DE2556043B2

DE2556043B2 - Antibiotikum bu-2183, verfahren zu seiner herstellung und arzneimittel

Info

Publication number: DE2556043B2
Application number: DE19752556043
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Tokio; Tomita . Koji Kawasaki Kanagawa; Fujisawa Keiichi Kamifukuoka Saitama; Tsukiura Hiroshi Tokio; Kawaguchi (Japan)
Original assignee: Bristol Myers Co
Current assignee: Bristol Myers Co
Priority date: 1974-12-12
Filing date: 1975-12-12
Publication date: 1978-02-02
Also published as: NL7514507A; SE7514033L; DK564275A; DE2556043A1; PH17247A; LU74002A1; US4012576A; YU37360B; DK142425B; IL48635A0; GB1525977A; CH619733A5; NO754213L; GR58535B; CA1060820A; SE431874B; NO144574C; IL48635A; ES443463A1; AU8742975A

Description

CHOH

CH₂OH

und dessen pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze.
5. Antibiotikum 8u-2183 B der Formel

OH

-^-JLq

^HO f\\ CH₂NH₂

OH J CHOH
O—CH

CHNH₂
CHOH

CH₂OH

und dessen pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze.

40

6. Antibiotikum Bu-2183 A₂der Formel

CH₃(CH₂J₂CONH
HO

und dessen pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze.
7. Aminoglycosid Bu-2183 D der Formel

H₂N

und dessen Säureadditionssalze.

8. Arzneimittel, bestehend aus mindestens einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6 und pharmazeutisch verträglichen Träger- und/oder üblichen Hilfsstoffen.

Die Erfindung betrifft einen neuen, als Bu-2183 bezeichneten Aminoglycosidantibiotikumkomplex, der hergestellt wird, indem man eine neue Species von Pseudomonas, die als Pseudomonas sp. Stamm D946-B83, ATCC Nr. 31 086, bezeichnet wird, in einem wäßrigen Nährmedium, welches assimilierbare Stickstoff- und Kohlenstoffquellen enthält, unter submersen aeroben Bedingungen kultiviert, bis durch den Organismus im Kulturmedium eine wesentliche Mepge an Bu-2183-Komplex gebildet ist, und den Bu-2183-Komplex aus dem Kulturmedium gewinnt. Die Erfindung schafft auch ein Verfahren zur Gewinnung der Komponenten des Bu-2183-Komplexes als Einzelsubstanzen, einschließlich insbesondere der antibiotischen Komponenten, die als Bu-2183 A, A₂ und B bezeichnet werden, und eines wertvollen, als Bu-2183 D bezeichneten Zwischenprodukts einfacherer Struktur, wobei das Verfahren die Herstellung des Bu-2i83-Kompiexes nach der zuvor beschriebenen Methode, das Abtrennen des antibiotischen Komplexes aus dem Mycel des Kulturmediums, das Adsorbieren des Bu-2183-KomDle-

xes auf einem kationischen Ionenaustauscherharz, das fraktionierte Eluieren der Bu-2183-Komponenten von dem Adsorbens und das Gewinnen der Fraktionen der gewünschten Komponenten, umfaßt.

Die Infrarot-Absorptionsspektren und die kernmagnetischen Resonanzspektren der vorstehend genannten Bu-2183-Komponenten wurden unter folgenden Versuchsbedingungen aufgenommen:

Infrarot-Absorptionsspektren von der jeweiligen freien Base als Kaliumbromid-Preßling. Kernmüjnetische Resonanzspektren von dem jeweiligen Hydrochlorid, gelöst in D2O unter Verwendung von 2,2-Dimethyl-2-silapentan-5-suI-fonat als inneren Standard, bestimmt mit einem J EOL-60-M Hz-Spektrometer (Typ TNM-C-60H L).

Die Spektren sind in den F i g. 1 bis 8 wiedergegeben.

Spektrum

Bu-2183-K.omponente A A₂ B

IR, Fig.
KMR, Fig.

3 4

10

20

Obwohl zahlreiche Antibiotika einschließlich mehrerer Aminoglycosidantibiotika, wie Kanamycin, Gentamycin, Streptomycin, Neomycin, Tobramycin und Paromomycin, bekannt sind, besteht ein Bedürfnis für jo weitere neue Breitbandspektrumantibiotika, insbesondere für solche, die Aktivität gegen Aminoglycosidresistente Organismen, wie Pseudomonas, aufweisen.

Die neue Species von Pseudomonas, die als Pseudomonas sp. Stamm D946-B83 in der Bristol-Ba- J5 nyu-Kultursammlung bezeichnet wird, ist ein psychrophiles Bodenbakterium, das aus einer indischen Bodenprobe isoliert wurde. Eine Kultur des Organismus ist in der American Type Culture Collection, Washington, D.C., hinterlegt und wird in der permanenten ·ιο Sammlung von Mikroorganismen als ATCC 31 086 geführt.

Der neue erfindungsgemäße Aminoglycosidkomplex umfaßt mindestens fünf Aminoglycosidkomponenten, von denen bei drei Komponenten, die als Bu-2183 A, A2 und B bezeichnet werden, festzustellen ist, daß sie bioaktiv sind, und bei zwei, als Bu-2!83C und D bezeichneten Komponenten, festgestellt wird, daß sie bioinaktiv sind.

Der antibiotische Komplex Bu-2183 und jede der drei bioaktiven antibiotischen Komponenten weisen ein breites Spektrum antibakterieller Aktivität auf und inhibieren das Wachstum der Aminoglycosid resistenten Miroorganismen, einschließlich der Pseudomones-Species. Die Antibiotika Bu-2183, Bu-2183 A, Bu-2183 A₂ und Bu-2183 B sind wertvoll als anitbakterielle Mittel, als Beifuttermittel bei Tierfutter und als therapeutische Mittel bei Geflügel und Tieren, einschließlich des Menschen. Sie sind wertvoll bei der Behandlung von infektiösen Erkrankungen, die durch gram-positive und gram-negative Bakterien verursacht sind, insbesondere bei Erkrankungen, die durch Aminoglycosid resistente Mikroorganismen hervorgerufen sind.

Eine der neuen bioinaktiven Komponenten des durch Fermentation hergestellten Komplexes, und zwar Bu-2183 D, eignet sich als Zwischenprodukt zur halbsynthetischen Herstellung der bioaktiven Komponenten Bu-2183 A, A₂und Bdurch N-Acylierung.

Der das Bu-2183-Antibiotikum produzierende Organismus, der als Pseudomonas Sp. Stamm ATCC 31 086 bezeichnet wird, ist ein streng aerobes, nichtsporulierendes und gram-negatives Bakterium. Die Zellen sind stabförmig und bilden unipolare Multiflagellen. Der Stamm ATCC 31 086 ist ein psychrophiler Organismus, der bei 4°C, nicht jedoch bei 41°C, wächst. Er bildet fluoreszierendes Pigment in Glutamatmedium und entrahmter Milchlösung, nicht jedoch in Kingschem Ε-Medium (H. lizuka & K. Komagata: An Attempt At Grouping Of The Genus Pseudomonas. J. Gen. Appl. Microbiol. 9,73 - 82,1963). Cytochromoxidasen werden nicht gebildet. Die morphologischen, kulturellen und physiologischen Chaiakteristika des Stamms ATCC 31 086 sind nachfolgend beschrieben:

Morphologie

Der Stamm ATCC 31 086 ist dadurch gekennzeichnet, daß er motile, nichtsporulierende und gram-negative Stäbchen aufweist. Die Zellen sind gerade, bisweilen entlang der Längsachse gebogen und produzieren unipolare Büschelflagellen. Poly-/?-hydroxybutyrat ist nicht als Zellreserve enthalten (R. Y. S tan ie r, N. J. Palleroni & M. Doudoroff: The Aerobic Pseudomonads: A. Taxonomic Study. J. Gen. Microbiol. 43, 159-271, 1966). Es wird keine Hülle, Stengel oder Schleim produziert.

Wachstumscharakteristika

Kolonie auf Nähragar und Hefeextraktagar: Reichliches Wachstum. 0,5 bis 1,5 mm Durchmesser nach 1 Tag. Diffus, kreisförmig und etwas erhoben. Glatt und weich. Opak, weißliche Creme, später hellederfarbenorange. Leicht viskos. Kein diffusionsfähiges Pigment.

Nährbrühe und Hefeextraktbrühe: Reiches Wachstum. Trüb, später mit Sediment und gelegentlich Häutchen.

Hefeextrakt-Agar-Stich: Wachstum nur an der Oberfläche. Kein Wachstum unter irgendeiner anaeroben Bedingung.

Chemisch definiertes Medium aus anorganischen Salzen: Mäßiges Wachstum, wenn mit Glucose oder Lactat als einzige Kohlenstoffquelle versetzt.

Erfordernis für Wachstumsfaktor: Keines.

Wachstumstemperatur: Gehemmtes Wachstum bei 4°C. Mäßiges bis reiches Wachstum bei 10 bis 32°C. Spärliches Wachstum bei 37°C. Kein Wachstum bei 41°C.

Einfluß des pH der Medien: Kein Wachstum bei pH 4,0. Gehemmtes Wachstum bei pH 4,5 und pH 10,5 bis 11,0. Mäßiges bis gutes Wachstum bei pH 5,5 bis 9,5.

NaCI-Effekt: Kein Wachstum bei 12% NaCl. Gehemmtes Wachstum bei 6 bis 9%. Mäßiges Wachstum bei 5% oder weniger.

Die oben beschriebenen morphologischen und kulturellen Charakteristika sind denen der Familie Pseudomonadaceae gleich.

Physiologische Charakteristika

Der Stamm ATCC 31 086 produziert diffundierbares fluoreszierendes Pigment in bestimmten Medien, nicht jedoch in anderen, während eine bekannte Species von Pseudomonas, Pseudomonas fluorescens, eine reiche Fluoreszenzbildung zeigt (Tabelle I).

Die physiologischen und biochemischen Charakteristika des Stamms ATCC 31 086 sind in Tabelle Il gezeigt. Die Nutzung von Kohlenhydrat und anderen Kohlenstoffquellen durch den Oreanismus ist in Tabelle

II! im Vergleich mit der von zwei bekannten Pseudomonas-Species, Ps. fluorescens und Ps. aeruginosa, gezeigt.

Taxonomie

Aufgrund der oben beschriebenen morphologischen, kulturellen und physiologischen Charakteristika scheint der Stamm ATCC 31 086 zur Gruppe der Pseudomonaden zu gehören. Nachdem von S t a η i e r et al. (R. Y. Stanier, N. J. Palleroni und M. Doudoroff: The Aerobic Pseudomonads: A Taxonomie Study. J. Gen. Microbiol. 43; 159-271, 1966) für die aeroben Pseudomonaden vorgeschlagenen taxonomischen System ist der Stamm ATCC 31 086 mit Pseudomonas fluorescens ziemlich nahe verwandt, ausgenommen seine negative Eigelbreaktion, die negative Nutzung von Inosit und die negative Oxidaseproduktion. Unter den 13 Typ-Species von aeroben Pseudomonaden, die von Stanier untersucht wurden, wird nur von Pseudomonas maltophilia berichtet, daß es eine negative Oxidasereaktion zeigt. Dieser Organismus ist jedoch vom Stamm ATCC 31 086 hinsichtlich des Fehlens von fluoreszierendem Pigment, dem positiven Methioninbedarf, dem nichtvorhandenen Wachstum bei 4⁰C, der negativen Arginidihydrolase und der unterschiedlichen Substratverwendung, sehr verschieden. Somit wird der Stamm ATCC 31 086 als einer neuen Species der Art Pseudomonas zugehörig angesehen.

Herstellung der Antibiotika

Der antibiotische Komplex Bu-2183 wird durch Kultivieren der neuen Pseudomonas Species, die als Pseudomonas sp. Stamm ATCC 31 086 bezeichnet wird, unter submersen aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium hergestellt. Man läßt den Organismus in einem Nährmedium wachsen, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, beispielsweise ein assimilierbares Kohlenhydrat, enthält. Zu Beispielen für bevorzugte Kohlenstoffquellen gehören Glucose, Fructose, Mannose, Glycerin und dergleichen. Das Nährmedium sollte auch eine assimilierbare Stickstoffquelle enthalten, wie beispielsweise Fischmehl, Sojabohnenmehl, Peptone und dergleichen. Es können auch anorganische Nährsalze in das Kulturmedium eingebracht werden, und derartige Salze können irgendwelche der üblichen Salze umfassen, welche in der Lage sind, Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Kalzium-, Phosphat-, Salufat-, Chlorid-, Bromid-, Nitrat-, Carbonat- oder ähnliche Ionen zu liefern.

Die Herstellung des Bu-2183-Komplexes kann bei irgendeiner Temperatur durchgeführt werden, die einem befriedigenden Wachstum des Organismus förderlich ist, beispielsweise bei 10 bis 32°C, und sie wird besonders bevorzugt bei einer Temperatur um 28 bis 30°C durchgeführt. Üblicherweise erhält man eine optimale Produktion in 3 bis 5 Tagen. Man stellt fest, daß der optimale pH-Bereich des Mediums ungefähr pH 5,5 bis 9,5 betragt und besonders bevorzug! wird das Medium auf einen pH von ungefähr 7 eingestellt. Wenn man eine Tankfcnncntation durchführt, ist es wünschenswert, ein vegetatives Inoculum in einer Niihrbrülie zu produzieren, indem man die Brühenkultur mit einer Schräg- oder Bodenkultur oder eine lyophilisicrlei'i Kultur des Organismus inoculierl. Nachdem man auf diese Weise ein aktives Inoculum erhallen hat, wird es aseptisch in das Fcrniunüitionstankmcdium überführt.

Hinc bevoizugte Arbeitsweise zur Herstellung des I)u-2I8J-Antibi()tikumkomplexes ist wie folgt:

Saatmedium

Fermentationsmedium

Bestandteile in %

Glucose 3

Fischmehl 2 2

Sojabohnenmehl 0,5 -

Pepton 0,2

CaCO₃ 0,6 0,5 [0,6*)]

Glycerin - 2

Leinsamenmehl - 2

Erdnußmehl**) - 1

(NH₄)₂SO₄ - 0,3

*) Gemäß Beispiel.

**) Gemäß Beispiel an dessen Stelle proteinreiches Mehl embryonischer Baumwollsaat.

Man verwendet eine gut gewachsene Agar-Schrägkultur von Pseudomonas Stamm ATCC 31 086, um das Saatmedium zu inoculieren, wobei vor der Sterilisation der pH auf 7,0 eingestellt wird. Man inkubiert die Saatkultur bei 28⁰C währnd 48 Std. auf einer Rotationsschüttelvorrichtung (250 UpM) und überführt 2 ml des Wachstums auf 100 ml des Fermentationsmediums in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben. Die Produktion an Antibiotikum erreicht nach 3- bis 5tägigem Schütteln bei 28°C ein Maximum. Die antibiotische

JO Aktivität in der Fermentationsbrühe wird durch einen Papierscheiben-Agardiffusionstest unter Verwendung von Bacillus subtilis PCI 219 als Testorganismus bestimmt. Der Stamm ATCC 31 086 produziert 1500 bis 2000 y/mi antibiotischen Komplex durch die Schüttel-

J5 kolbenfermentationsmethode.

Nachdem man die optimale Brühenwirksamkeit erreicht hat (beispielsweise durch die zuvor erwähnte Testmethode festgestellt), wird die Brühe auf einen pH von ungefähr 2 eingestellt, wodurch der basische, wasserlösliche antibiotische Komplex vom Mycel getrennt und im wäßrigen Fermentationsmedium gelöst wird. Dann wird die Brühe filtriert, vorzugsweise mit Filterhilfe, und das Filtrat, welches das Antibiotikum enthält, auf einen pH von ungefähr 7 neutralisiert. Man gibt das neutralisierte Filtrat durch ein kationisches Ionenaustauscherharz in der Ammoniumform. Dann wird das Harz mit Wasser und verdünntem (n/50) NH₄OH gewaschen und der antibiotische Komplex aus dem Harz mit einem geeigneten Eluiermittel, -beispielsweise n/2 NH₄OH, eluiert. Man vereinigt die aktiven Eluiermittel, konzentriert im Vakuum und dampft ein oder lyophilisiert, wobei man den rohen Bu-2183-Antibiotikumkomplex erhält.

Durch Dünnschichtchromatographie wird gezeigt, daß der so erhaltene rohe Feststoff mindestens drei aktive Komponenten enthält, die hier als Bu-2183 A, A2 und B bezeichnet werden, sowie mindestens zwei inaktive Komponenten, die hier als Bu-2183 C und D bezeichnet werden. Der Bu-2183-Komplex kann in seine

w) Komponenten Bu-2183 A, A2, B, C und D durch Verwendung eines kationischen lonenaustauscherharzes, vorzugsweise in der Ammoniumform, aufgetrennt werden. Nachdem man den Komplex in Wasser gelöst hat, wird er auf das Harz aufgebracht, mit Wasser und

(i5 verdünntem (n/40) Ammoniunihydroxid gewaschen und mit einem geeigneten Eluiermittel eluiert. Es wurde festgestellt, daß Ammoniunihydroxid (n/20) die Auftrennung der Komponenten Bu-2183 A und B erlaubt.

Weiteres Eluieren der Säule mit einer konzentrierten Ammoniumhydroxidlösung, beispielsweise (n/10) ergibt Bu-2183 C und D, die η inhydri η positiv, jedoch bioinaktiv sind. Um gereinigte Komponente Bu-2183 Aj zu erhalten, ist es üblicherweise erforderlich, eine zusätzliche Säulcnchromatographie der Bu-2183-A-Fraktion durchzuführen, um die Komponenten Bu-2183 A₂ und Bu-2183 A aufzutrennen. Die vollständige Trennung und Reinigung jeder Komponente wird erzielt, indem man die oben beschriebene chromatographische Trennung wiederholt. Wie in Tabelle IV gezeigt, wurde festgestellt, daß zwei DC-Systeme, die hier als S-117 und S-122 bezeichnet werden, geeignet sind, um die vier Komponenten Bu-2183 A, B, C und D zu differenzieren. Während der chromatographischen Reinigung der Komponente Bu-2183 A, wie sie in den nachfolgenden Beispielen detailliert beschrieben ist, wird eine weitere bioaktive Aminoglycosidkomponenle gefunden, die hier als Bu-2183 A2 bezeichnet wird. Die Komponente Bu-2183 A2 kann von der Komponente Bu-2183 A durch die DC-Systeme S-117 und S-122 differenziert werden, wie dies in der Tabelle V nachstehend gezeigt ist.

Charakterisierungsdaten für
die Bu-2183-Antibiotika-Komponenten

Bu-2183 A

Die antibiotische Substanz Bu-2183 A ist eine weiße, amorphe Base, die in Wasser löslich, in Methanol und Äthanol etwas löslich und in r.-Butanol, Aceton und anderen üblichen organischen Lösungsmitteln praktisch unlöslich ist.

Das Antibiotikum Bu-2183 A kann Salze mit Säuren bilden, und pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze des Antibiotikums sind in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Zu Beispielen für geeignete pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze gehören die nichttoxischen Salze mit organischen und anorganischen Säuren, wie beispielsweise Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Stearinsäure, Propionsäure, Weinsäure, Maleinsäure, Benzoesäure, Bernsteinsäure. Entsprechendes gilt für die Komponenten B und A2.

Die Komponente Bu-2183 A ergibt mit Ninhydrin- und Anthronreagcntien positive, mit Tollens-, Fchlinguncl Sakaguchi-Reagentien jedoch negative Reaktionen.

Die spezifische Drehung von Bu-2183-A-Base beträgt [λ] '»' +78,5° (c= 1,0; Wasser).

Eine Probe der Komponente Bu-2183 A wird nach dem Ausfällen aus Äthanol zu

Cr₁HJiN₃O.) · C₂H₅OH ■ H₂O analysiert.

Analyse:

Ber.: C 44,24, H 8,52, N 8,11%;
gef: C 44,25, H 8,08, N 9,11 %.

Das Di-N-acctat von Bu-2183 A wird in Form farbloser Nadeln mit Schmelzpunkt 149 bis 150⁰C erhalten. Es weist ein durch Osmometric bestimmtes Molekulargewicht von 481 auf und wird zu Ci₁₁Hr₁NiOn · H₂O analysiert.

Analyse:

tier.: C 45,68, H 7,42, N 8,41%;
gef.: C 45,73, H 7,49, N 8,19%.

Bu-2183 A ist schwach basisch und weist titrierbare Gruppen mit pK^-WeNcn von 6,90 und 9,40 in Wasser auf. Das aus den Titrationsdalun berechnete angenäherte Molekulargewicht des Antibiotikums beträgt 398.

Die Komponente Bu-2183 A weist nur eine Endab sorption von ultraviolettem Licht auf. In Kaliumbromic pelletisiert besitzt es ein Infrarotspektrum, das in wesentlichen wie in Fig. 1 dargestellt is!, mit charakte ristischen Absorptionsbanden bei den nachfolgender Wellenzahlen in cm-': 1635 und 1570 (Amid) und 108C und 1020 (Hydroxylgruppen). Gelöst in Deuteriumoxic bei einer Konzentration von ungefähr 8% ist da< NMR-Spektrum des Bu-2183-A-Hydrochlorids im wesentlichen wie in F i g. 2 dargestellt. Das Spektrum zeigi ein anomeres Proton bei <55,17 ppm(1H,d, J = 3 Hz) unc eine Propionylgruppe bei (51,12 (3H, t, J = 7,5 Hz) uno 2,29 (2H,q, J =7,5 Hz) ppm.

Es wurde festgestellt, daß die Struktur von Bu-2183 A wie folgt ist:

OH

CH₃CH₂CONH

LH₃LH₂

HO

Bu-2183 A₂

Die antibiotische Komponente Bu-2183 A₂ ist wie das obige Bu-2183 A eine weiße, amorphe Base, die ir Wasser löslich, in Methanol und Äthanol etwas löslich und in n-Butanol, Aceton und anderen üblicher organischen Lösungsmitteln praktisch unlöslich ist. Sie kann mit Säuren Salze bilden, und pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze der Bu-2183-Basc fallen in den Rahmen der vorliegenden Erfindung. Die Komponente Bu-2183 A₂ ergibt positive Ninhydrin- unc Anthronreaktionen und negative Tollens-, Fehling- unc Sakaguchireakt ionen.

Die spezifische Drehung von Bu-2183-A₂-Basc beträgt[«] '„' +79,1° (c=0,43; H₂O).

Eine Probe von Bu-2183 A2, die als Carbonatsab isoliert wird, wird zu C|(,H jiNjOq ■ '/2H₂COj analysiert.

Analyse:

Ber.: C 44,79, H 7,75, N 9,50%;
gef.: C 44,35, H 7,83, N 9,21%.

Die Komponente Bu-2183 A₂ weist nur eine Endabsorption von ultraviolettem Licht auf. In KBr pellctisierl besitzt sie ein Infrarotspektrum, das im wesentlichen wie in Fig. 3 gezeigt ist. Gelöst in D₂O bei einet Konzentration von ~6%i ist das NMR-Spcktrum von Bu-2183-ArHydrochloridsalz im wesentlichen wie in Fig.4 dargestellt. Die Komponente Bu-2183 A₂ kann von Bu-2183 A und Bu-2183 B durch die Anwesenheit einer n-Butyrylgruppc im NMR-Spektrum bei Λ0.92 (3ΙΊ, I), 1,63 (211, Sextett) und 2,30 (211, t) ppm anstelle der Propionyl- oder Acetylgmppen in den Komponenten A und B.unterschieden werden.

Es wurde festgestellt, daß die Struktur der Komponente Bu-2183 A₂ wie folgt ist:

CH₃(CH₂)₂CONH

HO

Fig. 6 dargestellt. Das NMR-Spektrum zeigt, daß Bu-2183 B von Bu-2183 A und Aj durch die Anwesenheit einer Acetylgruppe bei 02,02 ppm (3H, s) anstelle der Propionyl- oder n-Butyrylgruppe, wie in A bzw. A2, unterschieden werden kann.

Die Komponente Bu-2183 B besitzt die folgende Struktur:

Bu-2183 B

Das Antibiotikum Bu-2183 B ist in Aussehen und Löslichkeit den Komponenten Bu-2183 A und A₂ sehr ähnlich; es ist eine weiße, amorphe Base, die in Wasser löslich, in Methanol und Äthanol etwas löslich und in n-Butanol, Aceton und anderen üblichen organischen Lösungsmitteln praktisch unlöslich ist.

Das Antibiotikum Bu-2183 B kann Salze mit Säuren bilden, und pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze des Antibiotikums fallen in den Rahmen der vorliegenden Erfindung.

Die Komponente Bu-2183 B gibt mit Ninhydrin- und Anthron-Reagentien positive Reaktionen, jedoch ergibt sie mit Tollens-, Fehling- und Sakaguchi-Reagentien negative Reaktionen.

Die spezifische Drehung von Bu-2183-B-Base beträgt [λ] £ + 85° (c= 1,0; Wasser).

Eine Probe der aus Äthanol ausgefällten Komponente Bu-2183 B wird zu CuH₂₄NA · C₂H₅OH · H₂O analysiert.

Analyse:

Ben: C 42,95, H 8,34, N 9,36%;
gef.: C 42,69, H 7,78, N 8,86%.

Das Di-N-acetat von Bu-2183 B wird in Form farbloser Prismen mit Schmelzpunkt 159 bis 162°C erhalten. Es besitzt ein durch Osmometrie bestimmtes Molekulargewicht von 484 und wird zu CiaHjjNiOn · H₂O analysiert.

Analyse:

Ber.: C 44,53, H 7,27, N 8,66%;
gef.: C 44,96, H 7,44, N 8,52%.

Bu-2183 B ist schwach basisch und besitzt lilrierbare Gruppen mit pK,/-Weiten von 7,15 und 9,35 in Wasser. Das aus den Titrationsdaten berechnete angenäherte Molekulargewicht des Antibiotikums beträgt 409.

Die Komponente Bu-2183 B weist nur eine Endabsorption von ultraviolettem Licht auf. In Kaliumbromid pelletisiert besitzt sie ein Infrarotspektrum, das im wesentlichen wie in F i g. 5 gezeigt ist, mit charakteristischen Absorptionsbanden bei den nachfolgenden Wellenzahlen in cm¹: 1635 und 1570 (Amid) und 1080 und 1020 (Hydroxylgruppen). Gelöst in Deuteriumoxid in einer Konzentration von 10% ist das NMR-Spektrum von Bu-2183-B-llydrochloridsalz im wesentlichen wie in OH

CH₃CONH

HO

CHOH

CH,OH

Charakterisierungsdaten für
das Zwischenprodukt Bu-2183 D

Die bioinaktive Komponente Bu-2183 D ist eine weiße, amorphe Base, die in Wasser löslich, in Methanol und Äthanol etwas löslich und in n-Butano!, Aceton und anderen üblichen organischen Lösungsmitteln praktisch unlöslich ist.

Die Verbindung Bu-2183 D kann mit Säuren Salze bilden. Diese Säureadditionssalze liegen im Rahmen der Erfindung; Beispiele dafür sind die vorstehenden für die Komponenten A, A₂ und B genannten nicht toxischen Salze mit organischen und anorganischen Säuren.

Die Komponente Bu-2183 D ergibt positive Reaktionen mit Ninhydrin- und Anthronreagentien, jedoch negative Reaktionen mit Tollens-, Fehling- und Sakaguchi-Reagentien.

Die spezifische Drehung von Bu-2183-D-Base beträgt [«] s +72,5° (c= 1,0; Wasser).

Eine Probe der Komponente Bu-2183 D, die als das Carbonatsalz isoliert wurde, wird zu C|₂H₂7NjOs · HiCOjanalysiert.

Analyse:

Ben: C 38,70, H 7,25, N 10,42%;
gef.: C 38,86, H 6,93, N 10,14%.

Bu-2183 D ist schwach basisch und weist drei titrierbare Gruppe mit ρΚ.,'-Werten von b,95 (2 Äquivalente) und 9,68 in Wasser auf.

Man erhält das Tri-N-acetat von Bu-2183 D in Form farbloser Prismen mit Schmelzpunkt 159 bis 162°C. Bei diesem Salz wird festgestellt, daß es mit dem Di-N-acetat von Bu-2183 B identisch ist.

Die Komponente Bu-2183 D weist nur eine Endabsorption von ultraviolettem Licht auf. In Kaliumbromid pelletisiert besitzt sie ein Infrarotspektrum, das im wesentlichen wie in F i g. 7 gezeigt ist. Das Spektrum zeigt das Fehlen der Amidcarbonylbanden an, die in den bioaktiven Komponenten Bu-2183 A, A₂ und B vorliegen. Gelöst in Deuteriumoxid bei einer Konzentration von 10% ist das NMR-Spektrum von Bu-2183-D-l Iydrochloridsul/. im wesentlichen wie in F i g. 8 dargestellt.

Es wurde festgestellt, daß die Struktur von Bu-2183 D wie folgt ist:

OH

H, N

HO

OH

CH₂NH₂
CHOH

Q-CH
CHNH₂
CHOH
CH₂OH

Strukturbestimmung der Bu-2183-Komponenten

Milde saure Hydrolyse von Bu-2183 A und B (1 n-HCl/Methanol, 8O⁰C, 3 Std.) ergibt dieselbe Desacylverbindung C|₂H₂7N At, die mit der Komponente Bu-2183 D, die durch chromatographische Aul'trennung des rohen Bu-2183-Komplexes erhalten wurde, identisch ist. Die vollständige N-Acetylierung von Bu-2183 D ergibt das Tri-N-acetat, C|₈H₎₃NjO,i. das als das Di-N-acetat der Komponente Bu-2183 B identifiziert wird.

Saure Hydrolyse von Bu-2183 B in methanolischem Chlorwasserstoff (gesättigt, Rückflußtemperatur, 24 Std.) liefert ein Aglykon und einen Aminozucker zusammen mit der Komponente Bu-2183 D. Das Aglykon wird als kristallines Sulfat mit Schmelzpunkt 263 bis 264°C isoliert und zu C₆Hi₁₁N₂O₄ ■ H₂SO₄ analysiert.

Analyse:

Ber.: C 25,90, H 6,52, N 10,07, S 11,52%;
gef.: C 26,10, H 6,47, N 9,93, S 11,29%.

Das 220-MHz-NMR-Spektrum seines N,O-Hexaacetats zusammen mit massenspektrometrischen Daten, die mit den N-Acetyl-O-TMS-, N-Acetyl-diisopropyliden- und Hexa-N,O-acetyl-Derivaten des Aglykons erhalten wurden, legten eine 1,4-Diamino-2,3,5,6-tetra-ol-Struktur für den Aglykonteil nahe.

Das Di-N-acetat des Aglykons wird in Form farbloser Nadeln mit Schmelzpunkt 114 bis 115°C erhalten und zu CiOH₂ON₂Ob analysiert.

Analyse:

Ber.: C 45,45, H 7,63, N 10,60%;
gef.: C 45,37, H 7,97, N 10,57%.

Da angenommen wurde, daß die D-Glucosetyp-Konfiguration für das Aglykon am wahrscheinlichsten ist, wurde die Herstellung des l,4-Diamino-l,4-didesoxy-D· sorbits aus 4-Amino-4-desoxy-D-glueose durchgeführt, undcs wurde durch DC- und NMR-Analyse gezeigt, daß das so erhaltene Produkt das Aglykon ist.

Der nach der obigen sauren Methanolysc der Komponente B erhaltene Aminozuckertcil wird durch Chromatographie an schwach saurem Kationcnaustauschcr gereinigt und in die «- und /i-Formcn des Methylglycosids aufgetrennt, wobei die λ-Form das Hauptprodukt ist. Die N-Acetylierung des «-Melhylglycosiiis liefert farblose Prismen mit Schmelzpunkt 185 bis 186⁰C,die zu G)H|₇NOi,analysiert werden.

Analyse:

Ber.: C 45,95, H 7,28, N 5,95%;
gef.: C 45,93, H 7,43, N 5,88%.

~> Das Massenspektrum dieses N-Acetylderivals zeigt einen Peak bei m/e 204 (M-31), der dem Verlust einer glycosidischen Methoxylgruppe aus dem Molekül zuzuschreiben ist. Somit sollte der freie Aminozucker der Formel C₆H, _]NO₅ entsprechen.

κι Die «- und ^-Formen des Methylglycosids wurden durch die IR- und NMR-Spektren ihrer Tetra-N,O-acetylderivate als Methyl-4-amino-4-desoxy-«- bzw. -/?-gIucopyranosid, identifiziert. Die IR-Spektren authentischer Proben dieser aus 4-Trehalosamin isolierten Zucker (]. Antibiotics, 27, 145, 1974) stehen in Übereinstimmung mit den IR-Spektren der experimentellen Proben.

Saure Hydrolyse von Bu-2183 D in 6 n-HCI (Rückfluß, 3Std.) ergibt dasselbe Aglykon und denselben Aminozucker wie aus dem Hydrolysat von Bu-2183 B isoliert.

Das durch chromatographische Auftrennung des rohen Bu-2183-Komplexes erhaltene Bu-2183 C wird in Methanol, welches 1 n-HCl enthält, während 3 Std. bei Rückflußtemperatur hydrolysiert. Der Aglykonteil ist mit dem der anderen Komponenten von Bu-2183 identisch, und der Zuckerteil wird durch DC-, NMR- und Gas-Chromatographie als Methyl-D-glucosid identifiziert. Demgemäß besitzt die Summenformel von Bu-2183 C den Wert Ci₂H₂₆N₂O*

Auf der Grundlage der obigen Daten wurde festgestellt, daß die Bu-2183-Komponenten folgende Strukturen aufweisen:

OH

Bii-2183-Komponcnte

A₂

CH₁CH₂CONH-

CH₁CONH-

CH(CII₂CII₂CONIi-

IIO -

H₂N-

Antimikrobiellc Aktivität

In vitro-Tests zeigen, daß der Komplex Bu-2183 und die einzelnen antibiotischen Komponenten Bu-2183 A, A₂ und B ein breites Spektrum antibaklcrieller Aktivität aufweisen. Der antibiotische Komplex und die aktiven Komponenten sind besonders brauchbar zur Inhibierung des Wachstums der meisten Aminoglycosid-resistenten Mikroorganismen. Man stellt fest, daß die

Komponente Bu-2183 A₂ aktiver als Bu-2183 ß, jedoch weniger aktiv als Bu-2183 A ist.

Die minimalen Hemmkonzeiaralionen (MHK) von Bu-2183 A und B wurden bei einer großen Vielzahl von Bakterien durch die zwo ifache Agarverdünnungsmethode auf Nähragarplatten bestimmt. Man verwei dete die Inokular-Repliziervorrichtung von Steers et al. Die Inokulumgröße wird auf eine 10⁴-Verdünnung der Übernachtkultur der Testorganismen in Heart-Infusionsbrühe (Difco) eingestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle Vl zusammen mit denen für Kanamycin gezeigt, das als Vergleichsantibiotikum untersucht wurde.

Die Eigenaktivitäten von Bu-2183 A und B sind hinsichtlich ihrer MHK-Werte mäßig oder ziemlich schwach, wobei die Komponente A ungefähr zwei- bis viermal aktiver als B ist. Jedoch weisen sie ein breites Spektrum antibakterieller Aktivität gegen gram-positve und gram-negative Bakierien, einschließlich vieler der Aminoglycosid-resistenten Mikroorganismen und Pseudomonas-Stämme auf.

Die nachstehende Tabelle VlI zeigt die minimalen Hemmkonzentrationen der Komponenten Bu-2183 A und A₂ gegen verschiedene pathogene Mikroorganismen.

Man stellt fest, daß eine Probe von Bu-2183-Komplex mit einer Reinheit von angenähert 30 bis 40% E. coli A20365 bei einer Konzentration von 12,5 j'/ml, K. pneumoniae D-11 bei einer Konzentration von 12,5jVml und Ps. aeruginosa A9930 bei einer Konzentration von 25 >'/ml, inhibiert.

Einfluß des pH der Medien auf die MHK

Der Einfluß des pH der Medien auf die MHK von Bu-2183 A wurde durch die zweifache Agarverdünnungsmethode unter Verwendung von Nähragarmediuiii bei pH 6,0, 7,0, 8,0 und 9,0 untersucht. Die in der Tabelle VIII dargestellten Ergebnisse zeigen, daß die Aktivität von Bu-2183 A bei alkalischem pH steigt und bei saurem pH abnimmt.

Einfluß der Medien

der Medien auf die Aktivität von Testorganismen

Der Einfluß

Bu-2183 A und B wurde bei acht
bestimmt. Bei den untersuchten Medien handelte es sich um Nähragar, Heart-Infusionsagar und Mueller-Hinton-Agar. Der pH der Medien wurde auf 8 eingestellt. Wie in Tabelle IX dargestellt, zeigt sich die größte In-vitro-Aktivität, wenn man Nähragar als Testmedium verwendet.

In vivo-Aktivität und Toxizität

Bu-2183 A und B wurden in vivo bei experimentellen Infektionen von Mäusen beurteilt. Bei den verwendeten pathogenen Bakterien handelte es sich um S. aureus Smith, E. coli NIHJ und Ps. aeruginosa A9930. Die Mäuse wurden mit einer 100 · LD,o-Dosis der pathoge nen Mikroorganismen in einer 5%igen Suspension ir Mucin aus Schweinemägen insultiert. Unmittelbar nacr dem Baklerieninsult (0 Std.) wurde eine einzelne subkutane Behandlung mit dem Antibiotikum vorge nommen, und nach einem Doppeldosiszeitplan wurde das Antibiotikum 0 und 3 Std. nach dem Insuli verabreicht. Für jede Dosierung wurden Gruppen von f

in Mäusen verwendet, und die Tiere wurden 5 Tag£ beobachtet, um die mittlere Schutzdosis (PD50) zi bestimmen.

Die Ergebnisse sind in Tabelle X dargestellt Bu-2183 A und B liefern gegen alle drei der untersuch ten Infektionen eine In-vivo-Aktivität.

Die akute Toxizität von Bu-2183 A und B wurde be Mäusen subkutan und intravenös bestimmt. Die Mäuse wurden 15 Tage beobachtet, und die intravenösen (i. v.' und subkutanen (s. c.) LD^-Werte der Komponente Bu-2183 A wurden zu 2500 mg/kg bzw. I000mg/k£ ermittelt. Die Komponente Bu-2183 B ist wesentlich weniger toxisch als Bu-2183 A und bei Dosen bis zu 2000 mg/kg entweder i. v. oder s. c. trat während det Bobachtungsperiüde "on 15 Tagen kein Todesfall auf.

Brauchbarkeit der Komponente Bu-2183 D

Obgleich die Komponente Bu-2183 D bioinaktiv ist stellt sie ein wertvolles Zwischenprodukt für die halbsynthetische Herstellung der bioaktiven Kompo-

jo nenten Bu-2183 A, A₂ und B dar. So kann die entsprechende freie Aminogruppe von Bu-2183 D (nach geeignetem Schützen der anderen reaktiven funktionellen Gruppen) nach an sich bekannten Methoden N-acyliert werden, wobei man (nach dem Entfernen irgendwelcher Schutzgruppen) das N-Butyrylderival Bu-2183 A, das N-Acetylderivat Bu-2183 B oder das N-Propionylderivat Bu-2183 A₂ erhalten würde.

40 Tabelle I Bildung von fluoreszierendem Pigment

•45

Medium	Bu-2183	I	+ +	Ps. fluores-
	Produzent		cens
	ATTC 31086	+ +	NIHJ B254
Hefeextraktagar	_	+
Kingsches B-Medium	+ +
20% entrahmte Milch	+ +
lösung
Glutamatbrühe	+ +

Tablle Il

Physiologische und biologische Charakteristika von Stamm ATCC 31086

Test	Ansprechen
Argindihydrolase	positiv
Katalase	positiv
Oxidase (Cytochromoxidase)	negativ
Extrazellulare Hydrolasen
Gelatinehydrolase	positiv

Methode und verwendetes Medium

Modifizierte Methode von Stanier et al.')

Wasserstoffperoxid auf der Kolonie

Nach drei verschiedenen Methoden untersucht¹).

Methode von Stanier et al.¹)

15

Fortsetzung

Ansprechen Methode und verwendetes Medium

Stärkehydrolase
Voges-Froscauer-Reaktion
Indolbildung

H₂O-Bildung aus Cystein und
Thiosulfat

Gelatineverflüssigung

Reaktionen in entrahmter
Milchlösung

Nutzung von Nitrat-N
Nitritbiidung aus Nitrat

Nutzung von Ammonium-N

Ammoniakbildung aus Pepton

Denitrifizierung

Gas aus Kohlenhydrat

Nutzung von Harnstoff

Nutzung von Citrat

Nutzung von Oxalat

Eigelbreaktion
Spaltungsmechanismus der

aromatischen Verbindung
Bildung von Phenazinpigmenten,

einschließlich Pyocyanin,

Chloraphin und Phenazin-cr-

carbonsäure

negativ negativ negativ negativ

positiv

(schnell verflüssigt)

grünlichgelb

fluoreszierendes

Pigment gebildet

pH alkalisch gemacht

positiv

negativ

positiv

negativ

positiv

negativ

negativ ortho-Spaltung

negativ Methode von Stanier et al.¹) Peptonbrühe plus 1% Glucose Peptonbrühe (Kovacs Reagens) Ammonium-anorganische Salze plus Cystein und Thiosulfat

Bleiacetatpapier zum Auffinden von H₂S Peptonbrühe plus 25% Gelatine⁵)

20% entrahmte Milchlösung durch mildes Behandeln im Autoklav sterilisiert (0,5 kg/cm² während 5 Min.)

Rhodes anorganische Salze-Glycerin-Nitrat-Medium²)

Peptonbrühe plus 0,1 % KNO₃ Kosers Citratmedium Peptonbrühe (Nesslers Reagens) Methode von Stanier et al.') Nährbrühe plus 1 % Glucose Christensens Harnstoffmedium Simmons Citratmedium und Kosers Citratmedium

Oxalat von Citrat in Simmons und Kosers Medien

von Stanier et al.¹) angewendete Methode Modifizierte Methode von Stanier et al.¹)

Kings A-Medium

') R. Y. Stanier, N. J. Palleroni & M. Doudoroff: The Aerobic Pseudomonads: A Taxonomic Study. J. Gen. Microbiol.

43. 159-271, 1966.

²) M. E. Rhodes: The Characterization Of Pseudomonas Fluorescens. J. Gen. Appl. Microbiol. 21. 221-263, 1959. ') H. Iizuka & K. Komagata: An Attempt At Grouping Of The Genus Pseudomonas. J. Gen. Appl. Microbiol.

9. 73-82, 1963.

⁴) U. Iizuka & K. Komagata: Taxonomy Of Genus Pseudomonas With Special Reference To Their Modes Of Metabolism Of Carbon Compounds. J. Gen. Appl. Microbiol. 9. 83-95, 1963.

⁵) V. 3. D. Skerman: Abstracts Of Microbiological Methods. Wiley-Interscience, New York, Seite 364, 1969.

Tabelle III

Nutzung von Kohlenstoffquellen

60

65

Substrat	Stamm	Ps. fluores	Ps. aeru-
	ATCC	cens	ginosa
	31086	NIHJ	ATCC
		B254	19660
Glycerin	+	₊	+
L-Arabinose	+	+	-
D-Xylose	+	+	-
L-Rhamnose	-	-	-
D-Fructose	+	+	+
D-Galactose	+	+	-
D-Glucose	+		+

Substrat	Stamm	Ps. fluores- Ps. aeru-
	ATCC	cens ginosa
	31 086	NIHJ ATCC
		B254 19660
D-Mannose	₊	₊
D-Fucose	—	- -
Trehalose	+	+ -
Cellobiose	-	- —
Maltose	-	- -
Saccharose	-	- -
Lactose	-	- -
Raffinose	_	_ _
Inosit	-	+
D-Mannit

17

Fortsetzung

Substrat

Stamm ATCC 31086

Ps. fluorescens NIHJ B254

Ps. aeruginosa ATCC 19660

D-Sorbit - 4-

Dulcit

Geraniol - -

Stärke

Cellulose -

Inulin - -

Salicin -

Acetat + 4-

Propionat + +

jS-OH-Butyrat + +

2-Ketogluconat 4- +

Succinat + 4-

Maleat

Glycolat - -

DL-Lactat + +

Pelargonat 4- +

Adipat

p-OH-Benzoat + +

m-OH-Benzoat

Methanol - -

Tabelle IV

DC von Bu-2183-Komponenten

IO

15

20

25 18

Stamm ATCC 31086

Ps. fluorescent NiHJ B254

Ps. aeruginosa ATCC 19660

Äthanol - - H

n-Propanol - -

Phenol - -

Kresol - -

Monoäthanolamin - -

Äthylamin - -

Diethylamin - -

Triäthylamin -

Testosteron - -

Acetamid - -

Arginin + +

Valin + +

Norleucin - -

D-Tryptophan - -

ö -Aminovalerat 4- - +

Betain 4-4-

Putrescin 4-4- +

Basalmedium enthält pro Liter: 40 ml 1 m-Phosphatpuffer (pH 6,8); lg(NH₄)₂SO₄;
20 ml Hutrers vitaminfreie Mineralsalzlösung.

System

Platte

Lösungsmittelsystem Rf*) A

S-117 Silikagel CHC1₃-CH₃OH-28%NH₄OH (1:3:2)

S-122 Silikagel CHCl₃-CH₃OH-2n-NH₄OH-CH₃COOH

(20:65:40:5)

Tabelle V

DC von Bu-2183-Komponenlen A und A₂ 0,39 0,38

0,30 0,27

0,21 0,15

System

Platte

Lösungsmittelsystem Rl*) A

Silikagel Silikagel

CHC1₃-CH₃OH-28%NH₄OH (1:3:2)

CHCl₃-CH₃OH-2n-NH₄OH-CH₃COOH (20:65:40:5) 0,49 0,39

*) Auffindung: Ninhydrinreagens.

Tabelle VI

Antibakterielle Spektren von Bu-2183 A und B

Testorganismus

S. aureus Smith
S. aureus D193
S. aureus D133
S. aureus D137
S. aureus A20239

Bu-2183 A	Bu-2183 B	Kanamycin A
12,5	50	0,2
25	25	0,4
25	>100	0,8
100	>100	1,6
25	100	25

Fortsetzung

20

Testerganismus

MHK (y/ml)	BU-2I83B
BU-2I83A	50
12,5	50
25	50
12,5	100
25	12,5
6,3	50
12,5	25
6,3	100
25	50
12,5	25
12,5	50
25	100
25	50
12,5	50
25	25
12,5	>100
>100	12,5
3,1	100
25	>100
>100	>100
100	25
12,5	100
25	100
25	50
25	100
25	50
25	>100
>100

Kanamycin A

E. coli NIHJ E. coli PO 1495 E. coli ML 1630 E. coli NR 79/W677 E. coli JR 35/C600 E. coli A20107 E. coli JR 66/W677 E. coli R 5 E. coli A20895 E. coli A20732 EnL cloacae A20364 Ent. cloacae A21006

Pr. vulgaris A9436 Pr. morganii A20031 Pr. mirabilis A9554 Prov. stuartii A20894

K. pneumoniae DIl

K. pneumoniae Typ 22-3038 Ser. marcescens A20019 Ser. marcescens A 21247 Ps. aeruginosa A 9930 Ps. aeruginosa A 20653 Ps. aeruginosa #130 Ps. aeruginosa A 20601 Ps. aeruginosa A 20896 Ps. aeruginosa GN Pseudomonas sp. A 20621

Tabelle VII

Antibakterielle Spektrer, von Bu-1283 A und A₂

0,8 0,4 100

25

12,5

25

25 6,3 0,8

12,5 100

50

0,2 0,8 0,4 0,8

0,2 100

0,8 >100

6,3

>100

25

12,5

>100

100

12,5

Testorganismus MHK ( /ml)
BU-2183A

Bu-2183 A₂

S. aureus Smith S. aureus D 193 S. aureus D 133 S. aureus D 137 S. aureus A 20239

E. coli NIHJ E. coli PO 1495 E. coli ML1630 E. coli NR79/W677 E. coli JR35/C600 E. coli A 20107 E. coli JR66/W677 E. coli R 5 25
25
50
50
50

25
25
25
12,5

6,3
25
25

6.3

25

50

100

>100

50

25

6.3

50

25

Fortsetzung

22

Tcslorganismus

MHK ( /ml)
Bu-2183 A

Bu-2183 A₂

E. coli A 20895 25

E. coli A 20732 12,5

Ent. cloacae A 20364 25

Ent. cloacae A 21006 25

Pr. vulgaris A 9436 25

Pr. morganii A 20031 25

Pr. mirabilis A9554 25

Prov. stuartii A 20894 > 100

K. pneumoniae DIl 6,3

K. pneumoniae Typ 22-3028 25

Ser. marcescens A20019 > 100

Ser. marcescens A 21247 > 100

Ps. aeruginosa A 9930 12,5

Ps. aeruginosa A 20653 50

Ps. aeruginosa # 130 25

Ps. aeruginosa A 20601 50

Ps. aeruginosa A 20896 50

Ps. aeruginosa GN 315 25

Pseudomonas sp. A20621 > 100

Tabelle VIII

Einfluß des pH der Medien auf die MHK von Bu-2183 A

100 100

100

50

>100

12,5 100

>100 >100

50 >100

100 >100 >100

100

>100

pH 6

pH 7

pH 8

pH

E. coli NIHJ
K. pneumoniae D 11
Ps. aeruginosa D 15
S. aureus Smith
B. subtilis PCI 219

>50	50	25	12,5
12,5	12,5	12,5	3,1
>50	50	25	12,5
>50	50	50	50
50	6,3	6,3	6,3

Tabelle IX

Einfluß der Medien auf die Aktivität von Bu-2183 A und B

Stamm	Bu-2183 A	HIA	MHA	Bu-2183 B	HIA	MHA
	NA*)	50	100	NA	>100	>100
E. coli NIIIJ	12,5	12,5	25	50	50	50
K. pneumoniae 1) 11	3,1	50	100	12,5	>100	>100
Hnt. cloacae A20364	25	50	100	50	>100	>100
Ps. vulgaris Λ9436	12,5	50	50	50	>100	100
Rs. mirabilis Λ9554	12,5	25	50	25	100	>IOO
Ps. aeruginosa Λ9930	12,5	50	50	25	100	>100
S. aureus Smith	12,5	100	> 100	50	>100	>100
S. aureus A2O239	25		100

*) ΝΛ : Nähraniar.

IHA : llc!r!-!nfusionsargar.
MlΙΛ: Miiullcr-Ilinlonnruar.

Tabelle X

In-vivo-Aktivität von Bu-2183 A und B

Infizierende Mikroorganismen

PD₅₀ in mg/kg
(Einzeldosis)

Bu-2183 A

Bu-2183 B

S. aureus Smith	42	100
E. coli NIHJ	92	135
Ps. aeruginosa A9930	230	540

Infizierende Mikroorganismen

PD₅₀ in mg/kg
(Doppeldosis)

BU-2183A

S. aureus Smith	36	•2
E. coli NIHJ	45	■2
Ps. aeruginosa A9930	80	•2

Das nachfolgende Beispiel dient zur Erläuterung der Erfindung. Als Ionenaustauscher wurden durchwegs schwachsaure kationische Austauscherharze mit Carboxylgruppen (Methacrylsäure-Divinylbenzol-Copolymerisat, pK etwa 6,1) verwendet.

Beispiel
1. Fermentation im Tank

Man verwendet eine Agar-Schrägkultur von Pseudomonas sp. Stamm ATCC 31 086, um 100 ml des Saatmediums in 500 ml Erlenmeyer-Kolben zu inokulieren. Die Kolben werden 3 Tage auf einer Rotationsschüttelvorrichtung (250 UpM) bei 28°C inkubiert, und man verwendet 1 Ltr. Saatkultur, um 300 ml des Fermentationsmediums zu inokulieren. Der Tank wird bei 30⁰C unter Rühren bei 140UpM und einer Belüftungsrate von 200 l/min betrieben. Die Brühenwirksamkeit wird durch die Papierscheiben-Agarplattenmethode unter Verwendung von B. subtilis PCI 219 als Testorganismus und Bu-2183 A als Teststandard bestimmt. Man erhält die nachfolgenden Ergebnisse:

Zeit (Std.)

pH der Brühe

Wirksamkeit

0
20
30
40
50
f>0
64

6,7

7,5
7,8
7,9
7,9
8,1
8,1

200
400
1600
1650
1700
1800

2. Aufarbeitung

Die geerntete Brühe wird mit Filterhilfe bei pH 2 filtriert. Das Filtrat (19 1), das ungefähr 30 g Wirksamkeit an Bu-2183 A enthält, wird auf pH 7 eingestellt und mit 31 Ionenaustauscher (NH VFonn) gerührt. Man trennt das Harz ab, wäscht nacheinander mit 10 1 Wasser und 51 n/50 NH₄OH und rührt dann mit zwei 4-1-Portioncn n/2 NH₄OII, um die Bioaktivität zu

eluieren. Man vereinigt die aktiven Eluate, konzentriert im Vakuum und lyophilisiert dann, wobei man 18,6 g weißen Feststoff (ungefähr 700}>/mg) erhält. Diesen Feststoff löst man in Wasser und gibt auf eine Säule mit Ionenaustauscher (NH⁺ ₄-Form, 400 ml) auf. Die Säule wird nacheinander mit 2,2 I Wasser und 3 1 n/40 NH₄OH gewaschen und dann mit n/20 NH₄OH entwickelt. Die Eluate werden fraktioniert gesammelt und durch Biountersuchung auf einer B.-subtilis-Platte und auch durch DC (System S-117, Ninhydrin) untersucht. Geeignete Fraktionen werden vereinigt, im Vakuum konzentriert und lyophilisiert, wobei man die folgenden Feststoffe erhält:

n/20 NH₄OH

Feststoff,
Gewicht

Bu-2183-Komponenten (roh)

-1,31	—	keine Aktivität
-2,51	2,7 g	A
-4,41	7,8 g	A + B (weniger)
-5,21	3,3 g	B

3. Gewinnung von Bu-2183 A

Die in der Aufarbeitungsstufe erhaltene rohe Probe von Bu-2183 A (2,7 g) wird in Wasser gelöst und auf eine Säule mit Ionenaustauscher (NH+₄-Form, 80 ml) aufgegeben. Die Säule eluiert man mit n/20 NH₄OH und sammelt jeweils 15-ml-Portionen des Eluats in einem Fraktionssammler. Die Fraktionen werden durch DC/Ninhydrin und ebenso durch Biountersuchung getestet, und geeignete Fraktionen werden vereinigt, im Vakuum konzentriert und lyophilisiert, wobei man die nachfolgenden Feststoffe erhält:

Fraktion Nr.

Feststoff,
Gewicht

DC

28-	53	801mg	A+ Verunreinigung
54-	72	1597 mg	A
73-	95	189 mg	A+ B (weniger)

Das reine Präparat von Bu-2183 A wird zu C15H31N3O9 · '/2 H2CO3analysiert.

Analyse:

Ber.: C 43,45, H 7,53, N 9,81%;
gef.: C 43,22, H 7,52, N 9,49%.

Seine IR- und NMR-Spektren sind in Fig. 1 bzw.2 gezeigt. Eine Zusammenfassung der NMR-Daten ist nachfolgend angegeben:

Chemische Verschiebung	ppm)	Kopplungskonstnntc	Relative
(<5,	1,12(1)	(J, Mz)	Intensität
	2,29(q)	7,5	311
	-3,35(m)	7,5	211
3,1	-4,3(m)		211
3,5	5,17(cl)		1211
	3,0	Ul
(S)	= Singulett; (d) = Duhlett; (I) -■ Triplett; (i\|)	Quartett;
(m)	= Multiple».

4. Gewinnung von Bu-2183 B

Die in der Aufarbeitungsstufe erhaltene rohe Probe von Bu-2183 B (3,3 g) wird in Wasser gelöst und auf eine Säule mit Ionenaustauscher (NH+4-Form; 130 ml) aufgegeben. Man eluiert die Säule mit n/20 NH₄OH und sammelt jeweils 15 ml-Portionen des Eluats durch einen Fraktionssammler. Die Fraktionen werden durch DC/Ninhydrin und ebenso durch Biountersuchung getestet, und geeignete Fraktionen werden vereinigt, im Vakuum konzentriert und lyophilisiert, wobei man die nachfolgenden Feststoffe erhält:

Fraktion Nr.

Feststoff,
Gewicht

DC

1- 59 86mg

60-151 2792 mg

152-160 356 mg

B + Verunreinigung B

B + Verunreinigung (weniger)

Das reine Präparat von Bu-2183 B wird zu Ci₄H₂₉N₃O₉ · '/2 H₂CO₃ analysiert.

Analyse:

3er.: C 42,02, H 7,30, N 10,14%; gef.: C 41,92, H 7,43, N 9,93%.

Seine IR- und NMR-Spektren sind in Fig.5 bzw. 6 gezeigt. Eine Zusammenfassung der NMR-Daten ist nachstehend angegeben:

Chemische Verschiebung Kopplungskonstante	ppm)	(J, Hz)	Relative
(<5,	2,02(s) ■		Intensität
	-3,2(m)		3H
3,1	- 4,3 (m)		2 H
3,6	5,17(d)	3,0	12H
	= Singulett; (d) =	= Duplett; (m) = Multiplett	IH
(S)

untersucht die Eluate durch DC, wobei mit Ninhydrinreagens besprüht wird. Geeignete Fraktionen werden vereinigt, im Vakuum konzentriert und lyophilisiert, wobei man die folgende Feststoffe erhält:

n/10 NH₄OH

Feststoff,
Gewicht

Identifizierung

¹⁽¹ 0- 300ml

301-120OmI 1638mg Bu-2183C

1201-1900ml
1901-2400ml 526mg Bu-2183D

6. Gewinnung von Bu-2183 A2

Während des bei der Gewinnung von Bu-2183 A beschriebenen Reinigungsverfahrens wird eine neue aktive Komponente aus den Vorfraktionen isoliert und als Komponente Bu-2183 A2 bezeichnet. Sie wird durch die DC-Systeme S-117 und S-122 von der Komponente A differenziert, wie nachstehend gezeigt:

Bu-2183 A

Bu-2183 A-,

S-I17
S-122

Rf = 0,49
Rf = 0,39

Rf = 0,57 Rf = 0,48

Die IR- und NMR-Spektren der Komponente J5 Bu-2183 A2 sind in den Fig. 3 und 4 gezeigt. Eine Zusammenfassung der NMR-Daten ist nachstehend angegeben:

Chemische Verschiebung KopplungskonsUinte Relative ((5, ppm)

(J, Hz)

Intensität

5. Gewinnung von Bu-2183 C und Bu-2183 D

Die in der Aufarbeitungsstufe verwendete Säule wird weiter mit 1,4 I h/20 NH₄OH entwickelt, mit dem kein weiteres bioaktives Material eluiert wird. Dann entwickelt man die Säule mit n/10 NH₄OH und (d) = Dublett; (t) = Triplett; (m) = Multiplett.

0,92 (t)	7,5
1,63 (Sextett)	7,5
2,30 (t)	7,5
3,1- 3,5 (m)
3,6-4,4 (m)
5,27 (d)	3,0

3 H 2H 2H 2H 12H IH

Hierzu S Watt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikumkomplexes Bu-2183, dadurch gekennzeichnet, daß man Pseudomonas sp. Stamm ATCC 31 086 in einem wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare Stickstoff- und Kohlenstoffquellen enthält, unter submersen aeroben Bedingungen bei einem pH von 4,5 bis 11,0 und einer Temperatur von 4 bis 37° C kultiviert, bis durch den Organismus im ι ο Kulturmedium eine wesentliche Menge an Bu-2183-Komplex gebildet ist und man in einer weiteren Stufe den Bu-2183-Komplex aus dem Kulturmedium gewinnt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Kultivieren bei einem pH von 5,5 bis 9,5 und einer Temperatur von 10 bis 32° C durchführt.

3. Verfahren zur Gewinnung der Komponenten Bu-2183 A, Bu-2183 B, Bu-2183 A₂ und Bu-2183 D, dadurch gekennzeichnet, daß man den gemäß dem Verfahren nach Anspruch 1 erhaltenen Bu-2183-Komplex durch

(a) Adsorbieren des Komplexes an einem kationischen lonenaustauscherharz, ^2d

(b) fraktioniertes Eluieren der Bu-2183-Komponenten von dem Adsorbens und

(c) Gewinnen der Fraktionen der gewünschten Komponenten Bu-2183 A, B, A₂ und D

auftrennt.

4. Antibiotikum Bu-2183 A der Formel

OH

CH₃CH₂CONH

HO