DE2841374A1

DE2841374A1 - Antibiotikum bn-200 und verfahren zu dessen herstellung

Info

Publication number: DE2841374A1
Application number: DE19782841374
Authority: DE
Inventors: Eiichi Akita; Shoichi Amano; Norio Ezaki; Mitsugu Itoh; Shinji Miyadoh; Yujiro Yamada
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1977-10-04
Filing date: 1978-09-22
Publication date: 1979-04-05
Also published as: DE2841374C2; GB2005658A; FR2405265A1; GB2005658B; US4169889A; JPS5452797A; FR2405265B1

Description

HOFFMANN · IQCTLE dt PARTNER 2 8 4 1 3 7 A

PATENTANWÄLTE DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976) - DIPU-ING. W.EITLE - DR. RER. NAT. K. HOFFMANN · DIPL.-ING. W. LEHN

DIPL.-ING. K. FÖCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 (STERNHAUS) . D-8000 MD NCHEN 81 - TELEFON (089) 911087. · TELEX 05-2?«19 (PATHE)

31 191 o/fg

Meiji Seika Kaisha, Ltd., Tokyo / Japan

Antibiotikum BN-2oo und Verfahren zu dessen Herstellung

Die Erfindung betrifft ein Antibiotikum und ein Verfahren zu dessen Herstellung. Sie betrifft insbesondere ein neues Antibiotikum BN-2oo und ein Verfahren zu dessen Herstellung, bei dem man einen die Substanz BN-2oo produzierenden Stamm des Genus Erwinia in einem Kulturmedium kultiviert und aus der Kulturbrühe die BN-2oo-Substanz abtrennt und gewinnt.

Es wurde festgestellt, dass in dem Kultivierungsprodukt eines Stammes vom Genus Erwinia eine Substanz mit einer grossen Aktivität gegenüber Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien gewonnen werden kann, und dass man diese Substanz in reiner Form aus dem Kultivierungsprodukt isolieren kann. Die Untersuchung der Eigenschaften der Substanz hat gezeigt, dass es sich hier um ein neues Antibiotikum handelt, das sich von bekannten Antibiotika unterscheidet. Diese Substanz wurde mit BN-2.OO bezeichnet.

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Gemäss einer Ausführungsform der Erfindung wird das Antibiotikum BN-2oo_f welches die physikalischen und chemischen Eigenschaften der nachfolgend beschriebenen Art hat, gezeigt.

Gemäss einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums BN-2oo gezeigt, bei dem man aerobisch einen BN-2oo-Substanz produzierenden Stamm vom Genus Erwinia in ein Kulturmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff-und Stickstoffquellen enthält, bei einer Temperatur von etwa 2o bis etwa 35 C kultiviert und aus der Kulturbrühe die BN-.2oo-Substanz gewinnt.

Fig. 1 ist das Ultraviolette Absorptionsspektrum der BN-2oo-Substanz, bestimmt in Methanol, und

Fig. 2 zeigt das Infrarot-Absorptionsspektrum der BN-2oo-Substanz bei der Verwendung der KBr-Tabletten-Methode.

Ein Beispiel für einen Stamm vom Genus Erwinia, der erfindungsgemäss verwendet werden kann, ist Erwinia sp. BN-2oo, der von den vorliegenden Erfindern aus einer verfaulten Pflanze in Hyogo-Prefecture/Japan isoliert wurde. Dieser Stamm wurde beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry of Japan unter der Hinterlegungsnummer FERtI-P Nr. 3561 hinterlegt sowie beim American Type Culture Collection (ATCC) unter der Hinterlegungsnummer 3142o.

Die mikrobiologischen Eigenschaften von Erwinia sp. BN-2oo sind die folgenden:

(a) Morphologische Eigenschaften

Zellen, die in einem Bouillon-Agar-Medium kultiviert wurden,

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sind stäbchenförmig mit einer Grosse von o,5 - o,7 x 0,8 bis o,5 ,um mit peritrichaler Bewegung. Es werden keine Sporen oder Sporangiophoren gebildet, noch besteht PoIymorphismus. Die Gram-Färbung und die Säurefestigkeit sind beide negativ.

(b) Kultureigenschaften

(1) Bouillon-Agar-Kultur: Die Bakterienzellen sind gelbbraun und werden zunehmend gelb mit Fortschreiten der Kultivierung. Die Kolonien zeigen ein deutliches schleimartiges Wachstum und scheinen nicht viskos oder beweglich zu sein. Es wird keine Bildung eines diffundierbaren Pigmentes bemerkt.

(2) Bouillon-Kultur: Das gesamte Kulturmedium wird trüb.

(3) Bouillon-Gelatine-Stäbchenkultur: Verflüssigt.

(4) Lackmus-Milch-Kultur: Peptonisierung verläuft mit schwacher Alkalinität.

(c) Physiologische Eigenschaften

(1) Reduktion von Nitrat : negativ

(2) Denitrierungsreaktion: negativ

(3) MR-(Methylrot) Test: positiv

(4) VP-(Voges Proskauer) Test:negativ

(5) Bildung von Indol: positiv

(6) Bildung von Schwefelwasserstoff: negativ

(7) Hydrolyse von Stärke: positiv

(8) Verwertung von Zitronensäure: positiv

(9) Verwertung von anorganischen Stickstoffquellen: Ammoniumsalze sind die einzigen anorganischen Stickstoffquellen, die verwendet werden.

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— D —

(10) Bildung von Pigmenten: Die Zellen werden gelb, aber es wird kein wasserlösliches Pigment gebildet.

(11) Urease: Negativ

(12) Oxidase: Negativ

(13) Wachsturnstemperatur: 1o bis 35°C, aber kein Wachstum bei 42°C.

(14) Falkutativ anaerobisch

(15) OF-Test (Heuleifson-Methode): F-Typ, es wird kein Gas gebildet

(16) Ornithin-Decarboxylierungsreaktion: Negativ

(17) Lysin-Decarboxylierungsreaktion: Negativ

(18) KCN-Beständigkeit: Zeigt Beständigkeit

(19) Verwertung von Malonsäure: Negativ

(20) Verwertung von Zucker: Verwertet Glucose, Maltose, Xylose, Mannitol, Lactose und Saccharose.

Der BN-2oo-Stamm mit den vorgenannten bakteriologischen Eigenschaften wurde verglichen mit Stämmen, die in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe, 1974 aufgeführt waren, und es wurden die folgenden Schlüsse gezogen:

Der BN-2oo-Stamm gehört zur Familie Enterobacteriaceae aufgrund der Tatsache, dass der BN-2oo-Stamm ein Gram-negatives stäbchenförmiges Bakterium mit Motilität ist, fakultativ anaerobisch und oxidase-negativ ist und kein Gas entwickelt. Der BN-2oo-Stamm wurde als zum Genus Erwinia gehörig identifiziert im Hinblick auf die Tatsache, dass Zucker verwendet wird, dass eine negative NiLratreduktion vorliegt, dass eine KCN-Beständigkeit vorliegt, und dass negative Ornithin- und Lysin-Decarboxylierungsreaktionen vorliegen.

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Varianten des Erwinia sp. BN-2oo-Stammes können künstlich ·.". hergestellt werden unter Verwendung von ultraviolettem Licht, Röntgenstrahlen, Hochfrequenzwellen, durch Bestrahlung, Chemikalien und dergleichen. Alle so gebildeten Varianten vom Genus Erwinia können gemäss der vorliegenden Erfindung verwendet werden, soweit sie fähig sind, die BN-2oo-Substanz zu bilden.

Zahlreiche Kulturmedien, wie sie bei üblichen mikrobiologischen Fermentationsverfahren eingesetzt werden, können zur Kultivierung von BN-2oo-Substanz bildenden Stämmen verwendet werden, und zur Bildung und zum Ansammeln der BN-2oo-Substanz. Glucose, Glycerin, Sucrose, Dextrin, Stärke und Hirsebrei können beispielsweise als Kohlenstoffquellen dienen. Stickstoffquellen, die man verwenden kann, schliessen beispielsweise Pepton, Fleischextrakt, Bouillonpulver, Maismaische, Sojabohnenkuchen, Fischmehl, Ammoniumsulfat und Ammoniumchlorid ein. Anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid und Calciumcarbonat können erforderlichenfalls zusätzlich verwendet werden. Gewünschtenfasll können Antischaumbildner zugegeben werden.

Die Kultivierung kann vorteilhaft unter Verwendung eines flüssigen Kulturmediums, wie einer Schüttelkultur oder in einer untergetauchten, belüfteten Rührkultur, vorgenommen werden. Die Kultivierungstemperatur liegt optimal im Bereich von 2o bis etwa 35 C und eine geeignete Kültivierungszeit liegt im Bereich von 6 bis 24 h.

Die Gewinnung der BN-2oo-Substanz aus der Kulturbrühe kann unter Berücksichtigung der physikalischen und chemischen Eigenschaften der BN-2oo-Substanz in der später beschriebenen Weise erfolgen.

Die folgende Verfahrensweise wurde zur Bewertung der BN-2oo-Substanz

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angewendet: Eine Mischung aus 2 % Mycinagar und o,5 % Bactoagar wurde als Bewertungsmedium verwendet. Bacillus subtilis ATCC 6633 Stamm wurde als zu prüfendes Bakterium verwendet.

Nach der erwähnten Bewertungsmethode wurde eine lineare Beziehung entwickelt zwischen dem Logarithmus der Konzentration der BN-2oo-Substanz (reines Produkt) und dem Durchmesser der Inhibierungszone bei einer Konzentration der BN-2oo-Substanz im Bereich von 31 mcg/ml bis 1oo meg/ml, wobei der Durchmesser der Inhibierungszone im Bereich von 22,5 mm bis 3o,3 mm (Papierscheibenmethode) lag.

Die BN-2oo-Substanz kann extrahiert und gereinigt werden aufgrund ihrer physikalischen und chemischen Eigenschaften in der nachfolgend beschriebenen Weise. Die anschliessend beschriebene Weise ist besonders praktisch. Dabei wird die den aktiven Bestandteil enthaltende Fermentationsbrühe zur Entfernung von Peststoffen filtriert. Das Filtrat wird über einem Absorptionsmittel, wie Diaion HP-Io, Diaion HP-2o und Eiaion HP-3o (Handelsnamen der Mitsubishi Chemical Industries, Ltd., Japan), Amberlit XAD-2 (Handelsname der Rohm & Haas Co., USA) adsorbiert und die aktive Substanz wird mit alkalischer 7o%-iger wässriger Methanollösung (pH 8 bis 9) eluiert. Das Methanol wird abdestilliert und der Rückstand wird beispielsweise mit Äthylacetat, Benzol, Chloroform, n-Butanol, Methylisobutylketon und dergleichen extrahiert, wobei man die rohe BN-2oo-Substanz erhielt. Das Rohprodukt wird dann durch eine geeignete Kombination von Gegenstromverteilungsverfahren, Ausfällungsverfahren und GeIfiltrationchromatografie unter Verwendung von Sephadex LH-2o (Handelsname der Pharmacia Co., Schweden) gereinigt, wobei man die gereinigte BN-2oo-Substanz erhält.

Wird das erhaltene pulverige Produkt dünnschichtchromatografiert über Kieselgel unter Verwendung von verschiedenen Lösungsmittelsystemen, beispielsweise Chloroform-Methanol, Benzol-Äthanol,

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Benzol-Aceton und dergleichen, so findet man bei allen verwendeten Systemen einen einzigen Spot« Dies zeigt, dass das erhaltene pulverige Produkt die BN-2oo-Substanz in reiner Form darstellt.

Die BN-2oo-Substanz hat die folgenden physikalsichen und chemischen Eigenschaften:

(1) Elementaranalyse: C 67,46 %, H 7,24 %, N 7,55 %,

0 17,75 %

(2) Molekulargewicht: 52o, bestimmt durch die Titrationszahl

(3) Schmelzpunkt: Wird bei 15o C braun und zersetzt sich

bei 156°C.

(4) Spezifische Drehung: L^J²^=-^o_tl (C=1, Methanol)

(5) ültraviolett-Absorptionsspektrum: Wird in Fig. 1 gezeigt.

1 %

Das Absorptionsmaximum beträgt 293 rsm (Ε- , . 9So) in metha-

"f S: ^ CIU

nolischer Lösung, 298 nm (E₁ 84o) in 0,1%-iger Chlorwasser-

1 % stoff-Methanol-Lösung und 3oo nm (E₁ 118o) in ο,Ι η Kalium-

I Will

hydroxid-Methanol-Lösung.

(6) Infrarot-Absorptionsspektrum: Das Spektrum gemessen nach der Kaliumbromid-Tablettenmethode wird in Fig. 2 gezeigt.

(7) Löslichkeit in Lösungsmittel: Löslich in Methanol, Äthanol, Pyrridin, Dimethylformamid, Aceton und Dimethylsulfoxid, unlöslich in Benzol, Äthylacetat, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Petroläther und Wasser.

(8) Farbreaktion: Positiv mit Ferrichlorid, Kaliumpermanganat

und Jod und

negativ mit Ninhydrin, Sakaguchi, Biuret, Fehling'schar Lösung, Moiisch und Anthron.

(9) Form und Farbe: weisses Pulver.

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- 1ο -

(1o) Rf-Werte bei Dünnschichtchromatografie über Kieselgel: Chloroform-Methanol (9:1) ο,5 7 Benzol-Äthanol (9:1) ο,4 7 Benzol-Aceton (IrT) o,76

Es vrarde die Äntimikrobenwirkung der BN-Substanz gegen verschiedene Mikroorganismen gemessen und die minimale Wachsturnsinhibierungskonzentration (MIC) der BN-2oo-Substanz gegen verschiedene Mikroorganismen wird in Tabelle 1 gezeigt„

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Tabelle 1

Minimale Wachstumsinhibierungs-Konzentration (Flüssigkeitsverteilungs-Methode)

Geprüfter Mikroorganismus

Bacillus subtilis (ATCC 6633) Bacillus stearothermophilis Bacillus subtilis (UV-34) Staphylococcus aureus 2o9P

Staphylococcus aureus 52-34, Tetracyclin- und Erytrhomycinbeständig

Sarcina lutea
Escherichia coli NIHJ Escherichia coli K.. 2& Pseudomonas aeruginosa Klebsiella pneumoniae Proteus vulgaris

Microbacterium smegmatis Kanamycin-beständig

Microbacterium smegmatis Streptomycin-beständig

Candida albicans

Bemerkung: Kulturmedium

1 ist ein Bouillon-Medium

2 ist ein Glycerin-Bouillon-Medium

3 ist ein Glucose-Pepton-Medium

inhibierungs-Konzen- tration (mcg/ml)	Kultur medium
o,7	1
o,7	1
3,2	1
1,5	. 1
1,5	1
>1oo	1
6,5	1
6,5	1
1oo	1
1oo	1
o,3	1
>1oo	2
>1oo	2
1oo	3

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Aus den Ergebnissen der Tabelle 1 wird ersichtlich, dass die BN-2oo-Substanz als Medikament für human- und veterinärmedizinische Zwecke verwendet werden kann.

Die akute Toxizität der BN-2OO-Substanz wurde intraperitoneal bei Mäusen bestimmt, wobei die Mäuse eine Woche beobachtet wurden. Alle Mäuse überlebten bei einer Dosis von 1oo mg/kg.

Die BN-2oo-Substanz gemäss der Erfindung kann in einer Dosis von etwa 2o bis etwa 3oo mg/kg Körpergewicht entweder intramuskulär, subkutan, intravenös oder topisch verabreicht werden.

Beim Vergleich der BN-2oo Substanz mit bekannten Antibiotika entsprach keines der bekannten Antibiotika der vorliegenden Substanz hinsichtlich der Eigenschaften zur Bildung des Mikroorganismus und hinsichtlich der physikalischen und chemischen Eigenschaften und antimikrobischen Aktivität. Eumycetin und Melinacidin haben ebenso wie die BN-2oo-Substanz der vorliegenden Erfindung ein Absorptionsroaximum von etwa 3oo nm in methanolischer Lösung. Jedoch ist Eumycetin eine Zellkomponente und das antimikrobische Spektrum des Eumycetins ist unterschiedlich von der BN-2oo-Substanz. Melinacidin unterscheidet sich von der BN-2oo-Substanz hinsichtlich der spezifischen Drehung. Infolge dessen ist die BN-2oo-Substanz gemäss der Erfindung eine neue Substanz.

In den folgenden Beispielen wird ein Verfahren zur Herstellung der BN-2oo-Substanz in ausführlicher Form gezeigt. Jedoch soll die Erfindung keineswegs beschränkend im Hinblick auf die Beispiele ausgelegt werden und zahlreiche andere Modifizierungen sind möglich.

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Beispiel 1

1oo ml eines flüssigen Kulturmediums aus 2 % Glycerin, 1,5 % Pepton, 1 ,o % Fleischextrakt, ο,3 % KCl und ο,3 % CaCO₁, wurden jeweils in 25 5oo-ml-Kolben gegeben und die Kolben wurden mit einem Baumwollpfropfen verschlossen. Jeder der Kolben und der Inhalt wurden 1o Min. unter Druck bei 12o°C sterilisiert. Jedes Kulturmedium wurde mit einer Platinspitze einer Schrägkultur von Erwinia sp. BN-2oo (FERM-P 3561) inokuliert und die Kultivierung wurde unter Schütteln bei 28°C während 2o h durchgeführt. .Man erhielt auf diese Weise 2,4 1 einer Kulturbrühe mit einer Wirksamkeit von 2o mcg/ml.

Die Bakterienzellen wurden mittels einer Zentrifuge mit einer Umdrehung von I0.000 pro Min. entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wurde durch eine Säule gegeben, die mit 2oo ml Diaion HP-2o gefüllt war,- um den aktiven Bestandteil zu adsorbieren. Die Säule wurde gründlich mit Wasser gewaschen und weiterhin mit angesäuerter 5o%-iger wässriger Methanollösung (eingestellt auf einen pH von 2 mit 6n HCl), und dann mit einer alkalischen 80 %-igen wässrigen Methanol-Lösung (eingestellt auf einen pH 9 mit 6n NaOH) zum Extrahieren des aktiven Bestandteils behandelt. Die Fraktionen mit einer antimikrobischen Aktivität wurden gesammelt, mit 6n Chlorwasserstoffsäure neutralisiert und unter vermindertem Druck auf 2oo ml konzentriert. Das Konzentrat wurde mit In Chlorwasserstoffsäure auf pH 2,ο eingestellt und dann mit 2oo ml Benzol extrahiert. Das Extrakt wurde mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und konzentriert unter vermindertem Druck, wobei man ein sirupöses Produkt erhielt. Das sirupöse Produkt wurde durch eine Säule (3oo mm 0 χ 8oo mm) Sephadex LH-2o (5oo. ml) eingestellt mit Methanol, gegeben und dann mit Methanol (5oo ml) entwickelt unter Ausbildung einer Gelfiltration, wobei man bis 24 aktive Fraktionen (2o ml in jeder Fraktion) erhielt.

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Die Fraktionen mit einer antimikrobischen Aktivität wurden gesammelt, unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert, wobei man 12 mg der BN-2oo-Substanz als weisses Pulver erhielt.

Beispiel 2

In einen 3o-l-Fermentationstankt wurden 2o 1 eines Kulturmediums aus 2 % Glycerin und 3 % Bouillonpulver gegeben und das ganze wurde 15 Min. bei 12o C sterilisiert und dann gekühlt. Das Kulturmedium im Fermentationstank wurde mit Erwinia sp. BN-2oo (FERM-P 3561) inokuliert und 2o h in einem Kolben, welcher das gleiche Kulturmedium wie vorher angegeben enthielt, vorkultiviert und die Kultivierung wurde dann unter Rühren und Belüftung bei 28 C mit einer Rührgeschwindigkeit von 2oo UpM während 8 h bei einer Luftfliessgeschwindxgkeit von 2o l/Min, durchgeführt. Man erhielt so 18 1 einer Kulturbrühe mit einer Aktivität von 1o mcg/rnl.

Zu der Kulturbrühe wurden 1,5 1 Diaion HP-2o als Adsorptionsharz gegeben und der Ansatz wurde 15 Min. zum Absorbieren der aktiven Bestandteile gerührt. Nach der Absorption wurde das Diaion HP-2o entfernt, das Harz, welches den aktiven Bestandteil daran adsorbiert enthielt, wurde ausreichend mit Wasser gewaschen und dann mit einer 5o %-igen wässrigen Methanollösung, die mit 6 η HCl auf pH 2 eingestellt worden war,und dann mit einer 7o %-igen wässrigen Methanollösung, die mit 6n NaOH auf pH 9,ο eingestellt worden war, eluiert.

Fraktionen mit einer antimikrobischen Aktivität wurden gesammelt und mit 6n Chlorwasserstoffsäure bis zum pH 7 neutralisiert. Die neutralisierte Flüssigkeit wurde auf 1 1 unter vermindertem Druck konzentriert, mit 1n Chlorwasserstoffsäure auf pH 2,ο eingestellt und mit 1 1 Äthylacetat extrahiert. Das Extrakt

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AS-

wurde mit Wasser gewaschen und getrocknet. Das Äthylacetat wurde unter Gewinnung eines sirupösen Produktes abdestilliert. Der Sirup wurde in Methanol (1o ml) gelöst und die Lösung wurde durch eine Säule (3o mm 0 χ 8oo mm) Sephadex LH-2o (5oo ml), eingestellt mit Methanol,gegeben und mit Methanol (5oo ml) entwickelt, wobei man 17 bis 2'4 aktive Fraktionen (2o ml in jeder Fraktion) erhielt. Fraktionen mit einer antimikrobischen Aktivität wurden gesammelt und konzentriert unter vermindertem Druck bis zur Trockne, wobei maji 7o mg der BN-2oo-Substanz als weisses Pulver erhielt.

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Claims

PAT 13 N TAN WAI/F 13 DR. ING. E. HOFFAAANH (1930-1976) . D I PL.-I NG. W. EITLE · D R. RER. NAT. K. HO FFMAN N · D I PL.-I N G. W. LEHN D1PL.-ING. K. FOCHSLE . DR. RER. NAT. E. HANSEN ARABELLASTRASSE-l(STEtiNHAUS) . D-8000 MÖNCHEN 81 · TELEFON (06V) 9110 67~ - TELEX 05-29619 (PATH E) 31 191 o/fg Meiji Seika Kaisha, Ltd., Tokyo / Japan Antibiotikum BN-2oo und Verfahren zu dessen Herstellung Patentansprüche

1. Antibiotikum BN-2oo mit den folgenden Eigenschaften:

Form und Farbe: weisses Pulver,
Elementaranalyse : C 67,46 %, H 7,24 %, N 7,55%,

O 17,75 %
Molekulargewicht : 52o? bestimmt durch die Titrationszahl,

Schmelzpunkt : wird bei 15o°C braun und zersetzt sich

bei 156°C,

Drehung : £oC_7²^= -7o,7 (C = 1, Methanol), Ultraviolett-Absorptionsspektrum (in Methanol:

wie in Figur 1,
Infrarot-Absorptionsspektrum (KBr-Tablette):

wie in Figur 2,

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ORIGINAL INSPECTED

Löslichkeit im Lösungsmittel: Löslich in Methanol, Äthanol,

Pyridin, Dimethylformamid, Aceton und Dimethylsulfoxid. Unlöslich in Benzol, Äthylacetat, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Petroläther und Wasser;

Farbreaktion : positiv mit Ferrrichlorid, Kalium-

permanganat und Jod, und negativ mit Ninhydrin, Sakaguchi, Biuret, Fehling, Molisch und Anthron;

Rf-Werte bei Dünnschichtchromatografie über Kieselgel: Chloroform-Methanol (9/1) o,57 Benzol-Äthanol (9:1) o,47

Benzol-Aceton (1:1) o,76.

2. Verfahren zur Herstellung einer Antibiotikum-BN-2oo-Substanz gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass man aerobisch einen BN-2oo-Substanz bildenden Stamm vom Genus Erwinia in ein Kulturmedium, enthaltend assimilierbare Kohlenstoff-und Stickstoffquellen, bei einer Temperatur von etwa 2o bis etwa 35°C kultiviert und die BN-2oo Substanz aus der Kulturbrühe gewinnt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch g e k e η η zeichnet, dass der BN-2oo-Substanz bildende Stamm vom Genus Erwinia Erwinia sp„ BN-2oo-Stamm (FERM-P 3561) ist.

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