少葡萄糖进料以满足代谢需求。在40小时(59小时)的发酵期间递送到生物反应器的葡萄糖总量为3.1kg(在59小时为4.2kg)。通过加入IPTG来完成诱导。当在550nm处的光密度(OD550)达到为4的值时,IPTG浓度变为110μM。当OD550达到150时,IPTG浓度升至192μM。在生物反应器内的OD550随着时间推移的分布显示在图14A中。使用Hiden质谱仪测定来自生物反应器的尾气中的异戊二烯含量。在发酵过程中异戊二烯滴度在40小时处增加至33.2g/L的最大值(在59小时处为48.6g/L)(图14B)。在发酵过程中异戊二烯滴度在40小时处增加至40.0g/L的最大值(在59小时处为60.5g/L)(图14C)。在40小时(59小时)的发酵期间产生的异戊二烯的总量为281.3g(在59小时为451.0g),并且产量的时间进程显示在图14D中。体积产率的时间进程显示在图14E中,并且显示在0至40小时之间维持1.0g/L/h的平均速率(在19和59小时之间为1.4g/L/h)。如通过CER所测定的代谢活性分布显示在图14F中。在发酵期间参与产生异戊二烯所利用的碳的摩尔产率在40小时为19.6%(在59小时为23.6%)。得自葡萄糖的异戊二烯重量百分比产率在40小时为8.9%(在59小时为10.7%)。
实例3:由可再生资源产生的异戊二烯的回收
由一组四个14L规模的发酵罐以两步操作来回收异戊二烯,该两步操作涉及通过吸附到活性炭来将异戊二烯从发酵尾气流中脱除、随后是离线水蒸汽解吸和冷凝从而得到液态异戊二烯(图16A和16B)。由四个发酵罐产生的异戊二烯的总量为1150g(16.9mol),其中953g(14mol,83%)被碳过滤器吸附。在蒸汽解吸/冷凝步骤之后,回收的液态异戊二烯的量为810g,对应于70%的总回收率。分析回收的异戊二烯,确定是否存在杂质。
对异戊二烯液体的分析及其杂质分布
通过GC/MS和气相色谱法/火焰离子化检测(GC/FID)来分析回收的异戊二烯液体,从而确定杂质的性质和含量。测得产物的纯度>99.5%,并且除了多种微量组分之外,该产物包含几种主要杂质。GC/FID色谱图在图17中示出,并且杂质的代表性含量在表19中示出。杂质分布类似于以该规模产生的其他异戊二烯批次的分布。
表2:在由可再生资源产生的几批异戊二烯中观察到的杂质的性质和
含量汇总
通过用吸附剂处理来纯化由可再生资源产生的异戊二烯
业内广泛地使用吸附剂来从烃原料中移除痕量杂质。合适的吸附剂包括基于沸石、氧化铝和二氧化硅的材料。通过在硅胶上经过能将由可再生资源产生的异戊二烯基本上纯化,并在较小程度上使用氧化铝。图18显示在处理之前(A)以及在使用氧化铝(B)或二氧化硅(C)处理后的异戊二烯样品的GC/FID色谱图。来自巴斯夫公司(BASF)的SelexsorbTM吸附剂产品是用于从由可再生资源产生的异戊二烯中移除极性杂质的优选的吸附剂之一。具体地讲,考虑到SelexsorbTM CD和CDX产品具有经证实的从异戊二烯和丁二烯原料中移除极性杂质的效用,因此它们是优选的。
实例4:构建菌株MCM518-521和528-531:λ启动子驱动整合的
mKKDyI
P1转导能够使至多100kb的DNA在细菌菌株之间移动(Thomason等人,2007年)。通过使用P1转导将来自大肠杆菌K12MG1655的一片细菌染色体移动至大肠杆菌BL21(DE3)来置换在大肠杆菌BL21(DE3)中的17,257bp缺失(参见图20)。
采用使用不同的可选择标记的两种策略来鉴定包含重组的细菌染色体的菌落。首先,将抗生素标记插入接近待转移的17,257bp序列的基因中,该序列的缺失不会对菌株不利。包含该抗生素标记的菌株将可能具有与所述标记同时转导的17,257bp的一片细菌染色体。在这种情况下,将编码卡那霉素抗性(“kanR”)的基因插入编码未知功能的126种氨基酸蛋白质的ybgS基因内。其次,因为已知的是在利用半乳糖的过程中涉及的若干基因靠近在待转导至大肠杆菌BL21(DE3)的17,257bp碎片中的pgl,所以使用得自大肠杆菌K12MG1655(其包含在大肠杆菌BL21(DE3)中缺失的17,257bp序列)的P1溶菌产物转导且在包含0.4%(w/v)半乳糖的M9培养基(6g/L Na2HPO4、3g/L KH2PO4、0.5g/L NaCl、0.5g/L NH4Cl、0.1mMCaCl2、2mM MgSO4)中分离的菌落将可能包含17,257bp的一片细菌染色体。
根据制造商的方案使用Stratagene HerculaseTM II融合试剂盒(得自位于加利福尼亚州拉荷亚市的安捷伦科技有限公司的Stratagene产品部(Agilent Technologies,Stratagene Products Division,La Jolla,California)),将引物MCM120(序列标识号36)和MCM224(序列标识号37)用于扩增来自基因桥公司FRT-gb2-Cm-FRT模板的氯霉素抗性(“CmR)表达盒。对四次50μL PCR反应进行如下循环:95℃/2分钟、95℃/20秒、55℃/20秒、72℃/1分钟,循环30次;并且72℃/3分钟。然后将反应物冷却至4℃。根据制造商的方案将四种反应物合并、加载到凯杰公司的PCR柱上,然后使用55℃下的60μL洗脱缓冲液(“EB”)洗脱。
使用标准程序将质粒pRedET-羧苄青霉素R(来自位于德国海德堡的基因桥公司)电穿孔到大肠杆菌BL21(DE3)菌株MCM446(CmR,gi1.6mKKDyI A1-3)内。通过在30℃的SOC培养基中振荡一小时来使转化株恢复,然后在LB+50μg/mL羧苄青霉素(“LB/carb50”)平板上于30℃下培养过夜,选择出转化株。将羧苄青霉素抗性菌落冷冻为菌株MCM508。
使来自新划线的菌株MCM508在30℃下的5mL LB/carb50中生长至OD600为约0.5。此时,加入40mM L-阿拉伯糖,然后将培养物在37℃下温育1.5小时。然后通过离心收集细胞、如上所述使3μL纯化的扩增子通过电穿孔进入细胞,然后使细胞在37℃下的500μL SOC培养基中恢复1.5至3小时。在37℃下的LB+10μg/mL卡那霉素(LB/kan10)平板上挑选转化株。
通过使用引物GB-DW(序列标识号38)和MCM208(序列标识号39)的PCR来确认在目标基因座处的扩增子重组。对所得的扩增子测序,以鉴定具有以下所列的序列的四种克隆。将四种对羧苄青霉素敏感的克隆冷冻为菌株MCM518-MCM521。
将菌株MCM518-MCM521再次划线接种至LB/kan10上并在37℃下生长过夜。挑选菌株MCM518-MCM521的菌落,在37℃下的LB/kan10中培养并使用质粒pCP20电转化,所述质粒编码酵母Flp重组酶、氯霉素和氨苄青霉素抗性基因并赋予宿主细胞温度敏感性复制体(Cherepanov,P.P.etal.,Gene 158(1):9-14(1995)(Cherepanov,P.P.等人,《基因》,第158卷第1期第9-14页,1995年))。通过使细胞在500μLSOC培养基中在30℃下振荡1小时而使细胞恢复。通过在LB/carb50平板上于30℃下培养过夜而选择出转化株。次日早晨,使来自各个平板的菌落在30℃下的LB/carb50培养基中生长直至明显浑浊。然后将培养物转移至37℃并维持至少3小时。将细胞从该培养物划线到LB平板上,并在37℃下生长过夜。
次日,将菌落影印到LB、LB/carb50和LB/kan10上。将对羧苄青霉素和卡那霉素均敏感(即,不会在carb50和kan10上生长)的克隆培养在液体LB中,并冷冻为菌株MCM528-MCM531。
表3:大肠杆菌菌株
菌株 | 描述 | 亲本 |
MCM508 | BL21 gi1.6-mKKDyI+predet.-carb | MCM446 |
MCM518 | BL21 neo-PL.6-mKKDyI,克隆10 | MCM508 |
MCM519 | BL21 neo-PL.0-mKKDyI,克隆11 | MCM508 |
MCM520 | BL21 neo-PL.0-mKKDyI(在mMVK前面RBS损坏),克隆13 | MCM508 |
MCM521 | BL21 neo-PL.2-mKKDyI,克隆15 | MCM508 |
MCM528 | BL21 PL.6-mKKDyI,neoR环出 | MCM518 |
MCM529 | BL21 PL.0-mKKDyI,neoR环出 | MCM519 |
MCM530 | BL21 PL.0-mKKDyI(在mMVK前面RBS损坏),neoR环出 | MCM520 |
MCM531 | BL21 PL.2-mKKDyI,neoR环出 | MCM521 |
表4:引物序列
整合进菌株MCM518-MCM521的染色体的组装物包括源自噬菌体λ的新的PL启动子以及mMVK ORF的起点,其中来自基因桥公司FRT-gb2-Cm-FRT表达盒的序列整合在启动子/mMVK组装物的上游、并且mMVKORF的剩余部分随后是来自菌株MCM508的MVA途径下游整合子的其余部分。
整合进MCM518的启动子/mMVK序列(序列标识号40):aaagaccgaccaagcgacgtctgagagctccctggcgaattcggtaccaataaaagagctttattttcatgatctgtgtgttggtttttgtgtgcggcgcggaagttcctattctctagaaagtataggaacttcctcgagccctatagtgagtcgtattaaattcatataaaaaacatacagataaccatctgcggtgataaattatctctggcggtgttgacataaataccactggcggtgatactgagcacatcagcaggacgcactgaccaccatgaaggtgcaaaggaggtaaaaaaacatggtatcctgttctgcgccgggtaagatttacctgttcggtgaacacgccgtagtttatggcgaaactgcaattgcgtgtgcggtggaactgcgtacccgtgttcgcgcggaactcaatgactctatcactattcagagc
整合进MCM519的启动子/mMVK序列(序列标识号41):aaagaccgaccaagcgacgtctgagagctccctggcgaattcggtaccaataaaagagctttattttcatgatctgtgtgttggtttttgtgtgcggcgcggaagttcctattctctagaaagtataggaacttcctcgagccctatagtgagtcgtattaaattcatataaaaaacatacagataaccatctgcggtgataaattatctctggcggtgttgacctaaataccactggcggtgatactgagcacatcagcaggacgcactgaccaccatgaaggtgcaaaggaggtaaaaaaacatggtatcctgttctgcgccgggtaagatttacctgttcggtgaacacgccgtagtttatggcgaaactgcaattgcgtgtgcggtggaactgcgtacccgtgttcgcgcggaactcaatgactctatcactattcagagc
整合进MCM520的启动子/mMVK序列(序列标识号42):aaagaccgaccaagcgacgtctgagagctccctggcgaattcggtaccaataaaagagctttattttcatgatctgtgtgttggtttttgtgtgcggcgcggaagttcctattctctagaaagtataggaacttcctcgagccctatagtgagtcgtattaaattcatataaaaaacatacagataaccatctgcggtgataaattatctctggcggtgttgacctaaataccactggcggtgatactgagcacatcagcaggacgcactgaccaccatgaaggtgcaaaggtaaaaaaacatggtatcctgttctgcgccgggtaagatttacctgttcggtgaacacgccgtagtttatggcgaaactgcaattgcgtgtgcggtggaactgcgtacccgtgttcgcgcggaactcaatgactctatcactattcagagc
整合进MCM521的启动子/mMVK序列(序列标识号43):aaagaccgaccaagcgacgtctgagagctccctggcgaattcggtaccaataaaagagctttattttcatgatctgtgtgttggtttttgtgtgcggcgcggaagttcctattctctagaaagtataggaacttcctcgagccctatagtgagtcgtattaaattcatataaaaaacatacagataaccatctgcggtgataaattatctctggcggtgttgacgtaaataccactggcggtgatactgagcacatcagcaggacgcactgaccaccatgaaggtgcaaaggaggtaaaaaaacatggtatcctgttctgcgccgggtaagatttacctgttcggtgaacacgccgtagtttatggcgaaactgcaattgcgtgtgcggtggaactgcgtacccgtgttcgcgcggaactcaatgactctatcactattcagagc
实例5:构建菌株DW199和DW202
该实例描述在PTrc启动子的控制下构建具有银白杨异戊二烯合酶(MEA变体)的截短形式的产生异戊二烯的大肠杆菌菌株。
通过来自模板pEWL244(也称为pTrc-P.alba(MEA)-mMVK,其在美国专利申请No.12/335,071的实例10中有所描述)的QuikchangeTM(得自位于加利福尼亚州拉荷亚市的安捷伦科技有限公司的Stratagene产品部)PCR诱变来构建具有截短的银白杨异戊二烯合酶(IspS)的质粒。PCR反应物包含以下组分:1μl pEWL244(编码pTrc P.alba-mMVK)、5μl10×PfuUltra高保真缓冲液、1μl 100mM dNTP、1μl 50μM QC EWL244MEA F引物(序列标识号44)、1μl 50μM QC EWL244MEA R引物(序列标识号45)、2μl DMSO、1μl PfuUltra高保真聚合酶(得自位于加利福尼亚州拉荷亚市的安捷伦科技有限公司的Stratagene产品部),以及39μl去离子水。对PCR反应进行如下循环:95℃/1分钟;95℃/30秒、55℃/1分钟、68℃/7.3分钟,循环18次。然后将反应物冷却至4℃。
PCR产物通过使用E-凝胶(得自位于加利福尼亚州卡尔斯巴德市的英杰公司)的凝胶电泳来可视化检测,然后在37℃下使用1μl DpnI限制性核酸内切酶(来自位于加利福尼亚州南旧金山市的罗氏公司(Roche,South SanFrancisco,CA))处理3小时。然后使用微量透析膜(来自位于马萨诸塞州比尔里卡市的密理博公司(MilliPore,Billerica,MA))对10μl的PCR产物进行脱盐,并且使用标准分子生物学技术将其转化为电感受态大肠杆菌菌株MCM531(如上所述进行制备)。将细胞置于1ml的LB培养基中在30℃下保持1.5小时来使其恢复,再平铺在包含50μg/ml羧苄青霉素和5mM甲羟戊酸的LB琼脂平板上,然后在37℃下温育过夜。次日,选择(参见下文的菌株DW195的)阳性菌落进行繁殖、质粒纯化(加利福尼亚州瓦伦西亚市凯杰公司(Qiagen,Valencia,CA)),并由以下所列出的引物通过DNA测序(由位于加里福利亚州伯克利市的昆塔纳生物科学公司进行)来进行确认。经确认,最终质粒pDW34(图19A;序列标识号7)携带编码银白杨IspS的截短形式的开放阅读框。
通过将pDW34和pMCM82(在美国专利申请No.12/335,071的实例10中有所描述)转化为电感受态MCM531(如上所述进行制备)来得到菌株DW199。将细胞置于1ml的LB培养基中在37℃下保持1小时来使其恢复,再平铺在包含50μg/ml大观霉素和50μg/ml羧苄青霉素的LB琼脂平板上,然后在37℃下温育过夜。次日,选择菌株DW199的抗生素抗性菌落用于进一步研究。
通过将pBBRCMPGI1.5-pgl(在实例1中有所描述)转化为电感受态DW199(如上所述进行制备)来得到菌株DW202。将细胞置于1ml的LB培养基中在37℃下保持1小时来使其恢复,再平铺在包含50μg/ml大观霉素、50μg/ml羧苄青霉素和5μg/ml庆大霉素的LB琼脂平板上,然后在37℃下温育过夜。次日,选择菌株DW202的抗生素抗性菌落用于进一步研究。
表5:引物
引物名称 | 序列(5’→3’) |
QC EWL244MEA F | gaggaataaaccatggaagctcgtcgttct(序列标识号44) |
QC EWL244MEA R | agaacgacgagcttccatggtttattcctc(序列标识号45) |
EL-1006 | gacagcttatcatcgactgcacg(序列标识号46) |
EL-1000 | gcactgtctttccgtctgctgc(序列标识号47) |
A-rev | ctcgtacaggctcaggatag(序列标识号48) |
A-rev-2 | ttacgtcccaacgctcaact(序列标识号49) |
QB1493 | cttcggcaacgcatggaaat(序列标识号50) |
MCM208 | gctctgaatagtgatagagtca(序列标识号39) |
MCM66(akapTrc反向) | ccaggcaaattctgttttatcag(序列标识号51) |
表6:菌株
实例6:构建大肠杆菌BL21菌株CMP215、CMP258和CMP234
该实例描述由使用包含大肠杆菌MG1655基因组DNA的P1噬菌体转导的BL21衍生的大肠杆菌菌株的构建,选择这些菌株用于重组在MG1655中存在但在BL21和BL21(DE3)中缺失的17,257bp片段。
P1溶菌产物由菌株JW0736产生,其中ybgS基因被来自Keio集合(Baba等人,2006年)的卡那霉素抗性基因(“KanR”)(即,ybgS::KanR突变)所取代。使用该溶菌产物来感染菌株MCM531(如上所述),从而产生菌株CMP215。通过使用引物galM R(5’-GTC AGG CTG GAA TACTCT TCG-3’;序列标识号8)和galM F(5’-GAC GCT TTC GCC AAGTCA GG-3’;序列标识号9)的PCR来确认CMP215的基因型。如图20所示,这些引物使galM基因退火,但仅产生来自具有17,257bp缺失的大肠杆菌BL21(DE3)染色体DNA的PCR产物。
通过使用以下方案的PCR来验证在P1转导后17,257bp片段的整合。将一个细菌菌落置于30μl水中搅拌,并加热至95℃维持5分钟。使所得溶液减慢旋转,然后将2μl的上清液用作以下PCR反应中的模板:2μl水中的菌落、5μl缓冲液、1μl 100mM dNTP、1μl 10μM正向引物、1μl 10μM反向引物、0.5μl增强型DNA聚合酶(得自位于加利福尼亚州拉荷亚市的安捷伦科技有限公司的Stratagene产品部),以及39.5μl去离子水。使PCR反应在PCR Express热循环仪(PCR ExpressThermal Cycler,得自位于马萨诸塞州富兰克林市(Franklin,MA)的ThermoHybaid公司)中进行如下循环:95℃/2分钟、95℃/30秒、52℃/30秒、72℃/60秒,循环30次;并且72℃/7分钟。然后将反应物冷却至4℃。退火温度为52℃,比引物对中较低的Tm还低3℃。使用DNA分子量标记X(75-12,216bp)(来自位于德国曼海姆市的罗氏诊断公司(Roche Diagnostics,Mannheim,Germany))作为尺寸标记,在预制的0.8%(得自位于加利福尼亚州卡尔斯巴德市的英杰公司)上测定所得PCR片段的尺寸。如果菌株CMP215能在半乳糖上生长,则也可确认转导获得了成功。
作为另外一种选择,使用大肠杆菌MG1655的溶菌产物来转导菌株BL21(如上文的实例1中所述)。将在补充0.4%(w/v)半乳糖的M9培养基上选择的菌落命名为CMP258。基本如上所述,通过使用引物galM R(序列标识号9)和galM F(序列标识号8)的PCR来确认包含17,257bp区域的pgl是否存在。
通过将表达mvaE和mvaS(如美国专利申请No.12/335,071的实例8中所述进行制备)以及pDW34(包含如上所述的截短银白杨异戊二烯合酶和马氏产甲烷球菌甲羟戊酸激酶)的质粒pCLPtrcUpperPathway电穿孔来共转化菌株CMP215。在包含50μg/ml羧苄青霉素+50μg/ml大观霉素的LB琼脂平板上选择出转化株。挑选一个菌落并命名为CMP234。
实例7:构建大肠杆菌BL21菌株CMP269和CMP312
该实例描述由使用包含大肠杆菌MG1655基因组DNA的P1噬菌体转导的BL21衍生的大肠杆菌菌株的构建,选择这些菌株用于重组在MG1655中存在但在BL21和BL21(DE3)中缺失的17,257bp片段。用于选择的标记已被环出。
使用pCP20将菌株CMP215(如上所述)转化(Cherepanov,P.P.et al.,1995,Gene 158(1):9-14(Cherepanov,P.P.等人,1995年,《基因杂志》第158卷第1期第9-14页);Datsenko and Wanner,2000,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,97(12):6645(Datsenko和Wanner,2000年,《美国国家科学院院刊》,第97卷第12期第6645页)),并且根据之前描述的工序将包含在ybgS基因中的kanR标记环出(Datsenko and Wanner,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,97(12):6645(2000)(Datsenko和Wanner,《美国国家科学院院刊》,第97卷第12期第6645页,2000年))。通过上述PCR来证实标记环出,但使用的是ybgSAmp F引物(5’-CCT GGA ATT AGC AAG AAAAAC GC-3’;序列标识号52)和ybgSAmp R引物(5’-GTG AAA ATTGCA CGG CGA GTA GG-3’;序列标识号53)。将该菌株命名为CMP269。通过将质粒pCLPtrcUpperPathway(表达mvaE和mvaS)和包含截短的银白杨IspS和马氏产甲烷球菌MVK的pDW34(参见图19A)电穿孔来共转化菌株CMP269以产生菌株CMP312。
实例8:构建大肠杆菌BL21菌株CMP296、CMP315和CMP323
该实例描述源自大肠杆菌BL21、使用包含大肠杆菌MG1655基因组DNA的P1噬菌体转导的菌株的构建,所述菌株被选择用于重组在MG1655中存在但在BL21和BL21(DE3)中缺失的17,257bp片段,从而将pgl的功能性拷贝修复至源自大肠杆菌BL21和BL21(DE3)的菌株。还构建了其中修复的pgl基因通过插入卡那霉素表达盒(其随后也被环出)而被精确敲除的菌株。
使用引物对pglAmpF(5’-Cagcaaatagcaggtgtatccagc-3’;序列标识号54)和pglAmpR(5’-GCA ACC GAC TGT TGA TAG AAC AAC-3’;序列标识号55)将包含pgl/ybhE的拷贝的PCR产物由来自Keio集合的大肠杆菌菌株JW0750扩增,其中kanR基因已插入pgl/ybhE的拷贝(pgl/ybhE::kanR)。该引物对产生含有pgl/ybhE::kanR加上约350bp来自突变每一侧的旁侧序列的片段。如下所述制备PCR模板:将携带pgl/ybhE::kanR的大肠杆菌JW0750的一个菌落置于30μl的水中搅拌,并加热至95℃维持5分钟。使所得溶液减慢旋转,然后将2μl的上清液用作如下进行的PCR反应中的模板:2μl水中的菌落、5μl pfu Ultra II缓冲液、1μl 100mM dNTP、1μl 10μM正向引物、1μl 10μM反向引物、1μl pfu UltraII聚合酶(得自位于加利福尼亚州拉荷亚市的安捷伦科技有限公司的Stratagene产品部),以及39μl H2O。使PCR反应在PCR Express热循环仪(得自位于马萨诸塞州富兰克林市的Thermo Hybaid公司)中进行如下循环:95℃/2分钟、95℃/20秒、53.4℃/20秒、72℃/40秒,循环30次;72℃/3分钟。然后将反应物冷却至4℃。
使用DNA分子量标记X(75-12,216bp)(来自位于德国曼海姆市的罗氏诊断公司)作为尺寸标记,在预制的0.8%(得自位于加利福尼亚州卡尔斯巴德市的英杰公司)上测定所得PCR片段的尺寸。使用PCR纯化试剂盒(得自位于加利福尼亚州拉荷亚市的凯杰公司)来纯化PCR反应。
将质粒pRedETAmp(来自位于德国海德堡的基因桥股份有限公司)电穿孔到CMP269内以形成CMP296。根据制造商的指示(来自基因桥公司)使用L-阿拉伯糖来使CMP296生长并对其进行诱导,并使用在该实例中描述的pgl/ybhE::kanRPCR产物来使其转化。在包含20ppm卡那霉素的LB琼脂上选择转化株。挑选一个菌落,使用pglAmpF(5’-cagcaaatagcaggtgtatccagc-3’;序列标识号54)和pglRecCheck(5’-GGTTAC AAA ATG ATT GGC GTA CGC-3’;序列标识号56)、通过使用聚合酶的PCR来检查其基因型,并将其命名为CMP298。如在上文的实例2中所述将标记移除以形成菌株CMP315。将质粒pCLPtrcUpperPathway和pDW34(参见实例1)如在上文的实例4-5中所述引入CMP315中以形成菌株CMP323。
表7:对菌株的描述
引用的参考文献:Aon et al.,2008,“Suppressing posttranslationalgluconoylation of heterologous proteins by metabolic engineering of Escherichiacoli.”Appl.Environ.Microbiol.74:950-958(Aon等人,2008年,“通过大肠杆菌的代谢工程抑制异种蛋白的翻译后葡萄糖酸化”,《应用与环境微生物学》,第74卷第950-958页);Baba et al.,2006,“Construction ofEscherichia coli K-12in-frame,single-gene knockout mutants:the Keiocollection,”Mol.Syst.Biol.2:2006.0008(Baba等人,2006年,“在框内单基因敲除突变体:Keio集合中构建大肠杆菌K-12”,《分子系统生物学》,第2卷第2006.0008号);Cherepanov,P.P.et al.,1995,“Genedisruption in Escherichia coli:TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant,”Gene 158(1):9-14(Cherepanov,P.P.等人,1995年,“大肠杆菌中的基因中断:具有由Flp催化的抗生素抗性决定子的切除的选择的TcR和KmR表达盒”,《基因杂志》,第158卷第1期第9-14页;Datsenko,K.,and Wanner,B.,2000,“One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12usingPCR products”,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 97:6640-6645(Datsenko,K.和Wanner,B.,2000年,“使用PCR产物一步灭活大肠杆菌K-12中的染色体基因”,《美国国家科学院院刊》,第97卷第6640-6645页);Neidhart,F.,Ingraham,J.,and Schaechter,M.,1990,Physiology of the bacterialcell:a molecular approach(Sinauer Associates,Inc.Sunderland,MA)(Neidhart,F.、Ingraham,J.和Schaechter,M.,1990年,《细菌细胞生理学:分子途径》,由位于马萨诸塞州桑德兰的Sinauer Associates有限公司出版);Thomason,L.,Court,D.,Datta,A.,Khanna,R.and Rosner,J.,2004,“Identification of the Escherichia coli K-12ybhE gene as pgl,encoding 6-phosphogluconolactonase,”J.Bact.186:8248-8253(Thomason,L.、Court,D.、Datta,A.、Khanna,R.和Rosner,J.,2004年,“将编码6-磷酸葡萄糖酸内酯酶的大肠杆菌K-12ybhE基因识别为pgl”,《细菌学杂志》,第186卷第8248-8253页);Thomason,L.,Costantino,N.,Court,D.,2007,“E.coli genome manipulation by P1 transduction,”Curr.Protocols Mol.Biol.Chapter 1,Unit 1.17(Thomason,L.、Costantino,N.、Court,D.,2007年,“通过P1转导操纵大肠杆菌基因组”,《分子生物学实验指南》,第1章第1.17单元);Studier F.,Daegelen,P.,Lenski,R.,Maslov,S.,Kim,J.F.,2009,“Understanding the differences between genome sequences ofEscherichia coli B strains REL606and BL21(DE3)and comparison of the E.coli B and K-12genomes,”J.Mol.Biol.394(4):653-80,2009)(Studier F.、Daegelen,P.、Lenski,R.、Maslov,S.、Kim,J.F.,2009年,“理解大肠杆菌B菌株REL606和BL21(DE3)的基因组序列之间的差异并比较大肠杆菌B和K-12基因组”,《分子生物学杂志》,第394卷第4期第653-80页,2009年)。
实例9:在使用编码pgl的17,257bp染色体片段转导的BL21菌株中
产生异戊二烯
该实例表明,要使具有甲羟戊酸途径的大肠杆菌在4.5mL分批微型发酵中具有高异戊二烯比产率,需要将pgl修复至细菌染色体。
培养基配方(每升发酵培养基):将13.6g K2HPO4、13.6g KH2PO4、2g一水柠檬酸、0.3g柠檬酸铁铵、3.2g(NH4)2SO4和1ml1000×痕量金属溶液一起加入并溶解在去离子水中。使用28%(w/v)氢氧化铵将pH调节至6.8,然后定容至最终体积。使用0.22微米过滤膜对培养基进行过滤灭菌。在灭菌和调节pH后,加入葡萄糖(10g用于过夜培养物,5.0g用于主要培养物)和适当的抗生素,随后加入来自100g/L储备溶液的1g酵母提取物和来自1M MgSO4溶液的1g MgSO4。
1000×痕量金属溶液(每升发酵培养基):以每次溶解一种物质的方式将40g一水柠檬酸、30g MnSO4*H2O、10g NaCl、1g FeSO4*7H2O、1gCoCl2*6H2O、1g ZnSO4*7H2O、100mg CuSO4*5H2O、100mg H3BO3和100mg NaMoO4*2H2O溶解在去离子水中。然后使用HCl/NaOH来将pH调节至3.0,将溶液定容到最终体积,并使用0.22微米滤膜来过滤灭菌。
大肠杆菌菌株:(1)CMP312:将大肠杆菌BL21细胞工程化以包含甲羟戊酸(MVA)途径上游(pCL Upper)、整合的MVA途径下游(PL.2KKDyI)、以及具有截短的银白杨IspS(MEA分离物)的质粒和来自马氏产甲烷球菌的甲羟戊酸激酶(pTrcAlba(MEA)+mMVK)。该菌株还包括17,257bp片段的整合拷贝,该17,257bp片段包含利用半乳糖的基因以及编码在大肠杆菌BL21(DE3)中发现为缺失的pgl的基因。该片段来源于大肠杆菌K-12染色体DNA。(2)CMP323:除了将pgl从转导的一片K-12DNA片段中精确切除并使用授予卡那霉素抗性的基因(pgl/ybhE::kanR)取代外,该菌株与如上所述的菌株CMP312相同。
实验工序:通过使菌株在得自MicroReactor Technologies有限公司(位于加利福尼亚州的山景市(Mountain View,CA))的CelleratorTM中生长来分析异戊二烯的生成。24孔的每一个中的工作容积为4.5mL。将温度维持在30℃,不控制pH,氧气流量设定值为10sccm(“标准立方厘米/分钟”)并且搅拌速率为550rpm。从冷冻小瓶中获得大肠杆菌接种物并将其划线到包含适当抗生素的LB琼脂平板上,然后在30℃下温育。将单个菌落接种到具有抗生素的生长培养基,然后生长过夜。将细菌稀释到具有适当抗生素的4.5mL培养基中,以达到在550nm处测得的光密度(“OD”)(即“OD550”)为0.05。在试验开始时,通过将异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)添加到200μM的最终浓度来诱导异戊二烯的产生。
使用具有定制的低流量变形杆菌阀的在线Hiden质谱仪(得自位于英国沃灵顿市的海德公司(Hiden Analytical,Warrington,UK))进行异戊二烯的尾气分析。当阀循环通过24孔板时,它每次对一个孔进行采样。因为尾气连续流经毛细管到达质谱仪,但是每次仅对一个口进行采样,所以构建了定制顶板以将来自24孔中每一个的毛细管连接至变形杆菌阀的对应口。当板旋转时,所述顶板还便于外部采样。
在试验过程中使用酶标仪(Spectramax,得自位于加里福利亚州桑尼维尔市的美迪希实验仪器公司(MDS Analytical Technologies,Sunnyvale,CA))来离线获得OD550测量值。使用已建立的标准曲线将微孔板OD转化为OD(1cm光路长度)。将通过质谱仪测量的异戊二烯浓度(μg/L)乘以氧气流量再除以OD读数和孔中剩余的体积来获得比产率。在微型发酵过程中在四个时间点处从目标孔采取OD样品。在实测值之间使用线性插值法来计算这些时间点之间的OD值。
结果。示出的OD代表图(图21)和比产率代表图(图22)显示上述两种菌株的情况。比较得自pgl+菌株(具有整合到细菌染色体内的pgl基因)与pgl-菌株的异戊二烯比产率。在微型发酵过程中,细菌在具有葡萄糖作为碳源的确定成分培养基中于相同条件下生长。随着时间推移的在线异戊二烯测量值揭示pgl+菌株(CMP312)较之pgl-菌株(CMP323)具有更高的异戊二烯比产率(图22),即使前者在培养物中的细胞更少(图21)。
实例10:具有和不具有pgl表达的马氏产甲烷球菌甲羟戊酸激酶和银
白杨异戊二烯合酶的超表达
该实例显示在15L规模的分批补料培养物中生长的、表达来自甲羟戊酸途径和异戊二烯合酶的基因的大肠杆菌BL21产生异戊二烯的情况。
培养基配方(每升的发酵培养基):将7.5gK2HPO4、2gMgSO4*7H2O、2g一水柠檬酸、0.3g柠檬酸铁铵、0.5g酵母提取物和1ml1000×改进的痕量金属溶液一起加入并溶解在去离子水中。将溶液在123℃下热力灭菌20分钟,然后使用28%(w/v)氢氧化铵将pH调节到7.0,并定容到最终体积。在灭菌和调节pH后,加入10克葡萄糖、8mL汞维生素溶液和适当的抗生素。
1000×改进的痕量金属溶液(每升):以每次溶解一种物质的方式将40g一水柠檬酸、30g MnSO4*H2O、10g NaCl、1g FeSO4*7H2O、1gCoCl2*6H2O、1g ZnSO4*7H2O、100mg CuSO4*5H2O、100mg H3BO3和100mg NaMoO4*2H2O溶解在去离子水中,使用HCl/NaOH将pH调节至3.0,并将溶液定容到最终体积,然后使用0.22微米过滤膜来过滤灭菌。
Mercury维生素溶液(每升):以每次溶解一种物质的方式将1g盐酸硫胺素、1g D-(+)-生物素、1g烟酸、4.8g D-泛酸和4g盐酸吡哆辛溶解在去离子水中,使用HCl/NaOH将pH调节至3.0,并将溶液定容到最终体积,然后使用0.22微米过滤膜来过滤灭菌。
进料溶液(每千克):将0.57kg葡萄糖、0.38kg去离子水、7.5gK2HPO4和10g 100%Foamblast混合到一起,然后进行高压灭菌。在无菌溶液冷却至25℃之后,加入3.4mL Macro盐溶液、0.8ml 1000×改进的痕量金属溶液和6.7mLMercury维生素溶液。
Macro盐溶液(每升):将296gMgSO4*7H2O、296g一水柠檬酸和49.6g柠檬酸铁铵溶解在去离子水中,定容至最终体积,然后使用0.22微米过滤膜来过滤灭菌。
使用三种不同的大肠杆菌BL21细胞菌株在15L生物反应器中进行发酵:(1)DW199,其表达甲羟戊酸(MVA)途径上游(pCL Upper)、整合的MVA途径下游(PL.2mKKDyI)、来自马氏产甲烷球菌的甲羟戊酸激酶和来自银白杨的截短的异戊二烯合酶(pTrcAlba(MEA)+mMVK(pDW34)),但缺少pgl基因;(2)CMP312,其表达甲羟戊酸(MVA)途径上游(pCLUpper)、整合的MVA途径下游(PL.2mKKDyI)、来自马氏产甲烷球菌的甲羟戊酸激酶和来自银白杨的截短的异戊二烯合酶(pTrcAlba(MEA)+mMVK(pDW34)),并且包含编码pgl基因的修复的染色体17,257bp片段(在菌株构建过程中使用的ybgS::kanR标记被环出);以及(3)CMP323,除了将pgl基因从修复的DNA片段中精确切除并使用授予卡那霉素抗性的基因(pgl/ybhE::kanR)取代外,其与CMP312相同。
进行该实验以监测在期望的发酵pH和温度(pH=7.0和34℃)下从葡萄糖中产生的异戊二烯。将各种大肠杆菌菌株的冷冻小瓶解冻,然后接种至各生物反应器的胰蛋白胨-酵母提取物培养基内。在菌种生长至OD550=1.0后,使用500mL的培养物来接种15L生物反应器,然后使初始的罐体积变为5L。
以指数速率装入进料溶液,直至达到5.8克/分钟的顶部进料速率。在此之后,以小于或等于5.8克/分钟的速率加入葡萄糖进料以满足代谢需求。递送至生物反应器的葡萄糖的总量为:在44小时的发酵期间对于菌株DW199为5.8kg,在45小时的发酵期间对于菌株CMP312为3.4kg,并且在44小时的发酵期间对于菌株CMP323为6.3kg。通过加入表25中所示水平的异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(“IPTG”)来实现对产生异戊二烯的诱导。在生物反应器内随着时间推移的OD550分布显示在图23中。使用Hiden质谱仪(得自位于英国沃灵顿市的海德公司)测定来自生物反应器的尾气中的异戊二烯含量。在发酵过程中异戊二烯滴度增加至如下最大值:对于菌株DW199在44小时处为76g/L,对于菌株CMP312在45小时处为68g/L,并且对于菌株CMP323在44小时处为79g/L(参见图24)。在发酵过程中产生的异戊二烯的总量为:对于菌株DW199在44小时内为637g,对于菌株CMP312在45小时内为482g,并且对于菌株CMP323在44小时内为640g(图25)。比产率的时间进程显示在图26中。从葡萄糖中产生的异戊二烯的摩尔产率和质量产率显示在表9中。
表8:在菌株DW199、CMP312和CMP323的发酵过程中加入IPTG
菌株 | 诱导 | OD550 | IPTG浓度,μM |
DW199 | 第一次 | 5 | 105 |
第二次 | 105 | 195 | |
CMP312 | 第一次 | 5 | 115 |
第二次 | 80 | 225 | |
CMP323 | 第一次 | 5 | 115 |
第二次 | 115 | 215 |
表9:对于菌株DW199、CMP312和CMP323得自葡萄糖的异戊二烯
的摩尔产率和质量产率
菌株 | 时间,h | 摩尔产率,% | 质量产率,% |
DW199 | 44 | 23.9 | 11.0 |
CMP312 | 45 | 30.3 | 14.5 |
CMP323 | 44 | 22.0 | 10.2 |
实例11:马氏产甲烷球菌甲羟戊酸激酶和银白杨异戊二烯合酶超表
达、以及将包含pgl的修复的K12DNA(CMP312)与pgl被精确切除的相同
菌株(CMP323)
进行比较该实例比较在15L规模的分批补料培养物中生长的、表达来自甲羟戊酸途径和异戊二烯合酶的基因且具有修复的pgl基因和修复的pgl基因被精确删除的大肠杆菌菌株产生异戊二烯的情况。
培养基配方(每升发酵培养基):将7.5g K2HPO4、2gMgSO4*7H2O、2g一水柠檬酸、0.3g柠檬酸铁铵、0.5g酵母提取物和1ml1000×改进的痕量金属溶液一起加入并溶解在去离子水中。将该溶液在123℃下热力灭菌20分钟,然后使用28%(w/v)氢氧化铵将pH调节至7.0,并定容到最终体积。在灭菌和调节pH之后,加入10g葡萄糖、0.05g盐酸硫胺素和适当的抗生素。
1000×改进的痕量金属溶液(每升):以每次溶解一种物质的方式将40g一水柠檬酸、30g MnSO4*H2O、10g NaCl、1g FeSO4*7H2O、1gCoCl2*6H2O、1g ZnSO4*7H2O、100mg CuSO4*5H2O、100mg H3BO3和100mg NaMoO4*2H2O溶解在去离子水中,使用HCl/NaOH将pH调节至3.0,并将溶液定容到最终体积,然后使用0.22微米过滤膜来过滤灭菌。
进料溶液(每千克):将0.57kg葡萄糖、0.38kg去离子水和10g100%Foamblast混合到一起,然后进行高压灭菌。
进行该实验以比较在期望的发酵pH和温度(pH=7.0和34℃)下在具有修复的pgl的菌株以及在修复的pgl被精确敲除的菌株中由葡萄糖形成的异戊二烯。使用两种大肠杆菌菌株在15L生物反应器中进行发酵:(1)CMP312,大肠杆菌BL21细胞表达甲羟戊酸(MVA)途径上游(pCL Upper)、整合的MVA途径下游(PL.2mKKDyI)、来自马氏产甲烷球菌的甲羟戊酸激酶和来自银白杨的截短的异戊二烯合酶(pTrcAlba(MEA)mMVK(pDW34)),并且包含细菌染色体的修复的17,259bp片段,该片段包含pgl基因(其ybgS::KanR标记被环出);以及(2)CMP323,如上所述从修复的DNA片段中精确切除pgl的大肠杆菌菌株。将各种菌株的冷冻小瓶解冻,然后接种至各生物反应器的胰蛋白胨-酵母提取物培养基内。在菌种生长至在550nm处测得的OD(OD550)=1.0后,将500mL用于在15L生物反应器中接种,并使初始的罐体积达到5L。
以指数速率加入进料溶液,直至达到5.8克/分钟的顶部进料速率。在此之后,以小于或等于5.8克/分钟的速率加入葡萄糖进料以满足代谢需求。在20小时的发酵过程中递送至生物反应器的葡萄糖的总量为:对于pgl+菌株为1.6kg,对于pgl-菌株为2.0kg。进料这些菌株,避免葡萄糖在培养基中积聚。
当OD550达到为4的值时,通过加入异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(“IPTG”)至90μM来诱导异戊二烯产生。当OD550达到100时,IPTG浓度升至170μM。
图27显示在发酵过程中生物反应器中的OD550分布,所述分布对于两个罐而言是相似的。使用Hiden质谱仪(得自位于英国沃灵顿市的海德公司)测定来自生物反应器的尾气中的异戊二烯含量。在发酵过程中异戊二烯滴度在采样的最后时间点增加至17g/L的最大值(参见图28)。然而,pgl+菌株比pgl-菌株更快地达到该滴度。比产率的时间进程显示在图29中。根据OD和滴度趋势,在试验中pgl+菌株比pgl-菌株具有更高的比产率。
实例12:马氏产甲烷球菌甲羟戊酸激酶和银白杨异戊二烯合酶的超表
达
该实例显示在15L规模的分批补料培养物中生长的、表达来自甲羟戊酸途径和异戊二烯合酶的基因的大肠杆菌K12MG1655(其包含从大肠杆菌BL21(DE3)中删除的17,257bp)产生异戊二烯的情况。
培养基配方(每升发酵培养基):将7.5g K2HPO4、2gMgSO4*7H2O、2g一水柠檬酸、0.3g柠檬酸铁铵、0.5g酵母提取物和1ml1000×改进的痕量金属溶液一起加入并溶解在去离子水中。将该溶液在123℃下热力灭菌20分钟,使用28%(w/v)氢氧化铵将pH调节至7.0,并定容到最终体积。在灭菌和调节pH后,加入10克葡萄糖、8mL汞维生素溶液和适当的抗生素。
1000×改进的痕量金属溶液(每升):以每次溶解一种物质的方式将40g一水柠檬酸、30g MnSO4*H2O、10g NaCl、1g FeSO4*7H2O、1gCoCl2*6H2O、1g ZnSO4*7H2O、100mg CuSO4*5H2O、100mg H3BO3和100mg NaMoO4*2H2O溶解在去离子水中,使用HCl/NaOH将pH调节至3.0,并将溶液定容到最终体积,然后使用0.22微米过滤膜来过滤灭菌。
Mercury维生素溶液(每升):以每次溶解一种物质的方式将1g盐酸硫胺素、1g D-(+)-生物素、1g烟酸和4.8g D-泛酸、4g盐酸吡哆辛溶解在去离子水中,使用HCl/NaOH将pH调节至3.0,然后将溶液定容为最终体积,并使用0.22微米过滤膜来过滤灭菌
进料溶液(每千克):将0.57kg葡萄糖、0.38kg去离子水、7.5gK2HPO4和10g 100%Foamblast混合到一起,然后进行高压灭菌。在溶液冷却至25℃后,加入3.4mL Macro盐溶液、0.8mL 1000×改进的痕量金属溶液和6.7mL Mercury维生素溶液。
Macro盐溶液(每升):将296g MgSO4*7H2O、296g一水柠檬酸和49.6g柠檬酸铁铵溶解在去离子水中,定容至最终体积,然后使用0.22微米过滤膜来过滤灭菌。
进行该实验以监测在期望的发酵pH和温度(pH=7.0和34℃)下从葡萄糖中形成的异戊二烯。在15L生物反应器中使用菌株MCM769进行发酵:大肠杆菌MG1655细胞表达甲羟戊酸(MVA)途径上游(pCL Upper)、整合的MVA途径下游(PL.2mKKDyI)、来自马氏产甲烷球菌的甲羟戊酸激酶和来自银白杨的截短的异戊二烯合酶(pTrcAlba(MEA)+mMVK(pDW34))。将菌株MCM769的冷冻小瓶解冻,然后接种至各生物反应器的胰蛋白胨-酵母提取物培养基内。在菌种生长至OD550=1.0后,将500mL用于在15L生物反应器中接种,并使初始的罐体积达到5L。
以指数速率加入进料溶液,直至达到3.9克/分钟的顶部进料速率。在此之后,以小于或等于3.9克/分钟的速率加入进料溶液以满足代谢需求。在44小时的发酵过程中递送至生物反应器的葡萄糖的总量为2.3kg。通过加入数滴异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(“IPTG”)以达到在表10中示出的与测得的OD550值对应的含量来诱导异戊二烯生成。在生物反应器内随着时间推移的OD550分布显示在图30中。使用Hiden质谱仪(得自位于英国沃灵顿市的海德公司)测定来自生物反应器的尾气中的异戊二烯含量。在发酵过程中异戊二烯滴度增加至在44小时处的30.4g/L的最大值(图31)。在发酵中产生的异戊二烯的总量在44小时处为226.8g(图32)。比产率的时间进程显示在图33中。在发酵期间参与产生异戊二烯所利用的碳的摩尔产率在44小时处为21.1%。得自葡萄糖的异戊二烯重量百分比产率在44小时处为9.7%。
表10:在菌株MCM769的发酵过程中加入IPTG
OD550 | 加入后的IPTG浓度,μM |
13 | 41 |
36 | 61 |
70 | 81 |
105 | 100 |
195 | 117 |
115 | 215 |
实例13:在大肠杆菌BL21中pgl对甲羟戊酸比产率的作用
甲羟戊酸生物合成途径包括两部分:(1)包含乙酰乙酰基-CoA合酶(硫解酶)、HMG-CoA合酶(HMGS)和HMG-CoA还原酶(HMGR)的甲羟戊酸上游途径;以及(2)包含甲羟戊酸激酶(MVK)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)和异戊烯基二磷酸异构酶(IDI)的甲羟戊酸下游途径。途径上游蛋白的表达产生甲羟戊酸,这是异戊二烯生成中的中间体。
设计这些实验以研究pgl如何影响以及通过何种机制来影响在大肠杆菌BL21中甲羟戊酸的比产率。将粪肠球菌的稠合硫解酶/HMGR(mvaE)和HMGS(mvaS)构建在pCL、pBBR和pTrc质粒上,然后转化至不含pgl的大肠杆菌BL21和含有整合在细菌染色体中的pgl的大肠杆菌BL21。
在具有高浓度酵母提取物的基本培养基中、模拟分批补料发酵早期的生长条件下的生长期间,包含pgl的菌株比不含pgl的菌株具有更高的比产率。与不含pgl的菌株相比,在具有低酵母提取物浓度的基本培养基中的生长期间,pgl的存在也导致了显著更高的甲羟戊酸产生。然而,该作用不是由于甲羟戊酸途径酶的浓度增加所致,这表明在这些生长条件下pgl的存在可能通过影响大肠杆菌的中心代谢而正面影响流往或流经甲羟戊酸途径的流量。这些生长条件模拟存在于分批补料发酵的指数部分中的晚期的那些条件。
pDW15的构建(pBBR1MCS-5上的Ptrc-MVA上游途径)。为了将MVA上游途径插入pBBR1MCS-5载体内,通过使用具有引物Upper5′XhoI(序列标识号57)和Upper3′XbaI(序列标识号58)的质粒pMCM82模板的PCR来扩增包含Ptrc、mvaE、mvaS和rrn转录终止子的整个表达盒。PCR引物序列在下表28中列出。各反应包含1μL pMCM82(~30ng)、10μL5X缓冲液(得自位于加利福尼亚州拉荷亚Stratagene的公司(Stratagene,La Jolla,California))、0.5μL dNTP(各100mM)、1μLUpper5′XhoI(20μM)、1μL Upper3′XbaI(20μM)、35.5μL去离子水和1μLDNA聚合酶(得自位于加利福尼亚州拉荷亚市的Stratagene公司)。将反应加热至95℃维持4分钟,经过95℃20分钟/52℃20秒/72℃4分钟的5次循环,95℃20分钟/55℃20秒/72℃4分钟的25次循环,随后为72℃10分钟,最后冷却至4℃。
通过使用预制(得自位于加利福尼亚州卡尔斯巴德市的英杰公司)的凝胶电泳来确认PCR产物的尺寸,然后使用纯化柱(得自位于加利福尼亚州瓦伦西亚市的凯杰公司)根据制造商推荐的方案来纯化4.2kb产物。然后在37℃下如下使用XbaI和XhoI限制性内切酶将纯化的PCR产物和pBBR1MCS-5载体消化过夜:6μL去离子水、2μL 10XSuRE/Cut Buffer H(得自位于印第安纳州印第安纳波利斯的罗氏应用科学公司(Roche Applied Science,Indianapolis,Indiana))、10μL DNA(pBBR1MCS-5或PCR插入子)、1μL XhoI(得自罗氏应用科学公司)和1μl XbaI(得自罗氏应用科学公司)。次日,在连接之前在65℃下将限制酶加热灭活20分钟。在4℃下进行连接反应(参见以下条件)过夜,该连接反应包括2μL去离子水、1μL 10X连接酶缓冲液(得自位于马萨诸塞州伊普斯威奇的纽英伦生物技术公司(New England Biolabs,Ipswich,Massachusetts))、1μL T4DNA连接酶(得自纽英伦生物技术公司)、2μL载体(pBBR1MCS-5)和4μL插入子(MVA上游表达盒)。通过微透析(位于马萨诸塞州比尔里卡市的密理博公司)将连接反应物脱盐,然后根据制造商推荐的方案将大约5μL的各反应物转化至化学感受态大肠杆菌TOP10细胞(得自位于加利福尼亚州卡尔斯巴德市的英杰公司)。在37℃的LB中回收电穿孔的细胞1小时,然后平铺在含X-gal和10μg/ml庆大霉素的LB板上。选择未表现出β-半乳糖苷酶活性的菌落用于通过使用引物M13Reverse和MCM163的PCR进一步分析,以确认插入子的存在。将来自这些菌落之一的质粒纯化(凯杰公司)、完整测序(昆塔纳生物科学公司,参见表11的引物序列),以确认其以正确的取向包含完整的MVA上游途径表达盒,并命名为pDW15(序列标识号69)。质粒pDW15的图谱显示在图34A中,而完整的序列列在图34B-C-D中。
表11:PCR和测序引物
引物名称 | 引物序列 |
Upper5′XhoI | atgctcgagctgttgacaattaatcatccggctc(序列标识号57) |
Upper3′XbaI | cgatctagaaaggcccagtctttcgactgagcc(序列标识号58) |
MCM163 | ggattttggccatttccagctt(序列标识号59) |
CF07-58 | atgaaaacagtagttattattgatgc(序列标识号60) |
CF07-59 | cttaaatcatttaaaatagc(序列标识号61) |
CF07-82 | atgacaattgggattgataaaattag(序列标识号62) |
CF07-86 | gaaatagccccattagaagtatc(序列标识号63) |
CF07-87 | ttgccaatcatatgattgaaaatc(序列标识号64) |
CF07-88 | gctatgcttcattagatccttatcg(序列标识号65) |
CF07-89 | gaaacctacatccaatcttttgccc(序列标识号66) |
产MVA菌株MCM870-877的构建。通过电穿孔将编码粪肠球菌mvaE和mvaS基因的质粒引入大肠杆菌宿主内。使宿主细胞在37℃、250rpm的LB培养基中生长至OD600≈1。将培养物置于冰上直至冷却。对于各电穿孔反应,在室温下将1.5mL培养物在6000rpm的Eppendorf微量离心机中离心2-3分钟。在除去上清液后,将细胞沉淀在1mL冰冷的无菌去离子水中重悬。重复三次旋转和洗涤工序,最后将沉淀重悬在100μL中。
将由各1μL的pDW15(序列标识号67)、pTrcHis2AUpperPathway#1和pCLPtrcUpperPathway(两质粒的构建均在美国专利申请No.12/335,071的实例8中有所描述)组成的质粒混合物加入100μL的细胞悬液,然后在2mm比色皿、2.5伏、25μFd下电穿孔至感受态大肠杆菌细胞内。类似地,将1μL 的pDW15、pTrcHis2AUpperPathway#1或pCLPtrcUpperPathway加入100μL的细胞悬液,然后在2mm比色皿、2.5伏、25μFd下将其电穿孔至感受态大肠杆菌细胞内。在37℃下立即将细胞在500μL LB培养基中回收一小时。使用如下表12所列的合适抗生素在LB上选择转化株。在37℃、250rpm下使来自各转化中的单个菌落在LB培养基和指定的抗生素中生长至OD600≈1,然后将0.5mL培养物与1mL的50%无菌甘油混合,在干冰上冷冻,然后保存在-80℃下。
表12:用于测定甲羟戊酸比产率的细菌菌株
菌株CMP215、CMP258和CMP234的构建在上文实例6中描述。为了测定甲羟戊酸比产率,使所有菌株一式三份在30℃的TM3培养基中生长过夜,该TM3培养基包含0.1%(w/v)酵母提取物、1%(w/v)葡萄糖和合适的抗生素。将过夜培养物在包含1%(w/v)葡萄糖和0.1%(w/v)或0.02%(w/v)酵母提取物的新鲜TM3培养基中稀释至0.05的OD600。将培养物在34℃下温育直至达到0.5-1.0的OD600,在此时使用400μM IPTG诱导蛋白表达。收集诱导后1小时和2小时的样品以测定OD、甲羟戊酸浓度以及MvaS和MvaE蛋白的浓度。通过将1小时时间段内甲羟戊酸浓度的差值除以1小时时间段内的平均OD(以1小时和2小时OD计算)来确定甲羟戊酸的比产率。
为了测定甲羟戊酸浓度,将300μL的肉汤在14,000×g下离心5分钟。接着,将250μL上清液加入7.5μL的70%(w/v)高氯酸,然后在冰上温育5分钟。然后将混合物在14,000×g下离心5分钟,并且将为HPLC分析所收集的上清液在以下条件下运行:(1)BioRad-Aminex HPX-87H离子排斥柱(300mm×7.8mm)(目录号125-0140)(得自位于加利福尼亚州赫尔克里的伯乐公司(BioRad,Hercules,California));(2)柱温=50℃;(3)BioRad-Microguard Cation H保护柱再填充(30mm×4.6mm)(目录号125-0129)(得自伯乐公司);(4)运行缓冲液=0.01N H2SO4;(5)运行缓冲液流量=0.6ml/min;(6)大致运行压力=~950psi;(7)进样体积=100微升;(8)运行时间=26分钟。
结果。在包含0.1%(w/v)酵母提取物和1%(w/v)葡萄糖的TM3培养基中生长的菌株。构建六种菌株以测试从细菌染色体表达的pgl对甲羟戊酸产生发挥的作用(表13)。如上所述培养菌株。与除了pgl区域缺失外同基因的菌株相比,从细菌染色体表达pgl的菌株具有更高的甲羟戊酸比产率(参见图35),这表明pgl的染色体表达改善大肠杆菌BL21中甲羟戊酸的比产率。甲羟戊酸是甲羟戊酸下游途径的底物。因此,在互补的下游途径和异戊二烯合酶的存在下,具有更高甲羟戊酸比产率的菌株也可具有更高的异戊二烯比产率。
表13:用于测定甲羟戊酸比产率的菌株
菌株名称 | 质粒类型 | pgl |
BL21pCL | pCL | 否 |
BL21+pgl pCL | pCL | 是 |
BL21pBBR | pBBR | 否 |
BL21+pgl pBBR | pBBR | 是 |
BL21pTrc | pTrc | 否 |
BL21+pgl pTrc | pTrc | 是 |
在包含0.02%酵母提取物和1%葡萄糖的TM3培养基中生长的菌株。为了进一步研究在基本培养基中具有低浓度酵母提取物的条件下产生甲羟戊酸时pgl染色体表达的角色,使两种菌株MCM872和MCM876生长在包含如上所述0.02%酵母提取物的TM3培养基中。该生长培养基模拟存在于分批补料发酵的指数部分中的晚期的条件。除了在MCM876中存在的pgl的功能性染色体拷贝外,两种菌株为同基因型的。尽管菌株在基本培养基中的生长类似,但如图36所示,从本实验可清楚地发现,MCM876生长快于MCM872,这表明pgl的染色体表达正面影响大肠杆菌在具有低浓度酵母提取物的基本培养基中的生长。
如图37所显示,MCM876每细胞的甲羟戊酸积累速率显著高于(2.7倍)MCM872,这表明在包含有限水平酵母提取物的基本培养基中生长时细菌染色体上存在pgl显著增加甲羟戊酸产率。
为了研究MCM876菌株中升高的甲羟戊酸生产速率是否由具有低酵母提取物浓度的培养基中更高的蛋白产率所致,测定了途径上游酶MvaS和MvaE的浓度并将其归一化到相应培养物的光密度(图38和39)。在细菌染色体上存在pgl未显著改变在测试的具体生长条件下甲羟戊酸途径酶的浓度。然而,由于在这些生长条件下甲羟戊酸生产速率增加了2.7-倍,因此pgl的染色体表达必定通过某些机制而非通过增加甲羟戊酸途径酶的浓度来提高甲羟戊酸生产速率。一种这样的机制可能为通过戊糖磷酸途径产生还原等价物。在本实验中未对此做进一步检验。
大肠杆菌中pgl的功能性染色体拷贝增加甲羟戊酸的产生,并因而也可能增加异戊二烯的产生,这不仅通过增加在富营养条件下(发酵早期)途径蛋白的产生,也通过在发酵后期具有低酵母提取物浓度的基本培养基生长过程中通过MVA途径控制碳流量的因素来实现。出人意料地,该增加大于在由质粒组成型表达PGL的菌株中之所见,这表明染色体背景或细菌从其天然染色体背景调节PGL表达的能力在诸如异戊二烯的生物化学物质产率增加中发挥着作用。
实例14:在产异戊二烯菌株中PGL酶活性的比较
在以下三种菌株中测定PGL酶活性:RHM111608-2(该大肠杆菌菌株的制备在国际专利公开WO 2009/076676A2的实例13和美国专利申请12/335,071中有所描述)、DW199、CMP312和CMP323(在其他实例中描述)。可通过如文献所述的NMR方法测定酶活性(参见例如E.Micletet al.,J.Biol.Chem.276(37):34840-34846(2001)(E.Miclet等人,《生物化学杂志》,第276卷第37期第34840-34846页,2001年))。RHM111608-2包含在组成型启动子控制下的ybhE基因(编码PGL),DW199不含表达PGL的任何基因,CMP312和CMP323是同基因型的,CMP312具有通过转导而修复的ybhE并为具有缺失ybhE的CMP323的亲本。
如下测定PGL酶活性:简而言之,通过将5mM葡萄糖-6-磷酸、7.5mM NADP+以及具有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的100mM BES pH 7.4(得自位于密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO))温育约3分钟来制备δ-D-6-磷酸-葡萄糖酸-1,5-内酯和γ-D-6-磷酸-葡萄糖酸-1,4-内酯的混合物。在温育后,使溶液在室温下平衡约15-30分钟。随后,将400μL内酯溶液加入NMR比色皿内,然后采集原始光谱(Varian 500mHz,加利福利亚州帕罗奥涂(Palo Alto,CA))。随后,将50μL粗制细胞裂解液加入内酯溶液,然后在2和8分钟时间点时读取NMR光谱。将σ和δ内酯信号归一化至其各自的起始峰强度。用于运行的归一化峰强度显示在表14中。
表14
内酯活性
将菌株在微发酵罐和15L分批补料罐中进行发酵(如上面的实例9和10所述)。在小规模运行或发酵过程中测定所有菌株中的PGL活性。DW199为阴性对照并表明很低的活性至无活性(可观察到微量活性,因为可通过化学催化以低速率进行反应)。在整个运行中RHM111608-2具有类似的活性。CMP323显示类似于DW199的活性水平。在发酵过程中CMP312显示出不同的活性,在当菌株显示出比产率增加时的发酵早期时间点可见较高的活性,而在发酵后期活性较低。细胞调节活性的能力有助于异戊二烯产生的整体改善。
可通过使用转录阵列(NimbleGen/安捷伦科技有限公司)测定ybhE基因在CMP312中的表达。通过将样品收获到RNAlater(得自凯杰公司)中在整个发酵过程中从15L发酵物(如上)中分离RNA样品。使用RNeasy Minikit(得自凯杰公司)根据制造商规范制备RNA样品。由安捷伦科技有限公司进行样品的进一步处理并杂交至定制阵列。使用诸如GeneSpring GX(得自安捷伦科技有限公司)的软件分析ybhE基因的表达。
实例15:在质粒上表达的pgl比对整合在染色体上的pgl
该实例显示在15L规模的分批补料培养物中生长的、表达甲羟戊酸途径和异戊二烯合酶的基因的大肠杆菌BL21产生异戊二烯的情况。
培养基配方(每升发酵培养基):将7.5g K2HPO4、2gMgSO4*7H2O、2g一水柠檬酸、0.3g柠檬酸铁铵、0.5g酵母提取物和1ml1000×改进的痕量金属溶液一起加入并溶解在去离子水中。将溶液在123℃下热力灭菌20分钟,然后使用28%(w/v)氢氧化铵调节至pH=7.0,并定容到最终体积。在灭菌和调节pH之后,将10克葡萄糖、8mLMercury维生素溶液和合适的抗生素加入。
1000×改进的痕量金属溶液(每升):以每次溶解一种物质的方式将40g一水柠檬酸、30g MnSO4*H2O、10g NaCl、1g FeSO4*7H2O、1gCoCl2*6H2O、1g ZnSO4*7H2O、100mg CuSO4*5H2O、100mg H3BO3和100mg NaMoO4*2H2O溶解在去离子水中,使用HCl/NaOH将pH调节至3.0,并将溶液定容到最终体积,然后使用0.22μm过滤膜过滤灭菌。
Mercury维生素溶液(每升):以每次溶解一种物质的方式将1g盐酸硫胺素、1g D-(+)-生物素、1g烟酸、4.8g D-泛酸和4g盐酸吡哆辛溶解在去离子水中,使用HCl/NaOH将pH调节至3.0,并将溶液定容到最终体积,然后使用0.22微米过滤膜过滤灭菌。
进料溶液(每千克):将0.57kg葡萄糖、0.38kg去离子水、7.5gK2HPO4和10g 100%Foamblast混合到一起,然后进行高压灭菌。在将无菌溶液冷却至25℃后,将3.4mL Macro盐溶液、0.8ml 1000×改进的痕量金属溶液和6.7mLMercury维生素溶液加入。
Macro盐溶液(每升):将296g MgSO4*7H2O、296g一水柠檬酸和49.6g柠檬酸铁铵溶解在去离子水中,定容到最终体积,然后使用0.22微米过滤膜来过滤灭菌。
使用两种不同的大肠杆菌BL21细胞菌株在15L生物反应器中进行发酵:(1)DW202表达甲羟戊酸(MVA)上游途径(pCL Upper)、整合的MVA下游途径(PL.2mKKDyI)、来自马氏产甲烷球菌的甲羟戊酸激酶和来自银白杨的截短的异戊二烯合酶(pTrcAlba(MEA)+mMVK(pDW34))以及在质粒pBBRCMPGI1.5-pgl中表达的pgl(参见实例1);(2)CMP234表达甲羟戊酸(MVA)上游途径(pCL Upper)、整合的MVA下游途径(PL.2mKKDyI)、来自马氏产甲烷球菌的甲羟戊酸激酶和来自银白杨的截短的异戊二烯合酶(pTrcAlba(MEA)+mMVK(pDW34));并包含修复的编码pgl基因的染色体17,257bp片段(将菌株构建过程中使用的ybgS::kanR标记环出)。
进行该实验以监控在期望的发酵pH和温度(pH=7.0和34℃)下由葡萄糖产生异戊二烯。将各大肠杆菌菌株的冷冻小瓶解冻,并接种至各反应器中的胰蛋白胨-酵母提取物培养基。在菌种生长至OD550=1.0后,将500mL培养物用于接种15L生物反应器,然后使初始罐体积达到5L。
以指数速率装入进料溶液直至达到5.8g/分钟的顶部进料速率。在此之后,以小于或等于5.8g/分钟的速率加入葡萄糖进料以满足代谢需求。在59小时的发酵中向菌株DW202投入生物反应器的葡萄糖总量为5.5kg,在72小时的发酵中向菌株CMP234投入的为7.8kg。通过加入表15所示水平的异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(“IPTG”)实现了诱导异戊二烯的产生。使用Hiden质谱仪(得自位于英国沃灵顿市的海德公司)测定来自生物反应器的尾气中的异戊二烯含量。在发酵过程中异戊二烯滴度增加至如下最大值:对于菌株DW202在59小时处为56g/L,并且对于菌株CMP234在70小时处为81g/L(参见图42A)。比产率的时间进程显示在图42B中。
表15:在菌株DW202和CMP234的发酵中加入IPTG
菌株 | 诱导 | OD550 | IPTG浓度,μM |
菌株 | 诱导 | OD550 | IPTG浓度,μM |
DW202 | 第一次 | 5 | 100 |
第二次 | 140 | 184 | |
CMP234 | 第一次 | 5 | 110 |
第二次 | 110 | 197 |
本文所提供的标题并未限制可参考作为一个整体的说明书的本发明的各个方面。
尽管为了清晰理解已经通过举例说明和实例的方式相当详细地描述了上述本发明,但对于本领域的普通技术人员将显而易见的是按照本发明的教导内容在不脱离所附权利要求的精神或范围的情况下可进行各种变化和修改。
Claims (26)
1.一种能够产生异戊二烯的大肠杆菌(E.coli)菌株的重组细胞或其子代,所述细胞包含:(a)编码PGL多肽的异源核酸的一个或多个拷贝,其中所述核酸整合在所述大肠杆菌染色体中;以及(b)编码异戊二烯合酶的一种或多种异源核酸;
其中在所述整合之前,所述大肠杆菌细胞不包含编码PGL多肽的核酸,并且
其中所述所得的重组细胞产生的异戊二烯的滴度大于不包含(a)和(b)的相同细胞的该滴度。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌细胞,其中编码钼摄取多肽的异源核酸的一个或多个拷贝被额外整合在所述大肠杆菌染色体中。
3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌细胞,其中所述钼摄取多肽选自modF、modE、modA、modB和modC。
4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌细胞,其中编码半乳糖代谢多肽的异源核酸的一个或多个拷贝被额外整合在所述大肠杆菌染色体中。
5.根据权利要求4所述的重组大肠杆菌细胞,其中所述半乳糖代谢多肽选自galM、galK、galT和galE。
6.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌细胞,其中编码半乳糖代谢多肽的异源核酸的一个或多个拷贝和编码钼摄取多肽的异源核酸的一个或多个拷贝被额外整合在所述大肠杆菌染色体中。
7.根据权利要求6所述的重组大肠杆菌细胞,其中(a)所述PGL多肽是大肠杆菌PGL多肽;(b)所述钼摄取多肽选自modF、modE、modA、modB和modC;并且(c)所述半乳糖代谢多肽选自galM、galK、galT和galE。
8.根据权利要求7所述的重组大肠杆菌细胞,其中编码所述PGL多肽、半乳糖代谢多肽和钼摄取多肽的核酸是如图20中所示17,257碱基对片段的一部分。
9.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌细胞,其中所述细胞产生异戊二烯的比产率高于不包含(a)和(b)的相同细胞的该比产率。
10.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌细胞,其中所述比产率为至少15mg/OD/h。
11.根据权利要求7所述的重组大肠杆菌细胞,其中所述编码PGL多肽、钼摄取多肽和/或半乳糖代谢多肽的核酸来自大肠杆菌菌株K12MG1655或为大肠杆菌菌株K12MG1655的衍生物。
12.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌细胞,其中所述细胞属于大肠杆菌菌株B。
13.根据权利要求12所述的重组大肠杆菌细胞,其中所述细胞属于大肠杆菌菌株BL21。
14.根据权利要求12所述的重组大肠杆菌细胞,其中所述细胞属于大肠杆菌菌株BL21(DE3)。
15.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌细胞,还包含(c)编码甲羟戊酸(MVA)途径上游的多肽和/或MVA途径下游的多肽的异源核酸。
16.根据权利要求7所述的重组大肠杆菌细胞,还包含(d)编码甲羟戊酸(MVA)途径上游的多肽和/或MVA途径下游的多肽的异源核酸。
17.根据权利要求15或16所述的重组大肠杆菌细胞,其中所述MVA途径上游的多肽选自:(i)乙酰乙酰基辅酶A合酶(硫解酶)多肽;(ii)3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶多肽;以及(iii)3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶多肽。
18.根据权利要求15或16所述的重组大肠杆菌细胞,其中所述MVA途径下游的多肽选自:(i)甲羟戊酸激酶(MVK);(ii)磷酸甲羟戊酸激酶(PMK);(iii)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD);以及(iv)异戊烯基二磷酸异构酶(IDI)。
19.根据权利要求16所述的重组大肠杆菌细胞,其中(a)所述PGL多肽是大肠杆菌PGL多肽;(b)所述钼摄取多肽选自modF、modE、modA、modB和modC;并且(c)所述半乳糖代谢多肽选自galM、galK、galT和galE。
20.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌细胞,其中所述异戊二烯合酶多肽来自银白杨(Populus alba)。
21.一种产生异戊二烯的方法,所述方法包括:
(a)在适于产生异戊二烯的培养条件下培养包含权利要求1或7所述重组细胞的组合物,以及
(b)产生异戊二烯。
22.根据权利要求21所述的方法,还包括回收所述异戊二烯。
23.根据权利要求21所述的方法,其中所述重组细胞具有大于约15mg/OD/h的异戊二烯比产率。
24.一种产生甲羟戊酸的方法,所述方法包括:
(a)在适于产生甲羟戊酸的培养条件下培养包含权利要求15所述重组细胞的组合物,以及
(b)产生甲羟戊酸。
25.一种制备根据权利要求1所述的重组细胞的方法,包括:
(a)将编码PGL多肽的异源核酸转导至大肠杆菌细胞内,其中在所述整合之前,所述大肠杆菌细胞不包含编码PGL多肽的核酸;
(b)使所述编码PGL多肽的核酸整合在所述大肠杆菌染色体中;以及
(c)将编码异戊二烯合酶的一种或多种异源核酸引入大肠杆菌细胞内。
26.一种包含根据权利要求1或7所述的重组细胞的组合物。
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