DE1442293A1 - Eine neue und nuetzliche Substanz,die antimikrobische Aktivitaet und Krankheitskontrollaktivitaeten bei einigen Pflanzenkrankheiten aufweist,und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

[ Dr. Expl. [

Dipl.-Ing. Kerl Kiekeben
Patentanwalt
Berlin 19, Kaiserdamm 28 1442293

7. Februar 1963 P.4218

Sankyo Company Limited, Tokyo (Japan).

Eine neue und nützliche Substanz, die antimikro bische Aktivität und Krankheitskontrollaktivitäten "bei einigen Pflanzenkrankheiten aufweist, und Verfahren zu ihrer Herstellung.

Die Erfindung "bezieht sich auf eine neue und nützliche Substanz, die antimikrobische Aktivität und Krankheitskontrollaktivitäten bei einigen Pflanzenkrankheiten aufweist, und auf ein Verfahren zu ihrer Herstellung, Insbesondere bezieht sie sich auf ein neues und nützliches, Ascochytin genanntes, Antibiotikum sowie auf ein Verfahren zur Herstellung dieses Antibiotikums.

Bs ist ein Zweck vorliegender Erfindung, das neue und nützliche Antibiotikum Ascochytin herzustellen. Ein weiterer Zweck vorliegender Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung dieses Antibiotikums Ascochytin durch mikrobiologische Vorgang· aufzuzeigen.

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften de» ergeben eich aus folgendem·

0ö si it/in J ·■

-2- U42293

Physikalische und chemische -Eigenschaften des Ascoohytin. .

Ascochytin ist eine schwach saure, in gelben Radeln kristallisierende Substanz und schmilzt bei 2QO -^ 201 °G unter Zersetzung. Die analytischen Daten sind die -folgenden· Berechnet für C₁₅H₁₆O,- : G»65,21%· H»5,84%; 0»28,95%« MolgeWö 276,28. Gefunden: 0-65,66%; H=5,91%; 0*28,4-3%. Molgew. 284,54 (gemessen mit Hilfe eines Osmosemessers).

Es enthält weder Stickstoff noch Halogen noch Schwefel noch Phosphor.

Der G-rad der spezifischen Drehung des Ascochytin ist ω_Β ²⁵= -85,99° (c»1 % in Chloroform),

Das sichtbare und ultraviolette Absorptionsspektrum ergibt sich aus Fig» 1.Bs hat zwei charakteristische Absorptionsmaxima bei 286 m/t und bei Λ15 mA in äthanolischer Lösung, Das infrarote Absorptionsspektrum von Ascochytin ergibt sich aus Fig. 2, Es weist charakteristische Absorptionsbanden in dem infraroten Gebiet des Spektrums auf, in einem Kalium-Bromid-Kügelchen, bei den folgenden Wellenzahlen, ausgedrückt in reziproken Zentimetern: 310Ö, 2950, 1640, 159O_s 1530, / 1460, 1410, 1340, 1250, 1200, 1160, 112Q, 1070, 1050, 1005, 960, 935 und 835.

Ascochytin ist sehr löslich in Chloroform,, mäßig löslich in Methanol, Ithanol, Aceton, Ithylacetat, Diäthylather, Benzol, Äthylenglycöl, und kaum löslich in η-Hexan und petroläther, jedoch fast"unlöslich in Wasser. Bs gibt eine stark grünliche Fluoreszenz in äthanolischer Lösung unter Ultraviolettbestrahlung. Seine gelbe Farbe in Ithanol wird entfärbt durch Hinzufügen von Magnesiumacetat, ©ines Tropfens ii-HaOH odes? Hydrosulfit. laliumpermanganat wiEu entfärbt * Bs gibt eint rote Itsenohloiddr®action in Itiianol und

reduziert lehlingsche Lösung nicht.

Der Mikroorganismus.

Das oben beschriebene neue Antibiotikum, Ascochytin, kann hergestellt werden durch Züchtung eines Mikroorganismus, genannt Ascochyta fabae Spegazzini, auf einem geeigneten Nährmediumο Die Methode zur Herstellung von Ascochytin durch mikrobiologische Vorgänge wird nachstehend beschrieben.

Der für die Herstellung des Ascochytin geeignete Mikro-Organismus, nämlich Ascochyta fabae Spegazzini, ist ein krankheitserregender Pilz der Pferdebohne (Vicia faba L), der zu den Phomaceen (Sphaerioidaceen), phomales (Sphaeropsidales), Fungi imperfect! gehört, und die Natur dieser Pilze ist im einzelnen beschrieben durch H. Xoshii, in Ann. Phytopath_o Soc Japan 17; 175 (1955) und durch K. Yoshino in Nogyosekai 1: 61, (1906).

Das Antibiotikum.

Die Herstellung des Ascochytin gemäss vorliegender Erfindung wird' ausgeführt, indem man ein steriles wäßriges Nährmedium mit Ascochyta fabae Spegazzini impft, indem man das peimpfte Medium unter aseptischen Bedingungen bei Luftzutritt bei einer Temperatur zwischen etwa 23>->«/3O 0 sich entwickeln lässt, und indem man das gewünschte Ascochytin aus der festen Substanz des Kulturgemisches und aus der wäßrigen Kulturflüssigkeit isoliert.

Zum Impfen können Sporen und/oder Myzel von Ascochyta fabae Spegazzini verwendet werden. Ein Stück Myzelium reicht für die Impf urin; aus. Bei großem Ausmaß der Fermentation ist es vorteilhaft, kräftipe ,iunp;e Kulturen des Mikroorganismus

009818/1733

zu verwenden„

Geeignete wäßrige Nährmedien haben einen pH zwischen 5 und 10, vorzugsweise zwischen 6,5^*·^ 9,0, und enthalten eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine Quelle für Stickstoff und Mineralstoffe. Als assimilierbare Kohlenstoffquelle können verwendet werden entweder reine Kohlehydrate oder handelsübliche Kohlehydratgemische. Einige Beispiele derartiger geeigneter Stoffe sind Glucose, Mannose, Lactose, Sucrose, Maltose, Xylose, lösliche Stärke und dergleichen« Die Menge der in dem Nährmedium anwesenden Kohlehydrate ist nicht besonders wesentlich und kann variieren von etwa 0*5 Gewichtsprozent bis 8 Gewichtsprozent des Gesamtgewichtes des Mediums„

Die Stickstoffquelle in dem Nährmedium kann von organi- . scher, anorganischer oder gemischt organisch-anorganischer Natur sein. Einige Beispiele aus der Vielzahl der stickstoffhaltigen Substanzen, die im Nährmedium verwendet/werden können, sind Peptone, Aminosäuren_y hydrolysiert© und unhydrolysierte Proteine, Söjabohnenmehl, die Flüssigkeit von eingeweichtem Korn, anorganische Nitrate, Harnstoff, Ammoniumsalze und dergleichen. Als*Folge der rohen Natur der meisten verfügbaren stickstoffhaltigen Substanzen variiert die Menge, die dem Nährmedium hinzuzufügen ist, etwas in Übereinstimmung mit der Reinheit. Es lässt sich o'edoch für praktische Zwecke sagen, dass stickstoffhaltige Substanzen 4- Gewichtsprozent des Gesamtgewichtes des Fermentationsmediums nicht überschreiten müssen.

Eine bestimmte Menge von Mineralsalzen und Vitaminen ist erforderlich, um eine gute Ausbeute an Ascochytin zu erhalten. Im allgemeinen ist es vorteilhaft, eine kleine Menge anorganischer Salze hinzuzufügen, wie phosphate,

009818/1733

■ ■■. .■■■,■ . -'■.:.- 5---". -

-" 5 —

Bisensalze, Kaliumsalze, Magnesiumsalz und dergleichen. Obwohl im Hinblick auf die Vitamine das Hinzufügen einer kleinen Menge von Vitamin IL, Biotin, Calciumpantothenat und dergleichen vorteilhaft ist, sind diese Stoffe für die Herstellung von Ascochytin nicht immer notwendig, weil die übrigen Rohmaterialien, die in das Nährmedium gegeben werden, eine fast ausreichende Menge dieser Substanzen enthalten.

Weil die Ausbeute an Antibiotikum, Ascochytin, merklich reduziert wird durch die Operation außerhalb des pH-Bereiches von 5»0 und 10, wurde der vorerwähnte Bereich, in vorliegender Erfindung vorzugsweise festgelegt.

Die Züchtung von Ascochyta fabae Spegazzini in dem wäßrigen Nährmedium kann in einer Reihe verschiedener Arten ausgeführt werden. Beispielsweise kann der Mikroorganismus unter Luftzutritt auf der Oberfläche des Mediums kultiviert werden, oder er kann unterhalb der Oberfläche des Mediums, also untergetaucht, kultiviert werden, wenn gleichzeitig Sauerstoff zugeführt wird.

Die bevorzugte Methode der Herstellung von Ascochytin in großem Ausmaße bedingt untergetauchte oder tiefe Kulturen ^von Ascochyta fabae Spegazzini, Gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung wird ein steriles wäßriges Nährmedium mit Ascochyta fabae Spegazzini geimpft und zur Entwicklung gebracht unter Schütteln und Belüftung bei einer Raumtemperatur zwischen 20 ^ 32 °0, vorzugsweise im Bereiche von 23-"^3O °0, bis sich, eine maximale Konzentration an Ascochytin in der Kulturflüssigkeit gebildet hat. Die Zeitdauer, die für die maximale Produktion von Ascocliytin benötigt wird, variiert mit der Groß« und mit der Art der Ausrüstung. Bei der groß~ technißchen Fermentation wird diese beispielsweise auegeführt

009818/1733 ' - 6 -

in tankartigen Gärungsbottichen, wobei die maximale Produktion des Ascochytin in etwa 4 bis 10 Tagen erreicht wird. Die Entwicklungszeit variiert mit der Entwicklungsmethode der Impfung und dergleichen» Deshalb vermindert eine längere Entwicklungszeit die Ausbeute von Ascochytin nicht plötzlich,

nicht ■

wenn/irgendwie der pH des Kulturmediums über den Bereich zwischen 5 und IG hinausgeht. Bei untergetauchten Kulturen , entwickelt sich der Mikroorganismus mehr oder weniger in diskreten Partikeln, die im ganzen Hährmedium dispergiert sind, im Gegensatz zu dem mehr oder weniger zusammenhängenden Häutchen, das sich auf der Oberfläche des Mediums bildet bei der Oberflächen-Kulturmethode. Infolge dieser Verteilung des-Organismus im Medium können große Mengen an geimpftem Nährmedium gleichzeitig in großen Behältern und Bottichen gezüchtet werden, die üblicherweise in der Gärungsindustrie verwendet werden. Stationäre Gärbottiche_? die mit passenden Schütte1- und Belüftungsvorrichtungen versehen sind, ebenso wie horizontale Drehtrommelbehälter haben sich als besonders brauchbar für diesen Zweck erwiesen, lür die Herstellung kleinerer Mengen des Antibiotikums oder von Kulturen des Mikroorganismus kann die Kulturmethode unter der Oberfläche in kleinen Kolben öder Krügen ausgeführt werden, die durch geeignete Mechanismen entweder geschüttelt oder gerührt werden.

Die Bewegung und Belüftung des Kulturgsmisch.es kann in verschiedener Weise ausgeführt werden. Die Bewegung kann hervorgerufen werden durch Turbinen_s Eüfarscheit©, !Flügelräder oa,er andere mechanische Bewsgungsirorrichtungen, durch Drehen oder Schüttelndes Bottichs- selbst, durch verschiedene pump·=» vorrichtungen oder dadurch^ dass man liuffc durch das Medium .--;■

"·. - . 000818/1733. "■■· ■ ^ ■ ■ - 7 -

-?.- ■ K42293

leitet. Die Belüftung kann erzielt werden, indem man Luft in das Fermentationsgemisch einbläst durch offene Röhren, perforierte Röhren, poröse Diffusionsmedien wie Kohlenstoffstäbe, Carborundum, gesintertes Glas und dergleichen, oder sie kann erzielt werden durch Sprühen, Spritzen oder Abfließenlassen des Breies in oder durch eine sauerstoffhaltige Atmosphäre ο

TJm die wirksame Substanz, die in dem Kulturgemisch nach Beendigung der Fermentationsphase des Prozesses enthalten ist, zu isolieren, können die üblichen bekannten Methoden für die Isolierung von wirksamen Substanzen, die in verschiedenen Fermentationsmischungen enthalten sind, bequem angewendet werden. Bei der Isolierung von Ascochytin aus den oben beschriebenen Quellen werden solche Operationen durchgeführt, wie die Konzentrierung der wirksamen Substanz, die Entfernung von Verunreinigungen und die Umwandlung in eine Zusammensetzung, die leichter gereinigt werden kann, in Übereinstimmung mit den Eigenschaften des Ascochytin«, Unterschiede in den Löslichkeiten in verschiedenen Lösungsmitteln von anderen im Kulturpemisch enthaltenen Verunreinigungen, die Verteilungskoeffizienten zwischen zwei flüssigen Schichten, die Absorptionsaffinitäten und der Dissoziationsgrad des Wasserstoffions sind die anwendbaren Methoden. Als verwirklichte Operation "bei der Anwendung dieser Mittel sind beispielsweise zu nennen Herauslösen oder Extraktion mit Lösungsmitteln und Niederschlagung aus Lösungsmitteln.

Die Methoden der Isolierung von Ascochytin durch die vorerwähnten Mittel wird im folgenden ausführlicher beschrieben. Diese ausführliche Methode ist aber nur beispielsweise zu verstehen, sie hat nicht beschränkenden Charakter.

009818/1733

Bei der Behandlung-,des- Myzelium enthaltenden flüssigen. Kultur gemische s ist es zweckmässig, die Extraktion mit Hilfe von Lösungsmitteln auszuführen, die zwar Ascochytin lösen, jedoch mit Wasser nicht mischbar sind, wie "beispielsweise Chloroform, ]p:hylacetat und dergleichen. Es ist wünschens·— wert, die Extraktion "bei einem pH zwischen 5,0 und 5»0 auszuführen, jedoch kann auch ein niedriger oder höherer pH angewendet werden.

Wenn man das feste, Myzelium enthaltende Material und das Kulturfiltrat getrennt der Isolierung unterwirft, kann Ascochytin in der flüssigen Phase von Verunreinigungen "befreit werden durch Anwendung der Unterschiede in den Verteilungskoeffizienten zwischen wäßrigen und organischen Lösungsmittelschichten in der gleichen Weise wie,oben beschrieben, und das in der festen, Myzelium enthaltenden Substanz vorhandene Antibiotikum kann mit geeigneten Lösungsmitteln extrahiert werden, die in der Lage sind, das Antibiotikum herauszulösen, wie Methanol, ethanol, Aceton, Chloroform, Essigsäureester und dergleichen„ Wenn die Myzelium enthältende oder nicht enthaltende flüssige Kultur konzentriert oder verfestigt wird durch Vakuumdestillation oder Sprühtrocknung, kann Ascochytin in der gleichen Weise, wie im vorerwähnten Falle des festes Myzelium enthaltenden Materials beschrieben ist, isoliert werden. Wenn das Ausmaß der Konzentrierung gering ist, wird die Behandlung in der gleichen Weise durchgeführt, wie oben beim Fall des flüssigen Kulturgemisches beschrieben. In einem «Losungsmittel gelöstes Ascochytin kann isoliert werden, indem man das Lösungsmittel entfernt etwa mit Hilfe der Vakuumdestillation. Andererseits kann es isoliert werden durch Ausfällung, die bewirkt wird durch

00 98 18/1733 - 9 -

Hinzufügen eines Lösungsmittels zu der Lösung, in dem es nur wenig löslich ist, wie "beispielsweise Petroläther oder Wasser. Eine andere Möglichkeit, die wirksame Substanz zu isolieren, besteht darin, die Verunreinigungen zu entfernen, indem man den Rückstand mit einem Lösungsmittel wäscht, in dem Ascochytin fast unlöslich ist, nachdem das Lösungsmittel entfernt wurde, in dem es gelöst war.

Bas so erhaltene Ascochytin ist gut kristallisiert als rohe Kristalle, wenn man es stehen lässt, -vorzugsweise bei niedriger Temperatur nach Entfernung des Lösungsmittels in einem geeigneten Ausmaß. Das rohe Ascochytin kann gereinigt werden, indem man es mit verschiedenen organischen Lösungsmitteln "behandelt. Bin Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische hierfür sind beispielsweise Methanol, Ithanol, Aceton, Benzol und dergleichen bei den Vorgängen, wie Konzentrierung, Stehenlassen und Abkühlen.

Aus den vorerwähnten Eigenschaften des Ascochytin ist es begreiflich, dass die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltene Substanz neu ist und leicht isoliert werden kann. Weiter unten werden Beispiele angegeben, wobei Vereinigungen mehrerer Isolierungsmethoden angegeben sind. Bs ergibt sich jedoch aus der obigen Beschreibung, dass das erfindungsgemäße Verfahren auch ,jeweils mit einer einzelnen Isolierungsmethode ausgeführt werden kann» Haühdem ^etat die Eigenschaften der wirksamen Substanz beschrieben sind, ist es für den faohmann

, dass das Ziel der Erfindung auch durch andere f Kodifizierte Methoden erreicht werden kann, die in der Beg&kreibuag vorliegender Erfindung nicht im einzelnen erwähnt

0ÖSi1S/1t3i "". ν ~

Biologische Eigenschaften des Ascochytin_o Die antimikrobe Wirksamkeit des Ascochytin wurde untersucht mit der zweifachen Agar-Verdünnungsmethode während einer Zeit von Λ r^A- Tagen. Das Antibiotikum wurde· in einer kleinen Menge Dimethylformamid gelöst und mit sterilem Wasser verdünnt, wobei sich schließlich ein Agar-Medium ergibt, das weniger als 1 % des Lösungsmittels enthält, was nicht schädlich auf die untersuchten Organismen wirken kann. Untersuchungen mit tierischen parasitären Bakterien wurden ausgeführt in einem BAGTp NUTRIENT AGAR (das hergestellt und vertrieben wird durch Difco Labe). Für Pflanzenkrankheiten erregende Bakterien und pilze wurde ein Eartoffel-Sücrose-Agarmedium verwendet. Hefen und Trichophytone wurden in einem SABOURAUD-Medium getestet. Die Resultate sind aus Tabelle 1 ersichtlich.

Ascochytin zeigt eine recht breite Wirksamkeit. Es ist wirksam gegen einige Pflanzenkrankheiten erregende Bakterien, Hefen und pilze.

Tabelle 1. Antimikrobe Wirksamkeit des Ascochytin»

TestOrganismus

Minimale inhibierende Konzentrat ion (mc g · /ml«)

Bakterien

Bacillus subtilis Ötaphylococus aureus 209 Sarcina lutea
Ischericliia coli Pseudomona© aeruginosa Xantliomonas oryzae · Bacterium pruni
aroideae

Hefen

y
altäicanß

>100

>100

>100

100

>100 >1OO

100

SO

11

Piricularia oryzae 1»5

Glomerella cingulata 3

Cochliobolus miyabeanus 100

Alternaria kikutiana 50

Gloeosporium kaki 12,5

Gloeosporium" laeticolor 50

Gibberella saubinetii 12 ,5

Gibberella fujikuroi >1OO

Ifusarium nivemim >1OO

Ifusarium lycopersici >100

lusarium lini 100

Aspergillus niger >1OO

Asperglllus oryzae 100

Penicillium.digitatum 25

Penicilli-um italicum 50

Trichophyton iiitercLigitale 50

Trichopliytoii rubrum 50

Trichophyton asteroides 50

Ascoehytin besitzt kräftige hemmende Wirkungen gegenüber der Sporenkeinmng einiger Pflanzenkrankheiten erregender Pilze. Dies wurde wie folgt geprüft.-Ein Tropfen einer Sporensuspension mit einer bestimmten Konzentration an Ascoehytin wurde auf ein Glas gebracht und in einem feuchten Eaum bei 27 0 gehaltene Nach einer angemessenen Inkubationszeit (3 Stunden für Cochliobolus miyabeanus und 16 Stunden für Piricularia oryzae) wurden die Sporen durch Hinzufügen eines Tropfens I/ugöl-Lösung abgetötet, und der Prozentsatz der gekeimten Sporen unter dem Mikroskop bestimmt.

Das Ergebnis ist aus Tabelle 2 ersichtlich.

Tabelle 2«, Hemmung der Sporehkeimung bei einigen Pflanzenkrankheiten erregenden Pilzen durch Ascoehytin.

	% der	Keimung
Konzentration von	piricuiaria oryzae	Oochliobolus miyabeanus
Ascoehytin (meg./ml«)

100 0

50 0

25 0

12 0 3,9

6 0 52,2

3 10,8 68,7

1,5 39,3 92,8

0,8 75»9 98,2

0 96,2 99,6

Wie sich aus obiger Tabelle ergibt, verhindert Aseochytin die Sporenkeimung völlig bei' pirlcularia oryzae bei einer Konzentration von 6 ppm. und bei Cochllobolus miyabeanus bei einer Konzentration von 25 ppm.

Aseochytin hat sich als eine wertvolle Substanz bei der Beherrschung einiger Pflanzenkrankheiten erwiesen.

Die schützende Wirksamkeit des Ascoehytin gegen die Brusone-Krankheit (braune Fleckenkrankheit - "blast disease") von Reispflanzen (Oryza Sativa I₁₀) wurde durch folgende Untersuchungen festgestellt. Die Jungen Sämlinge der Reispflanzen (in der Art Shigaasahi No„27)» welche in kleinen Topfen etwa 4- Wochen gewachsen sind, wurden besprüht mit 10 ml einer wäßrigen Suspension eines benetzbaren Pulvers von Aseochytin pro Topf. Die Ascochytin-Konzentration der versprühten Lösung betrug 1000 ppm. Nach dem Trocknen wurden die Testpflanzen geimpft mit einer conidialen Suspension des Brusone-Piizes, Piricularia oryzae cav., und dann in einem feuchten Raum (97 % relative Feuchtigkeit) bei 25 ⁰C 4-8 Stunden aufbewahrt. Unbehandelte Pflanzen wurden zur Kontrolle ebenso geimpft. Die beimpften Pflanzen wurden dann in ein Gewächshaus gestellt. Drei Tage nach der Beimpfung wurde der Krankheitsgrad bei den behandelten und den Kontroll-Pflanzen bestimmt als Prozentsatz der erkrankten Blätter.

Tabelle 3« Schutzwirkung von Aseochytin gegenüber der Brusone-Krankheit bei Reispflanzen.

Behandlung Gesamtanzahl Anzahl der Prozentsatz

der untersuch- erkrankten der erkrankten ten Blätter Blätter Blätter

Aseochytin 100Ö ppm* 62 16 26

Keine Behandlung &a
(Kontrolle)

009818/1733

Wie sich aus Tabelle 3 ergibt, war die Empfindlichkeit der Reispflanzen gegenüber der Brusone-Krankheit merklich vermindert durch die Behandlung mit Ascochytin in einer Konzentration von 1000 ppm.

Die Schutzwirkung des Ascochytin gegenüber der Krautfäule ("late blight disease") der Tomate wurde auf zwei Arten -geprüft, nämlich mit Hilfe der Methode der abgelösten Blätter und durch Impftest im Gewächshaus„

Die Methode abgelöster Blätter wurde wie folgt ausgeführt: Eine Suspension von benetzbarem Ascochytin-Pulver wurde auf frisch geschnittene Tomatenblätter aufgesprüht. Der Gehalt des Ascochytin in der aufgesprühten Lösung betrug 1000 ppm, Nach dem Trocknen wurden die behandelten Blätter in eine 15 cm-Petrischale getan und mit einem Tropfen Sporensuspension des Krautfäulepilzes (Phytophthora infestaus DeBary) geimpft. Dann wurden die geimpften Blätter in einem kontrollierten Eaum von 20. ⁰G bei 100 % relativer Feuchtigkeit aufbewahrt. Als Kontrolle wurden unbehandelte Blätter gleichzeitig geimpft. Fünf Tage danach wurde der Erkrankungsgrad der geschnittenen Blätter bestimmt. Der Erkrankungsgrad wurde wie folgt geschätzt: Die Symptome der Tomatenblätter wurden eingeteilt in 6 Grade entsprechend der Größe der Schäden, beispielsweise wurde ein gesundes Blatt gekennzeichnet mit 0, ...... und der größte Schaden mit 5· Die Wirkung der Ascochytin-Behandlung wurde ausgedrückt als Prozentsatz an Totalschäden bei den behandelten Blättern gegenüber den unbehandelten Blättern.

Tabelle 4» Schutzwtrkunff des Ascochytin gegen Krautfättlekrankfaeit bei Tomaten, geprüft mit Hilfe der Methode abgelöster Blätter.

009818/1733

-14 -

Behandlung Krankheitsindex

Ascochytin 1000 ppm. - 35,6

Keine Behandlung . _Λ (Kontrolle) ' ^lü0

Gemäß den in Tabelle 4 angeführten Ergebnissen weist Ascochytin eine gute Schutzwirkung gegen die Krankheit der Krautfäule der Tomate auf. :

Der Impftest'hei Krautfäule von Tomaten im Gewächshaus wurde wie folgt ausgeführt:

Tomatensämlinge (in der Art Shinfukuju.), die im Gewächshaus einen Monat gewachsen waren, wurden besprüht mit der Suspension von benetzbarem Ascochytin-Palver, die 1000 ppm« Ascochytin enthält. Fach 24- Stunden wurden die behandelten^ und die unbehandelten Tomatensämlinge geimpft mit einer Sporensuspension des Krautfäulepilzes der Tomate und 24- Stunden in einem feuchten Raum bei 2O/-^ 23 ⁰O aufbewahrt, und dann wurden sie in das Gewächshaus gebracht. Das beobachtungsergebnis 3 Tage nach der Impfung ist aus Tabelle 5 zu ersehen. Die Methode der Schadenseinstufung ist die gleiche wie bei dem oben beschriebenen Test der abgelösten Blätter.

Tabelle 5» Schutzwirkung des Ascochytin gegen die Krankheit der Krautfaule bei Tomaten, untersucht durch Testimpfung im Gewächshaus ο , _: .

Behandlung Gesamtzahl der Durchschnitt des Er

be obachte-t en krankungsindex Blätter pro Blatt

ApoocEytin 1000 ppm* 136 2»02

Keine Btoöndluiig ιολ h. ni

(Kontrolle) i^u ^^Ul

1171733 " ¹⁵ "

TJnbehandelte Tomatensämlinge waren 5 Tage nach der Impfung völlig abgestorben, während die mit Ascochytin behandelten Tomaten noch am Leben waren.

Aus den Ergebnissen der vorerwähnten Versuche wurde gefunden, dass Ascochytin ein sehr wirksamer Schutzstoff für landwirtschaftliche Verwendung nicht nur gegen die Brusone-Krankheit von Reispflanzen sondern auch gegen die Krautfäule der Tomate ist. Bei obigen Versuchen konnte keine Giftigkeit gegenüber den Pflanzen beobachtet werden.

Das Ascochytin kann'in geeigneten Formen verwendet werden, beispielsweise als pulveriges Gemisch mit inaktiven pulverigen Zusätzen, als emulgierbare Lösung mit organischen Lösungsmitteln und verträglichen oberflächenaktiven Stoffen, als benetzbares Pulver mit inerten Verdünnungsmitteln und passenden oberflächenaktiven Stoffen, und als Granulat mit inaktiven Zusätzen und mit geringer Menge Wasser. In diesen Fällen kann Ascochytin bequem in Konzentrationen zwischen 0,1 und 10 Prozent der Präparate verwendet werden. Das Ascochytin kann, falls gewünscht, in Verbindung mit anderen öntimikroben oder pflanzenchemotherapeutischen Mitteln verwendet werden.

Die folgenden Beispiele beziehen sich auf geeignete Methoden für die Herstellung, Reinigung und Fraktionierung des Ascochytin.

Beispiel 1

100 ml-Portionen eines Mediums mit 2 g Glucose, 0,5 S pepton, 0,1 ρ zweibasisches Kaliumphosphat, 0,05 S Kaliumchlorid, 0,05 p; Magnesiumsulfat, 0,001 ?, Eisensulfat, 0,3 mp; Thiamin, 0,1 mft Vitamin B,-, 0,1 mg Vitamin B^

0 0 9 8 18/1733

ö»3 J^ Biotin weiden jeWe 13-? in einhundert 500 al-Schüttelfeimentationöf laschen in der üblichen Weise getan* Nach. Sterilisierung wird eine Brts· l|y^elium von Ascochyta fabae Spegazzini, der auf jCartoffel-Sucrose-Agar gezüchtet wurde, hinzugefügt, und die geimpften Flaschen werden unter Schütteln 8 Tage hei 26 ⁰G bebrütet. Die Produktion von Ascochytin in der Brühe liegt dann zwischen 20 und 40/Vml· ^l Bife Kulturen werden vereinigt j und das lörzelium wird durch Filtration abgetrennt» Bas nasse l^zelium wiegt 500 g und wird der Extraktion mit 2,5 kg Aceton unterworfen* Bas lösungsmittel wird im Vakuum abdestilliert, und das verbleibende angereicherte Wasser mit Chloroform eattrahiört. Biese Chloroformlösung wird in der gleichen Weise behandelt wie der Ghloroformextrakt, der aus dem Kulturfiltrat hergestellt wurde,

Bas Kulturfiltrat mit einem Volumen von 7,5- 1 Wird ange·^ säuert mit n-HGl auf einen pH 3/^ 4 und extrahiert mit 1/5 des Volumens an Chloroform, Ber Extrakt wird konzentriert, wobei sich eine zähe braune Substanz ergibt* Biese Substanz wird in heißem η-Hexan durch wiederholte Extraktionen gelöst, und dann das Hexan unter vermindertem Brück abdestilliert.

Bie verbleibende gelbe feste Substanz wird aus heißem

■".·■;.-"■'■ . . /Üm~ -" -.'■,. - ■"■-■■ ethanol kristallisiert. Bie'jspistallisation aus Xthanol, Benzol oder Aceton ergibt eine lichtgelbe, feinnadlige oder plättehenartige Substanz· Bas so erhaltene reine Ascoc wiegt 35ö mg.

■■■'tv. ['::■ Beispiel 2 ' ;'. \ -' -.-:-''.-v- ; ; .-300 If lüssiger NShrlösung, enthaltend 2% Glucose, 0,25 % Pepton, 0,2 % zweibasisches Kaliumphosphat, 0,05

0098 18M733 - Λ? -

-V-

Kaliumchlorid, 0,1 % Magnesiumsulf at und 0,001 % Bisensulfat werden in einen 600 1-ferment at ionstank gegeben. Das Medium wird unter Druck auf übliche Weise sterilisiert und geimpft mit 3 1 Schüttelkultur von Ascochyta fabae Spegazzini (gezüchtet "bei 26 ⁰O in 4 Tagen)» Das geimpfte Medium wird bebrütet bei 26 ° ± 1 ⁰O unter Belüftung mit 300 1 pro Minute und bewegt mit 250 Umdrehungen pro.Minute, Nach 146 Stunden Bebrütung werden erhalten 280 1 KuIturflüssIgkeit (einschließlich Myzelium), die 40V /ecm Ascochytin enthalten.

Beispiel 3

280 1 flüssiger Kultur von Ascochyta fabae Spegazzini (die 11,2 g Ascochytin enthalten), die in derselben Weise wie in Beispiel 2 erhalten wurden, werden zum pH Ton 3,4 mit Salzsäure angesäuert, und zu der angesäuerten Flüssigkeit werden 140 1 Chloroform gegeben. Das Gemisch wird bewegt und mit Hilfe einer Zentrifuge in 3 (Beile unterteilt, nämlich Ablauge, Myzelium und Chloroformschicht, Die Ablauge und das Myzelium werden wegen ihres sehr geringen Gehaltes an Ascochytin verworfen. Der Ohloroformextrakt wird im Vakuum konzentriert, wobei sich eine gummiartige Masse ergibt« Diese zäh© Substanz wird in heißem n-Hexao. gelöst durch wiederholte Extraktionen, bis der Extrakt farblos bleibt. Die lösung wird im Vakuum konzentriert und ergibt eine, gelbe feste Substanz. Diese Festsubstanz wird in 500 ml heißem Äthanol gelöst und über Nacht in einem Kühlschrank stehen gelassen, und die gebildeten gelben Kristalle werden abgetrennt und getrocknet, wobei man 9j5 g rohes Ascochytin mit 85 % Reinheit erhält· ■ ' _t

00 9818/1731 - 18 -

Beispiel 4- / "*

280 1 der flüssigen Kultur, die in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 erhalten wurde, wird auf einen pH von 3,4-mit Salzsäure eingestellt und 14-01 Chloroform werden zu der angesäuerten- llüssigkeit gegeben. Nachdem die Mischung heftig bewegt worden ist/, wird die Chloroforiaschicht durch Zentrifugieren abgetrennt und im Vakuum auf etwa 3 1 konzentriert _o Die konzentrierte Lösung wird durch eine Säule mit zweit as 1-schem Galciumphosphat gegebene Die schwarzen Verunreinigungen, werden im oberen Φ eil der Säule adsorbiert, und Ascochytin wird im Abfließenden erhalten. Die Säule wird weiter mit Chloroform gewaschen, bis sich,ein farbloser Abfluß ergibt. Das so erhaltene Eluat wird im Vakuum zur trockne gebracht und die xasDäxsüÜi verbleibende feste Substanz wird aus üthanol kristallisiert. Das,rohe Ascoehytin, welches in dieser Weise erhalten wird, beträgt 9,3 g (Reinheit 85 %). 5g des rohen Ascochytin werden in2OQ ml siedendem JLthanol gelöst. Die unlöslichen Stoffe werden abfiltriert, und das Piltrat wird im Kühlschrank über Nacht stehen gelassen* Die erhaltenen Kristalle werden abgetrennt und dreimal in der oben beschriebenen Weise umkristallisiert» Die so erhaltenen reinen

-Ascochytin-Kristalle wiegen 2,5g, sie bilden liehtgelbe feine ,^

Nadeln und sehmelziert bei 20Ο^ν201 ⁰G unter Zersetzung,

Patent ansprüche;

9StS/t733

Claims (1)

Patentansprii eh. e j

1. AsQochytin, eine schwach saure, in lichtgelben Radeln kristallisierende Substanz, die die Elemente Kohlenetoff, Wasserstoff und Sauerstoff enthält, die gut löslich in. Chloroform, mäßig löslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Äthylacetat, Diäthyläther, Benzol und Jtthylenglycol, schwach löslich in η-Hexan und Petroläther und fast unlöslich in Wasser ist, die eine stark grünliche fluoreszenz in Lösung unter Ultraviolettbestrahlung ergibt,, die eine rote Eisenchloridreaktion in Äthanol gibt, die Kaliumpermanganat entfärbt, einen negativen Fehlingschen Test ergibt, die durch Magnesiumacetat, Natrlumhydroxyd und Hydrosulfit entfärbt wird, die bei einer Temperatur im Bereiche von 200^201 unter Zersetzung schmilzt, deren Srad der spezifischen Drehung (oCjj^⁵« -85,99 ° (1 % in Chloroform) beträgt, deren analytische Daten sind: 0·65,66#·, H»5»91%? 0-28,4-3#j die ein sichtbares und ultraviolettes Absorptionsspektrum in äthanolischer Lösung hat, das zwei Maxima bei 415 und 286 m/t aufweist, und die charakteristische Absorptionsbanden im infraroten Gebiet des Spektrums in Kalium-Bromid-Kügelchen tilgt bei den folgenden We 11 anzahlen, ausgedrückt in reeiproken Zentt·. aeljernt 5100, 2950, 1640 1590, 1530, 1460, 1410 1340, 1250, 1200, 1160, 1120, 10?0, 1050, 1005, 960, 935 und β$5·

2, Verfahren zur Herstellung von Ascochytin, dadurch gekennzeichnet, das« man Aecochjrta fabae ßpegnzBini bei Luftzutritt bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 32 ⁰O in einen wäßrigen Nährmedium züchtet, das einen pH zwischen 5 und 10 hat, eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und Mineralstoffe enthält, und dass man das so hergestellte Ascochytin aus dem Medium gewinnt.

009818/1733