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Herstellung und Gewinnung von Pimaricin Die Erfindung bezieht sich
auf die Herstellung und Gewinnung des neuen, vorteilhaften Antibiotikums Pimaricin
auf mikrobiologischem Wege unter Verwendung einer bisher unbekannten Spezies von
Streptomyces.
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Die Herstellung erfolgt durch die Kultur von Streptomyces natalensis
nov. spec., dessen Eigenschaften weiter unten beschrieben werden, auf aerobem Wege,
wobei das Pimaricin sich bildet, das dann aus dem Fermentationsmedium gewonnen wird.
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Die Gewinnung des Antibiotikums aus der flüssigen Kultur und;oder
dem Mycel kann mit Vorteil durch Extrahieren mittels eines mit Wasser begrenzt mischbaren
Alkohols geschehen, z. B. Butanol, oder durch Behandeln mit Methanol (einer Methanollösung
von Calciumchlorid) mit nachfolgendem Konzentrieren des Extraktes und Reinigen mit
Hilfe von Lösungsmitteln.
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Die das Antibiotikum gemäß der Erfindung produzierenden Mikroorganismen
wurden aus einem Boden aus Pieter Maritzburg in der Provinz Natal (Südafrika) gewonnen.
Es handelt sich um einen Aktinomyceten der Familie Streptomyces, dem der Name Streptomyces
natalensis gegeben wurde.
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Die morphologischen und physiologischen Eigenschaften des Mikroorganismus
sind folgende: Morphologische Eigenschaften: Hyphae verzweigt, unregelmäßig verdreht,
in der Wachstumszone oft praktisch gerade und zueinander parallel, 0,3 bis 0,7 #t
dick, für gewöhnlich von gleichförmiger Dicke, jedoch manchmal mit örtlichen Verdickungen.
Die sporenbildenden Hyphae als einfüßige, seitliche Zweige am Luftmycel. Sporen
in unregelmäßig gekräuselten Ketten, selten in lose spiralig gewundenen Ketten.
Sporen durch kurze Zwischenstücke ohne Protoplasma voneinander getrennt, oval, rund
oder orangenförmig (tangerin), 0,7 bis 1,2 0,7 bis 0,8#L.
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Kultureigenschaften beim Züchten auf den im folgenden aufgeführten
Substraten (nach 7 Tagen bei 25° - wenn nicht anders angegeben) Tabelle I (Die angegebenen
Farben beziehen sich auf Ridgway, Color Standards and Nomenclature [1912]) Hafermehl-Agar:
Gutes Wachstum, vegetatives Mycel und Rückseite farblos. Nach 28 Tagen einige Kolonien
am Boden und am oberen Teil des Rohrs. Auf der Rückseite chamois gefärbt, nach 57
Tagen etwas dunkler (warmgelbbraun). Die Kolonie ist praktisch flach, getrennte
Kolonien im Zentrum ein wenig erhöht. Das Luftmycel blaßmausgrau bis hellmausgrau,
staubig und verfilzt, nach 28 Tagen ein Drittel grau, nach 57 Tagen gelblichgrau.
Riecht erdig mit zusätzlichem säuerlichem Geruch. Kein lösliches Pigment. Kartoffel-Agar:
Mäßiges Wachstum. Das vegetative Mycel hell mineralisch grau bis blaßolivbraungelb.
Rückseite: Kremfarben, nach 57 Tagen kremigbraungelb bis chamois, Kolonien feucht,
etwas erhöhtes Luftmycel, das die Kolonie zum Teil bedeckt. Luftmycel nach 7 Tagen
weiß und verfilzt, nach 28 Tagen gelblichgrau, die Kolonie zu 30 bis 70 °/o überdeckend.
Kein lösliches Pigment. Unangenehm erdig riechend.
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Kartoffel: Gutes Wachstum. Vegetatives Mycel feucht, erhabene Klumpen,
blaß, rosa, gelbbraun bis rosagelbbraun, nach 28 Tagen tiefolivgelbbraun. Rückseite
an der Glaswand nach 28 Tagen chamois. Nach 7 Tagen kein Luftmycel. Nach 28 Tagen
reichlich Luftmycel, zuerst weiß, dann blaßmausgrau, nach 57 Tagen grau mit gelblichgrauem
Ton. Die Kartoffel nach 7 Tagen nicht verfärbt, nach 57 Tagen ebenso wie die Flüssigkeit
am Boden des Rohrs zu einem gelbbraunen Ton verfärbt. Riecht erdig.
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Sabouraud-Glukose-Agar: Mäßiges Wachstum. Vegetatives Mycel klumpig,
erhaben, nach 7 Tagen olivgelbbraun wie die Rückseite, nach 28 Tagen dunkler (tiefolivgelbbraun
bis dunkelolivgelbbraun). Die Rückseite hat nun Tonfarbe. Das Luftmycel ist zunächst
weiß,
kurz und verfilzt, nachher mattmausgrau. Kein lösliches Pigment nach 7 Tagen erkennbar,
jedoch nach 57 Tagen mittelkastanienbraun.
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Emerson-Agar: Sehr gutes Wachstum. Vegetatives Mycel olivgelbbraun.
Die Rückseite erscheint dunkler (kremiggelbbraun bis chamois). Das Luftmycel ist
kurz und filzig, weiß. Kein lösliches Pigment. Riecht stark erdig.
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Stärke-Agar: Mäßiges Wachstum. Vegetatives Mycel und Rückseite blaßolivgelbbraun.
Kolonie ein wenig erhaben, bedeckt etwa zur Hälfte durch filziges, weißes Luftmycel.
Kein lösliches Pigment. Riecht stark erdig.
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Glukosenitrat-Agar: Gutes Wachstum. Runde, feuchte, graue Kolonien,
im Zentrum etwas erhaben, etwa 2 bis 2,5 mm Durchmesser (heller als mattolivgelbbraun).
Luftmycel kärglich, in Tüpfeln oder konzentrischen Ringen, filzig, weiß. Kein lösliches
Pigment. Riecht erdig.
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Natriumcitrat-Agar: Sehr geringes Wachstum. Runde, feuchte, graue
Kolonien, im Zentrum etwas erhaben, etwa 1 mm Durchmesser (heller als mattolivgelbbraun).
Rückseite mattohvgelbbraun. Kein lösliches Pigment. Kein. Geruch.
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Nähr-Agar: Gutes Wachstum. Kolonie feucht, leicht erhaben, sehr klein,
nasse Büschel, rauh und wirr, mit flachen und unbestimmten hirnartigen Windungen,
kremfarben bis lremiggelbbraun. Riecht unangenehm. Kein lösliches Pigment.
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Czapek-Agar (13 Tage): Wachstum sehr spärlich. Vegetatives Mycel durchsichtig.
Kein Luftmycel. Kein lösliches Pigment.
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Bacto-Agar, 2°%: Wachstum sehr spärlich, nicht vor 13 Tagen zu erkennen.
Vegetatives Mycel durchsichtig. Kein Luftmycel. Kein lösliches Pigment.
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Der gemäß der Erfindung für die Erzeugung von Pimaricin verwendete
Organismus gehört zur Streptomycesart und ist nicht identisch mit irgendeiner bisher
beschriebenen Streptomyces-Spezies. In Hinblick auf die im einzelnen oben ausgeführten
Eigenschaften gehört er in Gruppe 1 gemäß Waksman in Bergey's Manual (zum Vergleich
auch S. A. Waksman, »The Actinomycetes«, 1950, S. 30).
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Streptomyces natalensis nov. spec. kann auch in die Reihe der »Neo-Ingric;
von Baldacci (zum Vergleich Symposium Actinomycetales. VIth Congr. Intern. Microb.
Roma, 1953, page 31) klassifiziert werden. Zu bemerken ist, daß der Name Streptomyces
natalensis nov. spec. nicht nur Actinomyceten zukommt, die ganz genau der hier gegebenen
Beschreibung entsprechen, sondern daß der Ausdruck sich auch auf verwandte Stämme
bezieht, die im großen und ganzen die gleichen spezifischen Eigenschaften besitzen
und das Antibiotikum Pimaricin erzeugen; sie können betrachtet werden als Subspezies,
Varietäten, Rassen, Formen, Gruppen serologischer oder anderer Typen, Varianten,
Phasen, spontane Mutanten, Modifikationen od. dgl. dieser Spezies. Der Ausdruck
deckt auch die Mutanten von Streptomyces natalensis, die mit Hilfe von Mutationen
ergebenden Mitteln oder Substanzen aus diesem Streptomyces erhalten werden können,
wie z. B. durch Bestrahlen oder Behandeln mit Substanzen mit toxischer Wirkung.
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Das neue Antibiotikum Pimaricin ist in der Hauptsache aktiv gegen
saprophytische und parasitäre Pilze und Hefen.
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Tabelle II gibt einen Überblick über die antibiotischen Eigenschaften
von Pimaricin im Verhältnis zu Hefen und Pilzen, die für den Menschen nicht pathogen
sind. Für jede Spezies ist die Menge des Antibiotikums in Mikrogramm/ml des Nährmittels
angegeben, der gerade das Wachstum hemmt. Tabelle III zeigt die entsprechende Hemmung
einer Anzahl von Hefen und Pilzen, die für den Menschen pathogen sind.
| Tabelle II |
| Konzentration von |
| Pimaricin in |
| Testorganismus Mikrogramms'ml, |
| die das Wachstum |
| hemmt |
| Sacharomyces cerevisiae - H .... 0,15 |
| Sacharomyces cerevisiae - KLL. . 0,9 |
| Pichia membranifaciens ......... 2,5 |
| Schwanniomyces occidentalis ..... 2,5 |
| Aspergillus niger . . . . . . . . . . . . . . . . 1,8 |
| Aspergillus fumigatus . . . . . . . . . . . . 1,2 |
| Cladosporium cucumerinum ...... 0,9 |
| Verticillium dahliae ............. 1,2 |
| Fusarium spec. ................. 1,2 |
| Penicillium chrysogenum ........ 0,6 |
| Trichoderma spec. .. ........ .... 1,2 |
| Tabelle III |
| Konzentration von |
| Pimaricin in |
| Testorganismus Mikrogramm/ml, |
| (auf Sabouraud- |
| Agar), die das |
| `Vachstum hemmt |
| Candida albicans (drei Stämme) . . 6 bis 12 |
| Candida tropicalis' (zwei Stämme) 3 bis 12 |
| Trichosporon cutaneum' ......... 12 |
| Pityrosporum spec.l ............ 12 |
| Candida parapsilosis' . ... ....... 12 |
| Histoplasma capsulatum . . . . . . . . . 3 |
| Sporotrichum Schenckii ......... 6 |
| Trichophyton sulfuricum ........ 3 |
| Trichophyton mentagrophytes |
| (drei Stämme) . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 |
| Trichophyton violaceum ......... 6 |
| Trichophyton rosaceum . . . . . . . . . . 12,5 |
| Trichophyton Schönleinii ........ 6 |
| Trichophyton rubrum............ 12,5 |
| Trichophyton interdigitale........ 25 |
| Microsporum lanosum ........... 12,5 |
| Epidermophyton floccosum ....... 12,5 |
| Hormodendrum compactum ...... 6 |
| 1 Diese Hefe wird als nicht pathogen angesehen, sie wurde |
| jedoch aus medizinischem Material isoliert. |
Aus den obigen Tabellen wird unter anderem eine klare, eindeutige und wesentliche
Wirkung gegen pathogene Pilze wie Verticillium, Cladosporium und Fusarium, deutlich.
Auch ist die Hemmung bei Candida albicans sehr stark.
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Ein weiterer wesentlicher Gegenstand bzw. Vorteil des neuen Antibiotikums
ist der sehr geringe phytotoxische Effekt des Pimaricins im Gegensatz zu den meisten
bisher gefundenen fungiziden Antibiotika. Infolgedessen ist das neue Antibiotikum
auch in der Landwirtschaft und im Gartenbau sehr geeignet als Mittel zur Bekämpfung
von Pflanzenkrankheiten, um so mehr, als es sich leicht ausbreitet und systematisch
wirkt. So dringt Pimaricin z. B. in Erbsen (Pisum sativum) bei dem Eintauchen in
eine verdünnte wäßrige Lösung ein. Dies ergibt sich aus der Möglichkeit der Extraktion
von Pimaricin aus den Keimblättern und Keimen von behandelter Saat.
Die
Tabellen IVa und IVb zeigen die innere desinfizierende Wirkung. Das Pilzmycel (unter
anderem Ascochyta pisi) wird in der Saat vernichtet.
| Tabelle IVa |
| Konzentration von Pimaricin «/a Saat mit |
| in p. p. m.1 Mycel2 |
| 150 ............................ 0 |
| 75 ............................ 3 |
| 37,5 .......................... 11 |
| 18,7 .......................... 25 |
| unbehandelt .................... 80 |
| Tabelle IVb |
| Konzentration von Pimaricin «/a kranker Pflanzen |
| in p. p. m.1 Test I Test II |
| 150 ............................ 0 0 |
| 75 ............................ 0 0,7 |
| 37,5 .......................... 1 2 |
| 18,8 .......................... 2 3,6 |
| unbehandelt .................... 15 24 |
| 1 Wäßrige Lösung, in die die Saat 24 Stunden bei 20° eingelegt |
| wurde. |
| = Entwicklung des Mycels auf Filterpapier. |
Eingehende Versuche zeigten, daß Pimaricin in einer Konzentration von 75 p. p. m.,
die wirksam Fungizid ist, die Keimung bzw. Keimfähigkeit von Erbsen und das Wachstum
der Pflanzen nicht ungünstig beeinflußt (zum Vergleich Tabellen IVc und IVd).
| Tabelle IVc |
| Konzentration von a Länge der |
| Pimaricin in /a gekeimter Wurzeln in mm |
| p, p. m., Saat nach 3 Tagen2 |
| blank .............. 100 23 |
| 25 ................ 100 24 |
| 50 ................ 100 22 |
| 75 ................ 100 22 |
| 100 ................ 100 23 |
| 125 ................ 100 22 |
| 150 ................ 96 29 |
| 200 ................ 98 14 |
| 1 Wäßrige Lösung, in die die Saat 24 Stunden bei 20° eingelegt |
| wurde. |
| 2 Saat auf einem feuchten Filterpapier. |
| Tabelle IVd |
| Erbsen In Konzentration |
| in Wasser von Pimaricin |
| getaucht 75 p. p. in.' |
| Keime (Zahl) ........ 126 128 |
| Länge der Pflanze in |
| cm nach 2 Monaten 31,8 33,8 |
| Zahl der Schoten pro |
| Pflanze .. . .. .. .. . .. 2,8 2,8 |
| 1 Wäßrige Lösung, in die die Erbsen 24 Stunden bei 20° ein- |
| gelegt waren. |
Die Daten der obigen Tabellen beziehen sich auf die Erbsensorte »Eminent«, die extrem
anfällig für Ascochyta pisi ist. Versuche mit Ratten und Mäusen zeigten eine sehr
niedrige Toxizität. Zur Bestimmung der akuten Albionratten-Toxizität von Pimaricin
wurde ein Material entsprechend 985 Mikrogramm/mg Ratten gegeben, die dann 7 Tage
gehalten und untersucht wurden.
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Mit der Pimaricin-Suspension in Wasser wurden die folgenden Resultate
(Durchschnittswerte von Versuchen mit 40 Ratten) erhalten: LDSO oral . . . . . .
. . . . . . . . . . . 1,500 mg/kg LD5o intramuskulär . . . . . . . . . > 2,000 mg/kg
LDSO subkutan . . . . . . . . . . . . . . > 5,000 mg/kg LDSe intraperitoneal . .
. . . . . . . 250 mg/kg Pimaricin hat keine Reizwirkung auf die Haut und Schleimhäute.
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Im reinen Zustand ist Pimaricin eine weiße, kristalline Verbindung
von amphoterem Charakter, deren Salze auf übliche Weise erzeugt werden können. Es
gibt mit Fe C13 keine Farbreaktion, mit konzentrierter Phosphorsäure eine rosa,
unstabile Färbung. Konzentrierte Salzsäure und Schwefelsäure ergeben eine blaue
bzw. olivgrüne Verfärbung. Das Antibiotikum entfärbt Bromwasser. Diese Tatsache
und das Infrarot sowie das Ultraviolettspektrum (über die weiter unten berichtet
wird) zeigten, daß Pimaricin ein sogenanntes Polyen-Antibiotikum ist.
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Die Löslichkeit in Wasser ist sehr gering und beträgt 8 mg in 100
ml bei 20°. In organischen Lösungsmitteln, z. B. Alkoholen, Glykolen und Ketonen,
ist das Antibiotikum besser löslich, insbesondere in Alkoholen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen,
z. B. in Methylalkohol und n-Butylalkohol und in den sogenanuten cellosolves. Weiter
ist es löslich in Pyridin, Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Eisessig und Alkalihydroxyd.
In aliphatischen Kohlenwasserstoffen wie Pentan, Hexan, Cyclohexan u. dgl. ist die
Substanz praktisch unlöslich.
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Bei Raumtemperatur ist Pimaricin eine sehr stabile Verbindung. Eine
Lösung in Wasser (5 mg in 100 ml) behält ihre volle Aktivität während 7 Tagen bei
einem p$-Wert von 7 bei 25°. Bei pH 2 verliert die Lösung in. 3 Tagen bei dieser
Temperatur 50 °/o ihrer Aktivität. Bei p$ 10 ist die Halbwertzeit bei 25° 6 Tage.
Bei erhöhten Temperaturen ist die Lösung weniger stabil. Eine Lösung der angegebenen
Konzentration von Pimaricin in Wasser vom pH 2 verliert bei 90° in 15 Minuten 90
°/e ihrer Aktivität; beim pH 6,5 15 °/e und beim pH 9 50 °/o der Aktivität. In methylalkoholischer
Lösung ist Pimaricin bei höheren Temperaturen (25 bis 60°) beständig. Die antibiotische
Aktivität des Pimaricins wurde mikrobiologisch mit Saccharomyces-cerevisiae-Holland-Stamm
als Testorganismen im Vergleich zu einem reinen Standardpräparat geprüft.
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Pimaricin weist keinen Schmelzpunkt auf, sondern beginnt sich bei
etwa 150° zu zersetzen. Die spezifische Drehung beträgt aö = -I- 250° (c = 0,083
°/o in 100 °/o Methanol). Das Molekulargewicht der Substanz ist etwa 727. Die vermutliche
empirische Formel ist C33 H50 N 014# Die Elementaranalyse ergab folgende
Werte: C 57,77 °/e, H 7,27 1)%, N 1,95 e% und O 33,01 e% (berechnet).
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Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Pimaricin weist Maxima bei
290, 304 und 318 mp, mit einer Spitze bei etwa 280 und ein Minimum bei etwa 250
mlt (C = 3,93 l@@lilcrogramm/ml in Methanol) auf. Eine Probe von Pimaricin, in eine
Kaliumbromidplatte (C = 0,50/,) eingepreßt, zeigt folgende Infrarotabsorption (in
cm-') 3460, 2985, 1721, 1637, 1577, 1441, 1401, 1381, 1275,
1269, 1238,
1192, 1176, 1136, 1109, 10C6-,1006, 988, 948, 887, 855, 844-,803, 794. (Bei
den, unterstrichenen Wellenlängen ist die Absorption stark bis sehr stark.)
Die
Zeichnung zeigt eine graphische Darstellung des Infrarotspektrums von Pimaricin
in einer Kaliumbromidplatte.
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Für die Herstellung von Pimaricin wird der Streptomyces natalensis
aerob in stationären Kulturen oder eingetaucht in eine Nährflüssigkeit unter sterilen
Bedingungen in geschlossenen Gefäßen, ausgerüstet mit Rühreinrichtungen, denen zur
Belüftung steriler Sauerstoff oder sterile Luft während des Züchtens zugeführt werden
kann, gezüchtet.
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Die Dauer des Züchtens, die Temperatur und die anderen zu guten Ausbeuten
von Pimaricin führenden Bedingungen sind leicht durch einfache Versuche zu bestimmen.
Sie werden unten im einzelnen dargelegt.
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Das Nährmedium kann aus den üblichen Stoffen bestehen; es soll eine
Kohlenstoffquelle und eine Quelle von fermentierbarem organischemund/oder anorganischem
Stickstoff enthalten, wobei ferner vorzugsweise Mineralsalze wie Phosphate, Kaliumsalze
und N atriumsalze und Spuren verschiedener Metalle zugegen sind. Die in der Praxis
verwendeten Ausgangsstoffe sind im übrigen oft hinreichend mit diesen Mineralsalzen
verunreinigt, so daß sich eine besondere Zugabe erübrigt.
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Als Kohlenstoffquelle können lösliche und unlösliche Kohlehydrate,
z. B. Glukose, Saccharose, Laktose oder Stärke, verwendet werden. Zuckeralkohole
wie z. B. Glycerin sind geeignet. Die Menge der Kohlenstoffquelle in dem Medium
kann in weiten Grenzen variieren, abhängig von der Natur des verwendeten Kohlehydrats
und von der übrigen Zusammensetzung des Mediums; im allgemeinen beträgt sie zwischen
0,5 und 5 Gewichtsprozent des Mediums.
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Als Stickstoffquelle kommt eine große Anzahl von Substanzen in Frage,
erwähnt sei hydrolisiertes oder nicht hydrolisiertes Kasein, Maische bzw. Getreidequellflüssigkeit,
Pepton, Fleischextrakt, entfettetes oder nicht entfettetes Sojamehl, Erdnußmehl,
Fischmehl, Nitrate. Die Wahl der Stickstoffquelle hängt für gewöhnlich von der übrigen
Zusammensetzung des Mediums ab, die ihrerseits derart gewählt wird, daß das Antibiotikum
auf möglichst wirtschaftliche Weise hergestellt wird. In dieser Verbindung mag erwähnt
werden, daß geringe Mengen von stickstoffhaltigen Materialien, wie z. B. Hefeextrakt,
Destillationslösungen, lösliche Fischsubstanzen usw., die Ausbeute an Pimaricin
in bestimmten Medien beträchtlich erhöhen. Auch Lipoidsubstanzen, wie z. B. fette
Öle vegetabilischen und tierischen Ursprungs (z. B. Sojaöl und Fischöl), vermögen
die Ausbeute in einem wesentlichen Maße zu steigern.
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Die Dauer der Fermentation hängt in hohem Maße von der Zusammensetzung
des Nährmediums ab. Für gewöhnlich variiert sie zwischen 48 und 120 Stunden, jedoch
kann mit der Fermentierung auch während einer längeren Zeit fortgefahren werden,
z. B. bis zu 14 Tagen, wenn die erhöhte Ausbeute an dem so erhaltenen Antibiotikum
die größeren Kosten einer längeren Fermentationsdauer rechtfertigt.
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Die Temperatur der Fermentation kann zwischen 15 und 30° liegen; bevorzugt
sind Temperaturen von etwa 26 bis 28°.
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Mit dem optimalen Wachstum der Mikroorganismen und der Ausbeute von
Pimaricin kann der pH-Wert variieren, insbesondere während der ersten Phase der
Fermentation, z. B. zwischen 5 und B. Nach dem Sterilisieren des Nährmediums wird
der pH-Wert vorzugsweise auf zwischen 6 und 7 eingestellt. Die Fermentation wird
vorzugsweise ausgeführt bei einem pH-Wert zwischen 6,5 und 8, da in diesem Falle
die höchstens Ausbeuten erhalten werden. Der pH-Wert kann während der Fermentation
durch Zusetzen von Alkalihydroxyd oder Säure in regelmäßigen Intervallen unter sterilen
Bedingungen konstant gehalten werden. Üblicherweise jedoch wird Calciumcarbonat
als eine Art Puffersubstanz in Mengen von 0,2 bis 1 Gewichtsprozent des Mediums
verwendet. Die eienge der in das Medium während der Fermentierung unter sterilen
Bedingungen eingeführten Luft hängt in hohem Maße von der Gestalt des Gefäßes, der
Gesch«indigkeit und der Form des Rührers ab. Im allgemeinen variiert diese Menge
zwischen 0,1 und 41 pro Liter Nährmedium pro Minute.
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Als Animpfungsmaterial in dem Hauptfermentierungsgefäß werden vorzugsweise
48 bis 72 Stunden alte Vorkulturen von Streptomy ces natalensis verwendet. Zur Erzielung
guter Ausbeuten und zur Verhinderung von Schwankungen der Ergebnisse wird das Animpfen
vorzugsweise mit Kulturmengen von 1 bis 7 Volumprozent des Nährmediums im Hauptfermentationsgefäß
durchgeführt. Es leuchtet ein, daß bei großen Fermentationsgefäßen einige Portionen
von Vorkulturen verwendet werden müssen. Es ist jedoch auch möglich, die Vorkultur
als eine einzige Portion z. B. in einer Menge von 10°7p in das Hauptfermentierungsgefäß
zwecks Erzeugen einer neuen Kultur einzugeben. Die gesamte Fermentierung kann auch
kontinuierlich durchgeführt «erden.
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Das Pimaricin kann aus der flüssigen Kultur auf verschiedene `'eise
gewonnen werden. Gemäß der Erfindung wird zur Gewinnung die Löslichkeit des Antibiotikums
in organischen Lösungsmitteln ausgenutzt, die mit Wasser in einem beschränkten Maße
mischbar sind, z. B. Butanol. Das Verfahren kann z. B. folgendermaßen durchgeführt
werden: Nach Erhalten einer hinreichend aktiven Flüssigkeit wird sie auf einen pH-Wert
von etwa 10 eingestellt, um die aktive Substanz aus dem sogenannten Mycel frei zu
machen, wonach es abfiltriert wird. Die Flüssigkeit kann dann mit z. B. n-Butanol
extrahiert «erden bei einem pH-Wert zwischen 3 und 10. Wird die Flüssigkeit angesäuert,
so wird vorzugsweise mit Phosphorsäure gearbeitet; etwa gebildete Ausfällungen können
entfernt und nötigenfalls ebenfalls extrahiert werden. Der n-Butanolextrakt wird
durch azeotrope Destillation konzentriert; die rohe aktive Substanz kristallisiert
dabei. Sie kann durch selektive Fällung z. B. aus Eisessig, Pyrridin, Dimethylformamid
u. dgl. gereinigt «-erden. Bei Fermentierungen mit Ausbeuten über 700 Mikrogramm,-ml
kann die Ausbeute an Pimaricin sehr erheblich durch Extrahieren des Mycels erhöht
werden. In dieser Beziehung ist die Verwendung von Methylalkohol, dessen Lösefähigkeit
durch Auslösen von 1 bis 3 °;'o Calciumchlorid erhöht sein kann, als Extraktionsmittel
von Vorteil. Beispiel 1 (Herstellung der Impfkultur) Aus einem Röhrchen mit einer
Kultur von Streptomyces natalensis nov. spec. auf z. B. Hafermehl-Agar, bei der
eine gute Sporenbildung stattgefunden hat, werden kleine Mengen Conidium unter sterilen
Bedingungen in Schüttelflaschen von etwa 21 Fassungsvermögen, in die 500 ml eines
flüssigen Nährmediums eingefüllt sind, übertragen. Das Nährmedium besteht aus: Pepton
............................. 0,5°/o Konzentrierte Maischflüssigkeit (50 °/o Trockensubstanz)
. . . . . . . . . . . . 0,60/, Glukose ............................ 1,0°/o Kochsalz
(eingestellt auf p" = 7,0 mit Alkalihydroxyd) ................... 1,0°;'a Nach der
Inkubation unter dauerndem Schütteln bei 26° während 48 Stunden ist die Kultur für
das Animpfen in dem Hauptfermentationsmedium fertig.
Beispiel 2
(Herstellung der Kultur) 11 der Animpfkultur, hergestellt gemäß Beispiel
1,
wird unter sterilen Bedingungen in ein mit Rührer und Einblasvorrichtung
für sterile Luft ausgerüstetes Fermentierungsgefäß, das 151 eines Kulturmediums
folgender Zusammensetzung enthält, eingefüllt Glukose ...........................
3,0 % Konzentrierte Maischflüssigkeit (50 % Trockensubstanz) . . . . . . . . . .
. 0,2 0/0 Ammonsulfat .......... . ....... . ... 0,5 0/0 Kaliumchlorid .....................
0,4 0/0 Primäres Kaliumphosphat . . . . . . . . . . . 0,020/, Calciumcarbonat .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,8 0/0 Dieses Kulturmedium wird mit Alkalihydroxyd
auf einen pH-Wert von 6 bis 9 eingestellt. Nach einer Inkubationszeit von 48 Stunden
bei 27' unter dauernder Belüftung und dauerndem Rühren enthält die Kultur 610 Mikrogramm
Pemaricin pro ml.
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Andere Kulturmedien, mit denen Ausbeuten derselben Größenordnung erhalten
werden können, können die folgende Zusammensetzung haben: A. Erdnußmehl .......................
2 0/0 Kartoffelstärke . . ..... ... . .... . .... . 1 0/0 Konzentrierte Maischflüssigkeit
(50 % Trockensubstanz) . . . . . . . . . . . 2 0/0 Kochsalz ..........................
0,5 0/0 Magnesiumsulfat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,1 0/0 Primäres
Kaliumphosphat . . . . . . . . . . . 0,050/,
Calciumcarbonat ...................
0,6 0/0 Kaliumhydroxyd bis p. 6,5.
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Mit diesem Medium wurden nach dem Animpfen mit 4% Animpfkultur nach
72 Stunden Inkubation und Belüftung bei 26' 590 Mikrogramm Pimaricin pro ml Fermentationsflüssigkeit
erhalten.
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B. Zuckerrübenmelasse (Zuckergehalt etwa 5001,) . . . . . .
. . . 4 0/0 Laktose ........................... 1 0/0
Konzentrierte Maischflüssigkeit
...... 2 0/0 Natriumsulfat 10 aq. . . . . . . . . . . . . . . . 0,10/0 Calciumcarbonat
................... 0,50/0 Kaliumhydroxyd bis pH 7,1.
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Mit diesem Medium wurden nach dem Animpfen mit 5 % Animpfkultur und
120 Stunden Inkubation und Belüftung bei 27° 640 Mikrogramm Pimaricin pro ml Fermentationsflüssigkeit
erhalten.
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C. Pepton ............................. 0,5% Fleischextrakt . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,50/,
Glukose ............................
1 0/0
Kochsalz ........................... 0,50/0 In diesem Medium bildeten
sich nach Animpfen mit 3 % Animpfkultur und 148 Stunden Inkubation und Belüftung
bei 26° 535 Mikrogramm Pimaricin pro ml Fermentationsflüssigkeit.
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D. Sojamehl (grob) .................... 5 0/,
Sojaöl ............................
0,5 0/0 Konzentrierte Maischflüssigkeit (50 0/0 Feststoffe) . . . . . . . . . .
. . . . . . . 0,2 0/0 Glukose ........................... 1 0/0
Primäres Kaliumphosphat
. . . . . . . . . . . 0,020/, Ammoniumsulfat ................... 0,5 0/0 Calciumcarbonat
................... 1 0/ 0 Mit diesem Medium wurden nach dem Animpfen mit
30/, Animpfkultur in einem 15-1-Fermentierungsgefäß und Inkubation und Belüftung
während 168 Stunden bei 28° 690 Mikrogramm Pimaricin pro ml Fermentierungsflüssigkeit
gebildet. Nach dem Behandeln des Mycels, das ausgepreßt und in einer reichlichen
Menge Wasser mit verdünntem Alkalihydroxyd vom pH-Wert 10 gerührt worden war, konnte
in dem Filtrat des Mycels 20,4g
Pimaricin festgestellt werden.
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Beispiel 3 (Isolierung des rohen Pimaricins) 41 der Kulturflüssigkeit
wurden nach vollendeter Fermentierung - Gehalt an Pimaricin 590 Mikrogramm/ml -
mit 10 %igem Natriumhydroxyd auf pH 10 eingestellt, dann von dem Mycel durch Filtrieren
mittels Kieselgur als Filtriermittel (20/,) befreit. Das Filtrat der Kultur betrug
3,71; die Aktivität betrug 570 Mikrogramm/ml; das Filtrat wurde mit Phosphorsäure
zu pH 3 angesäuert. Dieses angesäuerte Filtrat wurde nacheinander mit 750, 350 bzw.
350 ml n-Butanol extrahiert. Der Butanolextrakt wurde dann dreimal mit je 120 ml
einer 4%igen Boraxlösung und darin zweimal mit je 120 ml Wasser gewaschen. Der Butanolextrakt
enthielt dann 1400 Mikrogramm/ml. Nach dem azeotropischen Eindampfen auf 100 ml
trennten sich 0,64g von nicht völlig reinem Pimaricin in kristallinem Zustand ab
(Aktivität 900 Mikrogramm/ml). Aus dem Rest des Extraktes konnte eine Gesamtmenge
von 1,42 g unreines Pimaricin durch weiteres Eindampfen (Aktivität 395 Mikrogramm/mg)
erhalten werden. Die Ausbeute, bezogen auf die Gesamtaktivität der vollkommen fermentierten
Flüssigkeit, betrug 48,3 0/0. Beispiel 4 (Isolierung von rohem Pimaricin) 151 einer
Kulturflüssigkeit nach vollendeter Fermentierung, die 610 Mikrogramm/ml Pimaricin
enthielt, wurde auf pH 10,3 mit 35 0/0igem Kaliumhydroxyd eingestellt und dann von
dem Mycel mittels 50 g Hyflo als Filtriermittel befreit. Das Filtrat wurde dann
mit Phosphorsäure auf pH 2,8 angesäuert. Die gebildete Fällung wurde abfiltriert,
und zwar mittels 10 g Hyflo. Die Fällung wurde dann eine halbe Stunde mit 100 ml
N-Butanol gerührt. Nach dem Absetzen wurde der Butanolextrakt abgezogen und der
Rückstand mit 100 ml Wasser gewaschen. Der gesamte Butanolextrakt wurde dreimal
mit je 10 ml einer 40/0igen Boraxlösung und danach dreimal mit je 10 ml Wasser gewaschen.
Er wurde dann im Vakuum bei 44' auf 40 ml eingedampft. Nach dem Kühlen auf 0°, Absaugen
und Trocknen, wurden 0,51 g mattgelbes, kristallines Pimaricin mit einer Aktivität
von 850 Mikrogramm/mg erhalten. Das filtrierte Kulturfiltrat wurde in der im Beispiel
1 beschriebenen Weise weiterbehandelt. Erhalten wurden zwei Fraktionen: 3,21 g (Aktivität
890 Mikrogramm/mg) und 6,8 g (Aktivität 223 Mikrogramm/mg). Die Gesamtausbeute betrug
51,50/0.
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Beispiel 5 (Isolierung von rohem Pimaricin) 101 eines vollständig
fermentierten Kulturmediums (Aktivität 640 Mikrogramm/ml) wurden auf pH 10 mit 15
0/0igem Kaliumhydroxyd eingestellt. Danach wurde das Mycel zentrifugiert; das klare
Zentrifugat wurde mit 10 n-Salzsäure auf p" 6,9 eingestellt. Danach wurde nacheinander
mit 2000, 1000 und 1000 ml Isoamylalkohol extrahiert. Die vereinigten Isoamylalkoholextrakte
wurden nacheinander dreimal mit je 300 ml einer 4%igen Natriumcarbonatlösung und
dann zweimal mit je 300 ml
Wasser gewaschen. Der so behandelte Extrakt
wurde azeotrop auf 100m1 eingedampft; dabei trennten sich 2,62 g eines mattgelben,
kristallinen Pimaricins mit einer Aktivität von 900 Mikrogramm/mg ab. Ausbeute 36,8
°/o. Beispiel 6 (Isolierung von rohem Pimaricin) 201 einer vollständig fermentierten
Kultur von Aktivität 700 Mikrogramm/ml wurden mit 20 °/oigem Natriumhydroxyd auf
pH 10 eingestellt. Das Mycel wurde danach über ein Filterhilfsmittel (200 g) abfiltriert.
Das klare Kulturfiltrat wurde nacheinander mit 4000, 2000 und 1000 ml n-Butanol
extrahiert. Die vereinigten Butanolextrakte wurden zweimal mit je 500 ml 4°/oiger
Boraxlösung und dann zweimal mit j e 500 ml Wasser gewaschen. Danach wurde der pH-Wert
des Butanolextraktes mit 10 n-Salzsäure auf 6,8 eingestellt; der Extrakt wurde azeotrop
im Vakuum auf 250 ml eingedampft. Dabei trennten sich 9,85 g mattgelben, kristallinen
Pimaricins (Aktivität 913 Mikrogramm/mg) ab. Ausbeute 60,8 °/o. Beispiel 7 (Isolierung
von rohem Pimaricin aus Mycel) 151 einer vollständig fermentierten Kultur
von Streptomyces natalensis nov. spec. wurden mit Eisessig auf einen pH-Wert von
4,1 eingestellt. Danach wurden 200 g Filtriermittel zugegeben, mit dem die Lösung
gerührt wurde. Das Mycel wurde dann so trocken als möglich ausgepreßt bis zu einem
Gesamtgewicht von 1700 g (1 g dieses Mycels wurde in diesem Zustand während einer
Stunde mit 40 ml Methylalkohol extrahiert, um die Zahl der Mikrogramm Pimaricin
zu bestimmen. Der Methanolextrakt wurde auf 100 ml aufgefüllt und spektrophotometrisch
gemessen. Der Gehalt der Methanollösung an Pimaricin betrug 120 Mikrogramm/ml).
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Der Pimaricingehalt des gesamten Mycels betrug 20,4 g. Das abgepreßte
Mycel wurde während einer halben Stunde bei Raumtemperatur mit 81 Methanol, in dem
20/, Calciumchlorid gelöst waren, extrahiert. Der so erhaltene Extrakt wurde mit
11 Wasser verdünnt und von Methanol im Vakuum befreit; dabei bildete sich ein kristalliner
Niederschlag von Pimaricin, der nach dem Absaugen, Waschen mit Wasser und Trocknen
im Vakuum 14,73 g wog und eine Aktivität von 9 Mikrogramm/mg besaß (65°/o der theoretischen
Ausbeute). Beispiel 8 (Reinigung von Pimaricin) 10 g unreines Pimaricin (Aktivität
890 Mikrogramm/mg) wurden unter gelindem Erwärmen in 80 ml Eisessig gelöst und dann
so rasch als möglich durch Filtrieren von ungelösten Verunreinigungen befreit. Das
klare, gelbbraune Filtrat wurde mit 1500 ml Wasser verdünnt; der pH-Wert dieser
Lösung wurde mit 33°/oigem Natriumhydroxyd auf 6,3 eingestellt. Nach dem Kühlen
wurde die gebildete kristalline Fällung zentrifugiert und zweimal mit einer Gesamtmenge
von 500 ml Wasser gewaschen und abgesaugt. Die kristalline Masse auf dem Filter
wurde wieder mit 200 ml Wasser gewaschen, danach im Vakuum über Phosphorpentoxyd
getrocknet. Das Gewicht des so erhaltenen sehr blaß gelben Produktes betrug 7,07
g; seine Aktivität betrug 960 Mikrogramm/mg.
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Die oben mitgeteilte Behandlung wurde mit 60 ml Eisessig und 1000
ml Wasser wiederholt. Die Substanz wurde dreimal mit je 200 ml Wasser gewaschen.
Das so erhaltene Produkt wog 5,35 g und besaß eine Aktivität von 995 Mikrogramm/mg.
Gesamtausbeute: 59,8 °/o. Beispiel 9 (Reinigung von Pimaricin) 10 g unreines Pimaricin
(Aktivität 890 Mikrogramm/mg) wurde unter gelindem Erwärmen in 100 ml Dimethylformamid
gelöst. Diese Lösung wurde abfiltriert zur Entfernung ungelöster Verunreinigungen,
das Filter wurde wieder mit 30 ml Dimethylformamid gewaschen. Zu dem braungefärbten
klaren Filtrat wurden 250 ml Wasser zugegeben, wonach das Antibiotikum im kristallinen
Zustand ausfiel. Das Produkt wurde abgesaugt, das Filter wieder mit 100 ml Wasser
gewaschen. Die kristalline Masse wurde danach im Vakuum getrocknet. Das so erhaltene
Produkt wog 9,24 g. Nach Wiederholung der oben beschriebenen Behandlung wurde schließlich
ein mattgelbes kristallines Produkt von einem Gewicht von 7,9 g mit einer Aktivität
von 985 Mikrogramm/mg erhalten. Gesamtausbeute: 87,5 °/o. Beispiel 10 (Herstellung
des Natriumsalzes) 2,5 g Pimaricin (Aktivität 985 Mikrogramm/mg) wurden unter mechanischem
Rühren in 20 ml Methanol suspendiert. Danach wurden 0,145 g Natriumhydroxyd, gelöst
in 0,3 ml Wasser, zu dieser Suspension zugegeben. Das sich zunächst lösende Pimaricin
kristallisierte nach wenigen Minuten als Natriumsalz aus. Nach weiteren 30 Minuten
Rühren und 24stündigem Stehenlassen bei 0° wurde die kristalline Masse abgesaugt
und mit 5 ml Äthylalkohol und 10 ml Diäthyläther gewaschen. Nach dem Trocknen im
Vakuum betrug das Gewicht des weißen, nadelförmig kristallinen Natriumsalzes 2,16
g (Gehalt 995 Mikrogramm/mg = 87,3 °/o der berechneten Aktivität). Andere Salze
können in entsprechender Weise hergestellt werden.
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Die obigen Beispiele veranschaulichen die Erfindung und zeigen bevorzugte
Ausführungsbeispiele, jedoch können verschiedene Änderungen und Abwandlungen vorgenommen
werden, die im Bereich der Erfindung liegen.