-
Organische Verbindungen, inre Verwendung und Herstellung Die vorliegende
Erfindung betrifft neue Antibiotika, die nachstehend als SL 7810/F, SL 7810/F-II
und SL 7810/F-III bezeichnet werden, ihre Tetrahydroderivate, Verfahren zu ihrer
Herstellung und pharmazeutische Zubereitungen, die mindestens eine der genannten
Verbindungen. enthalten Erfindungsgemäss gelangt man zu den neuen Antibiotika SL
7810/F, SL 7810/F-II, SL 7810/F-III und deren Tetrahydroderivaten, indem man a)
die Antibiotika SL 7810/F und/oder SL 7810/F-II und/oder SL 7810/F-III erhält, indem
man einen die Antibiotika SL 7810/F und/oder SL 7810/F-II und/oder SL 7810/F-III
produzierenden Stamm der Gattung Aspergillus rugulosus Thom & Raper in Gegenwart
eines Nährmediums züchtet, oder indem man
b) eines der Tetrahydroderivate
der Antibiotika SL 7810/F, SL 7810/F-II und SL 7810/F-III erhält, indem man eines
der Antibiotika SL 7810/F, SL 7810/F-II und SL 7810/F-III hydriert.
-
Die neuen Antibiotika und deren Tetrahydroderivate haben folgende
Charakteristika: SL 7810/F Farbloses amorphes Pulver vom Smp. 160 - 163 ° (Zers.);
[α]D20 = - 48,3 ° (c = 0,806 in Methanol) Analyse: Gef C 57,3 H 7,9 N 9,2
0 25,2 % Mol. Gew. (osmometrisch in Aethanol bestimmt): 1190 UV-Spektrum in Methanol:
# max = 194 nm, log 6' = 1,98 (vgl. Fig. 1) 276 nm, log t = IR-Spektrum in Nujol
(vgl. Fig. 2) H-NMR in DMSO (100 MHz, Tetramethylsilan als interner Standard) [vgl.
Fig. 3] Die Hydrolyse von SL 7810/F mit 6 N Salzsäure (4 Stunden bei 110 ° unter
N2-Atmosphäre) liefert: als Hydrolyseprodukt u. a. Linolsäure.
-
Farbreaktionen: Ninhydrin negativ Cl2-Benzidin blau
(Löslichkeit,
Stabilität, Dünnschichtchromatogramm und MIC-Werte siehe unten) 51; 7810/F-II Farbloses
amorphes Pulver vom Smp. 158 - 160 ° (Zers.); [α]D20 = - 47,9 ° (c = 0,81
in Methanol) Analyse: Gef. C 58,5 H 8,0 N 9,3 0 23,8 % Mol. Gew. (osmometrisch in
Methanol bestimmt): 1018 UV-Spektrum in Methanol: # max 193 nm, log ' = 1,95 (vgl.
Fig. 4) 278 nm, log #' = 0,18 IR-Spektrum in Nujol (vgl. Fig. 5) H-NMR-Spektrum
in DMSO (100 MHz, Tetramethylsilan als interner Standard) [vgl. Fig. 6] Farbreaktionen:
Ninhydrin negativ C12-Benzidin blau (Löslichkeit, Stabilität, Dünnschichtchromatogramm
und MIC-Werte siehe unten) SL 7810/F-III Farbloses amorphes Pulver vom Smp. 164
- 168 ° (Zers.); 20 [α]D = - 53,0 ° (c = 1,00 in Methanol) Analyse: Gef. C
51,1 H 8,0 N 9,0 0 22,0 %
UV-Spektrum in Methanol: # max 193 nm,
log #' = 1,98 (vgl. Fig. 7) 278 nm, log 6' = 0,24 IR-Spektrum in Nujol (vgl. Fig.
8) H-NMR-Spektrum in DMSO (100 MHz, Tetramethylsilan als interner Standard) [vgl.
Fig. 9] Farbreaktionen: Ninhydrin negativ C12-Benzidin blau (Löslichkeit, Stabilität,
Dünnschichtchromatogramm und MIC-Werte siehe unten) Tetrahydro-SL 7810/F Farbloses,
amorphes Pulver vom Smp. 173 - 178 ° (Zers.) nach Kristallisation aus Aethanol-Wasser
(95 : 5) Smp. 190 - 205 / 210 - 212 ° (Zers.); 20 [α]D = - 47,8 ° (c = 0,984
in Methanol) Analyse: Gef. C 56,8 H 8,0 N 9,0 0 25,5 % UV-Spektrum in Methanol:
# max 194 nm, log 6' = 1,85 (vgl. Fig. 10) 277 nm, log £' = 0,09 227 (Schulter)
log #' = 1,00 IR-Spektrum in Nujol (vgl. Fig. 11) H-NMR-Spektrum in DMSO (100 MHz,
Tetramethylsilan als interner Standard) [vgl. Fig. 12] 13C-NMR-Spektrum in CD3OD
mit Tetramethylsilan als interner Standard (vgl. Tabelle 1)
Farbreaktionen:
Ninhydrin negativ C12-Benzidin blau (Löslichkeit, Stabilität, Dünnschichtchromatogramm
und MIC-Werte siehe unten) Die Hydrolyse von Tetrahydro-SL 7810/F mit 6 N Salzsäure
(4 Stunden bei 110 ° unter N2-Atmosphäre) liefert als Hydrolyseprodukt u.a. Stearinsäure.
-
Tetrahydro-SL 7810/F-II Farbloses amorphes Pulver vom Smp. 160 - 163
° (Zers.); [α]D20 = ~ 41,4 ° (c = 0.823 in Methanol) D Analyse: Gef. C 58,7
H 8,1 N 9,6 0 23,7 % UV-Spektrum in Methanol: max 194 nm, log #' = 1,90 (vgl. Fig.
13) 278 nm, log #' = 0,25 227 (Schulter) log ' = 1,07 IR-Spektrum in Nujol (vgl.
Fig. 14) 1H-NMR-Spektrum in DMSO (90 MHz, Tetramethylsilan als interner Standard)
[vgl. Fig. 153 13C-NMR-Spektrum in CD3OD mit Tetramethylsilan als interner Standard
(vgl. Tabelle 2)
Farbreaktionen: Ninhydrin negativ C12-Benzidin
blau (Löslichkeit, Stabilität, Dünnschichtchromatogramm und MIC-Werte siehe unten)
Tetrahydro-SL 7810/F-III Farbloses amorphes Pulver vom Smp. 175 - 180 ° (Zers.);
[α]D20 = - 41,5 ° (c = 1,094 in Methanol) Analyse: Gef. C 60,5 H 8,5 N 9,2
0 21,9 % UV-Spektrum in Methanol: #max 193 nm, log #' = 1,93 (vgl. Fig. 16) 278
nm, log 6' = 0,19 224 nm, log #' = 1,01(Schulter) IR-Spektrum in Nujol (vgl. Fig.
17) ¹H-NMR-Spektrum in DMSO (100 MHz, Tetramethylsilan als interner Standard) [vgl.
Fig. 18] Farbreaktionen; Ninhydrin negativ C12-Benzidin grün (Löslichkeit, Stabilität,
Dünnschichtchromatogramm und MIC-Werte siehe unten)
Löslichkeit
Die Antibiotika SL 7810/F, SL 7810/F-II und SL 7810/F-III sowie ihre Tetrahydroderivate
sind bei Raumtemperatur leicht löslich in Methanol und Aethanol, schwer löslich
in Chloroform, Aether, Petroläther, Hexan und praktisch unlöslich in Wasser.
-
Stabilität Die neuen Antibiotika SL 7810/F, SL 7810/F-II und SL-7810/F-III
sind in Gegenwart von Licht und besonders an der Luft wenig stabil und zersetzen
sich.
-
Die Zersetzung wird auch beim Erwärmen auf über 50 bemerkbar. Durch
Hydrierung zu den Tetrahydroderivaten wird die Instabilität weitgehend beseitigt.
-
Charakteristisch für alle drei Antibiotika und ihre Tetrahydroderivate
ist die Instabilität unter basischen Bedingungen. Bei einem pH über 8 tritt Umwandlung
zu Zersetzungsprodukten auf, die biologisch nur noch schwach bzw. nicht mehr aktiv
sind.
-
Dünnschichtchromatogramm Die Analyse erfolgt auf Kieselgel Merck 60-Platten
(0,25 mm Schichtdicke), Mit den nachstehenden Fliessmitteln können folgende Rf-Werte
festgestellt werden:
| Rf -Werte |
| Fliessmittel SL 7810/F Sl 7810/F-II SL 7810/F-III |
| Chloroform-Methanol-Wasser 0,28 0,47 0,59 |
| (70 : 25 : 5) |
| Chloroform-Methanol 0,15 0,27 0,44 |
| (10 : 3) |
| Chloroform-Methanol 0,41 |
| (2 : 1) |
| (Essigester-n Butanol) 0,22 |
| wassergesättigt 0,33 0,34 |
| (3 : 1) |
Die Antibiotika SL 7810/F, SL 7810/F-II und SL 7810/F-III zeigen bei dieser Bestimmung
dieselben Rf-Werte wie ihre Tetrahydroderivate.
-
Beim Entwickeln mit einer 0,2 %igen Ce(SO4)2-Lösung in 50 %iger Schwefelsäure
als Sprühreagens können folgende Flecken (nach Erwärmen auf 130 0) nachgewiesen
werden: SL 7810/F braune Flecken SL 7810/F-II braune Flecken SL 7810/F-III braune
Flecken Tetrahydro-SL 7810/F gelbliche Färbung Tetrahydro-SL 7810/F-II schwache
Anfärbung Tetrahydro-SL 7810/F-III hellbraune Anfärbung
Zur Detektion
der Antibiotika SL 7810/F, SL 7810/F-II und SL 7810/F-III kann auch Joddampf verwendet
werden.
-
Die Unterscheidung der drei Antibiotika SL 7810/F, SL 7810/F-II und
SL 7810/F-III von ihren Tetrahydroderivaten kann dünnschichtchromatographisch auf
Kieselgel-GF 254-Platten erfolgen (0,3 mm Schichtdicke), wobei das Kieselgel mit
3 % AgNO3 gemischt ist. Mit Chloroform-Methanol-Wasser (70 : 25 : 5) als Fliessmittel
können mit 40 Y Substanz folgende Rf -Werte festgestellt werden: Antibiotikum Rf-Wert
SL 7810/F 0,33 SL 7810/F-II 0,42 SL 7810/F-III 0,64 p-Hydroxybenzaldehyd 0,80 Tetrahydroderivat
Rf-Wert Tetrahydro-SL 7810/F 0,40 Tetrahydro-SL 7810/F-II 0,45 Tetrahydro-SL 7810/F-III
0,66 Griseofulvin 0,92 Zum Nachweis der Substanzen wird mit Vanillin-Schwefelsäure
besprüht. Beim Erwärmen auf 120 - 130 treten gelbbraune Farbflecke für die Tetrahydroverbindungen
auf. Die nicht hydrierten Verbindungen zeigen eine rötliche Anfärbung.
-
Das erfindungsgemässe Verfahren a) lässt sich nach für die fermentative
Gewinnung von Antibiotika bekannten Methoden ausführen. Eine Kultur davon wurde
beim United States Department of Agriculture (Northern Utilization Research and
Development Division), Peoria, I11., USA deponiert und steht der Oeffentlichkeit
unter der Bezeichnung NRRL 8039 zur Verfügung.
-
Vorzugsweise wird der Stamm NRRL 8039 verwendet.
-
Doch können auch Stämme verwendet werden, die aus dem Ausgangsstamm
Aspergillus rugulosus Thom & Raper durch Behandlung mit mutagenen Substanzen
oder Strahlen oder durch Selektion gewonnen werden können.
-
Charakteristikum des Stammes NRRL 8039 Der neue Stamm NRRL 8039 von
Aspergillus rugulosus Thom & Raper wurde aus einer auf dem Jaunpass in der Schweiz
gesammelten Bodenprobe isoliert und lässt sich aufgrund seiner morphologischen Merkmale
mit Hilfe der Aspergillus-Monographie von K.B. Raper & D.I. Fennell (THE GENUS
ASPERGILLUS: The Williams & Wilkins Company Baltimore, 1965, 686 S.) bei Aspergillus
rugulosus Thom & Raper einordnen.
-
Der Stamm NRRL 8039 wächst auf Agarnährböden zwischen 15 und 50 °
C, das Wachstumsoptimum liegt zwischen 35 und 42 ° C. Auf Czapek-Dox-Agar wächst
der Stamm NRRL 8039 eher lanysam, die Kulturen entsprechen habituell annähernd der
Artbeschreibung (Raper & Fennell, 1965): 20 Tage alte Kolonien sind stark, gefältelt
und das uuz, samtartige .urtrnycel ist grau,
hellbraun bis braun-violett
pigmentiert. Der Kolonierand bleibt bei tieferen Inkubationstemperaturen (z. B.
18 bis 27 ° C) weiss, bei höheren Temperaturen (z. B. 33 bis 45 ° C) erscheint dieser
gelb-braun.
-
Die Rückseite der Kolonie bleibt bei tieferen Inkubationstemperaturen
gelblich, bei höheren Temperaturen wird ein violettes Pigment gebildet und in den
Agar ausgeschieden. Auch nach 20-tägiger Inkubation auf Czapek-Dox-Agar werden keine
Cleistothecien und nur bei höheren Inkubationstemperaturen vereinzelte, aber verkümmerte
Konidienträger gebildet.
-
Bedeutend schneller und besser entwickelt sich der Stamm NRRL 8039
auf 2 % Malz-Dextrose-Agar, wo bereits nach 20-tägiger Inkubation bei 27 ° die Haupt-
und Nebenfruchtformen in beachtlichen Mengen gebildet und ausgereift sind. Die Kolonien
sind höchstens ganz schwach, meist aber überhaupt nicht gefältelt und das samtartige
Luftmycel ist einheitlich gelblich gefärbt.
-
Die Rückseite der Kolonie ist bei tieferen Inkubationstemperaturen
gelb, bei höheren Temperaturen hellbraun.
-
Der auf 2 % Malz-Dextrose-Agar wachsende Stamm NRRL 8039 zeigt dunkelgrüne
Konidienköpfchen, die meist in kleineren Grüppchen in und am Rand der Kolonie auftreten.
-
Die Morphologie und Dimension aller Strukturen der Nebenfruchtform
stimmen gut überein mit der erwähnten Artbeschreibung von Aspergillus rugulosus.
-
Bezüglich der Hauptfruchtform bestehen hingegen einige Differenzen
zur Artbeschreibung: So bleiben
die in mehreren Lagen des samtartigen
Luftmycels sich in grosser Zahl entwickelnden, kugeligen Cleistothecien bedeutend
kleiner als für die Art angegeben wird (50 - 80 p im Durchmesser gegenüber 225 -
350 p). Auch sind die Hüllezellen hyalin, während sie bei dieser Art dunkelbraun
sein sollten.
-
Eine gute Uebereinstimmung mit der Artbeschreibung besteht hingegen
im artcharakteristischen Merkmal der violett-orange-roten, linsenförmigen, 4,1 -
5,0 x 3,4 - 3,8 ja grossen Ascosporen, deren Oberfläche mehr oder weniger deutlich
runzlig und gefurcht und deren beiden parallel angeordneten Aequatorsäume 0,4 -
0,7 ju breit sind.
-
Der neue Stamm NRRL 8039 lässt sich auf verschiedenen Nährböden mit
den üblichen Nährstoffen züchten, z. B.
-
wie im nachstehenden Beispiel beschrieben.
-
Die neuen Antibiotika SL 7810/F, SL 7810/F-II und SL 7810/F-III kann
man in der Weise herstellen, dass man ein flüssiges Medium mit einer Sporen- oder
Mycelsuspension des Stammes NRRL 8039 beimpft und die Kultur 2 - 4 Tage, vorzugsweise
3 Tage, bei 27 inkubiert. Die Züchtung erfolgt unter aeroben Bedingungen, entweder
in Oberflächen- oder Submerskultur. Sobald eine maximale Menge an Antibiotika produziert
ist (feststellbar durch Nachweis der Aktivität gegen Candida albicans) werden diese
aus der Kulturbrühe nach an sich bekannten Methoden isoliert, z. B. wie im nachstehenden
Beispiel beschrieben, wobei
als Lösungsmittel statt Essigester
auch andere organische Lösungsmittel, wie z. B. Butylacetat oder Butanol, verwendet
werden.
-
Zur Abtrennung von fettartigen Begleitstoffen aus dem rohen Extrakt
kann als erste Operation eine Filtration über eine Kieselgelsäule durchgeführt werden,
wobei etwa die 4- bis 5-fache Gewichtsmenge Kieselgel, bezogen auf die Extraktmenge,
angewandt wird. Die Elution erfolgt mit Chloroform-Nethanol-Geiaischen (siehe nachfolgendes
Beispiel).
-
Ein anderes Verfahren ist beispielsweise wie folgt durchführbar: Man
trennt fettartige Begleitstoffe und weitere Nebenprodukte durch geeignete Fällungsreaktionen
ab. Dazu wird z. B. der Essigester-Extrakt mit Petroläther verrieben, wobei die
gegen Candida albicans aktiven Antibiotika im unlöslichen Anteil verbleiben. Dieser
Rückstand wird in Methanol aufgeschlämmt und nach Abfiltrieren von unlöslichen,
inaktiven Anteilen das Filtrat im Vakuum eingedampft.
-
Dieses Material löst man in Methanol und tropft die klare Lösung zur
10-£achen Menge Essigester. Die Fällung enthält SL 7810/F, SL 7810/F-II und SL 7810/F-III
neben inaktiven Begleitstoffen.
-
Die weitere Reinigung und Auftrennung der Komponenten aus dem Gemisch
erfolgt nun durch an und für sich bekannte chromatographische Methoden, wobei sich
die Gelchromatographie an Sephadex LH 20 und die Chromatographie an Kieselgel sehr
gut eignen. Diese Methoden werden in Kombination und zur Reinigung der einzelnen
Komponenten
wiederholt angewendet. So wird z. B.
-
eines der oben beschriebenen Rohprodukte zuerst an Sephadex LH 20
mit Methanol chromatographiert, wobei die drei Antibiotika bei der Elution in den
gleichen Fraktionen auftreten. Die vereinigten aktiven Fraktionen werden anschliessend
an Kieselgel, Korngrösse 0,06 - 0,2 mm, chromatographiert. Zur Elution kann entweder
Chloroform, dem steigende Mengen Methanol zugesetzt werden, oder aber durchgehend
ein Chloroform-Methanol-Wasser-Gemisch (80 : 17,5 : 2) verwendet werden. Entsprechend
den Rf-Werten im Dünnschichtchromatogramm wird bei der Elution von Kieselgelsäulen
zuerst SL 7810/F-III, dann SL 7810/F-II und zuletzt SL 7810/F erhalten. Zur Auftrennung
von Mischfraktionen, insbesondere SL 7810/F-II und SL 7810/F-III, wird an der 250-
bis 400-fachen Menge Kieselgel eventuell mehrmals chromatographiert. Die gegen Candida
albicans aktiven und im Dünnschichtchromatogramm reinen Fraktionen entsprechen nach
den Rf-Werten den beanspruchten Antibiotika.
-
Das erfindungsgemässe Verfahren b) lässt sich nach an sich bekannten
Methoden ausführen, z. B. durch katalytische Hydrierung.
-
Als Lösungsmittel kommen vorzugsweise niedere aliphatische Alkohole,
wie z. B, Methanol oder Aethanol, in Frage. Die Hydrierung erfolgt zweckmässsigerweise
in neutralem oder in schwach saurem Bereich, z. B.
-
in Gegenwart von schwachen organischen Säuren wie Essigsäure. Die
Hydrierung erfolgt bei Temperaturen
zwischen 10 und 40 ° C, vorzugsweise
zwischen 20 und 25 ° C. Die Hydrierung erfolgt zweckmässigerweise unter Atmosphärendruck
oder wenig erhöhtem Druck, in Gegenwart eines Platin-Katalysators, wie z. B. PtO2,
das zu Pt vorhydriert wird, oder vorzugsweise eines Palladium-Katalysators, wie
z. B. Palladium auf Kohle oder Bariumsulfat. Die Hydrierung erfolgt bis zur vollständigen
Wasserstoffaufnahme. Hierbei wird davon ausgegangen, dass die Wasserstoffaufnahme
2 Mol pro Mol Antibiotikum SL 7810/F, SL 7810/F-II und SL 7810/F-III dem Mol. Gew.
von ca. 1000 bis 1200 entspricht. Bei hydrierten Derivaten der genannten Antibiotika
konnten im NMR Spektrum keine Protonen, die auf Linolsäure hinweisen, nachgewiesen
werden.
-
Die erhaltenen hydrierten Derivate der Antibiotika SL 7810/F, SL 7810/F-II
und SL 7810/F-III werden wenn nötig in an sich bekannter Weise gereinigt.
-
Vorzugsweise eignet sich dazu die Chromatographie an Sephadex LH-20
(Elu-tion mit Methanol) und/oder die Chromatographie an feinkörnigem Kieselgel,
wobei zweckmässigerweise mit Chloroform-Methanol-Gernischen (9:1) bis (3:1) oder
mit Chloroform-Methanol-Gemischen unter Zusatz einer kleinen Menge Wasser eluiert
wird.
-
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Fermentationslösungen, die
bei der Züchtung eines die Antibiotika SL 7810/F, SL 7810/F-II und/oder SL 7810/F-III
produzierenden Stammes der Gattung Aspergillus rugulosus Thom & Raper gewonnen
werden.
-
Die neuen Antibiotika und ihre Tetrahydroderivate zeigen interessante
pharmakologische Eigenschaften.
-
Zur biologischen Charakterisierung der Antibiotika SL 78l0/F, SL 7810/F-II,
SL 7810/F-III und ihrere Tetrahydroderivate dient ihr Wirkungsspektrum.
-
Während sämtliche Verbindungen bei den gebräuchlichen Testbedingungen
unwirksam sind gegen grampositive und gramnegative Bakterien wie z. B. Staphylococcus
aureus und Escherichia coli, zeigen sie ausgeprägte Wirkungen gegen Hefen und Pilze.
-
In der nachstehenden Tabelle sind die Mindesthemmkonzentrationen gegen
verschiedene Hefen und Pilze aufgeführt. Der hierfür verwendete Reihenverdünnungstest
wurde auf bekannte Weise durchgeführt mit den angegebenen Teststämmen. Die Inkubation
beim Reihenverdünnungstest erfolgte in einem Malzextrakt-Medium (2 %ig) vom pH 4,4
- 4,7 bei 27 bis 37 ° C je nach Temperaturoptimum des betreffenden Teststammes.
-
Die Auswertung erfolgt nach 72 Stunden Inkubationsdauer. Die Teststämme
sind in der Mycothek der Firma Sandoz deponiert und stehen dort zur Verfügung.
| Stamm MIC-Werte in µg/ml |
| Tetrahydro- Tetrahydro- Tetrahydro- |
| SL 7810/F SL 7810/F-II SL 7810/F-III SL 7810/F SL 7810/F-II
SL 7810/F-III |
| Candida albicans 0,3 0,3 1 0,03 0,01 0,03 |
| Candida albicans H 12 0,3 0,1 0,3 0,1 31,6 0,01 |
| Candida albicans 5897 0,3 0,3 1 100 31,6 0,3 |
| Candida albicans 439 0,3 0,03 0,3 0,03 3,2 0,01 |
| Candida albicans resistent 0,03 30 10 100 1 0,03 |
| gegen Blasticidin S |
| Candida tropicalis 0,3 0,03 0,3 100 100 0,1 |
| Candida tropicalis CK 4 0,03 0,03 0,1 100 10 0,03 |
| Candida krusei 1 0,3 1 0,03 10 0,3 |
| Trichophyton mentagrophytes >100 |
| Trichophyton quinckeanum >100 |
| Saccharomyces cerevisiae 10 10 10 0,1 0,01 |
| Hansuela anomala 0,01 0,01 0,1 0,01 0,03 |
| Rhodotorula rubra 0,1 31,6 31,6 >100 100 |
| Kloeckera apiculata 30 3,16 10 1 0,1 |
| Cryptococcus neoformans 100 >100 |
| Aspergillus flavipes 3,2 |
| Giberella fujikuroi 3,2 |
| Aspergillus niger 100 |
| Curvularia lunata >100 |
Wie aus den vorstehenden Untersuchungsresultaten (MIC-Werte) hervorgeht,
zeigen die genannten Verbindungen eine Wirksamkeit gegen bestimmte Pilze, insbesondere
gegen Candida albicans. Die Wirksamkeit gegen Candida albicans kann auch in vivo
durch folgende Tests bestimmt werden: 1, Experimentelle Darminfektion mit Candida
albicans n124 an weiblicher Maus Bei dieser Methode wird durch Antibiotika-Behandlung
das Gleichgewicht der normalen Darmflora zugunsten der peroral applizierten Candida
albicans a 124 gestört. Durch die Breitspektrumantihictika-Behandlung kommt es zur
Unterdrückung der bakteriellen Flora und damit zur selektiven Vermehrung der Candida-Pilze
im Darm der weiblichen Maus. Die im Darm angesiedelten Candida-prganismen werden
mit dem 4 Kot (Keimzahl von 10 /g Kot) über mindestens drei Wochen regelmässig ausgeschieden.
-
Material und Methode Versuchstiere: Es werden weibliche, mit Mäusepellet
ad libitum gefütterte NMRI-Mäuse mit einem Gewicht von 18 bis 24 g verwendet. Im
Trinkwasser ist ein Zusatz von 1 mg/ml Streptomycin enthalten.
-
Inoculum und Infektion: Die Darminfektion der weiblichen Maus mit
Candida albicans wird folgendermassen durchgeführt: Aus einer in flüssigem Stickstoff
aufbewahrten und aufgetauten Ampulle wird eine Verdünnung bereitet, die in 0,25
ml 5 x 10 Keime enthält. Es werden 7 dann jeweils 5 x 10 Keime pro Maus peroral
appliziert.
-
Nach der Infektion werden die Tiere einzeln in Käfige verteilt (6
oder 10 Tiere, die einzeln gehalten werden, stellen ein Kollektiv dar).
-
Keimzahlbestimmung im Faeces (RZ/g Kot): Die Versuchstiere werden
am 6. Tag - bzw. zu jenem Zeitpunkt, zu dem die Keimzahl im Kot bestimmt werden
soll - in sterile Makralonkäfige gesetzt und die Faeces von 4 Stunden gesammelt
und gewogen. Anschliessend wird in einer NaCl-Lösung eine Suspension -l -7 von 10
hergestellt und bis 10 verdünnt. Danach werden die Keime im Plattenverfahren mit
Sabouraud-Agar ausgezählt, wobei pro ml SAB-Agar 50 Streptomycin zugegeben werden.
Durch den Streptomycin-Zusatz in Agar wird das Wachstum der übrigen Darmkeime ausgeschaltet
und wir erhalten auf der Agarplatte eine Reinkultur des Pilzes Candida albicans.
-
Dosierung und Behandlungsart Die höchste verabreichte Dosis einer
Testsubstanz richtet sich im allgemeinen nach der Dosis tolerata maxima. Sie beträgt
meistens 300 mg/kg Körpergewicht der Maus; eine weitere Dosierung beträgt 100 mg/kg
Körpergewicht. Diese zu verabreichenden Tagesdosen
werden, beginnend
mit dem Tag der Infektion, fünf Tage hindurch peroral appliziert. Die Tagesdosen
werden auf jeweils drei Einzelgaben verteilt und in einem Volumen von 0,25 ml (bei
wasserunlöslichen Substanzen dient 0,2 teige CMC + 0,2 % Tween 80 als Suspensionsvermittler)
auf 20 g Maus peroral verabreicht.
-
Jeder Infelctionsversuch wird durch die Mitführung von 10 Kontrolltieren
ergänzt, die eine Standardsubstanz erhalten. Als Standardsubstanz wird in diesem
Infektionsversuch Nystatin in Tagesdosen von 300 und 100 mg/kg Körpergewicht peroral
verabreicht.
-
Die Applikation dieser Dosen erfolgt wie bei der Testsubstanz. Bei
einer p.o. verabreichten Dosis von 300 mg/kg Körpergewicht Nystatin sind einen Tag
nach Abschluss der Behandlung keine Keime von Candida albicans im Kot nachzuweisen,
während 100 mg/kg Körpergewicht Nystatin eine Keimreduktion von mindestens zwei
Zehnerpotenzen, in einigen Fällen auch bereits eine völlige Elimination dieser Keime
bewirken.
-
Für jede Dosierung ist eine Gruppe von je 6 Tieren vorhanden, die
einzeln in Käfigen gehalten werden.
-
6 weitere Tiere erhalten wie alle anderen auch Streptomycin über Trinkwasser
und das Lösungsmittel ohne Substanz als Kontrolle. Die Tiere werden ebenfalls einzeln
gehalten.
-
Auswertung und Beurteilun: Bei der Auswertung eines solchen Versuches
werden Keimzahlreduktionen bzw. Keimeliminationen festgestellt und mit den unbehandelten
Kontrolltieren bzw. den Kontrolltieren der Standardsubstanzen verglichen und in
Prozenten berechnet.
-
2. Vaginale Candida albicans-Infektion der Ratte (Stamm b 124) Die
vaginale Mykose der weiblichen Ratte stellt eine Schleimhaut-Infektion dar. Durch
die Ovariektomle und anschliessende Hormongabe induzierte Dauerbrunst der geschlechtsreifen
Ratte kann eine experimentelle vaginale Mykose erzeugt werden. Diese lokale Infektion
umfasst meist nur die oberflächlichste Schichte der Vaginalschleimhaut. Durch Abstriche
kann ihr Verlauf gut kontrolliert werden. Die gute Reproduzferbarkeit und der gleichmässige
Verlauf der Infektion erfüllen alle Anforderungen, die für die Suche nach einem
neuen Wirkstoff Voraussetzung sind.
-
Versuchstiere: Es werden weibliche Wistar Ratten mit einem Gewicht
von ca. 200 g verwendet. Die Tiere erhalten Futter und Wasser ad libitum. Pro Versuchsgruppe
werden 10 Tiere verwendet.
-
Vorbereitung und Durchführung der Infektion: Unter Nembutal-Narkose
weden die Tiere ovariektomiert. Einen Tag nach der Ovariektomie werden 100 pg Oestradiol
in einer Menge von 0,5 ml Sesamöl subcutan pro Ratte verabreicht. 1 Woche nach der
Hormongabe befinden sich die Tiere im Oestrus, was leicht mittels Abstrichen und
Methylenblau-Färbung im Mikroskop erkennbar wird.
-
In diesem Zustand der Dauerbrunst sind Leucozyten im Vaginalinhalt
kaum zu finden, was für die Manifestation einer Infektion von Vorteil ist, da Fremdkeime,
die in die Vagina eindringen, von den Leucozyten nicht sofort phagozytiert werden.
-
7 Tage nach der Ovariektomie erfolgt die Infektion.
-
Mit einer Tuberkulinspritze und Schlundsonde werden Candida albicans-Keime
in einer Menge von 0,05 ml oder 10 Keimen pro Ratte intravaginal appliziert.
-
Die Herstellung des Inoculums erfolgt nach dem üblichen Verfahren
und wird in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Die Keime werden direkt vom N2 nach
schnellem Auftauen für die Infektion verwendet.
-
Der Verlauf der lokalen Vaginal-Mykose wird am 3., 7., 10., 15. und
20. Tag nach der Infektion kontrolliert. Mit einer Platinöse wird Vaginalinhalt
auf eine Streptomycin-haltige Sabouraud-Agar Platte (20 Fg/ml) ausgestrichen. Parallel
werden mit Vaginalinhalt Abstriche hergestellt,
nach gram gefärbt
und unter dem Mikroskop auf das Vorhandensein von Pseudomycel untersucht. Nach 2-tägiger
Bebrütung der SAB-Platten (Röhrchen) bei 30 ° C werden diese semiquantitativ ausgewertet.
-
Je nach dem Wachstum von Candida albicans-Kolonien kann man von einer
hochgradigen, (Rasenwachstum), mässigen (zählbare Kolonien) und geringgradigen (vereinzeltes
Kolonien-Wachstum von Candida albicans) Infektion sprechen.
-
Behandlung und Dosierung.
-
Die lokale Behandlung der experimentellen Vagina-Candidasis beginnt
24 Stunden nach der Infektion.
-
Es wird 2 x täglich (vormittals und nachmittags) an 5 aufeinanderfolgenden
Tagen intravaginal therapiert. Als Einzeldosis einer Testsubstanz werden jeweils
0,1 ml einer 1,5 %igen und 5 %igen Salbe pro Ratte verabreicht.
-
Substanzen werden in einem Gemisch aus 2 Teilen Polyäthylenglykol
300 und 1 Teil Polyäthylenglykol 1500 "Salbengrundlage" verarbeitet und intravaginal
verabreicht.
-
Jeder Infektionsversuch wird durch die Mitführung von einer Gruppe
von 10 Tieren als Kontrolltiere, die eine bekannte Standard-Substanz erhalten, ergänzt.
Als Standard-Substanz wird Nystatin als 1,5 teige Salbe bzw. Clotrimazol als 1,5
%ige Salbe alternativ verwendet. 10 weitere Tiere erhalten Salbengrundlage ohne
Substanz und eine Gruppe von 10 Tieren dient als Infektionskontrolle.
-
Die neuen Antibiotika und ihre Tetrahydroderivate eignen sich daher
für die Behandlung der durch Candida albicans hervorgerufenen Erkrankungen.
-
Im allgemeinen werden befriedigende Resultate mit einer Tagesdosis
von etwa 100 bis 1500 mg erzielt.
-
Diese Dosis kann nötigenfalls in 2 bis 3 Anteilen von 30 bis 750 mg
verabreicht werden.
-
Als Heilmittel können die neuen Antibiotika und ihre Tetrahydroderivate
allein oder in geeigneten Arzneiformen gemeinsam mit anorganischen oder organischen,
pharmakologisch indifferenten Hilfsstoffen verabreicht werden. Beispielsweise werden
sie als Bestandteil einer Salbe eingesetzt, wobei die Konzentration in der Salbe
ca. 5 bis 130 mg Wirkstoff pro g Salbe betragen kann. Andere Formen sind Tabletten,
Kapseln und Lösungen.
-
In den nachfolgenden Beispielen, welche die Ausführung deS Verfahrens
erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen
alle Temperaturangaben in Celsiusgraden. Alle angegebenen Verhältnisse sind Volumen/Vclumen.
Merck, Sephadex und Dispax sind Handelsmarken.
-
Beispiel 1: Eine Sporensuspension, die zur Beimpfung der Nährlösung
dient, wird aus einer Kultur des Stammes NRRL 8039 hergestellt. Hierzu beimpft man
200 ml Nähragar folgender Zusammensetzung: 20 g Cerelose (Glucose) 2 g Pepton 2
g Malzextrakt 2 g Hefeextrakt 2 g primäres Kaliumphosphat 2 g MgSO4 7H 20 15 g Agar
1 Liter entionisiertes Wasser Nach 10 Tagen Inkubation bei 27 ° werden die gebildeten
Sporen in 200 ml sterilem Wasser suspendiert und damit ein Stahlfermenter beimpft,
der 50 Liter folgender Nährlösung enthält: 20 g Cerelose (Glucose) 10 g Stärke 10
g Sojapepton 3 g Calciumcarbonat 2 g Natriumnitrat 1 g primäres Kaliumphosphat 0,5
g Kaliumchlorid 0,5 g MgSO4 7H2O 1 ml Gemisch aus 90 ° Rhodorsil Siliconemulsion
Antimousse B sowie 10 % Polypropylenglykol 2020 (Chem. Werke Hüls, Marl BRD) 1 Liter
entionisiertes Wasser
Dieser Fermenter wird unter Rühren während
42 Stunden bei 27 ° inkubiert, wobei die Belüftung 1 Liter Luft/ Min./Liter Medium
beträgt, bei einer Rührgeschwindigkeit von 250 U/Min.
-
Diese Kultur dient als Vorkultur für 500 Liter-Fermenter der gleichen
Nährlösung, die damit 66 Stunden bei 27 ° inkubiert wird. Die Belüftungsrate beträgt
wiederum 1 Liter Luft/Min./Liter M dium, die Rührgeschwindigkeit aber nur 150 U/Min.
Nach 66 Stunden Inkubationsdauer wird die Kulturbrühe geerntet und wie folgt aufgearbeitet:
450 Liter Kulturbrühe werden mit 2 N Salzsäure auf pH 7,0 gestellt, mit 500 Liter
Essigester versetzt und mit dem Dispax-Reaktor homogenisiert. Anschliessend wird
die organische Phase mit dem Separator von der Brühe getrennt und mit 50 Liter Wasser
gewaschen.
-
Dieser Extraktionsschritt wird zweimal wiederholt. Die erhaltenen
3 Extrakte werden vereinigt und unter Vakuum (Wasserringpumpe) bei 20 bis 40 ° zur
Trockne eingeengt.
-
Dieses Material wird an der 4-fachen Menge Kieselgel Merck 60 (Rorngrösse
0,063 - 0,20 mm) fraktioniert.
-
Die Eluate mit Chloroform + 10 % Methanol und Chloroform + 20 % Methanol
enthalten inaktive Begleitstoffe. Die Chromatographiesäule wird anschliessend mit
Chloroform-Methanol (1 : 1) eluiert und die Fraktionen mit Aktivität gegen Candida
albicans vereinigt und zur Trockene eingeengt.
-
Durch Chromatographie von 16,4 g aktivem Material an 1 kg i'eseia.1'
Merck 60 (Korngrösse
0,063 - 0,20 mm) und Elution mit Chloroform
+ 20 % Methanol werden zuerst Mischfraktionen von SL 7810/F-II und SL 7810/F-III
erhalten. Die nachfolgende Elution mit Chloroform + 30 % Methanol liefert Fraktionen
mit SL 7810/F als Hauptkomponente. Nach Gelfiltration der SL 7810/F-Fraktion (8,1
g) an 1,2 kg Sephadex LH 2C mit Methanol wird SL 7810/F in annähernd reiner Form
gewonnen. Dieses Präparat wird unter Erwärmen in -Aceton gelöst und die klare Lösung
auf 1/4 des Volumens eingeengt. Nach 3 Stunden Stehen bei - 15 ° wird der entstandene
Niederschlag abfiltriert und nach Waschen mit Aceton und Aether 24 Stunden bei Raumtemperatur
über P 205 im Hochvakuum getrocknet. SL 7810/F fällt als farbloses Pulver vom Smp.
160 - 163 ° (Zers.) an.
-
Durch weitere Chromatographie der aktiven Mischfraktionen von SL 7810/F-II
und SL 7810/F-III aus der obigen Kieselgelchromatographie können die beiden Antibiotika
isoliert werden. Dazu wird das Material (2,5 g) in Chloroform + 20 % Methanol gelöst
und die Lösung an einer Säule von 1 kg Kieselgel, die mit demselben Lösungsmittelgemisch
bereitet ist, adsorbiert. Die Elution erfolgt durchgehend mit Chloroform + 20 %
Methanol, wobei zuerst vorwiegend SL 7810/F-III, dann vorwiegend SL 7810/F-II eluiert
wird. Zur Gewinnung von reinem SL 7810/F-III werden die eingedampften Mischfraktionen
(0,75 g), die dieses Antibiotikum enthalten, in Chloroform + 10 % Methanol gelöst
und
die Lösung analog wie früher beschrieben an 1 kg Kieselgel
Merck adsorbiert. Die Elution mit Chloroform + 10 % Methanol bis 15 % Methanol liefert
das stark angereicherte Material von SL 7810/F-III. Nach Gelfiltration (0,55.g)
an 500 g Sephadex LH 20 mit Methanol wird reines SL 7810/F-III erhalten: farbloses
amorphes Pulver mit dem Smp. 164 - 168 (Zers.) Zur Isolierung von SL 7810/F-II werden
die Mischfraktionen (1,7 g), die SL 7810/F-II enthalten, in Chloroform + 20 % Methanol
gelöst und diese Lösung an einer mit demselben Lösungsmittelgemisch bereiteten Säule
von 1 kg Kieselgel adsorbiert. Die Elution mit Chloroform + 20 t Methanol ergibt
stark angereicherte Fraktionen des SL 7810/F-II. Die nachfolgende Gelfiltration
(1t2 g) an 1,2 kg Sephadex LH 20 mit Methanol liefert reines SL 7810/F-II, ein amorphes
Pulver mit dem Smp. 158 - 160 ° (Zers.).
-
Beispiel 2: Tetrahrdro-SL 7810/F Eine Suspension von 1 g Palladium-Kchle
(10 % Pd) in 250 ml Alkohol oder 250 ml Alkohol-Eisessig (1 : 1) wird 30 Minuten
vorhydriert. Anschliessend gibt man eine Lösung von 5 g SL 7810/F in 50 ml Alkohol-Eisessig
(1 : 1) zu. Nach 3 Stunden Hydrierung bei 20 ° unter Atmosphärendruck wird der Katalysator
auf
einer Talknutsche abgetrennt und das klare Filtrat im Vakuum
eingedampft. Der Eindampfrückstand wird in Chloroform-Methanol (1 ; 1) gelöst, mit
dieser Lösung 10 g Kieselgel 60 Merck (Korngrösse 0,063 - 0,20 mm) imprägniert und
dieses auf eine Säule von 500 g Kieselgel gegeben. Die anschliessende Elution mit
Chloroform-Methanol (4 : 1) liefert das amorphe Hydrierungsprodukt als farbloses
Pulver vom Smp. 173 - 178 (Zers.). Das Präparat kristallisiert aus Aethanol-Wasser
(95 : 5). Smp. nach Trocknen 3 Stunden im Hochvakuum bei 50 0: 190 - 205 ° / 210
- 212 (unter Zersetzung).
-
Beispiel 3: Tetrahydro-SL 7810/F-II Die Herstellung erfolgt analog
zu Beispiel 2, wobei als Ausgangsmaterial das Antibiotikum SL 7810/F-II eingesetzt
wird.
-
Beispiel 4: Tetrahydro-SL 7810/F-III Die Herstellung erfolgt analog
zu Beispiel 2, wobei als Ausgangsmaterial das Antibiotikum SL 7810/F-III eingesetzt
wurde, die Hydrierungsdauer 4 Stunden betrus und als Lösungsmittelgemisch zur Chromatographie
an Kieselgel Chloroform-Methanol-Wasser (80 : 17,5 : 2) verwendet wurde.