JPS602189A - 新規なプラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はトリプトファンシンターゼの生合成を司る遺伝
子を含む自分を有する新規なプラスミドに関し、さらに
詳しくは、宿主内に安定に維持することのできる。トリ
プトファンシンターゼの生合成を司る遺伝子を含む画分
１例えはトリプトファンオペロンを有するプラスミドに
関する。

トリプトファンオペロンのクローニングについては従来
からいろいろと研究されているが１例えばＪｏｕｒｎａ
ｌ　ｏｆ　Ｇｐｎｇｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
、Ｖｏｌ。

１１８１２５３（１１１１８０）に記載されているよう
に、宿主内での安定性に問題があり、トリプトファンの
工業的製造に応用するには多くの困難があると考えられ
ている。

一部、プラスミドの宿主内での安定性において。

応用的に最も１要な要素は一般に宿主の継代培養におけ
るプラスミドの脱落現象である。そのため。

従来上りプラスミドの脱落を防止するために種々の試み
がなされており１例えば、エシェリヒア属のストレプト
マイシンに依存しないという性質を川る染色体遺伝子Ｄ
ＮＡ７ラグメントが組み込まれたプラスミドケ、エシェ
リヒア椙のストレプトマイシン依存性変異株に含有せし
めて、グラスミドを含有する微生物の性質を安定する方
法が提案されている（特開昭５５−１５６５９１号公報
）。

しかしながら、かかる方法は経済的に圏題があるのみな
らず、目的のプラスミドに複雑な機能を組み込む必要が
あるため、宿主の分裂増殖時にプラスミドが安定に娘細
胞に分配され揃いことが予想され、工業的に応用するに
はかなりの問題がある。

そこで、不発明者らは、トリットファンシンターゼの生
合成を司る遺伝子を含む画分１例えはトリプトファンオ
ペロンを、親泊１月包から娘細月包へと継代ｆ：ｌ’ｌ
に安定に分配することを可能にする機能をつプラスミド
について鋭意研究を行なった。その貼呆１本祐明省らは
、Ｆ因子プラスミド（父はＦ゛プラスミドは通常細胞染
色体当り１〜２個のコピー数しかもたないが、細胞分裂
時に安定に娘細胞に受け継がれていく機構を有している
ことに庸目し、このＦ因子プラスミドの増殖制御分配糸
を司る遺伝子を含む自分と、上記のトリプトファンシン
ターゼの生合成を司る遺伝子を含む画分とを照付せるこ
とにより１本発明を完成するに至った。

しかして１本発明によれば、トリプトファンシンターゼ
の生合成を司る遺伝子を含む自分と　／１因子プラスミ
ドの増殖制御分画系を司る遺伝子を営む画分とを有する
ことを％徴とする新規なプラスミドが提供される。

本発明のプラスミドを構成する「トリプトファンシンタ
ーゼの生合成を司る遺伝子を含む両分」（以下「１画分
」と略称することがある）とけ。

インドールとＬ−又１−ＩＤＬ−セリンからＬ−トリプ
トファンの生合成を司る遺伝子を含む両分を意味し、し
かして、７゛両分に社トリプトファンオペロン又はトリ
プトファンオペロンを含むもつと大きな遺伝子画分、或
いは、トリプトファンオペロン中のトリプトファンシン
ターゼの生合成を司る遺伝子であるＴｒｐ　ＡとＴｒｐ
Ｅにプロモータ及びオペレーターを結合した両分、又は
ｌ’ｒｐ　ＡとＴｒｐ　ＢにＴｒｐ　Ｃ，Ｔｒｐ　Ｄ及
びＴｒｐＭｔ７）少なくとも１ａとプロモーター及びオ
ペレーターを結合シフｔ　画分（例工ば、　Ｉ’ｒｐ　
Ａ、ｉ’ｒｐＢ％ＴｒｐＣ及びＴｒｐＥにプロモーター
及びオペレーターが結合した両分）等が包含される。こ
れらのＴ画分としては実用的には大腸丙由来のものが好
適に吠用され、中でも、トリプトファンオペロンそれ自
体及び７アーヅφ８０ｐｔの遺伝子を制限ｍ累Ｂａｍ１
ｉｌにより切断して得られる約２２．６　ｋ　ｂの分子
ｍｔ有するトリプトファンオペロンを含む画分が有利Ｆ
Ｃ萌用される。

本発明は前述したように、上記の７“画分を、Ｆ因子プ
ラスミドの増殖制御分配系を司る遺伝子を含む画分と組
合わせる点に特徴を有する。、Ｆ因子シラスミドは例え
ば「蛋白・ｄ什核酸　酵素」第２７巻第１号（１９８２
）の９８頁の図１の遺伝子地図及びＥｇｏ　Ｅｌによる
物理的地図に示される如き構造をもつ１分子量が９４．
５ｋｂＣ６２×１０’　ｄｏｌｔｏｎ）の既知のグラス
ミドであシ、大腸菌などの腸内細菌中に通常１而胞染色
体邑り１〜２１固のコピー数で存任し、従って染色体が
則施当り２個あるとすればＦ因子プラスミドとしては２
〜４個しか担われていない。このプラスミ＋″は細胞分
裂時にちょうど倍化してそれぞれの娘細胞に正確に伝六
されるような機構を備えているにりように、コピー数を
低いレベルに保ちつつ、正確に宿主の増殖とペースを会
わせて増やす仕組かをｓｔｒｉｎｇｅｎｔな増殖の制御
と呼んでいる）。Ｆ因子プラスミドにおけるこのような
ｓｔｒｉｎｇｅｎｔな増殖の制御Ｑ能が、ｍ１ｎｉ−Ｆ
と呼ばれる分子量が９．１ｋｂの自律増殖できる断片に
担われていることも既に究明されており、このｍ、１ｎ
ｉ−ＦがＦ因子プラスミドより制限酵素ＥｃｏＲＩ　に
より切り出し可能であることも知られている。

本発明はこの青、１ｎｉ−Ｆ　ＶＣ担われている増殖制
御分配系を利用するものであり、しかして「Ｆ因子プラ
スミドの増殖制御分配系を司る遺伝子を含む両分」（以
下Ｆ画分と略称することがある）とけ、上述したよりな
ｔ゛因子シラスミドを娘細胞に正確に伝達する機構を備
えた遺伝子画分を意味し、そのようなＦ画分の代表例と
して杜約ｔａ、　１ｋ　ｂの分子量を有するｍ１ｎｉ　
−Ｆ画分が挙けられる。

本発明のプラスミドは１以上に述べた７゛画分とＦ画分
に加えて、さらに他の遺伝子画分、例えば各４１ｍ細菌
の薬剤耐性を司る１例えばカナマイシン耐性等の遺伝子
画分２例えばカナマイシン耐性を司る遺伝子画分等を含
有していてもよい。

そのようなプラスミドの代表例として１本発明では、ト
リプトファンオペロン画分及びＦ因子プラスミドのｍ４
ｎｔ　−Ｆ画分を含有し１分子量が約３１、７　ｋ　６
であり且つ下記の制限酵素忙対して下記の感受性を示す
、すなわち （α）ＥｏｏＲＩに対する認識部位が５ケ所であり、（
ｂ）　Ｂａ？７ＬＨＩに対する認識部位が２ケ所であり
。

（（＋）Ｈ４ｎｄＮに対する認識部位が３ケ所であるこ
とｔｌ−特性とするプラスミドｐＭＴＹ−１が提供され
る。

このプラスミドｐＭＴＹ−１ｕ上記のとおり約３１、７
　ｋ　ｂの分子量含有するが、この分子量はアガロース
・ｒルミ気泳妨法により１ｌｌｌ　”ｄしたものである
。

ま１ｃ、プラスミドｐＭＴＹ−１の名種制限酵素に対す
る感受性は上記（α）〜（Ｃ）に示すとおりであり。

より詳細に谷１１７１１限酵素に、ζる分解断片の分子
量Ｃｋｂ）を示せば次のとおりである。

（α）　Ｅｃｏ　Ｒ１富　９．１　、　７．０　、　６
．４　、　６．１　、　３．１（６）　Ｂａｒｎ　ＨＩ
　Ｉ２　Ｚ　６　＃　９−１（６）　ＢｉｎｄＵｌ　１
１＆０，１０．８．Ｌ９以上に述べた如き特性をもつプ
ラスミドｐＭ１’Ｙ−１は例えは矢のようにして製造す
ることができる。

まず、トリプトファンオペロン画分の調製は。

例えば、染色体遺伝子中にトリゾトファンオペロ７”ｉ
　本ツ大腸園１例えば、　Ｅｓｃｈｇｒｉａｈｉａ　ｃ
ｏｌｉＫ−１２（ＩＦＯ３３０１、ＡＴＣＣ１０’１９
Ｂ。

ＡＴＣＣｔｔ２３５６２）などに、ファージ、例えばフ
ァージφ５ｏ（Ａｆｆ’ｃｃｉ　１４５６α−Ｂｌ）々
どを感染させ、溶源化及び肪発現象を利用して、ファー
ジＤＮＡ中にトリシトファンオペロンを取り込んだ７ア
ージを大量に調製し〔ＲｏＭ、ＤｎｎｎｇＩｌ、Ｃ１Ｙ
ａｎｏｆｓｋｙ＄　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、。

１１８．５０５（１９７４）参照〕、それから常法［Ｅ
、　Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　５ａｒｎｂｒｏｏｋ、　”
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｌｏｎｉｎｇ”ｃ　１９８２）ｐ
、１６４〜１６５゜Ｃｏ１ｄ　５ｐｉｎ　Ｈａｒｂｏｒ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ参照〕に従ってファージＤＮＡ
を抽出し、制限酵素１例えばＢαｍＨＩ　、ＥｅｔｏＲ
Ｉ等を用いてトリプトファンオペロンを含む遺伝子画分
を切シ出すことにより行なうことができる。

他方１ｍ、ｉｎｉ　Ｆ画分の調製は１例えば、Ｆ因子プ
ラスミドを保有する値生物１例えば、大腸閾（ｇ、ｃｏ
ｌｉ）　Ｋ　−１２株（Ａ７’Ｃ（１’１５１５３會Ａ
ＴＣＣｇ２３５８９　＊ＡＴＣＣ５２３５９０）等から
それ目体公知の方法で１例えばＰ、Ｇｕｇｒデ焦り、　
Ｌ、　ＬｓＢＬａｙ、　Ｓ、Ｆ’ａｌｋｏｗ　＋　Ｊ、
　Ｈａｃｔ、。

１１６．１０６４（１９７３）等の文献に記載の方法で
Ｆ因子プラスミドを取り出し、それから制限ｍ素ｇｃｏ
ＲＩｆｔ用いて分子址が約９、ｌｋｂのη厖ｎｉＦ断片
を切り田すことにより１製することができる。

このようにして調製されたｍ、ｉｎｉ　Ｆ’断片は、上
目己トリプトファンオペロンを含む＆ｆｉ子画分の切り
出しに用いたと同じ制限師系で処理した後、上記でＴｉ
Ｆ４製したトリプトファンオペロンを含む遺伝子画分と
一緒にし、リガーゼ、例えばＴ４ファーヅ田米のりガー
ゼ等を作用系せて結付させることにより、目的とするプ
ラスミドｐＭＴＹ−１７）Ｖ４！４られる。

なお、プラスミドｐＭＴＹ−１の具体間両製法について
は（支）記実施例１に詳細に説明されている。

このようにして調製される本発明のプラスミドは、コピ
ー数は少ないが、宿主の細胞分裂に除して娘細ｇ＝に正
確に受け継がれ、脱落することが少ないという優れた特
性を有する。

従って１本発明のプラスミドはトリプトファンの製造に
おいて工業８’ｌに応用することが大いに期待される。

トリプトファンの製造に除しては、本発明のプラスξＦ
で宿主が形質転換される。この形質転換に利用できる宿
主園としては、例えは。

大腸藺、枯革圃、サツカロマイセス等が挙げられるが、
これらの中でも大腸−が好ましい、更に。

仁れらの宿主−をトリプトファン要求性質異体としたも
のが特に好ましいものである。

また、これら宿主菌に対する本発明のプラスミドの導入
はそれ自体公知の方法１例えばＭ。

ＭａｎｄｇＬ、　Ａ、　Ｈ４ｇａ：　Ｊ、　Ｍｏ１．　
Ｂｉｏｌ、　５３　。

１５９（１９７０）等の文献に記載の方法で行なうこと
ができる。

このようにして形質転換されたイｄ主蘭はそれ自体公矧
の方法で培養することにより、トリプトファンシンター
ゼを元弁に生産蓄積させた後、インドールとＬ−又Ｆｉ
ＤＬ−セリンとからＬ−トリプトファンを製造する除の
酵素反応に利用することができる。培養された菌体を該
＃１素反応に利用する場会＊　Ｉ４１菌体はそのままで
１更用することができるが、該一体を超音波処理等で破
砕した破砕物。

又はその破砕吻ケさらに水等で抽出した抽出？。

或い＃′ｉ咳佃出物をさらに硫女等で処理してｔガ素成
分を沈減させた粗ｉｊｆ製物の形で反用することもでき
、さらに、該１体又はこれら処理物は必要により固矩化
して用いること本できる。

該菌体又はその処理物の存在下でのインドールとＬ−又
はｎＬ−セリンとの反応は、通常の酵素反応と四様に例
えば０．ＩＭリン＃稜衝液Ｃ’１）Ｂ７．０〜９．０】
あるいは水（ｐＨ”１．０〜９，０）等の浴媒中で、約
２０〜約５０℃、好ましくは約３０〜約４０℃の温度で
通常約１０〜約７２時間行なわれる。

インドールとＬ−又１：ｊ：Ｄ　Ｌ−セリンの反応時の
１史用卸には特に制限ｔゴないが、一般にｔＩ′ｉそれ
ぞれを０．１〜２０％（ｗｔ／ｖｏｗ）の一度馳囲で使
用するのが適当である。また、該国体又はその処理物の
使用宿も特に制限されるものでＩＩｉないが、一層に１
〜１０％（ｗｔ／ｖｏＬ）の濃度で・直用することがで
きる。

なお、上記形質転換されたーの培養は宿主−の４４Ｊｉ
類によって異なるが、一般には１通常用いられる倚成或
いは天然層旭を用いて何なうことができる。しかして炭
素源としては、グルコース、グリセロース、フラクトー
ス、シュクロース、ｍ密等の撞々の炭水化物が１史用で
きる。また、窒素源としては、トリプトン、酵母エキス
、コーンΦスチーデ・リカー、カゼイン訓水分所吻等の
天然有機室業源が滅相できる。天然有暖窒素源の多くは
輩糸源と共に屍系源にもなり得る。

培養ｔよ、振盪培養成いは辿知攪拌深部培嘗などの好ヌ
（的未件下に行うことができる。４＃温度は一般に２０
〜５０℃であ＃）、培地中の培地のｐＨは中性または微
アルカリ性附近に維持することが望ましい。′Ｊ＠賃期
開期間通常１〜５日である。

上目己のような培養方法によって得られた菌体又ＬＩｉ
その処理物を用いてインドールとＬ−、又けＤＬ−セリ
ン會反応せしめて得られる１反応液中に生成したＬ−）
リグトファンの分離・槽製＃ｉ、イオン３ｅ′換倒脂、
活性炭等忙よるＶ、看、脱看処理等の公知の方法により
行うことができる。

また、本発明のプラスミドで形質転換した宿主菌はＬ−
ｈリデトファンの発酵法による生産にも利用することが
できる。すなわち１本発明のプラスミドで形宵転換した
宿主をインドールを含む培地で培養すれば、培地中にＬ
−ｈリデトファンが生産蓄積し、これを採取することに
よりＬ−トリプトファンを製造することができる。

実施例ＩＩプラスミドｐＭＴＹ−１のＡ！ｌ製（４）　
ｒｎｉｎｉ　Ｆ　Ｆｄｉ分の調製太ｗｉｌ、１１　（Ｅ
、Ｃｏ１ｄ）　Ｋ　−１２ｍ株（ＡＴＣＣ１５１５３）
を１１のＬ培地（Ｂａｃｔｏ　トリグートン１０１、酵
母エキス５　ｇ、ＮａＣｌ２１１．グルコース１１水１
ｊｌｐ＃７．２）に接種し、約３７８Ｃで約４時間振盪
培養した後、菌体を集め、リリチウム処理を行ない且つ
ドデシル（ｆｌナトリウム（ＳＤＳ　）を添加して溶−
させた。この溶菌液を３ス０００Ｘ＃で４０分間遠心分
離処坤し、上歯を分画し１次いで馬化セシウムーエチジ
゛ウムプロマイド平衡密度勾配遠心分離処理を行なった
後。

透析処理により、Ｆｉｇ子プラメミドを含む溶液を分散
しｆｃ、この、Ｕ液にエタノール枕誠を行ない。

、ａｔ　ｉ、’＋ｆｉ］に約２０μｓのＦ因子プラスミ
ドを採取した。

次に、　ｍ１ｎｉ　Ｆ画分の調製に除して、上記のＦ因
子プラスミドを５μｇとり、制限酵素であるＮｅ。

ＲＩを３７℃、１時間ｔＦ−用させて該Ｆ因子プラスミ
ドＤＮＡ−を切断し、約９．　ｔ　ｋ　ｂのｔ’ｎ１ｎ
４１”断片を含むＤＮＡ（９敵合−製した。

０　ファージφ５ｏｐｔのダ４１！！！犬腸菌（Ｅ、ｃ
ｏｌｉ）　Ｋ　−１２休（１１４“０３３０１）を１０
０　ｍｌのＬ培地（組成吐前記と同じ）ＶＣ接極し、３
７℃で約４時間振盪した培′＃物の０．２−と。

ファージφ８０（Ａｒｃに１１４５６ａ−Ｂ１）水溶液
（１０１ケ／樅）の０，１−とを、Ｌ培地軟寒天（Ｌ培
地十寒天沫）中に混合したのち、Ｌ培地寒天プレート上
に重層する。該プレートを３７℃にて約５時間培養する
とプラーク（浴明斑）を生じ、さらに２〜３日間３７℃
にて培養を継続すると、プラーク中にファージφ８０溶
原国の生育コロニーを生ずる。該浴原菌をＬ培地にて３
７℃ズ゛４時間培養後、上記と同じＬ培地好天グレート
上に塗抹したのち、紫外線照射（４００〜８００ｔｒｒ
ｇａ／　ＦｌＫ”　、１０〜２０秒）による溶原ファー
ジの８発によりファージφ８０９ｔ（トリプトファンオ
ペロンを含むファージＤＮＡ）１ｒ：調’Ｊ４する。

０　トリプトファンオペロン画分の詞製犬腸自（Ａ’、
ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株（Ｉ　Ｆ　０３３０１）を１１の
Ｌ培地（組成は前記と同じ）に接種し。

約３７℃でｆＪ３時間振盪培養し、対数増殖期に２５優
（ｗ　／　ｗ　）ダルコース溶液ｉｏｍと上記で調製し
たファージφ８０ｐｔ溶液を１０１１ケ／　ｍｌのｉ：
Ａ！度で添加しく７１ＬＯ（２，０）、５時間振盪を継
続後常法通りクロロホルムの添加により、ファージφ８
０７ｙｔを大量にＮｊ７．Ｉ　Ｐした［　’Ｚ’、　Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ。

Ｅ、　Ｉ’、　Ｉ’ｒｉｔｓｃｈ、　Ｓａｔｎｂｒｏｏ
ｋｌＭｏｌｇｃｕＬａｒｃｌｏｎｉｎｇ”ｃ　１９８２
　）　Ｔ）、７６〜８０　ＣｈｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈ
ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　参照］。

次に取得したファージφ５ｏｐｔ浴欣全トリス緩衝液（
ｐＨ７，８）にて透析後、フェノール法により、ＤＮＡ
抽出法〔上記”ＭｏｌｇａｕＬａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”
ｐ、８５参照〕によってファージＤＮＡを抽出精製し、
これに制限酵素ＢａｍＨＩを与え３０℃で３０分間反応
させ、トリプトファンオペロンヲ含む遺伝子画分を得た
。

０　トリプトファンオペロン画分とフルｉｎｉ　Ｆ画分
の結合 前記（至）で得たｒｎｉｎ’ｋｊｌｊ分に制限酵素Ｂａ
ｒｎＨＩを３０℃にて３０分間反応させ１次いで、６０
℃で５分曲熱処理してＨａｍ　Ｉｆ　Ｉを失活させた後
、前記（Ｃ’）で得たトリプトファンオペロン画分を添
加混合し、Ａ’ｌ’ＰＣアゾンシントリホスフェート）
及ヒジチオスレイトールを加え、さらに１１４フアージ
由来のＤＮＡ＋）ガーゼ（ＤＮＡ結合結合用を有する喜
宝酒造（休）＃「Ｔ４ＤＮＡリガーゼ」）を添加した後
、１２℃で１７時間反応を何なった。次いで６０℃で５
分間熱処理して、ＤＮＡ＋）ガーゼを失活させた陵、エ
タノール沈）演法にて、プラスミドｐＭＴＹ−１を採取
した。

得られたプラスミドｐＭＴＹ−１の分子用を。

アガロース・ｒルミ気泳動法により測定した。期用した
アガロース・ｒル屯気泳ｄ装置Ｆｉ、マリツル産業（ｉ
未）襞フラットアがロースグルｉ、気泳動装置ｔｆＫｓ
−８４２２ＦＡｇ型であり、′電気泳動条件に、０．６
係澤天ｒルを作製し、緩衝液（０，０４Ｍ　Ｔｒｉｓ、
０．０４Ｍ酢厳ソーメ、０．００ＢＡ（１！：ＤＴＡ、
併敞でｐＨ８，３にル４整）中に製限酵索（Ｅｃｏ　Ｅ
１％ＢａｍＨＩ又はｌ１ｉｎ、ｄ　ＩＩ　）を用いてプ
ラ、（ミＦｐＭＴＹ’−１を分解さぜ′ｆｃＪ）　Ｎ’
　Ａ断片の混合物を入れ、ｓｏＶ、４〜５時間屯気泳動
させた。

泳動後、■天ｒルを取り出し、エチジウムブロマイドに
て染色［友、２５４　ｎ　ｍ、ＵＶ光で照射してＪ）Ｈ
Ａの移動位置を瑛出し、分子量既テロのＤＮＡ障１片（
λＤＮＡ″ｆ！：ＨｉｎｄＮで分解して侍られたＤＮＡ
＋　オ目光ｆＡ４％工業（株　）製［λ　Ｄ　Ｎ　Ａ　
−Ｈ４ｎ４ｍ　ｄｉｇｇｓｔｓ」）との比紛により分子
４−ｆ決定した。

（４）宿主菌の準備 犬Ｗｋｍ　（１！；、ｃｏｌｉ）　Ｋ　−１２株（ｌｆ
４’ｏ　３３０１）から常法に従い、Ｎ１’Ｇにトロソ
グアニソン）処理によってトリプトファン要求性変異株
を調製した（　ｇ、　Ａ、　Ａｄｍｌｂａｒｇ　ａｔ　
ａＬ、、Ｂｉｏｅｈｎｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｇ、　ノシｇｓ、　Ｃｏｒｒｖｎ、　、　
１　８　、　７　８　８　（１９６５）参照〕。

すなわち、上記に；、ｃｏＬｉ　Ｋ　−１２株をＬ培地
にて同数増殖中期まで培養′Ｌ／、遠心分離により果肯
して画法をｌ’ｒｉｓ−マレインば緩衝液（ｐＨ６，０
）に゛非削１した後、１００μｇ／ゴ〜２００μ９７−
のＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−二トロソグ
アニジン）全添加し、１５〜３０分間パ処理する。、該
処理物を同じ緩衝液にで洗浄後、Ｌ培地に珍加し、３７
℃にて振盪培養を行ない、該培養物は常法に従い、ペニ
シリン握縮法およびレプリカ法を掛川してトリプトファ
ン要求性変異株を単離した。

（ロ）形質転換 上記四で得た大ｔｍ１ｍ７（−１２系体（トリプトファ
ン要求性変異株を、前記実施例で用いたと同じＬ培地ｉ
ｏｎ〕に接種し、３７℃にて振盪培養を行ない、対数壇
夕は中期もしくは、後期まで生材させた醗遠心分離にて
集菌し、これを０℃の水冷下に０、　Ｉ　Ｍ　ｉＷｇＣ
ｌ、及びｏ、　Ｉ　Ｍ　ＣａＣｌ、　ｔｖ水ｒｄ’ｌＯ
ｉ、（ｆｃ懸濁させてＤＮＡ受答状幀菌（コンビ−テン
ト菌）を−製した。こｉｏｒ−に前記実乃例１で得たプ
ラスミドｐＭＴＹ”−１を加え、０℃の水冷下に４０分
間反応させ、次いで４０℃にて３分間加温処理した後。

再度θ℃の水冷下にて２時間反応させた。

次ｋＣＬ培地に上記処理菌体を接種し、３７℃にて１時
間３０分振菫ｉ＠養恢、４心分即にて集菌し。

国体を洗浄後、最少培地（Ｄαυｉ８培地：馬ｈｐｏ。

？　、９．　ＫＨ，ＰＯ４２，９％ｙ　ｇ　ｓ　ｏ、・
’ＩＨ，ＯＯ，１，９％（Ｎ１−１．１．　Ｓｏ、　１
　ｇ、グルコース２Ｆ、純水１〕）にてｌ１ｌｌ製した
子機培地に塗抹し、３７℃にて培養し、生貸したコロニ
ーを再び同Ｊ＠地上で純化した後、形質転換株（Ｔｒｐ
要求性の消失、すなわちプラスミド上のトリプトファン
オペロンにより生合成βＴＶとなり、最少培地上にて生
育可能となった―株）を得た。この形質転換株は茨木県
筑波郡谷田部町東１丁目１番３号の工業技術院微生物工
梁技術研つし所に、昭和５８年　月　日付で受託番号：
徹工研菌寄第　号にて寄託されている。

参考例２Ｉ形質転換休の安定性 前述（７）　Ｌ培地１００　ｍｌを５００１！Ｌｔ容三
角フラスコに介在し、１２０℃で１５分間滅菌処理した
ものに、参考例１で得た形質転換株を植菌し、３７℃に
て２４時間振盪培養を行なった後、同様にして調製した
Ｌ培地にｚｗｇ植継し、同じく３７℃にて２４時間振盪
培養を行ない、この繰作を繰返し実施して計５回の培養
を行なった。

各培＝＃終了時（２４時間培養時）に集國し、画体を洗
浄後、前記最少培地にＬ　−トＩＪブトファン２’ｏｍ
！／／Ｊを冷加して調製した平板耐地に−だ鍛塗抹し、
３７℃にて１日培養しブζ。生白コロニー２００ケ（無
差別・７“ゐ択）をし、トリプトファンを含まない最少
培地に植肉し、３７℃にて２日間培：ｎミ佐、再度回様
の７’ｉｆ少培地に植菌し、生育コロニーをカウントす
る。

この結果、トリプトファン添加培地に生育したコロニー
はすべてトリプトファンを含まない最少培地にも生育す
ること、すなわち該プラスミドの重重すＤノｒ安シ白４
Ｌイヒイビジ認した。

なお、形質転換株中のグラスミド存在の確認試験として
、形質転換株のアクリジンオレンジ処理法により請求性
抹が出現し１寸だ、前記の５ＤＳ−リゾチーム法及び環
化セシウムーエチジウムブロマイド法により、プラスミ
ド確んを併何シてイテない、プラスミドの分子型に変化
の無いことを確認した。

参考例ａ會Ｌ−）ＩＪブト７アンの製造り培地１００ｄ
を５ｏｏＷＬｌ容三角フラスコに分注し、１２０℃で１
５分間滅菌後、形質転換株を植−し、３７℃にて一夜振
盪培養後、同様の培地５００　ｍｌにｌＯ―接櫨し、同
じく３７℃にて５時間振盪培養した。遠心分離により菌
体を回収し。

これ管インドール５００り、ＤＬ−セリン２．、Ｏｌｌ
およびピリドキサールリン［５／ｎｆを含む５０ｍＭリ
ン酸峰衝液（ｐＨ７，５）５０ゴに懸濁し、振盪しなが
ら３０℃、７２時間反応を行なった。反応終了後液を１
０−とり、メタノール１０ｗＬｔを加えて叡しく攪拌し
た後、遠心分離により得念上置液について商運液体クロ
マトグラフィーで生滅したＬ−トリプト７アンの分析を
行なったところ。

１５／′ｔｇ／―の生成が認められた。

反応終了液５０１に苛性ソーダ水溶液を加えてｐツノｌ
Ｏにしたのち、アンモニア”Ｊｌ　％　ｒ扱住イオン父
侯柄脂（ダイヤイオン５ＫＩ−Ｂ、三菱化成製）のカラ
ム’ｒ−；１４１してＬ−）リデトファンヲ吸盾せしめ
、２Ｎ−アンモニア水で１〜３出せしめた。俗出γ夜を
展節してＬ−トリプトファンの粗結晶を析出さぜ１この
ち、こノ′Ｌをアセトンでθをン手し、早乙燥してＬ−
トリプトファンの結晶を３６０９侍だ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、トリプトファンシンターゼの生合成を司る遺伝子を
   含む両分と、Ｆ因子プラスミドの増殖制御分配系を司る
   遺伝子を含む画分とを有することを特徴とする新規なプ
   ラスミド。 ２　トリプトファンシンターゼの生合成を司る遺伝子を
   含む画分がトリプトファンオペロンである特許請求の範
   囲第１項記載のプラスミド。 ＆　トリプトファンシンターゼの生合成を司る遺伝子を
   含む両分が大腸菌由来のものである特許請求の範囲第１
   項記載のプラスミド。 ４、Ｆ因子プラスきドの増殖制御分配系を司る遺伝子を
   含む一分がｍ１ｎｉ−Ｆ画分である特許請求の範囲第１
   項記載のプラスミド。 ５、トリプトファンオペロン画分及びＦ因子プラスミド
   のｍ１ｎｉ−Ｆ画分を含有し１分子葡が約３ＬＴｋｈで
   あり且つ制限酵ｇＥｃｏＥＩ、ＢａｍＨｌ及び１ノ（ル
   ｄｉに対するｇ＝部位が、それぞれ５ケｒ９ｒ、　２ケ
   所及び３ケ所であることを特徴とするプラスミドｐＭ１
   ’Ｙ−１である特許請求の範囲第１項記載のプラスミド
   。 ６、　プラスミドｐＭＴＹ−１で形質転換された大腸菌
   （Ｅａｃｈｔｔｒｉｅｈｉａ　ｃｏｌｔ　）　Ｋ　−１
   ２トリプトファン要求性変異株。 ７、トリプトファンシンターゼの生合成を司る遺伝子を
   含む両分と、Ｆ因子プラスミドの増殖制御分配系を司る
   遺伝子を含、む画分とを有するプラスミドで形・Ｑ転換
   された大腸菌の培養物又はその処理物の存仕下に、イン
   ドールとＬ−又１′１ＤＬ−セリンとを反応せしめるこ
   とを特徴とするＬ−）リプトファンの製造方法。 ８、大腸菌がＬ−トリシトファンの分解活性を有しない
   菌株である特許請求の範囲第７項記載の方法。