CH619733A5 - - Google Patents

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines neuen antibiotischen Komplexes Bu-2183, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man den Pseudomo-1 nas sp. Stamm D946-B83, ATCC 31086, in einem wässrigen Nährmedium, das assimilierbare Quellen von Stickstoff und Kohlenstoff enthält, unter submersen aeroben Bedingungen bei einem pH von 4,5 bis 11,0 und bei einer Temperatur von 4 bis 37 °C züchtet, und dann aus dem Züchtungsmedium den Bu-i 2183-Komplex gewinnt. Erfindungsgemäss werden auch die einzelnen Komponenten des Bu-2183-Komplexes, insbesondere die antibiotischen Komponenten, bezeichnet mit Bu-2183 A, A2 und B und die nützliche Zwischenverbindung, bezeichnet mit Bu-2183 D, getrennt; dieses Verfahren zur Tren-, nung dieser Komponenten ist dadurch gekennzeichnet, dass man den mittels dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Bu-2183 Komplex in einem Lösungsmittel löst, auf einem kationischen Ionenaustauschharz adsorbieren lässt, die einzelnen Komponenten von Bu-2183 aus dem Adsorbens frak-, tioniert eluiert und aus den einzelnen Fraktionen die gewünschten oben angeführten Komponenten Bu-2183 A, B, A2 und D gewinnt.

Die beiliegende Figur 1 zeigt das Infrarotabsorptionsspektrum der freien Base und Bu-2183 A nach Pelletieren in Kalium-I bromid.

Figur 2 zeigt das protonische magnetische Resonanzspektrum von Bu-2183 A als Hydrochloridsalz in D2O gelöst und unter Verwendung von 2,2-Dimethyl-2-silapentan-5-sulfonat als den inneren Standard, ermittelt mit einem JEOL 60 MHz NMR , Spectrometer (Typ TNM-C-60HL).

Figur 3 zeigt das Infrarotabsorptionsspektrum der freien Base von Bu-2183 A2, pelletiert in Kaliumbromid.

Figur 4 zeigt das protonische magnetische Resonanzspek-

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trum des Hydrochloridsalzes, gelöst in D2O von Bu-2183 A2,

unter Verwendung von 2,2-Dimethyl-2-silapentan-5-sulfonat als den inneren Standard, ermittelt mit JEOL 60 MHz Spectrome-ter (Typ TNM-C-60HL).

Figur 5 zeigt das IR-Absorptionsspektrum der freien Base 5 von Bu-2183 B, pelletiert in Kaliumbromid.

Figur 6 zeigt das protonische, magnetische Resonanzspektrum des Hydrochloridsalzes, gelöst in D2O von Bu-2183 B unter Verwendung von 2,2-Dimethyl-2-silapentan-5-sulfonat als den internen Standard, unter Verwendung eines JEOL 60 MHz 10 NMR Spectrometers (Typ TNM-C-60HL).

Figur 7 stellt das IR-Absorptionsspektrum der freien Base von Bu-2183 D, pelletiert in Kaliumbromid, dar.

Figur 8 stellt das protonische, magnetische Resonanzspektrum des Hydrochloridsalzes, gelöst in D2O von Bu-2183 D, 15 unter Verwendung von 2,2-Dimethyl-2-silapentan-5-sulfonat als internen Standard, und ermittelt mittels eines JEOL 60 MHz NMR Spectrometers (Typ TNM-C-60HL).

Verschiedene Antibiotika dieser Art sind schon bekannt, einschliesslich mehrere Aminoglycosid-Antibiotika, wie Kana- 20 mycin, Gentamycin, Streptomycin, Neomycin, Tobramycin und Paromomycin. Es besteht aber ein Bedürfnis, weitere neue Breitspektrum-Antibiotika herzustellen, insbesondere solche, die eine Wirksamkeit gegenüber aminoglycosid-resistenten Organismen, wie Pseudomonas, haben. 25

Die neue Art von Pseudomonas, bezeichnet mit Pseudomonas sp. Stamm D946-B83 in der Bristol-Banyu-Kultursammlung ist ein psychrophiles Erdbakterium, welches aus. einer indischen Erdprobe isoliert würde. Eine Kultur dieses Organismus wurde J0 am 7. Oktober 1974 in der American Type Culture Collection, Washington, D.C., hinterlegt und erhielt die Bezeichnung ATCC 31086.

Der erfindungsgemäss erzeugte neue Aminoglycosid-Kom- 35 plex umfasst mindestens 5 Aminoglycosid-Komponenten, von welchen drei, bezeichnet mit Bu-2183 A, A2 und B, als bioaktiv befunden und zwei, bezeichnet mit Bu-2183 C und D, als bioinaktiv festgestellt wurden.

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Der antibiotische Komplex Bu-2183 und jede der drei oben genannten bioaktiven antibiotischen Komponenten weisen ein Breitspektrum von antibakterieller Wirksamkeit auf und hemmen die meisten der aminoglycosid-resistenten Organismen, einschliesslich der Pseudomonasarten. Die Antibiotika Bu- 45 2183, Bu-2183 A, Bu-2183 A2 und Bu-2183 B sind wertvoll als antibakterielle Mittel, als Nahrungsergänzungsstoffe in tierischem Futter und als therapeutische Mittel bei Geflügel und Tieren, einschliesslich Menschen. Sie sind wertvoll bei der Behandlung von infektiösen Leiden, hervorgerufen durch vi gram-positive und gram-negative Bakterien, insbesondere von Leiden, hervorgerufen durch aminoglycosid-resistente Organismen. Eine der neuen erfindungsgemäss erzeugten bioinaktiven Komponenten des durch Fermentation erzeugten Komplexes, und zwar Bu-2183 D, ist als Zwischensubstanz bei der halb- « synthetischen Herstellung, wie durch N-Acylierung, der bioaktiven Komponenten Bu-2183 A, Ai und B.

Die Mikroorganismen

Der das Bu-2183-Antibiotikum produzierende Organismus, bezeichnet mit Pseudomonas sp. Stamm D946-B83, ATCC 31086, ist ein streng aerobes, nicht-sporenbildendes und gramnegatives Bakterium. Die Zellen haben die Form von Stäbchen und erzeugen unipolare Multigeisseln. Der Stamm D946-B83 ist ein psychrophiler Organismus, der bei 4 °C, aber nicht bei m 41 °C, wächst. Er erzeugt ein fluoriszierendes Pigment in Gluta-matmedium und Magermilch, aber nicht in King's B Medium (H. Iizuka und K. Komagata: An Attempt At Grouping Of The

Genus Pseudomonas. J. Gen. App. Microbiol. 9:73-82,1963). Cytochromoxidasen werden nicht erzeugt. Die morphologischen, Züchtungs- und physiologischen Charakteristiken des Stammes D946-B83 werden jetzt beschrieben.

Morphologie

Der Stamm D946-B83 wird charakterisiert durch bewegliche, nichtsporenbildende und gram-negative Stäbchen. Die Zellen sind gerade, gelegentlich gebogen entlang der langen Achse und erzeugen unipolare büschelige Flagellen. Poly-ß-hydroxybutyrat ist nicht enthalten als Zellenreserve (R. Y. Sta-nier, N. J. Palleroni & M. Doudoroff: The Aérobic Pseudomo-nads: A Taxonomic Study. J. Gen Microbiol. 43:159-271,1966). Es wird keine Scheide, kein Stengel oder Schleim produziert.

Wachstums-Charakteristiken

Ein übermässiges Wachstum von Kolonien auf Nähragar und Hefeextraktagar. 0,5 bis 1,5 mm im Querschnitt nach einem Tag. Diffus, kreisförmig und manchmal erhöht. Glatt und weich. Opak, weiss-creme gefärbt, später hell lederorange. Etwas viskos. Kein diffundierbares Pigment.

Übermässiges Wachstum auf Nährbrühe und Hefeextraktbrühe. Trüb, später mit Sediment und gelegentlich mit Häutchen bzw. Belag.

Hefeextraktagar-Stich: Wachstum nur an der Oberfläche. Kein Wachstum unter anaeroben Bedingungen.

Chemisch definiertes anorganisches Salzmedium: Massiges Wachstum, bei Zugabe von Glucose oder Lactat als einzige Kohlenstoffquelle.

Anforderung als Wachstumsfaktor: keine.

Wachstumstemperatur: Eingeschränktes Wachstum bei 4 °C. Mässiges bis reichliches Wachstum bei 10 bis 32 °C. Spärliches Wachstum bei 37 °C. Kein Wachstum bei 41 °C.

Wirkung von pH: Kein Wachstum bei pH 4,0, eingeschränktes Wachstum bei pH 4,5 und pH 10,5 bis 11,0, mässiges bis gutes Wachstum bei pH 5,5 bis 9,5.

NaCl-Wirkung: Kein Wachstum bei 12% NaCl. Beschränktes Wachstum bei 6 bis 9%, mässiges bei 5% oder weniger.

Die oben beschriebenen morphologischen und Kultur-Charakteristiken sind ähnlich denen der Familie Pseudomona-dacae.

Physiologische Charakteristiken

Der Stamm D946-B83 erzeugt diffusionsfähige fluoreszente Pigmente in gewissen Medien, aber nicht in anderen, während eine bekannte Art von Pseudomonas, d. h. Pseudomonas fiuo-rescens, eine reichliche Fluoreszenz-Erzeugung zeigt, siehe Tabelle 1.

Die physiologischen und biochemischen Charakteristiken des Stammes D946-B83 sind aus Tabelle 2 zu entnehmen. Die Verwendung von Kohlehydraten und anderen Kohlenstoffquellen durch die Organismen sind in Tabelle 3 vergleichsweise mit denen von zwei bekannten Pseudomonal-Arten, d. h. Ps. Fluorescens und Ps. Aeruginosa, zusammengestellt.

Taxonomie

Der Stamm D946-B83 scheint zur Pseudomonads-Gruppe zu gehören, im Hinblick auf die oben beschriebenen morphologischen, Züchtungs- und physiologischen Charakteristiken. Gemäss dem taxonomischen System vorgeschlagen von Sta-nier und Mitarbeiter (R. Y. Stanier, N. J. Palleroni und M. Doudoroff: The Aérobic Pseudomonads: A Taxanomic Study. J. Gen. Microbiol. 43:159-271,1966) für die aeroben Pseudomonads, ist der Stamm D946-B83 eher eng verwandt zum Pseudomonas fluorescens, ausgenommen der negativen Eigelb-Reaktion, negativen Verwendung von Inositol und der negativen Oxidase-Erzeugung. Es wird berichtet, dass unter den 13 Typenarten von aeroben Pseudomonads, die durch Stanier unter

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sucht wurden, lediglich Pseudomonas maltophilia eine negative Oxidase-Reaktion zeigt. Dieser Organismus ist aber ganz verschieden vom Stamm D946-B83 durch das Fehlen von Fluoreszenz-Pigment, positiven Methionin-Anforderungen, Abwesenheit des Wachstums bei 4 °C, negativen Arginin-Dihydrolase und der verschiedenen Substrat-Verwendung. Somit wird der Stamm D946-B83 als zur neuen Art des Genus Pseudomonas gehörend betrachtet.

Herstellung der Antibiotika

Der antibiotische Komplex Bu-2183 wird durch Züchtung der neuen Pseudomonas species, bezeichnet mit Pseudomonas sp. Stamm D946-B83, ATCC 31086, unter submersen aeroben Bedingungen in einem wässrigen Nährmedium hergestellt. Der Organismus wächst in einem Nährmedium, der eine assimilierbare Kohlenstoffquelle enthält, beispielsweise ein assimilierbares Kohlenhydrat. Beispiele von bevorzugten Kohlenstoffquellen umfassen Glucose, Fructose, Mannose, Glycerin und ähnliche. Das Nährmedium soll auch eine assimilierbare Stickstoffquelle, wie beispielsweise Fischmehl, Soyabohnenmehl, Peptone usw., enthalten. Anorganische Salze als Nährstoff können" gleichfalls in das Nährmedium einverleibt werden und solche Salze können jegliche der üblichen Salze enthalten, die befähigt sind, Natrium, Kalium, Ammonium, Kalzium, Phosphat, Sulfat, Chlorid, Bromid, Nitrat, Carbonat oder ähnliche Ionen zu liefern.

Die Erzeugung des Bu-2183-Komplexes kann bei einer für das Wachstum des Organismus befriedigenden Temperatur erfolgen, z. B. bei 10 bis 32 °C, und am besten bei einer Temperatur um 28 bis 30 °C. Gewöhnlich wird eine optimale Erzeugung innerhalb von 3 bis 5 Tagen erreicht. Der optimale pH-Bereich des Mediums wurde bei etwa pH 5,5 bis 9,5 und am vorteilhaftesten bei einem pH von etwa 7 gefunden. Falls eine Behälter-Fermentation durchgeführt werden soll, ist es erwünscht, ein vegetatives Inokulum in einer Nährbrühe zu erzeugen, und zwar durch Impfen der Brühe mit einer schräg im Reagenzglas angelegten Agarkultur oder einer Erdkultur oder einer lyophylisierten Kultur des Organismus. Nachdem auf diese Weise ein aktives Inokulum erhalten wurde, wird es aseptisch in das Fermentations-Tankmedium transferiert.

Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung des Bu-2183-antibiotischen Komplexes ist das folgende:

Eine gut ausgewachsene, schräg zum Reagenzglas angelegte Agarkultur vom Pseudomonas-Stamm D946-B83 wurde zur Impfung eines Samenmediums, mit 3% Glucose, 2% Fischmehl, 0,5% Soyabohnenmehl, 0,2% Pepton und 0,6% CaC03, wobei der pH vor der Sterilisierung auf 7,0 eingestellt wurde, verwendet. Diese Samenkultur wurde bei 28 °C während 48 Stunden auf einer Rotations-Rührvorrichtung mit 250 Upm inkubiert und es wurden 2 ml dieser Wachstumsbrühe in 100 ml des Fermentationsmediums in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben, welcher 2% Glycerin, 2% Leinsamenmehl, 1% Erdnuss-mehl, 2% Fischmehl, 0,3% (NH.O2SO4 und 0,5% CaC03 enthielt, transferiert. Die antibiotische Erzeugung erreichte ein Maximum nach 3 bis 5 Tagen unter Schütteln bei 28 °C. Die antibiotische Wirksamkeit in der Fermentationsbrühe wurde mittels einem Papierscheiben-Agardiffusionsversuch, unter Verwendung von Bacillus subtilis PCI 219 als Testorganismus,

bestimmt. Der Stamm D946-B83 erzeugte 1500 bis 2000 mcg/ml des antibiotischen Komplexes mittels der Schüttelkolben-Fermentationsmethode.

Nach Erreichung der optimalen Brühstärke, wie dies beispielsweise mittels der obigen Methode bestimmt wurde,

wurde die Brühe auf ein pH von etwa 2 eingestellt, wobei der basische wasserlösliche antibiotische Komplex vom Mycel separiert und im wässrigen Fermentationsmedium gelöst wurde. Die Brühe wurde dann filtriert, vorzugsweise mit einem Filterhilfsmittel, und das das Antibiotikum enthaltende Filtrat wurde auf ein pH von etwa 7 neutralisiert. Das neutralisierte Filtrat wurde dann durch einen kationischen Ionenaustauschharz, vorzugsweise vom IRC-50-Amberlit-Typ in der Ammoniumform, durchgelassen. Das Harz wurde dann mit Wasser und dann mit verdünnter n/50 NH»OH gewaschen und der antibiotische Komplex aus dem Harz mit einem geeigneten Eluenten, z. B. n/2 NH4OH eluiert. Die aktiven Eluenten wurden vereinigt, im Vakuum eingeengt und abgedampft oder lyophylisiêrt, wobei der rohe Bu-2183 antibiotische Komplex erhalten wurde.

Der so erhaltene rohe Feststoff enthielt, wie dies mittels TLC gezeigt wurde, mindestens drei aktive Komponenten, welche als Bu-2183 A, A2 und B bezeichnet wurden, ebenso mindestens zwei inaktive Komponenten, welche mit Bu-2183 C und D benannt wurden. Der erhaltene Bu-2183-Komplex kann in seine Komponenten Bu-2183 A, A2, B, C und D unter Verwendung eines kationischen Ionenaustauschharzes, vorzugsweise eines Harzes vom Amberlit CG-50-Typ in der Ammoniumform. Der in Wasser gelöste Komplex wurde mit dem Harz behandelt, mit Wasser und dann mit verdünnter n/40 Ammoniumhydroxyd gewaschen und mit einem geeigneten Eluenten eluiert. Es wurde gefunden, dass man mit n/20 Ammoniumhydroxyd die Komponenten Bu-2183 A und B separieren kann. Eine weitere Eluierung der Säure mit einer konzentrierteren Ammoniumhydroxidlösung, z. B. n/10, liefert Bu-2183 C und D, welche wohl ninhydrin-positiv, aber bioinaktiv sind. Um die gereinigte Komponente Bu-2183 A2 zu erhalten, ist es gewöhnlich notwendig, eine zusätzliche Säulenchromatographie der Bu-2183 A-Frak-tion durchzuführen, um die Komponenten Bu-2183 Ai und Bu-2183 A zu separieren. Eine komplette Separierung und Reinigung jeder der Komponenten wird erreicht durch wiederholte Chromatographie gemäss oben beschriebener Methode. Es wurden zwei TLC-Systeme, die als S-l 17 und S-122 bezeichnet wurden, die sich dazu eignen, die vier Komponenten Bu-2183 A, B, C und D zu unterscheiden, was in unten angeführter Tabelle 4 angezeigt ist. Während der chromatographischen Reinigung der Komponente Bu-2183 A, wie dies im einzelnen in folgenden Beispielen beschrieben wird, wurde eine weitere bioaktive Aminoglycosid-Komponente gefunden, welche mit Bu-2183 Ai bezeichnet wurde. Die Komponente Bu-2183 Ai kann von der Komponente Bu-2183 A mittels der TLC-Systeme S-l 17 und S-122, wie dies aus Tabelle 5 ersichtlich ist, unterschieden werden.

Charakteristische Merkmale für die Bu-2183 antibiotischen

Komponenten

Bu-2183 A

Die antibiotische Substanz Bu-2183 A ist eine weisse amorphe Base, welche in Wasser löslich, leicht löslich in Methanol und Äthanol und praktisch in n-ButanoI, Aceton und anderen üblichen organischen Lösungsmitteln unlöslich ist.

Aus dem Antibiotikum Bu-2183 A ist es möglich, die Säurensalze sowie pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze zu bilden. Beispiele solcher geeigneten pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalze sind die nicht-toxischen Salze mit anorganischen und organischen Säuren, wie beispielsweise Chlorwasserstoff-, Schwefel-, Phosphor-, Essig-, Stearin-, Propion-, Wein-, Malein-, Benzoe-, Bernstein-Säure und ähnliche.

Die Komponente Bu-2183 A gibt positive Reaktionen mit Ninhydrin und Anthron-Reagenzien, aber negative Reaktionen mit Tollens-, Fehling- und Sakaguchi-Reagenzien.

Die spezifische Rotation der Base von Bu-2183 A beträgt [a]o = +78,5° (c, 1,0, Wasser).

Eine aus Äthanol niedergeschlagene Probe der Komponente Bu-2183 A hatte aufgrund einer Analyse die Formel C15H3.N3O9-C2H5OH.H2O.

Analyse berechnet: C = 44,24; H = 8,52; N = 9,11 ; O = 38,13;

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gefunden: C = 44,25; H = 8,08; N = 9,11 ; O = 38,56 (durch Differenz)

Das di-N-Acetat von Bu-2183 A wurde als farblose Nadeln mit F von 149 bis 150 °C erhalten. Das mittels Osmometrie ermittelte Molekulargewicht betrug 481 und nach Analyse wurde es als C19H35N3O11 • H2O gefunden.

Analyse berechnet: C = 45,68; H = 7,47; N = 8,41 ; O = 38,44;

gefunden: C = 45,73; H = 7,49; N = 8,19; O = 38,58 (durch Differenz)

Bu-2183 A ist eine schwache Base und weist titrierbare Gruppen mit einem pKa'-Wert von 6,90 und 9,40 in Wasser. Das approximative Molekulargewicht des Antibiotikums, wie dies aus Titrationsdaten berechnet wurde, beträgt 398.

Die Komponente Bu-2183 A weist lediglich eine Endabsorption im UV auf. Nach Pelletieren in Kaliumbromid zeigt es ein IR-Spektrum im wesentlichen wie dies aus Fig. 1 ersichtlich ist, d. h. mit charakteristischen Absorptionsbanden bei den folgenden Wellenzahlen in cnr1:1635 und 1570 (Amid) und 1080 und 1020 (Hydroxylgruppen). Beim Auflösen in Deuteriumoxid bei einer Konzentration von etwa 8% ist das NMR-Spektrum des Hydrochloridsalzes von Bu-2183 A im wesentlichen jenes von Fig. 2. Das Spektrum zeigt ein anomerisches Proton bei S5,17 ppm (1H, d, J = 3 Hz) und eine Propionylgruppe bei 51,12 (3H, t, J = 7,5 Hz) und 2,29 (2H, q, J = 7,5 Hz) ppm.

Die Struktur von Bù-2183 A kann wie folgt dargestellt wer den:

ch3ch2conh oh ho oh choh

0—ch

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choh I

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Bu-2183 A2

Die antibiotische Komponente Bu-2183 A2 ist, ähnlich wie Bu-2183 A oben, eine weisse amorphe Base, die in Wasser,

leicht in Methanol und Äthanol löslich und praktisch in n-Buta-nol, Aceton und anderen üblichen organischen Lösungsmitteln unlöslich ist. Sie ist fähig, Salze mit Säuren sowie pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze der Base von Bu-2183 zu bilden, was von der vorliegenden Erfindung umfasst wird. Die Komponente Bu-2183 A2 liefert positive Ninhydrin- und Anthron-Reaktionen und negative Tollens-, Fehling und Saka-guchi-Reaktionen.

Die spezifische Rotation der Base Bu-2183 Ai ist [a]o5 = +79,1° (c, 0,43, H2O).

Eine als Carbonatsalz isolierte Probe von Bu-2183 A2 wurde als Ci6H33N30»' '/2H2C03 analysiert.

Analyse berechnet: C = 44,79; H = 7,75; N = 9,50; O = 37,96;

gefunden: C = 44,35; H = 7,83; N = 9,21 ; O = 38,61 (durch Differenz)

Die Komponente Bu-2183 A2 zeigt lediglich eine Endabsorption im UV. Nach Pelletieren im KBr weist es ein IR-Spek-trum im wesentlichen wie in Fig. 3 angeführt auf. Das NMR-Spektrum des Hydrochloridsalzes von Bu-2183 A2, aufgelöst in D2O und einer Konzentration von etwa 6%, dasjenige, wie es

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aus Fig. 4 ersichtlich ist. Die Komponente Bu-2183 A2 kann von Bu-2183 A und Bu-2183 B durch die Gegenwart einer n-Butyryl-gruppe im NMR-Spektrum bei 80,92 (3H, t), 1,63 (2H, Sixtet) und 2,30 (2H, t) ppm, statt der Propionyl- oder Acetylgruppe in den Komponenten A und B unterschieden werden.

Die ermittelte Struktur der Komponente Bu-2183 A2 kann wie folgt dargestellt werden:

oh ho choh oh o —ch chniì I

choh I

CH201

Bu-2183 B

Das Antibiotikum Bu-2183 B ist sehr im Aussehen und in der Löslichkeit den Komponenten Bu-2183 A und A2 ähnlich; es ist eine weisse amorphe Base, die in Wasser löslich, in Methanol und Äthanol leicht löslich und in n-ButanoI, Aceton und anderen üblichen organischen Lösungsmitteln praktisch unlöslich ist.

Aus dem Antibiotikum Bu-2183 B können Salze mit Säuren sowie pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze erzeugt werden.

Die Komponente Bu-2183 B zeigt positive Reaktionen mit Ninhydrin- und Anthron-Reagenzien, aber negative Reaktionen mit Tollens-, Fehling- und Sakaguchi-Reagenzien.

Die spezifische Rotation der Base von Bu-2183 ist [a]o = +85° (c, 1,0, Wasser).

Eine aus Äthanol ausgefällte Probe der Komponente Bu-2183 B wurde analysiert als C14H29N3O9 • C2H5OH • H2O.

Analyse berechnet: C = 42,95;, H = 8,34; N = 9,36; O =

39,35;

gefunden: C = 42,69; H = 7,78; N = 8,86; O = 40,67 (durch Differenz)

Das di-N-Acetat von Bu-2183 B wurde als farblose Prismen mit F von 159 bis 162 °C erhalten. Es hat ein mittels Osmometrie bestimmtes Molekulargewicht von 484 und aufgrund einer Analyse hat es die Formel C18H33N3O11 • H2O.

Analyse berechnet: C = 44,53; H = 7,27; N = 8,66; O =

39,54;

gefunden: C = 44,96; H = 7,44; N = 8,52; O = 39,08 (durch Differenz)

Bu-2183 B ist schwach basisch und hat titrierbare Gruppen mit pKa'-Werten von 7,15 und 9,35 in Wasser. Das approximative Molekulargewicht des Antibiotikums, wie es durch Titrie-rungsdaten berechnet wurde, ist 409.

Die Komponente Bu-2183 B zeigt lediglich eine Endabsorption im UV. Pelletiert in Kaliumbromid hat es ein IR-Spektrum, wie es im wesentlichen in Fig. 5, mit charakteristischen Absorptionsbanden in den folgenden Wellenzahlen in cm-1:1635 und 1570 (Amid) und 1080 und 1020 (Hydroxylgruppen) ersichtlich ist. Das NMR-Spektrum des Hydrochloridsalzes von Bu-2183 B, das in Deutoriumoxid bei einer Konzentration von 10% gelöst wurde, ist aus beiliegender Fig. 6 ersichtlich. Das NMR-Spek-trum zeigt, dass Bu-2183 B von Bu-2183 A und Az durch die Anwesenheit einer Acetylgruppe bei 82,02 ppm (3H, s), statt der Propionyl- oder n-Butyrylgruppe, wie in A und A2 anwe5

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send, unterschieden werden kann.

Die Ermittlung der Struktur der Komponente Bu-2183 B hat die folgende ergeben:

chgconh-

ch2nh2

Charakteristische Daten für die Zwischensubstanz Bu-2183 D

Die bioinaktive Komponente Bu-2183 D ist eine weisse amorphe Base, die in Wasser löslich, in Methanol und Äthanol leicht löslich und in n-Butanol, Aceton und anderen üblichen organischen Lösungsmitteln praktisch unlöslich ist.

Aus der Verbindung Bu-2183 D können mit Säuren Salze, sowie Säureadditionssalze der Base erhalten werden.

Die Komponente Bu-2183 D gibt positive Reaktionen mit Ninhydrin- und Anthron-Reagenzien, aber negative Reaktionen mit Tollens-, Fehling- und Sakaguchi-Reagenzien.

Die spezifische Rotation der Base von Bu-2183 D ist [a]o = +72,5° (c, 1,0, Wasser).

Es wurde eine Probe der Komponente Bu-2183 D als Car-bonatsalz isoliert und analysiert und die Formel Ci2H27N30s- H2CO3 gefunden.

Analyse berechnet: C = 38,70; H = 7,25; N = 10,42; O = 43,63;

gefunden: C = 38,86; H = 6,93; N = 10,14; O = 44,07 (durch Differenz)

Bu-2183 D ist schwach basisch und hat drei titrierbare Gruppen mit pKa'-Werten von 6,95(zwei Äquivalente) und 9,68 in Wasser.

Das tri-N-Acetat von Bu-2183 D wurde als farblose Prismen mit F von 159 bis 162 °C erhalten. Es wurde gefunden, dass dieses Salz mit dem di-N-Acetat von Bu-2183 B identisch ist.

Die Komponente Bu-2183 D zeigt lediglich eine Endabsorption im UV. Pelletiert in Kaliumbromid hat es ein IR-Spektrum, wie es im wesentlichen aus Fig. 7 ersichtlich ist. Das Spektrum zeigt ein Fehlen von Amid-Carbonylbindungen, welche in den bioaktiven Komponenten Bu-2183 A, A2 und B anwesend sind. Das NMR-Spektrum des Hydrochloridsalzes von Bu-2183 D, aufgelöst in Deuteriumoxid bei einer Konzentration von 10%, ist im wesentlichen aus Fig. 8 ersichtlich. Die ermittelte Struktur von Bu-2183 B kann wie folgt dargestellt werden:

nh °h ch0nh0 I 2 l choh

0—ch chnh0 I 1 choh I

ch2oh

Strukturbestimmung von Bu-2183-Komponenten

Eine milde saure Hydrolyse von Bu-2183 A und B (In HCl/ MeOH, bei 80 °C und während 3 Stunden) ergab dieselbe Des-acylverbindung Cn^NsOs, welche identisch war mit der 5 Komponente Bu-2183 D, erhalten durch chromatographische Separierung des rohen Bu-2183-Komplexes. Die totale N-Ace-tylierung von Bu-2183 D führte zum tri-N-Acetat der Formel C18H33N3O11, welches als das di-N-Acetat der Komponente Bu-2183 B identifiziert wurde.

10 Eine saure Hydrolyse von Bu-2183 B in methanolischem gesättigtem Chlorwasserstoff, bei Rückflusstemperatur während 24 Stunden, führt zu einem Aglykon und einem Aminozuk-ker, zusammen mit der Komponente Bu-2183 D. Das Aglykon wurde als kristallines Sulfat isoliert, hatte ein F von 263 bis 15 264 °C und aufgrund einer Analyse die Formel

C6H16N2O4.H2SO4.

Analyse berechnet: C = 25,90; H = 6,52; N = 10,07 ; S = 11,52;

gefunden: C = 26,10; H = 6,47; N = 9,93; S = 11,29. 20 Das 220 MHz NMR-Spektrum von deren N, O-Hexaacetat zusammen mit den Massenspektrum-Daten, erhalten mit N-Acetyl-O-TMS, N-Acetyl-diisopropyliden und Hexa-N.O-ace-tyl-Derivaten des Aglykons, führte zur Annahme, dass eine l,4-Diamino-2,3,5,6-tetra-ol-Struktur beim Aglykon-Teil vor-25 liegt.

Das di-N-Acetat des Aglykons wurde als farblose Nadeln mit F von 114 bis 115 °C erhalten und analysiert als C10H20N2O6.

Analyse berechnet: C = 45,45; H = 7,63; N = 10,60;

gefunden: C = 45,37; H = 7,97; N = 10,57 30 Da die Konfiguration des D-Glucose-Typs als die wahrscheinlichste für das Aglykon angenommen wurde, wurde l,4-Diamino-l,4-dideoxy-D-sorbit aus 4-Amino4-deoxy-D-glu-cose durchgeführt und das Produkt zeigte sich aufgrund von TLC- und NMR-Analyse als das Aglykon.

35 Der nach der obigen sauren Methanolyse der Komponente B erhaltene Amino-Zuckerteil wurde mittels Chromatographie mit Hilfe von Amberlit CG-50 gereinigt und in a- und in ß-Form von Methylglycosid separiert, wobei die a-Form als das Hauptprodukt ist. N-Acetylierung des a-Methylglycosids zeigt farb-40 lose Prismen mit F von 185 bis 186 °C und aufgrund der Analyse wies sie die Formel CsHnNOs auf.

Analyse berechnet: C = 45,95; H = 7,28; N = 5,95;

gefunden: C = 45,93; H = 7,43; N = 5,88.

Das Massenspektrum dieses N-Acetyl-Derivates zeigte eine 45 Spitze bei mle (M-31), die dem Verlust einer glycosidischen Methoxylgruppe aus dem Molekül zuzuschreiben ist. Somit sollte der freie Aminozucker die Formel CsHnNOs haben.

Die a- und ß-Formen von Methylglycosid wurden durch IR-iund NMR-Spektren in deren Tetra-N,0-Acetyl-Derivate als îo Methyl-4-amino-4-deoxy-a- bzw. ß-D-glucopyranosid identifiziert. Die IR-Spektren von authentischen Proben dieses aus 4-Trehalosamin (J. Antibiotics, 27,145,1974) isolierten Zuckers stimmten mit den IR-Spektren der experimentellen Proben überein.

55 Eine Säurehydrolyse von Bu-2183 D in 6n HCl bei Rückfluss während drei Stunden ergab dasselbe Aglykon und den Aminozucker, wie jene, die aus dem Hydrolysat von Bu-2183 B isoliert wurden.

Das durch chromatographische Separierung des rohen Bu-bo 2183-Komplexes erhaltene Bu-2183 C in ln-HCl enthaltendem Methanol bei Rückfluss während drei Stunden hydrolysiert. Der Aglykon-Teil war mit jenem der anderen Komponenten von Bu-2183 identisch und der Zuckerteil wurde als Methyl-D-glucosid durch TLC-, NMR- und Gaschromatographie identifi-b5 ziert. Die Molekularformel N für Bu-2183 C ist demgemäss C12H26N2O9.

Basierend auf die oben angeführten Daten wurden die Strukturen von Bu-2183-Komponenten als die folgenden

7

619 733

bestimmt:

OH

R

HO

OH

O—

I

CHNH0

I 2

CHOH

I

CH2OH

Bu-2183

R

Komponente

A

C2H5CONH-

B

CH3CONH-

Ai n-CsHvCONH-

C

HO-

D

NH2-

Antimikrobielle Wirksamkeit

In-vitro-Tests zeigen an, dass der Komplex Bu-2183 und die einzelnen antibiotischen Komponenten Bu-2183 A, Ai und B ein breites Spektrum antibakterieller Wirksamkeit haben. Der antibiotische Komplex und die aktiven Komponenten sind insbesondere bei der Hemmung der meisten aminoglycosid-resistenten Organismen nützlich. Es wurde gefunden, dass die Komponente Bu-2183 A2 aktiver ist als Bu-2183 B, aber weniger aktiv als Bu-2183 A.

Die minimale Inhibitionskonzentration MIC von Bu-2183 A und B wurden gegenüber einer weiteren Vielfalt von Bakterien mittels der zwei Falten mittels der doppelten Agar-Verdünnungsmethode auf Nähragarplättchen bestimmt. Es wurde die Inokula-Vorrichtung von Steers und Mitarbeiter verwendet. Die Inokulummenge wurde auf eine 104-Verdünnung einer über Nacht stehen gelassenen Kultur der Testorganismen in der Heart Infusion Broth (Difco) eingestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 mit jenen von Kanamycin als antibiotische Vergleichssubstanz eingetragen.

Die Intrinsic-Wirksamkeiten von Bu-2183 A und B waren massig oder eher schwach, ausgedrückt in MIC-Werten, die Komponente A war etwa 2 bis 4 Mal aktiver als B. Sie weist aber breites Spektrum antibakterieller Wirksamkeit gegenüber gram-positiven und gram-negativen Bakterien, einschliesslich vieler aminoglycosid-resistenter Organismen und Pseudomo-nas-Stämmen.

Die unten angeführte Tabelle 7 zeigt minimale Inhibitionskonzentrationen von Komponenten Bu-2183 A und A2 gegenüber mehreren pathogenen Organismen.

Es wurde gefunden, dass eine Probe von Bu-2183-Komplex von etwa 30 bis 40%iger Reinheit E. coli A20365 bei einer Konzentration von 12,5 ng/ml. K. pneumoniae D-l 1 bei einer Konzentration von 12,5 (ig/ml und Ps. aeruginosa A9930 bei einer Konzentration von 25 (ig/ml hemmt.

Wirkung des pH in Medien auf MIC

Die Wirkung des pH auf MIC von Bu-2183 A wurde durch die doppelte Verdünnungsmethode unter Verwendung eines Nähragarmediums bei pH 6,0,7,0,8,0 und 9,0 untersucht. Die

Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengestellt und es ist daraus ersichtlich, dass die Wirksamkeit von Bu-2183 A bei einem alka-linen pH ansteigt und bei saurem pH abfällt.

Wirkung von Medien

Die Wirkung von Medien auf die Wirksamkeit von Bu-2183 A und B wurde gegenüber acht Testorganismen untersucht. Die getesteten Medien waren Nähragar, Heart-Infu-sions-Agar und Mueller-Hinton-Agar. Der pH der Medien wurde auf pH 8 gebracht. Wie aus Tabelle 9 ersichtlich, wird die grösste in-vitro-Wirksamkeit erreicht, falls Nähragar als Testmedium verwendet wird.

In-vivo-Wirksamkeit und Toxizität

Die Werte für Bu-2183 A und B wurden in vivo in experimentellen Funktionen mit Mäusen bestimmt. Die verwendeten pathogenen Bakterien waren S. aureus Smith, E. coli NIHJ und Ps. aeruginosa A9930. Es wurden Mäuse mit einer lOOfachen LDso-Dosis von pathogenen Bakterien in einer 5%igen Suspension von Schweinsmagenmucin beansprucht. Eine einzelne subkutane Behandlung mit dem Antibiotikum wurde sogleich nach der bakteriellen Behandlung, d. h. bei 0 Stunden durchgeführt und in einer doppelten Dosismenge wurde dann das Antibiotikum bei 0 und 3 Stunden nach der bakteriellen Behandlung verabreicht. Gruppen von 5 Mäusen wurden für jeden Dosierungsspiegel eingesetzt und die Tiere wurden während 5 Tagen beobachtet, zwecks Bestimmung der durchschnittlichen Schutzdosis (PDso).

Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 zusammengestellt. Aus dieser Tabelle ist ersichtlich, dass Bu-2183 A und B eine in-vivo-Wirksamkeit gegen sämtliche drei getesteten Infektionen herbeiführen.

Die akute Toxizität von Bu-2183 A und B wurde bei Mäusen auf subkutanem und intravenösem Weg bestimmt. Die Mäuse wurden während 15 Tagen beobachtet und die intravenösen (i.v.) und subkutanen (s.c.) LDso der Komponente Bu-2183 A wurde mit 2500 mg/kg bzw. 1000 mg/kg gefunden. Die Komponente Bu-2183 B war weniger toxisch als Bu-2183 A und es wurden keine tödlichen Fälle bei Dosismengen bis zu 2000 mg/kg weder bei i.v. noch bei s.c. während der Beobachtungsdauer von 15 Tagen festgestellt.

Nützlichkeit der Komponente Bu-2183 D

Obschon die Komponente Bu-2183 D bioinaktiv ist, ist sie eine wertvolle Zwischensubstanz bei der halbsynthetischen Präparierung von bioaktiven Komponenten Bu-2183 A, Ai und B. So kann die freie Aminogruppe der Zwischensubstanz Bu-2183 D, nach geeignetem Schutz anderer reaktiver funktioneller Gruppen, acyliert werden, wobei, nach Entfernung jeglicher Schutzgruppen, das N-Butyrylderivat Bu-2183 A, das N-Ace-tylderivat Bu-2183 B oder das N-Propionylderivat von Bu-2183 A2 erhalten wird.

Tabelle 1

Erzeugung von fluoreszierendem Pigment

Medium

Bu-2183 Erzeuger

Ps. Fluorescenz

D-946-B83

NIHJ B254

Hefeextraktagar

+

King's B-Medium

—±

+ +

20% abgerahmte Milch

lösung

+ +

+ +

Glutamatbrühe

+ +

+ +

5

10

15

20

25

ifl

35

40

45

50

55

bO

65

619733

8

Tabelle 2

Physiologische und biologische Merkmale vom Stamm D946-B83

Test

Ergebnis

Verwendete Methode und Medium

Arginindihydrolase

Katalasé Oxidase

(Cytochromoxidase) Extracellulare Hydrolasen Gelatinhydrolase Stärkehydrolase Voges-Proscauer-Reaktion Indolproduktion HîS-Erzeugung aus Cystein und Thiosulfat Gelatinverflüssigung

Reaktionen in abgerahmter Milchlösung

Verwendung von Nitrat-N Nitrit-Erzeugung aus Nitrat

Verwendung von Ammonium-N Ammoniak-Erzeugung aus Pepton Denitrifikation Gas aus Kohlehydrat Verwendung von Harnstoff Verwendung von Zitrat

Verwendung von Oxalat

Eigelb-Reaktion

Spaltungsmechanismus von aromatischen Verbindungen Erzeugung von Phenazin-Pigmenten, wie Pyocyanin, Chloraphin und Phen-azin-a-carbonsäure positiv positiv negativ positiv negativ negativ negativ negativ positiv schnell verflüssigt grünlich gelb, erzeugt fluroescie-rendes Pigment, peptonisiert pH, alkalisiert positiv positiv negativ positiv positiv negativ negativ positiv positiv negativ negativ ortho-Spaltung negativ modifizierte Methode von Stanier und Mitarbeiter1

Wasserstoffperoxid auf der Kolonie getestet mittels drei verschiedenen Methoden1'4

Methode von Stanier und Mitarbeiter1 Methode von Stanier und Mitarbeiter1 Pep tonbrühe + 1% Glucose Peptonbrühe (Kovac's-Reagenz) anorganische Ammoniumsalze + Cystein und Thiosulfat

Bleiacetat-Papier zur Ermittlung von H2S Peptonbrühe + 25% Gelatin5 20% abgerahmte Milchlösung, sterilisiert durch Autoklavebehandlung (0,5 kg/cm2 während 5 Minuten)

Rhodes anorganische Salze Glycerin-nitrat-Medium2

Rhodes anorganische Salze Glycerin-nitrat-Medium2 Peptonbrühe + 0,1% KNO3 Koser's Zitratmedium Peptionbrühe (Nessler's Reagenz) Methode von Stanier und Mitarbeiter1 Nährbrühe + 1% Glucose Christensen's Harnstoffmedium Simmon's Zitratmedium und Koser's Zitratmedium

Oxalat statt Zitrat in Simmon's und Koser's Medium

Methode verwendet von Stanier und Mitarbeiter1

modifizierte Methode von Stanier und Mitarbeiter1 King's A Medium

1. R.Y. Stanier, N.J. Palleroni & M. Doudoroff: The Aérobic Pseudomonads: A Taxonomic Study. J. Gen. Microbiol. 43: 159-271,1966

2. M.E. Rhodes: The Characterization Of Pseudomonas Flu-rescens. J. Gen. Microbiol. 21:221-263,1959

3. H. Iizuka & K. Komagata: An Attempt At Grouping Of

The Genus Pseudomonas. J. Gen. Appi. Microbiol. 9:73-82,1963

4. H. Iizuka & K. Komagata: Taxonomy Of Genus Pseudomonas With Special Reference To Their Modes Of Metabolism Of Carbon Compounds. J. Gen. Appi. Microbiol. 9:83-95,1963

5. V.B.D. Skerman: Abstracts Of Microbiological Methods. Wiley-Interscience, New York, London, Sydney and Toronto, P. 364,1969

Tabelle 3

Verwendung von Kohlenstoffquellen

Stamm Ps. fluorescens Ps. aeruginosa

Substrat D946-B83 NIHJB254 ATCC 19660

Glycerin

+

+

+

L-Arabinose

+

+

-

D-Xylose

+

+

-

L-Rhamnose

-

-

-

D-Fructose

+

+

+

D-Galactose

+

+

-

D-Glucose

+

+

+

D-Mannose

+

+

-

D-Fucose

-

-

-

Trehalose

+

+

-

Cellobiose

-

-

-

Maltose

-

-

-

Sucrose

-

-

-

Lactose

-

-

-

Raffinose

-

-

-

Inosit

-

+

-

D-Mannit

+

+

+

D-Sorbit

-

+

-

Dulcit

-

-

-

Geraniol

-

-

+

Stärke

-

-

-

Zellulose

-

-

-

Insulin

-

-

-

Salicin

-

-

-

Acetat

+

+

+

Propionat

+

+

+

ß-OH-butyrat

+

+

+

2-Ketogluconat

+

+

+

Succinat

+

+

+

Maleat

-

-

-

Glycollat

-

-

-

DL-Lactat

+

+

+

Pelargonat

+

+

+

Adipat

-

-

+

p-OH-Benzoat

+

+

+

m-OH-Benzoat

-

-

-

Methanol

-

-

+

Äthanol

-

-

+

n-Propanol

-

-

+

Phenol

-

-

-

Kresol

-

-

+

Monoäthanolamin

-

-

-

Monoäthylamin

-

-

-

Diäthylamin

-

-

-

Triäthylamin

-

-

-

Testosteron

-

-

-

Acetamid

-

-

+

Arginin

+

+

+

Valin

+

+

+

Norleucin

-

-

-

D-Tryptophan

-

-

-

a-Aminovalerat

+

-

+

Betain

+

+

+

Putrescin

+

+

+

Basales Medium enthält pro Liter: 40 ml von lM-phosphat-Puffer (pH 6,8); 1 g, (NH4)2S04; 20 ml of Hutner's vitaminfreie Mineralsalzlösung.

619 733

10

Tabelle 4. TLC Of Bu-2183 Komponenten

System

Platte

Lösungsmittelsystem

Rf*

A B C D

S-l 17 S-122

Silica gel Silica-gel

CHCh-CH30H-28% NH4OH (1:3:2)

CHCI3-CH3OH-2N NH4OH-CH3COOH(20:65:40:5)

0,39 0,30 0,21 0,23 0,38 0,27 0,15 0,03

Tabelle 5. TLC Of Bu-2183 Komponenten A und A2

System

Platte

Lösungsmittelsystem

Rf*

A A2

S-l 17 S-122

Silica-gel Silica-gel

CHCl3-CH30H-28%NH40H (1:3:2)

CHCI3-CH3OH-2N NH4OH-CH3COOH(20:65:40:5)

0,49 0,57 0,39 0,48

* Bestimmung Ninhydrin-Reagenz

Tabelle 6. Antibakterielle Spektren Bu-2183 A und B

MIC (mcg/ml)

Code Nr. Test-Organismen Bu-2183 A Bu-2183 B KanamycinA

Sa-2

S. aureus Smith

12,5

50

0,2

Sa-3

S. aureus Dl93

25

25

0,4

Sa-4

S. aureus Dl33

25

>100

0,8

Sa-9

" S. aureus Dl37

100

>100

1,6

Sa-10

S. aureus A20239

25

100

25

Ec-1

E. coli NIHJ

12,5

50

0,8

Ec-2

E. coli PO 1495

25

50

0,4

Ec-5

E. coli ML 1630

12,5

50

100

Ec-9

E. coli NR 79/W677

25

100

25

Ec-10

E. coli JR 35/C600

6,3

12,5

12,5

Ec49

E. coli A20107

12,5

50

25

Ec-53

E. coli JR 66/W677

6,3

25

25

Ec-55

E. coli R 5

25

100

6,3

Ec-62

E. coli A20895

12,5

50

0,8

Ec-72

E. coli A20732

12,5

25

12,5

El-2

Ent. cloacae A20364

25

50

100

El-12

Ent. cloacae A21006

25

100

50

Pv-1

Pr. vulgaris A9436

12,5

50

0,2

Pg-2

Pr. morganii A20031

25

50

0,8

Pm-1

Pr. mirabilis A9554

12,5

25

0,4

Ps-2

Prov. stuartii A20894

>100

>100

0,8

Kp-1

K. pneumoniae Dl 1

3,1

12,5

0,2

Kp-8

K. pneumoniae Typ 22-3038

25

100

100

Sm-1

Ser. marcescens A20019

>100

>100

0,8

Sm-16

Ser. marcescens A21247

100

>100

>100

Pa-3

Ps. aeruginosa A9930

12,5

25

6,3

Pa-12

Ps. aeruginosa A20653

25

100

>100

Pa-16

Ps. aeruginosa Nr. 130

25

100

25

Pa-21

Ps. aeruginosa A20601

25

50

12,5

Pa-24

Ps. aeruginosa A20896

25

100

>100

11 619 733

Tabelle 6 (Fortsetzung). Antibakterielle Spektren Bu-2183 A und A2

MIC (mcg/ml.)

Code Nr. Testorganismen Bu-2183 A Bu-2183 A2

Sa-2

S. aureus Smith

25

25

Sa-3

S. aureus Dl93

25

50

Sa-4

S. aureus D133

50

100

Sa-9

S. aureus Dl37

50

100

Sa-10

S. aureus A20239

50

100

Ec-1

E. coli NIHJ

25

100

Ec-2

E.coli P01495

25

>100

Ec-5

E. coli ML1630

25

50

Ec-9

E. coli NR79/W677

12,5

25

Ec-10

E. coli JR35/C600

6,3

6,3

Ec49

E. coli A20107

25

50

Ec-53

E. coli JR66/W677

25

25

Ec-55

E. coli R5

6,3

25

Ec-62

E. coli A20895

25

50

Ec-72

E. coli A20732

12,5

25

El-2

Ent. cloacae A20364

25

100

El-12

Ent. cloacae A21006

25

100

Pv-1

Pr. vulgaris A9436

25

100

Pg-2

Pr. morganii A20031

25

50

Pm-1

Pr. mirabilis A9554

25

50

Ps-2

Prov. stuartii A20894

>100

>100

Kp-1

K. pneumoniae Dl 1

6,3

12,5

Kp-8

K. pneumoniae Type 22-3028

25

100

Sm-1

Ser.marcescens A20019

>100

>100

Sm-16

Ser. marcescens A21247

>100

>100

Pa-3

Ps. aeruginosa A9930

12,5

50

Pa-12

Ps. aeruginosa A20653

50

>100

Pa-16

Ps. aeruginosa Nr. 130

25

100

Pa-21

Ps. aeruginosa A20601

50

>100

Pa-24

Ps. aeruginosa A20896

50

>100

Pa-27

Ps. aeruginosa GN315

25

100

Tabelle 8. Wirkung von pH in Medien auf MIC von Bu-2183 A

Code Nr. Stamm pH 6 pH 7 pH 8 pH 9

Ec-1 E. coli NIHJ >50 50 25 12,5

Kp-1 K. pneumoniae D11 12,5 12,5 12,5 3,1

Pa-1 Ps. aeruginosa D15 >50 50 25 12,5

Sa-10 S. aureus Smith >50 50 50 50

Bs-1 B. subtilis PCI 219 50 6,3 6,3 6,3

Tabelle 9

Wirkung von Medien auf die Bu-2183 A und B

Wirksamkeit auf

Code Nr. Stamm Bu-2183 A Bu-2183 B

NA* HIA MHA NA HIA MHA

Ec-1

E. coli NIHJ

12,5

50

100

50

>100 >100

Kp-1

K.pneumoniae Dil

3,1

12,5

25

12,5

50 50

El-2

Ent. cloacae A20364

25

50

100

50

>100 >100

Pv-1

Ps. vulgaris A9436

12,5

50

100

50

>100 >100

Pm-1

Ps. mirabilis A9554

12,5

50

50

25

>100 100

Pa-3

Ps. aeruginosa A9930

• 12,5

25

50

25

100 >100

Sa-2

S. aureus Smith

12,5

50

50

50

100 >100

Sa-10

S. aureus A20239

25

100

>100 100

>100 >100

*NA: Nähr-Agar

HIA: Heart-Infusionsagar

MHA: Mueller-Hinton-Agar

619 733

12

Tabelle 10. In-vivo-Wirksamkeit auf Bu-2183 A und B

Infiszierende PDso in mg/kg (Einzeldosis)

Organismen Bu-2183 A Bu-2183 B

S aureus Smith 42 100

E. coli NIHJ 92 135

Ps. aeruginosa A9930 230 540

Infiszierende PDso in mg/kg (doppelte Dosis)

Organismen Bu-2183 A

S. aureus Smith 36 x 2

E. coli NIHJ 45x2

Ps. aeruginosa A9930 80x 2

Das oben beschriebene Verfahren wird in nachfolgenden Beispielen näher veranschaulicht. Die oben angeführten sowie in den Beispielen verwendeten Amberlit IRC-50 und CG-50 sind Handelsmarken für schwach saure kationische Austauschharze eines carboxylhaltigen Polymethacrylsäure-Typs.

Beispiel 1

Fermentation im Tank

Eine im Reagenzglas schräg angelegte Agarkultur von Pseudomonas sp. Stamm D946-B83 wurde zur Impfung von 100 ml vom Samenmedium Nr. 83B mit 3% Glucose, 2% Fischmehl, 0,5% Sojabohnenmehl, 0,2% Pepton und 0,6% CaCCh, in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben, verwendet. Der Kolben wurde bei 28 °C während drei Tagen auf einer Rotations-Schüttelvorrich-tung bei 250 Upm inkubiert und es wurde ein Liter der Samenkultur zur Impfung von 300 Liter vom Fermentationsmedium Nr. 100F mit 2% Glycerin, 1% Pharmamedium, 2% Fischmehl, 2% Leinsamenmehl, 0,3% (NH.O2SO4 und 0,6% CaCC>3, verwendet. Die Durchführung im Tank erfolgte bei 30 °C unter Rühren bei 140 Upm und einem Belüftungsgrad von 200 Liter pro Minute. Die Brühstärke wurde bestimmt durch die Papier-scheibe-Agarplatte-Methode unter Verwendung von B. subtilis PCI 219 als Versuchsorganismus und Bu-2183 A als Versuchsstandard. Es wurden die folgenden Ergebnisse erzielt:

Zeit (Std.)

pH der Brühe

Stärke (ßg/ml)

0

6,7

0

20

7,5

200

30

7,8

400

40

7,9

1600

50

7,9

1650

60

8,1

1700

64

8,1

1800

Extraktion

Die geerntete Brühe wurde mittels eines Filterhilfsmittels bei pH 2 filtriert. 19 Liter dieses Filtrâtes, welche etwa 30 g von Bu-2183 A enthielten, wurden auf pH 7 gebracht und mit drei Liter Amberlit IRC-50 in NH4+-Form gerührt. Das Harz wurde dann abgetrennt, mit 10 Liter Wasser und hernach mit 5 Liter n-50 NH4OH gewaschen und dann mit zwei 4-Liter-Portionen von n/2 NH4OH gerührt, um die Bioaktivität zu eluieren. Die aktiven Eluate wurden vereinigt, im Vakuum eingeengt und dann lyophylisiert und man erhielt 18,6 g eines weissen Feststoffes (etwa 700 ng/mg). Dieser Feststoff wurde in Wasser gelöst und auf eine Säule mit 400 ml Amberlit CG-50 in NH4+-

Form angewendet. Die Säule wurde dann mit 2,2 Liter Wasser und hernach mit 3 Liter n/40 NH4OH gewaschen und dann mit n/20 NH4OH entwickelt. Die Eluate wurden fraktioniert und durch Bioversuche auf B-subtilis-Platten und auch durch TLC (System S-l 17, Ninhydrin) untersucht. Geeignete Fraktionen wurden vereinigt, im Vakuum eingeengt und lyophylisiert, wobei die folgenden Feststoffmengen erhalten wurden:

11/2ONH4OH

Feststoff(Gewicht)

Bu-2183 Komponenten (roh)

0-1,3 Liter

keine Wirksamkeit

-2,5 Liter

2,7 g

A

-4,4 Liter

7,8 g

A+B (wenig)

-5,2 Liter

3,3 g

B

Beispiel 2

Präparierung von Bu-2183 A

2,7 g der gemäss Verfahren von Beispiel 1 erhaltenen rohen Probe von Bu-2183 A wurden in Wasser gelöst und auf eine Säule von 80 ml Amberlit CG-50 in NH4+-Form angewendet. Die Säule wurde mit n/20 NH4OH eluiert und jede 15 ml-Por-tion des Eluats wurde durch einen Fraktionssammler gesammelt. Die Fraktionen wurden durch TLC-Ninhydrin und auch mittels Bioversuchen untersucht und geeignete Fraktionen wurden vereinigt, im Vakuum eingeengt und lyophylisiert; man erhielt die folgenden Feststoffmengen:

Fraktion Nr.

Feststoff (Gewicht)

TLC

28-53

801 mg

A+Verunreinigung

54-72

1597 mg

A

73-95

189 mg

A+B (wenig)

Aufgrund einer Analyse des reinen Präparates von Bu-2183 A wurde die folgende Formel ermittelt CuHjiNjO^fcHîCOj:

Analyse berechnet: C = 43,45; H = 7,53; N = 9,81 ; gefunden: C = 43,22; H = 7,52; N = 9,49.

Die IR- und NMR-Spektren dieser Substanz sind aus Fig. 1 bzw. 2 ersichtlich. Eine Zusammenstellung der NMR-Daten wird im folgenden angeführt:

Chemische Schicht

Kopplungskonstante relative

( 8, ppm)

(J, Hz)

Intensität

1,12 (t)

7,5

3H

2,29 (q)

7,5

2H

3,1-3,35 (m)

2H

3,5-4,30 (m)

12H

5,17 (d)

3,0

1H

s = Singlett; d = Doublett; t = Triplett; q = Quartett; m = Multiple«.

Beispiel 3

Präparierung von Bu-2183 B

3,3 g der gemäss Verfahren von Beispiel 1 erhaltenen rohen Probe von Bu-2183 B wurden in Wasser gelöst und auf eine Säule mit 130 ml Amberlit CG-50 in NH4+-Form angewendet. Die Säule wurde dann mit n/20 NH4OH eluiert und jede 15-ml-Portion des Eluates wurde mittels eines Fraktionssammlers gesammelt. Die einzelnen Fraktionen wurden mittels TLC-Nin-hydrin und auch durch Bioversuche untersucht und geeignete

5

10

15

20

25

30

35

0

45

50

35

bO

fc5

13

619 733

Fraktionen wurden vereinigt, im Vakuum eingeengt und lyophylisiert; man erhielt die folgenden Feststoffmengen:

Fraktion Nr.

Farbstoff (Gewicht)

TLC

1- 59 60-151 152-160

86 mg 2792 mg 356 mg

B+Verunreinigung B

B+Verunreinigung, 0 (wenig)

n/10NH«OH

Feststoff (Gewicht)

Identifikation

0- 300 ml

301-1200 ml

1638 mg

Bu-2183 C

1201-1900 ml

-

.1901-2400 ml

526 mg

Bu-2183 D

Mittels einer Analyse des reinen Präparates von Bu-2183 B wurde die folgende Gesamtzusammensetzung gefunden 15 C14H29M3O9 • '/îHîCCh:

Analyse berechnet: C = 42,01 ; H = 7,30; N = 10,14;

gefunden: C = 41,92; H = 7,43; N = 9,93.

Dessen IR- und NMR-Spektren sind aus Figuren 5 bzw. 6 ersichtlich. Eine Zusammenstellung der NMR-Daten wird im 20 folgenden angeführt:

Beispiel 5

Präparierung von Bu-2183 A2

Während des in Beispiel 2 beschriebenen Reinigungsverfahrens der Komponente A wurde eine neue aktive Komponente aus den Vorlauffraktionen isoliert und mit Komponente Bu-2183 A2 benannt. Diese Komponente kann von der Komponente A durch TLC-Systeme, S-l 17 und S-122, wie es im folgenden gezeigt wird, unterschieden werden:

Chemische Schicht

Kopplungskonstante relative

8, ppm)

(Ii Hz)

Intensität

2,02 (s)

3H

3,1-3,20 (m)

2H

3,6-4,30 (m)

12H

5,17 (d)

3,0

1H

s = Singlett; d = Doublett; m = Multiplett.

Beispiel 4

Präparierung von Bu-2183 C und Bu-2183 D

Die in Beispiel 1 verwendete Säule wurde im weiteren mit 1,4 Liter n/20 NH4OH entwickelt, wobei mit diesem kein weiteres bioaktives Material eluiert wurde. Die Säule wurde dann mit n/10 NH4OH entwickelt und die Eluate wurden durch TLC versprüht mit Ninhydrin-Reagens geprüft. Entsprechende Fraktionen wurden vereinigt, im Vakuum eingeengt und lyophylisiert, wobei die folgenden Feststoffmengen erhalten wurden:

25

Bu-2183 A

Bu-2183 A2

S-l 17

Rf = 0,49

Rf = 0,57

S-122

Rf = 0,39

Rf = 0,48

Die IR- und NMR-Spektren der Komponente Bu-2183 A2 sind in Figuren 3 und 4 angeführt. Eine Zusammenstellung der NMR-Daten wird im folgenden angeführt:

35

Chemische Schicht

Kopplungskonstante relative

( 8, ppm)

(J, Hz)

Intensität

0,92 (t)

7,5

3H

1,63 (Sixtett)

7,5

2H

2,30 (t)

7,5

2H

3,1-3,50 (m)

2H

3,6-4,40 (m)

12H

5,27 (d)

3,0

1H

d = Doublett; t = Triplett;m = Multiplett.

8 Blatt Zeichnunge

Claims (4)

9 733

1. Verfahren zur Herstellung eines neuen antibiotischen smplexes Bu-2183, dadurch gekennzeichnet, dass man den NH,

eudomonas sp. Stamm D946-B83, ATCC 31086, in einem 1

issrigen Nährmedium, das assimilierbare Quellen von Stick- 5

}ff und Kohlenstoff enthält, unter submersen aeroben Bedin-

mgen bei einem pH von 4,5 bis 11,0 und bei einer Temperatur

>n 4 bis 37 °C züchtet, und dann aus dem Züchtungsmedium

:n Bu-2183-Komplex gewinnt.

2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeich- io :t, dass man bei einem pH von 5,5 bis 9,5 und einer Tempera-

r von 10 bis 32 °C züchtet.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Verwendung des laut Verfahren gemäss Patentanspruch erhaltenen Bu-2183-Komplexes zur T rennung indie einzelnen omponenten Bu-2184 A der Formel 15

ch0nh0 I 2 2 choh I

0—ch I

chnh„ I 2 choh

:3ch2conh ch0nh0 I 2 2 choh

0—ch n Bu-2183 B

CH3conh m Bu-2183 A2

î3(ch2)2conh chnh0

I 2

choh I

ch20h ch0nh0 I 2 2 choh chnh,

I *

choh

I

ch2oh

25

30

ch0nh, I 2 ' choh I

-ch I

chnh„ I 2 choh I

ch2oh ch2oh dadurch gekennzeichnet, dass man den erhaltenen Komplex Bu-2183 in einem Lösungsmittel löst, auf einem kationischen Ionenaustauschharz adsorbieren lässt, die einzelnen Komponenten von Bu-2183 aus dem Adsorbens fraktioniert eluiert und aus den einzelnen Fraktionen die gewünschten oben angeführten Komponenten Bu-2183 A, B, A2 und D gewinnt.

4. Verwendung nach Patentanspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die einzelnen Komponenten von Bu-2183 A, B, A2 und D in Form ihrer Säureadditionssalze, durch Behandlung mit Chlorwasserstoff-, Schwefel-, Phosphor-, Essig-, Stearin*, Propion-, Wein-, Malein-, Benzoe- oder Bernsteinsäure, gewinnt.