Verfahren zur Anreicherung von Aneurin in pflanzlichen Mikroorganismen. Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anreicherung von Aneurin in pflanzlichen Mikroorganismen, und zwar in solchen, die für Nährzwecke geeignet sind.
Durch Zugabe von Aneurin zur gärenden Hefe kann der Vitamin-B,- Gehalt der Hefe beträchtlich gesteigert werden. Aneurin ist aber für diesen Zweck ein verhältnismässig kostspieliges Ausgangsmaterial.
Gemäss der vorliegenden Erfindung er folgt die Anreicherung von Aneurin in pflanzlichen Mikroorganismen in der Weise, dass man auf die Mikroorganismen Pyrimidin- und Thiazolderivate, zweckmässig in äqui- molaren Mengen, einwirken lässt.
Der Zusatz kann dabei bei der Züchtung der betreffen den Mikroorganismen erfolgen, also beispiels weise bei der Züchtung von Hefen im Lüf tungsverfahren, unter Verwendung der ver schiedenartigsten Nährlösungen, wie Melasse, Würzen und Maischen aus Getreide, Kartof feln und andern stärkehaltigen Rohstoffen, Zuckerlösungen aus Rohrzucker, Glukose oder dergleichen, Holzzuckerlösungen, Sulfit- ablaugen und andern technischen zuckerhal tigen Abwässern. Der Zusatz der Pyrimidin- und der Thiazolderivate kann aber auch bei der Vergärung der vorstehend erwähnten zuckerhaltigen Lösungen vorgenommen wer- den.
Auch nach stattgehabter Gärung oder Züchtung kann die Zugabe der genannten Derivate erfolgen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens werden die Pyrimidin- und die Thiazolderivate mit den Mikroorganismen in Wasser zusammen gebracht, wobei man zweckmässig durch Rüh ren oder Schütteln ein Absitzen der Mikro organismen verhindert. Das Verhältnis zwi schen Wasser und Mikroorganismen kann in weiten Grenzen schwanken. Hefe z. B. kann man in dickbreiig-wässrigem Zustand ver arbeiten.
Ein für die Durchführung des erfin dungsgemässen Verfahrens geeigneter Mikro organismus ist insbesondere die Torula utilis. Aber auch mit Presshefe konnte eine erheb liche Aneurin-Anreicherung erzielt werden. Das neue Verfahren ist nicht auf die Ver wendung von Hefen beschränkt, auch Pilze, wie beispielsweise Oidium lactis und En- domyces vernalis, asperg_ illus oryzae, können benutzt werden.
Aus den zugesetzten Pyrimidin- und Thi- azolderivaten synthetisieren die betreffenden MikroorganismenAneurin, das grösstenteils in Form von Vitamin-B,-Pyrophosphorsäure (Cocarboxylase) entsteht; gleichzeitig werden erhebliche Mengen Vitamin B, gespeichert. Gegenüber dem bekannten Verfahren, bei dem das fertige Aneurin der gärenden Hefe zugesetzt wird, hat das erfindungsgemässe Verfahren den Vorteil, dass von wesentlich billigeren Ausgangsstoffen ausgegangen wer den kann.
In erster Linie kommt zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens die An wendung von 2-Methyl-4-amino-5-oxymethyl- pyrimidin und 4-Methyl-5-oxäthyl-thiazol in Betracht. Diese Substanzen stehen den bei der Spaltung vonAneurin anfallendenBruch- stücken am nächsten, wobei jedoch erwähnt sei, dass Aneurin in vitro aus diesen Verbin dungen nicht ohne weiteres synthetisiert wer den kann.
Besonders zweckmässig ist es, zur Durchführung des erfindungsgemässen Ver fahrens solche Pyrimidin- und Thiazolderivate zu benutzen, die leichter als die vorstehend erwähnten Derivate zugänglich sind, die also bei der Reaktionsfolge, die zur chemischen Synthese des Aneurin führt, als Ausgangs stoffe dienen.
Als derartige Pyrimidinderi- vate seien beispielsweise 2-Methyl-4-amino-5-nitrilo-pyr imidin, 2-blethyl-4-amino-5-aminomethyl-pyrimidin, 2-Methyl-4-amino-5-carbomino-methyl- pyrimidin, 2-Methyl-4-hal-5-pyrimidyl-essigester oder 2-Methyl-4-oxy-5-pyrimidyl-essigester erwähnt. Geeignete Thiazolderivate sind u. a.:
4-141:ethyl-5-äthoxyäthyl-thiazol und 4-Methyl-ss-halogenäthyl-thiazol und insbesondere 4-Methyl-ss-chloräthyl-thiazol. Die zur Anwendung gelangenden Mengen von Pyrimidin- und Thiazolderivaten können ; innerhalb weiter Grenzen geändert werden. Bei relativ hohen Konzentrationen werden die behandelten Mikroorganismen ausserordent lich vitaminreich, jedoch erfolgt dabei die Ausnützung der Ausgangskomponenten weni- ; ger rationell.
Eine grössere Menge derselben verbleibt unverbraucht in der Flüssigkeit, je doch kann man die von den Mikroorganismen befreite Flüssigkeit mit oder ohne Ergänzung der verbrauchten Menge an Pyrimidin- und an Thiazolderivaten mit weiteren Mikroorga nismen erneut zum Ansatz bringen. Bei An wendung von verhältnismässig hohen Konzen trationen wird ein grösserer Teil des anfal lenden Aneurins als freies Aneurin erhalten, während der in Cocarboxylase übergeführte Anteil geringer ist.
Wendet man die Pyri- midin- und Thiazolderivate in relativ nied riger Konzentration an, dann ist ihre prozen tuale Ausnützung günstiger und der Anteil an phosphoryliertemAneurin (Cocarboxylase) höher. Der absolute Vitamingehalt der betref fenden vorbehandelten Mikroorganismen ist dann aber vergleichsweise niedriger.
Für die in der Zelle erfolgende Umwandlung von Aneurin in Aneurinpyrophosphat (Cocarbo- xylase) spielt übrigens die zugesetzte bezw. vorhandene Menge an organisch gebundenem. und anorganischem Phosphat eine Rolle.
Das in den Mikroorganismen angespei- cherte Aneurin kann in üblicher Weise iso liert werden. In manchen Fällen wird ein Teil des Aneurins an die umgebende Flüssig keit abgegeben, was insbesondere bei der Ver arbeitung von Presshefe der Fall ist. Auch dieses Aneurin kann in bekannter Weise als Konzentrat oder in reinem Zustande gewon nen werden.
Im folgenden soll die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens an Hand von einigen Ausführungsbeispielen näher erläu tert werden.
<I>Beispiel 1:</I> Bei der üblichen Züchtung von Torula utilis in Holzzucker (vergl. Fink und Krebs, Biochem. Zeitschrift 302, 1, 1939) nach dem Lüftungsverfahren wurden. 7 mg 4-Methyl- 5-oxäthyl-thiazol und 7 mg 2-Methyl-4- amino-5-oxymethyl-pyrimidin zugegeben.
Aus 12,0 Torula-Stellhefe <B>(23,2%</B> Trockensub- stanzgehalt, mit 21y Vitamin B, in 1 g Trok- kensubstanz) wurden 56,3 g Erntehefe erhal ten (21,0% Trockensubstanz), die 208 y Vit amin B,. pro 1 g Trockensubstanz, davon 162 y in Form von Cocarboxylase enthielt. Gegen über der Ausgangshefe wurde also eine Vit- amin-B,,-Anreicherung auf 1000,% erzielt.
Der Gehalt an Cocarboxylase hatte sich etwa verneunfacht.
<I>Beispiel 2:</I> 10 g Torula utilis mit einem Vitamin-B,.- Gehalt von 20 y in 1 g Trockensubstanz wur den in 200 cm' einer Lösung, die 20 g Glu cose und ein übliches Nährsalzgemisch ent hielt, unter Zugabe von 2800 y Thiazol- und 2800 y Pyrimidinderivat aufgeschwemmt und mehrere Stunden der Gärung überlassen.
Die so vorbehandelte und gewaschene Hefe ent hielt 749 y Vitamin B,. in 1 g Trockensub stanz, davon<B>97%</B> in phosphorylierter Form als Cocarboxylase. Der -Vitamin-B,-Gehalt dieser Hefe war also auf das 35fache der Ausgangshefe gestiegen.
Bei einem ähnlichen Ansatz, der aber nur der oben zugesetzen Thiazol- und Pyrimi- i dinmengen enthielt, betrug der Vitamin gehalt der angereicherten Hefe 241 y/1 g Trockensubstanz, das ist das 12fache der Ausgangshefe.
Wurden in der von der angereicherten Hefe abgetrennten Gärflüssigkeit nochmals 10 g Hefe aufgeschwemmt und wiederum der Gärung überlassen, so resultierte wieder eine Vitamin-B,,-angereicherte Hefe, die das 10- bezw. 25fache der Ausgangshefe an Vitamin B,, zumeist in der phosphorylierten Form, enthielt.
<I>Beispiel 3:</I> 10g Br ennereihefe mit einem Vitamin- B,-Gehalt von 35 y pro 1 g Trockensubstanz s wurden in 200 cm' einer Lösung, die 20 g Melasse und ein übliches Nährsalzgemisch enthielt, unter Zugabe von je 7 mg Thiazol- und Pyrimidinderivat aufgeschwemmt und der Gärung überlassen. Die so vorbehandelte Hefe enthielt 1087 y Vitamin B,. pro 1 g Trockensubstanz. Der Vi-tamin-BI-Anreiche- rungseffekt betrug also hierbei 3000%, be zogen auf die Ausgangshefe.
<I>Beispiel</I> 10 g Torula utilis mit einem Vitamin gehalt von 21 y in 1 g Trockensubstanz wur den in 200 cm' Leitungswasser unter Zugabe von je 7 mg Thiazol- und Pyrimidinderivat aufgeschwemmt und einige Stunden geschüt telt. Die so vorbehandelte und gewaschene Hefe enthielt 1151 y Vitamin B,. pro 1 g Hefetrockensubstanz. Der Anreicherungs effekt betrug also mehr als 5000%, bezogen auf die Ausgangshefe.
Der gleiche Anreicherungseffekt wurde auch dann erzielt, wenn die Wassermenge auf 1/4 der obigen verringert wurde, so dass der Hefeansatz ziemlich dickbreiig war. Die so vorbehandelte Hefe enthielt 1181y Vit amin B,. in 1. g Trockensubstanz und war somit auf etwa das 60fache der Ausgangs hefe angereichert.
Ein ähnliches Ergebnis wurde erhalten, wenn nur '/" der obigen Thiazol- und Pyrimidinmengen zugesetzt wurden. Die Hefe enthielt in diesem Falle 497 y Vitamin B, in 1 g Trockensubstanz, das ist also etwa 25mal mehr als die Ausgangshefe.
<I>Beispiel 5:</I> 220 em@ sterile 6 % ige Malzwürze wurden mit 715, y Thiazol- und 690 y Pyrimidinderi- vat versetzt und mit Oidium lactis beimpft. Der nach einigen Tagen geerntete Pilz ent hielt 180 y Vitamin B, pro 1 g Trockensub stanz, während er ohne Zugabe im sonst gleichen Kontrollansatz nur 65 y enthielt. Es war also eine Anreicherung im Vitamin-B,- Gehalt auf rund das dreifache erzielt worden.
<I>Beispiel 6:</I> 220 cm' sterile 6 % ige Malzwürze wurden mit 715<I>y</I> Thiazol- und 690<I>y</I> Pyrimidin- derivat versetzt und mit Endomyces vernalis beimpft. Der nach einigen Tagen geerntete Pilz enthielt 92 y Vitamin B, pro 1 g Trok- kensubstanz, während er im gleichen Kon- trollansatz, aber ohne Zusätze, nur 18 y auf wies.
Es war also eine Anreicherung im Vitamin-B,-Gehalt auf rund das fünffache eingetreten.
Beispiel 220 cmj sterile 6%ige Malzwürze wurde mit 715<I>y</I> Thiazol- und 690<I>y</I> Pyrimidinderi- vat versetzt und mit Aspergillus oryzae be- impft. Der nach einigen Tagen geerntete Pilz enthielt 153 y Vitamin B1 pro 1 g Trolt- kensubstanz, während er im gleichen Kon- trollansatz nur 18 y enthielt.
Es wurde also eine Vitamin-B,-Anreicherung auf das rund achtfache' erzielt.
Wurde in der von der angereicherten Hefe abgetrennten Flüssigkeit nochmals neue Ausgangshefe aufgeschwemmt, so resultierte wieder eine fast ebenso beträchtlich ange reicherte Hefe, da die zugesetzten Mengen an Thiazol- und Pyrimidinderivaten beim ersten Mal nicht erschöpft worden waren. Der An reicherungseffekt gelang sogar mit fast der gleichen Wirkung ein drittes Mal.
Process for the accumulation of aneurin in plant microorganisms. The present invention relates to a method for the enrichment of aneurin in plant microorganisms, specifically in those which are suitable for nutritional purposes.
By adding aneurine to the fermenting yeast, the vitamin B content of the yeast can be increased considerably. However, aneurine is a relatively expensive starting material for this purpose.
According to the present invention, the enrichment of aneurine in plant microorganisms takes place in such a way that pyrimidine and thiazole derivatives are allowed to act on the microorganisms, expediently in equimolar amounts.
The addition can be made during the cultivation of the relevant microorganisms, for example when cultivating yeast in the ventilation process, using a wide variety of nutrient solutions, such as molasses, condiments and mashes made from grain, potatoes and other starchy raw materials, sugar solutions Cane sugar, glucose or the like, wood sugar solutions, sulphite waste liquors and other technical wastewater containing sugar. The pyrimidine and thiazole derivatives can also be added during the fermentation of the above-mentioned sugar-containing solutions.
The derivatives mentioned can also be added after fermentation or cultivation has taken place.
In a preferred embodiment of the process according to the invention, the pyrimidine and thiazole derivatives are brought together with the microorganisms in water, in which case the microorganisms are advantageously prevented from settling by stirring or shaking. The ratio between water and microorganisms can fluctuate within wide limits. Yeast e.g. B. you can work ver in a thick, watery state.
A suitable microorganism for carrying out the method according to the invention is in particular the Torula utilis. However, a considerable enrichment of aneurine could also be achieved with compressed yeast. The new method is not restricted to the use of yeasts; fungi such as Oidium lactis and Endomyces vernalis, asperg_illus oryzae, can also be used.
From the added pyrimidine and thiazole derivatives, the microorganisms in question synthesize aneurine, which is largely produced in the form of vitamin B, pyrophosphoric acid (cocarboxylase); At the same time, significant amounts of vitamin B are stored. Compared to the known method in which the finished aneurine is added to the fermenting yeast, the method according to the invention has the advantage that it is possible to start from significantly cheaper starting materials.
Primarily, the use of 2-methyl-4-amino-5-oxymethyl-pyrimidine and 4-methyl-5-oxethyl-thiazole come into consideration for carrying out the process according to the invention. These substances are closest to the fragments resulting from the cleavage of aneurin, although it should be mentioned that aneurin cannot be easily synthesized in vitro from these compounds.
It is particularly useful to carry out the process according to the invention to use those pyrimidine and thiazole derivatives that are more easily accessible than the above-mentioned derivatives, that is, they serve as starting materials in the reaction sequence that leads to the chemical synthesis of aneurine.
Examples of such pyrimidine derivatives are 2-methyl-4-amino-5-nitrilo-pyrimidine, 2-methyl-4-amino-5-aminomethyl-pyrimidine, 2-methyl-4-amino-5-carbomino-methyl- pyrimidine, 2-methyl-4-hal-5-pyrimidyl-ethyl acetate or 2-methyl-4-oxy-5-pyrimidyl-ethyl acetate mentioned. Suitable thiazole derivatives are u. a .:
4-141: ethyl-5-ethoxyethyl-thiazole and 4-methyl-ß-haloethyl-thiazole and in particular 4-methyl-ß-chloroethyl-thiazole. The amounts of pyrimidine and thiazole derivatives used can; can be changed within wide limits. At relatively high concentrations, the treated microorganisms are extraordinarily rich in vitamins, but the starting components are used less; ger rational.
A larger amount of the same remains unused in the liquid, but the liquid freed from the microorganisms can be used again with or without supplementing the amount of pyrimidine and thiazole derivatives used with further microorganisms. When using relatively high concentrations, a larger part of the aneurine incurred is obtained as free aneurine, while the proportion converted into cocarboxylase is lower.
If the pyrimidine and thiazole derivatives are used in relatively low concentrations, their percentage utilization is more favorable and the proportion of phosphorylated neurin (cocarboxylase) is higher. The absolute vitamin content of the pretreated microorganisms in question is then comparatively lower.
For the conversion of aneurine into aneurine pyrophosphate (cocarboxylase) taking place in the cell, the added resp. existing amount of organically bound. and inorganic phosphate play a role.
The aneurine accumulated in the microorganisms can be isolated in the usual way. In some cases, part of the aneurine is released into the surrounding liquid, which is particularly the case when processing compressed yeast. This aneurine can also be obtained in a known manner as a concentrate or in the pure state.
In the following, the implementation of the method according to the invention will be explained in more detail using a few exemplary embodiments.
<I> Example 1: </I> In the usual cultivation of Torula utilis in wood sugar (cf. Fink and Krebs, Biochem. Journal 302, 1, 1939) using the ventilation method. 7 mg of 4-methyl-5-oxethyl-thiazole and 7 mg of 2-methyl-4-amino-5-oxymethyl-pyrimidine were added.
From 12.0 Torula yeast <B> (23.2% </B> dry matter content, with 21% vitamin B, in 1 g dry matter), 56.3 g harvest yeast (21.0% dry matter) were obtained who have favourited 208 y vitamin B ,. per 1 g of dry matter, of which 162 y contained in the form of cocarboxylase. Compared to the starting yeast, a vitamin B1 enrichment of 1000% was achieved.
The cocarboxylase content had increased about nine-fold.
<I> Example 2: </I> 10 g of Torula utilis with a vitamin B, .- content of 20% in 1 g of dry matter were in 200 cm 'of a solution containing 20 g of glucose and a conventional nutrient salt mixture , suspended with the addition of 2800 y thiazole and 2800 y pyrimidine derivative and left to ferment for several hours.
The yeast pretreated and washed in this way contained 749 y vitamin B. in 1 g dry substance, of which <B> 97% </B> in phosphorylated form as cocarboxylase. The vitamin B, content of this yeast had risen to 35 times that of the starting yeast.
In a similar approach, which only contained the amounts of thiazole and pyrimidine added above, the vitamin content of the enriched yeast was 241 μg / 1 g of dry matter, which is 12 times that of the starting yeast.
If another 10 g of yeast were suspended in the fermentation liquid separated from the enriched yeast and left to ferment again, the result was again a vitamin B ,, - enriched yeast, which contained the 10 or 25 times as much vitamin B as the starting yeast, mostly in the phosphorylated form.
<I> Example 3: </I> 10g distillery yeast with a vitamin B, content of 35 y per 1 g of dry matter s were in 200 cm 'of a solution containing 20 g of molasses and a conventional nutrient salt mixture, with the addition of 7 mg each of thiazole and pyrimidine derivatives are suspended and left to ferment. The yeast pretreated in this way contained 1087 y of vitamin B. per 1 g of dry matter. The vitamin BI enrichment effect was thus 3000% in relation to the starting yeast.
<I> Example </I> 10 g of Torula utilis with a vitamin content of 21% in 1 g of dry matter were suspended in 200 cm of tap water with the addition of 7 mg of thiazole and pyrimidine derivatives and shaken for a few hours. The yeast pretreated and washed in this way contained 1151 y of vitamin B. per 1 g yeast dry matter. The enrichment effect was therefore more than 5000%, based on the starting yeast.
The same enrichment effect was also obtained when the amount of water was reduced to 1/4 of the above, so that the yeast batch was quite thick. The yeast pretreated in this way contained 1181y vitamin B. in 1. g dry matter and was thus enriched to about 60 times the starting yeast.
A similar result was obtained when only 1/ "of the above amounts of thiazole and pyrimidine were added. In this case, the yeast contained 497 y of vitamin B in 1 g of dry matter, which is about 25 times more than the starting yeast.
<I> Example 5: </I> 220 em @ sterile 6% malt wort were mixed with 715 y thiazole and 690 y pyrimidine derivatives and inoculated with Oidium lactis. The mushroom harvested after a few days contained 180 y of vitamin B per 1 g of dry substance, while it contained only 65 y in the otherwise identical control batch without addition. An enrichment in the vitamin B content of around three times as much was achieved.
<I> Example 6: </I> 220 cm 'sterile 6% malt wort were mixed with 715 <I> y </I> thiazole and 690 <I> y </I> pyrimidine derivatives and inoculated with Endomyces vernalis . The mushroom harvested after a few days contained 92 y vitamin B per 1 g dry substance, while in the same control batch, but without additives, it had only 18 y.
So there was an enrichment in the vitamin B, content to around fivefold.
Example 220 cm3 of sterile 6% malt wort was mixed with 715 thiazole and 690 y pyrimidine derivatives and inoculated with Aspergillus oryzae. The mushroom harvested after a few days contained 153 y vitamin B1 per 1 g cloud substance, while it contained only 18 y in the same control batch.
A vitamin B enrichment was thus achieved by around eightfold.
If new starting yeast was floated again in the liquid separated from the enriched yeast, the result was again an almost equally considerably enriched yeast, since the added amounts of thiazole and pyrimidine derivatives were not exhausted the first time. The enrichment effect even succeeded a third time with almost the same effect.