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Verfahren zur Gewinnung von Tetracyclin
Die vorliegende Erfindung betrifft die Gewinnung eines neuen therapeutisch wertvollen Antibioticum mit breitem Wirkungsspektrum, das als Tetracyclin bezeichnet wird, aus Kulturen von Streptomyces aureofaciens oder seiner Chlortetracyclin erzeugenden Mutanten oder Varianten.
Es wurde gefunden, dass bei der Durchführung des Verfahrens vorliegender Erfindung unter geeigneten Bedingungen vorwiegend eine antibiotisch wirksame Substanz in hoher Konzentration gebildet wird, welche die Bruttoformel CHNzO : und folgende Strukturformel
EMI1.1
EMI1.2
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Da Tetracyclin nur aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff besteht, kann es von bisher bekannten Antibioticis, insbesondere von Chlortetracyclin, leicht unterschieden werden. Die
Eigenschaften von kristallisiertem Tetracyclin hängen in gewissem Masse vom Reinheitsgrad und dem
Verfahren, nach welchem die Kristalle gewonnen wurden, ab. Beim Fällen aus wasserhaltigen Lösungen fällt die freie Base als Trihydrat aus, das durch Trocknen in die wasserfreie Base übergeführt werden kann, die jedoch recht hygroskopisch ist.
Aus einer Methanol-Wasser-Lösung kristallisiert Tetracyclin bei Zimmertemperatur als Trihydrat.
Eine kristalline Phase des Trihydrats besteht aus gelb gefärbten, annähernd tafelförmigen Kristallen. Die
Brechungsindices betragen : α =1, 530 i 0, 003, B = 1, 646 0, 003, y = 1, 798 ¯0, 003. Der optische Winkel 2V beträgt 80-85 . Die optische Drehung von sehr reiner kristallisierter freier Tetracyclinbase
EMI2.1
Tetracyclin ist löslich in Methanol und Äthylenglykolmonoäthyläther (etwa 200 mg/ml), wenig löslich in Äthanol und n-Butanol, gering löslich in Wasser und nahezu unlöslich in Äther, Benzol und
Petroläther. Tetracyclin-hydrochlorid ist in Wasser zu 100-200 mg/ml löslich, ziemlich löslich in Methanol und Äthanol und schwach löslich in Äthylenglykolmonoäthyläther und n-Butanol. Das Hydro- chlorid ist ziemlich unlöslich in andern üblichen organischen Lösungsmitteln.
Das Calciumsalz des
Tetracyclins ist in Wasser zu ungefähr 890 γ/ml bei PH 8,55 und das Magnesiumsalz zu ungefähr
1000 y/ml bei PH 7, 0 löslich. In der folgenden Tabelle I sind die annähernden Löslichkeiten von
Tetracyclin-trihydrat von sehr grosser Reinheit in verschiedenen Lösungsmitteln angeführt.
Tabelle I
EMI2.2
<tb>
<tb> Lösungsmittel <SEP> Löslichkeit <SEP> in <SEP> 100 <SEP> ml
<tb> Methanol <SEP> wenigstens <SEP> 3 <SEP> g
<tb> Äthylacetat <SEP> 25 <SEP> mg
<tb> Chloroform <SEP> 20 <SEP> mg
<tb> Wasser <SEP> weniger <SEP> als <SEP> 10 <SEP> mg
<tb> Benzol <SEP> weniger <SEP> als <SEP> 10 <SEP> mg
<tb> Diäthyläther <SEP> weniger <SEP> als <SEP> 10 <SEP> mg
<tb>
Der Schmelzpunkt von wasserfreiem kristallisiertem Tetracyclin hängt nicht nur vom Reinheitsgrad, sondern auch von der Methode der Schmelzpunktsbestimmung ab. Kristalle von sehr reiner wasserfreier
EMI2.3
Behandlung ähnliche Resultate.
Das Infrarotspektrum einer Suspension der freien, wasserfreien Tetracyclinbase in Paraffinöl zeigt charakteristische Maxima bei 3300 - 3400 cm-l, nahe bei 1655 cm'\ bei 1613 crn-l, nahe bei 1580 cm-l sowie nahe bei 703,722, 785,862, 950,1178 und 1228 cm-l und lässt erkennen, dass es dem Chlortetracyclin nahesteht, doch können diese beiden Verbindungen mittels ihrer Absorptionsspektren leicht unterschieden werden.
Das U. V.-Absorptionsspektrum der freien Tetracyclinbase zeigt folgende Maxima und Minima :
Freie Base
EMI2.4
<tb>
<tb> E1 <SEP> cm <SEP> 1% <SEP> bei <SEP> 235 <SEP> m <SEP> = <SEP> 188
<tb> E1 <SEP> cm <SEP> 1% <SEP> bei <SEP> 269 <SEP> m <SEP> = <SEP> 271
<tb> E1 <SEP> cm <SEP> 1% <SEP> bei <SEP> 298,5 <SEP> m <SEP> = <SEP> 128
<tb> E1 <SEP> cm <SEP> 1% <SEP> bei <SEP> 365 <SEP> m <SEP> = <SEP> 272
<tb>
EMI2.5
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EMI3.1
EMI3.2
<tb>
<tb> 00è'Vo <SEP> bei <SEP> 234 <SEP> mp <SEP> = <SEP> 179 <SEP>
<tb> 1 <SEP> cm
<tb> E1'Vo <SEP> bei270mu <SEP> =301 <SEP>
<tb> 1cm
<tb> E1'Vo <SEP> bei <SEP> 298,
5 <SEP> mu <SEP> = <SEP> 131
<tb> 1 <SEP> cm
<tb> E <SEP> 1% <SEP> bei <SEP> 363 <SEP> mp <SEP> = <SEP> 274
<tb> 1 <SEP> cm
<tb>
EMI3.3
EMI3.4
<tb>
<tb> Test-Organismus <SEP> A <SEP> B <SEP> C <SEP> D
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> PCl <SEP> 209-P <SEP> 0, <SEP> 292 <SEP> 6,25 <SEP> 0, <SEP> 39 <SEP> 0, <SEP> 58
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> PCI <SEP> 1248-A <SEP> 0, <SEP> 39 <SEP> 6,25 <SEP> 0, <SEP> 78 <SEP> 0, <SEP> 78
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> ATCC <SEP> 8668 <SEP> 0, <SEP> 29 <SEP> 1, <SEP> 17 <SEP> 0, <SEP> 24 <SEP> 0, <SEP> 24
<tb> Streptococcus <SEP> mitis <SEP> ATCC <SEP> 6249 <SEP> 0,147 <SEP> 2,34 <SEP> 0,147 <SEP> 0,292
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> ATCC <SEP> 7080 <SEP> 0, <SEP> 39 <SEP> 6,25 <SEP> 0, <SEP> 78 <SEP> 1,95
<tb> Micrococcus <SEP> flavus <SEP> PCI <SEP> 16 <SEP> 0, <SEP> 292 <SEP> 1,56 <SEP> 0,
<SEP> 39 <SEP> 0, <SEP> 39
<tb> DiplococcuspneumoniaeATCC6301 <SEP> 0, <SEP> 098 <SEP> 2,34 <SEP> 0, <SEP> 147 <SEP> 0, <SEP> 292
<tb> SarcinaluteaATCC9341 <SEP> 0, <SEP> 147 <SEP> 1,56 <SEP> 0, <SEP> 39 <SEP> 0, <SEP> 39
<tb> Bacillus <SEP> subtillis <SEP> ATCC <SEP> 6633 <SEP> 0,195 <SEP> 6,25 <SEP> 0,39 <SEP> 0,39
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> ATCC <SEP> 9637 <SEP> 1,45 <SEP> 12,5 <SEP> 1,17 <SEP> 1,17
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> PCI <SEP> 602 <SEP> 0, <SEP> 29 <SEP> 1, <SEP> 17 <SEP> 0, <SEP> 58 <SEP> 0, <SEP> 58
<tb>
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EMI4.1
<tb>
<tb> Test-Organismus <SEP> A <SEP> B <SEP> C <SEP> D
<tb> Aerobacter <SEP> aerogenes <SEP> ATCC <SEP> 8508 <SEP> 1, <SEP> 17 <SEP> 3, <SEP> 12 <SEP> 2, <SEP> 34 <SEP> 1, <SEP> 56 <SEP>
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> ATCC <SEP> 6380 <SEP> 4, <SEP> 6 <SEP> 3, <SEP> 12 <SEP> 3, <SEP> 9 <SEP> 3,
<SEP> 12 <SEP>
<tb> Pseudomonas <SEP> aeroginosa <SEP> ATCC <SEP> 9027 <SEP> 25, <SEP> 0 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> 25. <SEP> 0 <SEP> 14, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Salmonella <SEP> schottmulleri <SEP> 3, <SEP> 12 <SEP> 3, <SEP> 12 <SEP> 2, <SEP> 34 <SEP> 3, <SEP> 12 <SEP>
<tb> Salmonella <SEP> typhosa <SEP> 1, <SEP> 17 <SEP> 4, <SEP> 6 <SEP> 2, <SEP> 34 <SEP> 1, <SEP> 56 <SEP>
<tb> Brucellabionchiseptica <SEP> ATCC <SEP> 4617 <SEP> 0, <SEP> 292 <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP> 0. <SEP> 78 <SEP> 1, <SEP> 17 <SEP>
<tb> Mycobacterium <SEP> tuberculosis <SEP> ATCC <SEP> 607 <SEP> 0, <SEP> 147 <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP> 0, <SEP> 195 <SEP> 0, <SEP> 29 <SEP>
<tb> Mycobacteriurn <SEP> friedmanü <SEP> A <SEP> TCC <SEP> 14 <SEP> 0.
<SEP> 122 <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP> 0, <SEP> 24 <SEP> 0, <SEP> 292 <SEP>
<tb> Mycobacterium <SEP> smegmatis <SEP> ATCC <SEP> 361 <SEP> 0, <SEP> 073 <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 147 <SEP> 0, <SEP> 292 <SEP>
<tb> Mycobacterium <SEP> smegmatis <SEP> ATCC <SEP> 10143 <SEP> 0, <SEP> 073 <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP> 0, <SEP> 147 <SEP> 0, <SEP> 122 <SEP>
<tb> Mycobacterium <SEP> sp.
<SEP> ATCC <SEP> 9820 <SEP> 0, <SEP> 58 <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP> 0, <SEP> 58 <SEP> 2, <SEP> 34 <SEP>
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> ATCC <SEP> 10231 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100
<tb> A <SEP> = <SEP> Chlortetracyclin-hydrochlorid
<tb> B <SEP> = <SEP> Chloramphenicol
<tb> C <SEP> = <SEP> Tetracyclin-trihydrat
<tb> D <SEP> = <SEP> Oxytetracyclin-hydrochlorid
<tb> PCI <SEP> = <SEP> Penicillin <SEP> control <SEP> Immunology
<tb> ATCC <SEP> = <SEP> American <SEP> type <SEP> culture <SEP> control
<tb>
In Tabelle III sind die Kulturcharakteristika von zwei Isolaten von Stämmen des Streptomyces aureofaciens, die bei der Gewinnung von Tetracyclin verwendet wurden, angegeben. Sie entsprechen vollständig den-Eigenschaften der bekannten Stämme von Streptomyces aureofaciens.
Tabelle III
EMI4.2
<tb>
<tb> Glucose-Bouillon <SEP> gelbliches, <SEP> am <SEP> Boden <SEP> abgesetztes <SEP> Wachstum, <SEP> saure <SEP> Reaktion
<tb> Laktose-Bouillon <SEP> gelbliches, <SEP> am <SEP> Boden <SEP> abgesetztes <SEP> Wachstum, <SEP> keine <SEP> saure <SEP> Reaktion
<tb> Glycerin-Bouillon <SEP> gelbliches, <SEP> am <SEP> Boden <SEP> abgesetztes <SEP> Wachstum, <SEP> keine <SEP> saure <SEP> Reaktion
<tb> Saccharose-Bouillon <SEP> gelbliches, <SEP> am <SEP> Boden <SEP> abgesetztes <SEP> Wachstum, <SEP> saure <SEP> Reaktion
<tb> Lackmus-Milch <SEP> Oberflächenwachstum, <SEP> leichtes <SEP> Aufhellen, <SEP> keine <SEP> Änderung <SEP> im <SEP> pH-Wert
<tb> Gelatine <SEP> gutes <SEP> Wachstum <SEP> an <SEP> der <SEP> Oberfläche, <SEP> keine <SEP> Verflüssigung, <SEP> gelbes <SEP> Pigment
<tb> Asparagin-Fleisch-schwaches <SEP> gelbes <SEP> Pigment,
<SEP> gutes <SEP> Wachstum,
<tb> extrakt-Agar <SEP> Lufthyphen <SEP> weiss, <SEP> grau <SEP> werdend
<tb> Czapek-Dox-Agar <SEP> schwaches <SEP> Wachstum, <SEP> flaches, <SEP> farbloses <SEP> Mycel,
<tb> keine <SEP> Lufthyphen, <SEP> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment
<tb> Emerson-Agar <SEP> starkes <SEP> Wachstum, <SEP> bräunliches <SEP> Mycel, <SEP> keine <SEP> Lufthyphen,
<tb> Rückseite <SEP> bräunlich, <SEP> schwach <SEP> lösliches <SEP> braunes <SEP> Pigment
<tb> Nähr-Glukose-Agar <SEP> wie <SEP> unter <SEP> Emerson-Agar
<tb> Glycerin-Asparagin-starkes <SEP> Wachstum, <SEP> weisse <SEP> Lufthyphen, <SEP> grauwerdend,
<tb> Agar <SEP> Rückseite <SEP> grünlich-gelb, <SEP> schwach <SEP> lösliches <SEP> gelbes <SEP> Pigment
<tb> Stärke-Agar <SEP> flaches, <SEP> farbloses <SEP> Mycel, <SEP> keine <SEP> Lufthyphen,
<tb> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment,
<SEP> Hydrolyse
<tb> Calciummalat-Agar <SEP> starkes <SEP> Wachstum, <SEP> Lufthyphen, <SEP> weiss, <SEP> grauwerdend, <SEP> bräunliches <SEP> Pigment
<tb>
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Bei der Durchführung der Erfindung werden solche Stämme bzw. Varianten oder Mutanten von
Streptomyces aureofaciens bevorzugt, die bei der Fermentation verhältnismässig hohe Ausbeuten, vor- zugsweise mehr als 500 Mikrogramm/ml, Tetracyclin liefern, z. B. der Stamm UV-8, der bei der
Züchtung auf Waksman-Agar (J. Bacteriol. 7 [1952], S. 339-341) ein starkes Mycelwachstum zeigt, das zuerst weisslich ist, gelb wird und sich allmählich mit einem pulverigen Luftmycel überzieht, das später Sporen bildet. Alte Schrägkulturen zeigen eine jet-schwarze Färbung mit kleinen Flecken von weissem Mycel.
Diese schwarze Wachstumsform, die bisher bei Kulturen von Streptomyces aureofaciens noch nicht beobachtet wurde und kein Charakteristikum der Species darstellt, besteht aus einer Masse von ovalen bis kugelförmigen Individuen von 0, 5 bis 4, 5 u in kurzen Ketten, die leicht auseinanderbrechen. Sie sind im Durchschnitt etwas grösser als die von Streptomyces aureofaciens NRRL-2209 und ausserdem bestehen mehr Variationen hinsichtlich Grösse und Form.
Sowohl natürliche als auch induzierte Mutanten von Streptomyces aureofaciens können, zusätzlich zu andern Antibiotics, Tetracyclin in wechselnden Mengen produzieren. Durch Wahl von natürlichen oder induzierten Mutanten, die eine verhältnismässig günstige Produktion von Tetracyclin bewirken, und durch Züchtung unter gesteuerten Kulturbedingungen kann eine verhältnismässig hohe Ausbeute an Tetracyclin erhalten werden.
Die Klassifizierung von Mikroorganismen ist oft sehr schwierig, so dass verschiedene Mycologen mitunter zu verschiedenen Klassifizierungen für ein und denselben Mikroorganismus gelangen können.
Das Aussehen von Streptomyces aureofaciens kann unter verschiedenen Bedingungen weitgehend verschieden sein. Morphologisch nicht unterscheidbare Stämme von Streptomyces aureofaciens variieren sehr stark hinsichtlich ihrer Tetracyclin-und Chlortetracyclinbildung und hinsichtlich des Verhältnisses zwischen diesen beiden Substanzen.
Tetracyclin wurde durch Züchtung vieler natürlicher Isolate von Streptomyces aureofaciens erzeugt.
Das allgemeine Aussehen und die ins einzelne gehende Prüfung dieser Isolate variieren beträchtlich.
Varianten bzw. natürliche und induzierte Mutanten zeigen Wachstumsfarben in verschiedenen Schattierungen von rot, orange, gelb, grün, braun und grau ; besonders verschiedene Wachstumsformen findet man bei der Kultur in flüssigen Medien im Schüttelkolben, von fadenförmigen bis kurzen Hyphenelementen mit einem pastösen, hefeartigen Aussehen. Die Mutanten sind hinsichtlich Lebenskraft und Wachstumsgeschwindigkeit oft sehr verschieden, so dass das maximale Wachstum in submersen Kulturen sich über einen Zeitraum von etwa einem Tag bis über eine Woche erstrecken kann. Die Wachstumsgeschwindigkeit steigt nicht unbedingt mit der Erzeugung des Antibioticum.
Zweckmässig erfolgt die Kultur im Submersverfahren unter Belüftung und Bewegung, beispielsweise in einem Kolben auf einer Schüttelmaschine oder in einem Fermenter, der mit Rührer und einer Vorrichtung zur kontinuierlichen Durchleitung eines sterilen Luftstromes ausgestattet ist. Die Temperatur scheint innerhalb eines Bereiches von 25 bis 350 C nicht kritisch zu sein, obwohl der Bereich von 30 bis 330 C vorzuziehen ist. Das ursprüngliche PH des Nährmediums soll vorzugsweise nahezu neutral sein, obwohl bei ursprünglichen pH-Werten von 3,5 bis 7,5 noch brauchbare Ergebnisse erzielt werden können.
Ein für die Gewinnung von Tetracyclin geeignetes Fermentationsmedium enthält Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff, anorganische Salze und die üblichen Spurenelemente sowie üblicherweise Puffer.
Die Kohlenstoffquelle besteht entweder aus einem löslichen Kohlehydrat wie Saccharose oder einem unlöslichen Kohlehydrat wie Stärke, beispielsweise Maisstärke. Auch Dextrin kann verwendet werden, während Laktose und Glukose trotz ihrer Löslichkeit verhältnismässig schlecht geeignet sind. Die Menge der Kohlenstoffquelle kann in weiten Grenzen von etwa 0,5 bis 10,0 Gew.-'o des Gesamtgewichtes des Fermentationsmediums variieren.
Als Quelle für assimilierbaren Stickstoff eignen sich sowohl anorganische Ammoniumsalze, z. B.
Ammoniumsulfat,-phosphat usw., als auch organische Stickstoffquellen, beispielsweise Aminosäuren und verschiedene eiweisshaltige natürliche Materialien.
Weiters kommen als anorganische Salze Phosphate, entweder Ammoniumphosphat oder ein Metallphosphat, z. B. Kaliumphosphat, ferner Magnesiumsulfat und, wenn dieses nicht schon als Kaliumphosphat anwesend ist, ein Kaliumsalz in Betracht.
Von Spurenelementen sollen Kupfer, Zink, Mangan, Eisen und Chrom vorhanden sein.
Zur Aufrechterhaltung des PH- Wertes im zulässigen Bereich von 3,5 bis 7,5 sind Puffersubstanzen wie Calciumcarbonat oder Salze organischer Säuren, z. B. Citrate, Acetate und Lactate geeignet. Die Verwendung eines Entschäumungsmittels ist bei den bei der technischen Durchführung verwendeten
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Fermentationsgefässen wünschenswert. Das Schäumen, das hier kein besonders schwieriges Problem dar- stellt, kann leicht durch Verwendung üblicher Entschäumungsmittel wie Octadecanol in Schmalzöl oder eines andern geeigneten handelsüblichen Entschäumers weitgehend behoben werden.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf bestimmte Mikroorganismen beschränkt, sondern sie umfasst die Verwendung aller jener Mikroorganismen der Gattung Streptomyces aureofaciens sowie deren natür- lich vorkommende oder künstlich induzierte Mutanten, die Tetracyclin in solchen Mengen zu erzeugen vermögen, dass die Gewinnung der therapeutischen Substanz möglich wird. Bei Verwendung von Mikro- organismen der Gattung Streptomyces aureofaciens, die normalerweise das Antibioticum Chlortetracyclin produzieren, wird Tetracyclin in hoher Konzentration erhalten, wenn der Gehalt des Nährmediums an verwertbaren Chloridionen auf einem Minimum gehalten wird.
Gemäss der Erfindung wird für die Er- zeugung von Tetracyclin ein Nährmedium verwendet, das im wesentlichen frei von verwertbaren Chlorid- ionen ist und vorzugsweise weniger als 1 Teil/Million verfügbarer Chloridionen enthält (Gewicht/Gewicht).
Auch höhere Gehalte sind möglich, sie müssen jedoch unter denjenigen der üblicherweise für die Ge- winnung von Chlortetracyclin verwendeten Fermentationsmedien liegen, wenn Tetracyclin als das ge- wünschte Endprodukt erhalten werden soll. Dabei können noch solche Gehalte an verwertbaren Chlorid- ionen verwendet werden, bei denen Chlortetracyclin bis zu etwa der gleichen Menge wie Tetracyclin gebildet wird. Als Arbeitsregel kann gelten, dass 1 Teil/Million verwertbarer Chloridionen zur Erzeugung von höchstens 14 Mikrogramm/ml Chlortetracyclin führt ; daraus lässt sich für jeden einzelnen Fall der zulässige Chloridionengehalt unter Zugrundelegung der festgestellten Gesamtausbeute an gegenüber
E. coli wirksamen antibiotischen Substanzen leicht errechnen.
Es gibt verschiedene Möglichkeiten, den Chloridionengehalt zu vermindern, z. B. durch Bindung der
Chloride in einem inaktiven Komplex oder durch Verwendung von destilliertem Wasser und von chlorid- freien Bestandteilen des Nährmediums in sogenannten synthetischen Nährmedien. Natürliche, chlorid- haltige Ausgangsstoffe des Nährmediums können durch Behandlung mit Ionenaustauschern chloridfrei erhalten werden. Ein synthetisches Medium, das im wesentlichen chloridfrei ist und nicht mehr als
1 Teil/Million an Chlorid enthält, hat folgende Zusammensetzung :
EMI6.1
<tb>
<tb> Saccharose <SEP> 30 <SEP> g/l
<tb> (NHJ, <SEP> SO <SEP> 8, <SEP> 1" <SEP>
<tb> Na3C6H507. <SEP> SHO <SEP> 1, <SEP> 0" <SEP>
<tb> MgSO4. <SEP> 7H20 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb> K2HPO, <SEP> 0, <SEP> 57..
<tb>
CaCOa <SEP> 1, <SEP> 0"
<tb> CHgCOOH <SEP> 0. <SEP> 1 <SEP> mol <SEP>
<tb> CuSO,. <SEP> 5 <SEP> H20 <SEP> 3 <SEP> Teile/Million
<tb> ZnS04. <SEP> 7H2O <SEP> 50 <SEP>
<tb> MnSO4. <SEP> 4H20 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP>
<tb>
EMI6.2
EMI6.3
<tb>
<tb> Glucose <SEP> 10 <SEP> g/l
<tb> Pepton <SEP> 5 <SEP> n <SEP>
<tb> KHPO <SEP> l
<tb> MgSO. <SEP> H2O <SEP> 0, <SEP> 5" <SEP>
<tb> Agar <SEP> 20
<tb>
Die Fermentation erfolgt in der bei der Gewinnung von Antibioticis der Tetracyclinreihe üblichen Weise, wobei die Züchtung zweckmässig bei 25 - 350 durchgeführt und wenigstens 24 Stunden oder so lange durchgeführt wird, bis das Medium wenigstens 100 y/ml Tetracyclin enthält.
Das bei der Fermentation gebildete Tetracyclin kann in Form der rohen Gärbrühe direkt zu Tierfutter zugesetzt werden, um eine Wachstumsstimulierung mit Vorbeugung gegen Krankheiten zu bewirken.
Wenn das Mycel und die unlöslichen Bestandteile unerwünscht sind, kann das Fermentationsmedium, gegebenenfalls nach dem Ansäuern, filtriert und die klare Flüssigkeit dem Trinkwasser oder Tierfutter zum gleichen Zwecke zugesetzt werden. Gewünschtenfalls kann die das Tetracyclin enthaltende Flüssig- keit unter vermindertem Druck oder durch Zerstäubungstrocknung konzentriert werden und das Antibioticum in roher Form zur Wachstumsstimulierung oder als Therapeuticum bei Menschen und Tieren verwendet werden.
Zur Gewinnung von reinem Tetracyclin aus dem Fermentationsmedium kommen die üblichen Reinigungsverfahren, wie Adsorption und Elution, Lösungstnittelextraktionen mit oder ohne Träger, Kristalli-
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sation, Fällung in Form von unlöslichen Salzen, beispielsweise des Calcium-, Barium-, Strontium- oder
Magnesiumsalzes bei PH-Werten oberhalb von etwa 6,5 oder als unlösliche Salze mit oberflächenaktiven
Substanzen sowie mit Azofarbstoffen, in Betracht. Tetracyclin kann aus der rohen Gärbrühe durch An- säuern auf ein PH von ungefähr 3 von unlöslichen Feststoffen abgetrennt und durch Einstellen der Lösung auf einen pH-Wert oberhalb von ungefähr 6,5 als Erdalkalikomplexverbindung gefällt werden.
Die das
Tetracyclin enthaltende saure wässerige Lösung kann auch mit damit nicht mischbaren organischen
Lösungsmitteln extrahiert werden. Von bekannten Lösungsmitteln wie Butanol, Chloroform und Äthyl- acetat wird Butanol bei der Tetracyclinextraktion bevorzugt. Gewisse Alkohole wie Isopropanol, die zwar mit Wasser mischbar, aber mit einer Salzlösung nicht mischbar sind, können ebenfalls gut verwendet werden. Die Zugabe eines wasserlöslichen, in der organischen Schicht unlöslichen Ammonium- oder Aminsalzes oder Alkalihalogenids und-sulfats ist bei der Extraktion förderlich.
Tetracyclin kann auch aus wässerigen Lösungen durch Zugabe dieser Salze ausgefällt werden. Das
Aussalzen kann durch eine geringe Menge eines organischen Lösungsmittels unterstützt werden.
Erfindungsgemäss erhält man ein von inaktiven Verunreinigungen freies Produkt, das auch keine andern Antibiotica, die bei der Fermentation gleichzeitig gebildet werden, enthält, wenn man das
Tetracyclin aus der Gärflüssigkeit bei alkalischer Reaktion (PH = 8 - 11) mit einem quaternären
Ammoniumsalz selektiv aus der Brühe ausfällt. Das Salz wird dann nach dem Abfiltrieren mit einer geringen Menge Wasser und einer verhältnismässig grossen Menge Chloroform aufgeschlämmt, wodurch das quaternäre Ammoniumsalz des Tetracyclins in der Chloroformphase der Aufschlämmung gelöst wird.
Die abgetrennte Chloroformphase wird mit einer wässerigen sauren Lösung bei einem PH-Wert von etwa
1 bis 2, 5 extrahiert, wobei das Säuresalz des Tetracyclins in die wässerige Phase übergeht. Nach Er-
EMI7.1
Bei dieser Gewinnungsmethode sind Alkyltrimethylammoniumchloride und Dialkyldimethylammoniumchloride, worin die Alkylgruppe von 8 bis (einschliesslich) 18 Kohlenstoffatome enthält, besonders gut verwendbar.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.
Beispiel l : Maisquellwasser wird mit destilliertem Wasser so weit verdünnt, dass der Gehalt an festen Stoffen ungefähr 2% beträgt, und dann über einen Anionenaustauscher und danach über einen Kationenaustauscher geleitet. Die abfliessende Flüssigkeit wird aufgefangen, wenn der spezifische Widerstand unter 3000 Ohm/cm gefallen ist. In 1000 ml des entionisierten Maisquellwassers werden folgende Bestandteile gelöst :
EMI7.2
<tb>
<tb> Saccharose <SEP> 30, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> K2HP04 <SEP> 15, <SEP> 0"
<tb> (NH4) <SEP> zHP04 <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> " <SEP>
<tb> MgS04. <SEP> 7HzO <SEP> 2, <SEP> 0" <SEP>
<tb> CaC03 <SEP> 1, <SEP> 0..
<tb>
KBr <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> tri <SEP>
<tb> ZnSO. <SEP> 7H20 <SEP> 0, <SEP> 05" <SEP>
<tb> Culs04. <SEP> 5 <SEP> H20 <SEP> 3,0 <SEP> mg
<tb> MnS04. <SEP> H20 <SEP> 2, <SEP> 5"
<tb>
EMI7.3
dient zur Herstellung der Impfkultur. Je 50 ml des obigen Nährmediums in 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben werden mit einer Sporenkultur von Streptomyces aureofaciens beimpft und 72 Stunden bei 300 auf einer Schüttelmaschine mit hin-und hergehender Bewegung geschüttelt (82 Bewegungen/Minute mit 7, 3 cm Distanz). 400 ml Medium wurden mit 1, 0 ml der entstandenen Mycelsuspension beimpft, weitere 28 Stunden geschüttelt und dann zum Beimpfen der Nährlösung im Fermentationsgefäss verwendet.
In einem Fermentationsgefäss von 94, 6 1 Inhalt wurden 59, 8 1 Nährlösung der oben beschriebenen Zusammensetzung in folgender Weise bereitet : Die Bestandteile wurden in den erforderlichen Konzentrationen zunächst in 43, 5 1 deionisierter Maisquellwasserlösung gelöst und diese Lösung durch Einführung von Dampf mit einem Druck von 1, 05 atü bei 1210 C während 30 Minuten sterilisiert. Durch das hiebei aus dem Dampf kondensierende Wasser stieg das ursprüngliche Volumen der Lösung von 43,5 1 auf das erforderliche Endvolumen von 59,8 1 an. Nach Abkühlen auf 300 C wurde die Mischung mit dem oben beschriebenen Impfstoff (400 ml) beimpft, hierauf während 38 Stunden bewegt und mit einer
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Geschwindigkeit von 1, 6 Volumina Luft/Volumen Medium belüftet.
Danach war der ursprünglich 5,9 betragende pH-Wert der Brühe auf 4, 1 gesunken. Die Brühe ergab 20 Mikrogramm/ml an Antibioticum bei Verwendung von Oxytetracyclin als Standard, wobei das gebildete Antibioticum zum grössten Teil aus Tetracyclin bestand.
Beispiel 2 : 189 1 der in Beispiel 1 beschriebenen Nährlösung wurden in einem 473 1 fassenden Impfstofftank aus rostfreiem Stahl bereitet und 30 Minuten bei 1210 C sterilisiert. Die Temperatur wurde auf 330 C gesenkt und der Ansatz mit 400 ml eines in dem gleichen Medium nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren während 72 Stunden gezüchteten Impfstoffes beimpft. Der Tank wurde 20 Stunden mit 1, 0 Vol, Luft/Vol. Medium belüftet und dabei in Bewegung gehalten. Danach betrug der PH-Wert 5, 05. Diese'Brühe wurde zum Beimpfen eines Fermentationsmediums verwendet, das folgende Zusammensetzung besass :
EMI8.1
<tb>
<tb> Saccharose <SEP> 40, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> CaCO3 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> "
<tb> MgSO4. <SEP> 7H2O <SEP> 0,25 <SEP> "
<tb> KH2PO4 <SEP> 0, <SEP> 10 <SEP> n. <SEP>
<tb>
K2HP04 <SEP> 0, <SEP> 10 <SEP> 11 <SEP>
<tb> (NH4)2SO4 <SEP> 3,3 <SEP> "
<tb> Natriumcitrat <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> "
<tb> ZnSOH2O <SEP> 0, <SEP> 04 <SEP> " <SEP>
<tb> MnS04. <SEP> 4H2O <SEP> 0, <SEP> 01" <SEP>
<tb> KzCrzO <SEP> 0, <SEP> 016 <SEP> mg
<tb> Essigsäure <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> ml <SEP>
<tb>
Das Volumen wurde mit destilliertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt. Der Chlorgehalt war gering.
2271 1 dieses Mediums wurden in einem 3785 l fassenden Tank aus rostfreiem Stahl bereitet und 25 Minuten bei 1210 C sterilisiert. Nach Abkühlen auf 300 C wurde die oben beschriebene Impfstoffbrühe (189 1) aseptisch eingeführt und die gesamte Mischung während 71 Stunden unter Bewegung mit einer Geschwindigkeit von 0, 68 Vol. Luft/Vol. Medium/Minute belüftet, wonach die Brühe eine Wirksamkeit von 92 Mikrogramm/ml zeigte.
Beispiel 3 : Eine Nährlösung zur Herstellung eines Impfstoffes (je 50 ml in 250 ml-Erlenmeyerkolben) hatte folgende Zusammensetzung :
EMI8.2
<tb>
<tb> Saccharose <SEP> 30 <SEP> g
<tb> Natriumcitrat <SEP> 1, <SEP> 0"
<tb> (NH4)2 <SEP> SO4 <SEP> 3,3 <SEP> "
<tb> MgSO4. <SEP> 7H2O <SEP> 0,25 <SEP> "
<tb> KH2PO4 <SEP> 0, <SEP> 10 <SEP> "
<tb> K2HPO4 <SEP> 0, <SEP> 10 <SEP> "
<tb> CaCO3 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> "
<tb> Essigsäure <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> ml
<tb> Sojaschrot <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb> Spurenelemente-Lösung <SEP> 1,0 <SEP> ml
<tb> Wasser <SEP> (destilliert) <SEP> bis <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> Die <SEP> Lösung <SEP> der <SEP> Spurenelemente <SEP> besass <SEP> folgende <SEP> Zusammensetzung <SEP> :
<SEP>
<tb> CUS04. <SEP> 5HzO <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> g/100 <SEP> ml <SEP>
<tb> ZnSO4. <SEP> 7H2O <SEP> 5,0 <SEP> " <SEP> " <SEP> "
<tb> MnSO4. <SEP> 4H2O <SEP> 0,25 <SEP> " <SEP> " <SEP> "
<tb> (Der <SEP> PH-Wert <SEP> wurde <SEP> mit <SEP> NaOH <SEP> auf <SEP> 6, <SEP> 2 <SEP> eingestellt. <SEP> )
<tb>
Nach Zusatz der Bestandteile in der angegebenen Reihenfolge wurde die Lösung im Autoklaven behandelt, nach dem Abkühlen mit einer Kultur des Stammes UV-8 beimpft und 48 Stunden bei 30 - 330C auf einer Schüttelmaschine mit hin-und hergehender Bewegung geschüttelt (97 Perioden/Minute mit 7, 9 cm Distanz).
Zur Erzeugung von Tetracyclin wurde das folgende Medium bereitet :
EMI8.3
<tb>
<tb> Saccharose <SEP> 30 <SEP> g/l <SEP> aqua <SEP> dest.
<tb>
MgSo4. <SEP> 7H2O <SEP> 0,25 <SEP> "
<tb> KH2PO4 <SEP> 0, <SEP> 15"
<tb> CaCOa <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> n <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 9>
EMI9.1
<tb>
<tb> Zitronensäure <SEP> 11,5 <SEP> g/l <SEP> aqua <SEP> dest. <SEP>
<tb>
NHOH <SEP> 10 <SEP> ml
<tb> Spurenelementelösung <SEP> 1, <SEP> 0" <SEP> (wie <SEP> oben <SEP> beschrieben) <SEP>
<tb>
In jeden 250 ml-Kolben wurden 50 ml des Mediums gebracht und nach dem Sterilisieren wurden je 2, 5 ml Impfstoff aseptisch zugesetzt. Der ursprüngliche PH-Wert lag im Bereich von 6, 0 bis 7, 0.
Nach dreitägiger Bebrütung auf einer rotierenden Schüttelmaschine mit 250 Umdr/min bei 300 C ergab sich aus zehn einzelnen Schüttelkolben unter Verwendung von E. coli ein Durchschnittswert von 610 Mikrogramm/ml gegen einen Tetracyclinstandard von 1, 000 Mikrogramm/ml für das reine Material. Bei einem Chloridgehalt von 0, 6 Teilen/Million betrug die gesamte wirksame Menge an gebildetem Chlortetracyclin 8 Mikrogramm/ml oder etwa 1, 4% des gesamten Antibioticum.
Beispiel 4: 586,7 1 einer im wesentlichen gemäss Beispiel 2 hergestellten Brühe mit 68 Mikrogramm/ml wirksamer Substanz wurden mit 5600 g Oxalsäure versetzt, um das Antibioticum löslich zu machen. Der PH-Wert wurde mit 4600 ml konzentriertem Ammoniak auf 3, 5 eingestellt und die Mischung mit 6, 8 kg Filterhilfe filtriert, um das Mycel und das gefällte Calciumoxalat zu entfernen.
Der filtrierten Brühe wurden 113, 5 I einer 51eigen Lösung von N- (Lauroyl-colamino-formyl-methyl)- pyridiniumchlorid in Äthylacetat zugesetzt, dann wurde die Mischung mit 2200 ml 50% iger Natronlauge auf PH 8, 5 eingestellt, 20 Minuten lang gerührt und dann absitzen gelassen.
Die 821 betragende Äthylacetatschicht, die das Antibioticum enthielt, wurde abgetrennt und dreimal unter Verwendung von 1500 ml Wasser extrahiert. Dabei wurde der pH-Wert jedesmal mit Salzsäure auf 1, 7 eingestellt. Auch Schwefelsäure kann für diesen Zweck verwendet werden. Die Extrakte wurden vereinigt und mit 6, 5 ml 4 n-Ammoniak auf PH 7, 8 eingestellt, wobei die verhältnismässig unlösliche freie Base gebildet wird. Die Mischung wurde abfiltriert und der Kuchen im Vakuumexsikkator getrocknet.
Es wurden 21 g rohes Material mit einer Aktivität von 417 Mikrogramm/mg erhalten. Eine Gegenstromverteilung des Materials ergab, dass etwa 75% des vorhandenen Antibioticum Tetracyclin waren.
Beispiel 5: Ein mehr als 130 Mikrogramm/ml anTerracyclin enthaltendes Fermentationsmedium wurde mit konzentrierter Schwefelsäure auf PH 3, 5 angesäuert, um das Antibioticum in eine leichtlösliche Form überzuführen, und nach Zugabe einer Filterhilfe filtriert. Das Volumen der filtrierten Brühe betrug 40501.
Sie wurde mit 2140 ml "Arquad 16" (einer Mischung von Alkyl-trimethylammoniumchlorid und Dialkyl-dimethylammoniumchlorid in Isopropanol, wobei die Alkylgruppen aus 90% Hexadecyl, 61o Octadecyl und 4% Octadecenyl bestehen und das Präparat etwa 50% Isopropanol enthält) versetzt und das PH durch Zugabe von 6100 ml 50% figer Natronlauge auf einen Wert von 10, 0 gebracht, um die in einem PH-Bereich von 8 bis 11 ausfallenden quaternären Ammoniumsalze des Tetracyclins zu bilden. Nach Zugabe von 9 kg Filterhilfe wurde die Brühe abfiltriert und die so gewonnenen Feststoffe mit Wasser gewaschen.
Ungefähr 4/5 dieses gewaschenen Filterkuchens wurden mit 45, 4 1 Methanol als Lösungsmittel und so viel konzentrierter Salzsäure aufgeschlämmt als nötig ist, um das PH auf einen Wert von 1, 8 herabzusetzen, wodurch die Löslichkeit des Tetracyclins erhöht wird. Nach 5minutigem Rühren wurde filtriert und die Feststoffe mit Methanol gewaschen, bis sie im wesentlichen farblos waren. Der mit den Waschflüssigkeiten vereinigte Extrakt (Gesamtvolumen 92 l) wurde mit 10 n wässeriger Natronlauge auf ein PH von 6, 8 gebracht, wodurch die verhältnismässig unlösliche freie Base abgeschieden wurde. Die Feststoffe wurden abfiltriert und luftgetrocknet. Es wurden 1545 g rohes amorphes isoelektrisches Tetracyclin-trihydrat mit einer Aktivität von 296 Mikrogramm/mg erhalten.
Beispiel 6 : 2140 ml"Arquad 16"wurden zu 40501 filtrierter Fermentationsbrühe bei PH 3, 5 zugesetzt und das PH auf 10 eingestellt. Nach Zugabe von 9 kg Filterhilfe wurde die Mischung abfiltriert und die Feststoffe mit Wasser gewaschen. Ein aliquoter Anteil des gewaschenen Filterkuchens (1kg) wurde mit 3300 ml Chloroform aufgeschlämmt und das PH auf 10, 5 eingestellt. Nach 15 Minuten langem Rühren wurden die Feststoffe abfiltriert und nacheinander zweimal mit einer Mischung aus 150 ml Wasser und 3300 ml Chloroform erneut aufgeschlämmt. Die das Antibioticum enthaltenden vereinigten Chloroformextrahte wurden mit 600 ml 0, 4 n-Schwefelsäure verrührt und das PH mit 4 n-Schwefelsäure auf 2 eingestellt. Nach 5 Minuten langem Rühren wurde die wässerige Phase abgetrennt und filtriert.
Ein aliquoter Anteil dieses Säure konzentrats \on 340 ml wurde auf pl, 5, 3 eingestellt und über Nacht im Eisschrank stehengelassen. Die gebildeten Kristalle wurden abfiltriert, mit Eiswasser gewaschen und im Vakuum über wasserfreiem Calciumchlorid getrocknet. Es wurden 19,5 g Substanz mit einer Wirksamkeit von 629 Mikrogramm/mg erhalten. Chlortetracyclin war nicht in nachweisbaren Mengen zugegen.
Beispiel 7 : Zwei Säulen, die jeweils 50 g"Amberlit IRC 50" (ein Carboxylgruppen enthaltendes Kationen-Austauschharz der Firma Rohm & Haas Co. ) in der H-Form enthielten, wurden auf PH 7 ge-
<Desc/Clms Page number 10>
puffert, indem durch jede Säule ein Liter 1 n-Natriumacetat-Essigsäurepuffer mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/Minute durchgeleitet wurde. 10 I filtrierter Brühe mit einer Aktivität von 41 Mikrogramm/ml wurden mit 4 n-wässeriger Natronlauge auf PH 7 eingestellt und mit einer Geschwindigkeit von 5 ml/Minute durch eine der gepufferten Amberlit-Säulen geleitet.
Folgende Fraktionen der austretenden Flüssigkeit wurden aufgefangen :
EMI10.1
<tb>
<tb> 0-2 <SEP> l-wirksame <SEP> Substanz <SEP> 13, <SEP> 3 <SEP> y/ml <SEP>
<tb> 2-5 <SEP> " <SEP> " <SEP> " <SEP> 8,7 <SEP> " <SEP> "
<tb> 5-7"to <SEP> 11 <SEP> 15. <SEP> 1 <SEP> 1." <SEP>
<tb> 7-10"It <SEP> 1. <SEP> 25, <SEP> 0"" <SEP>
<tb>
Die aus dieser Säule austretende Flüssigkeit wurde durch die zweite gepufferte Säule mit der gleichen Geschwindigkeit von 5 ml/Minute geleitet.
Fraktionen der aus der zweiten Säule austretenden Flüssigkeit wurden zur Prüfung ihrer Wirksamkeit aufgefangen :
EMI10.2
<tb>
<tb> 0-21-wirksame <SEP> Substanz <SEP> 16, <SEP> 9 <SEP> y/ml <SEP>
<tb> 2-4"""12, <SEP> 4"" <SEP>
<tb> 4-6"""7, <SEP> 5"" <SEP>
<tb> 6-10"""7, <SEP> 2"" <SEP>
<tb>
1 1 1 n-Salzsäure in ssObigem Methanol wurde mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/Minute durch die erste Säule geleitet. Das Eluat, das 74% der wirksamen Substanz aus der filtrierten Brühe enthielt, wurde im Vakuum auf etwa 1/3 seines Volumens eingeengt, wobei das PH auf 2,5 fiel. Das PH wurde durch Zugabe einer Filterhilfe auf 1, 8 gebracht ; um die Feststoffe zu entfernen, die sich während des Einengens abgeschieden hatten.
Die abfiltrierten Feststoffe wurden mit Wasser gewaschen und das mit Waschflüssigkeiten vereinigte Filtrat durch Zugabe von 4 n-Natronlauge auf PH 7, 8 eingestellt. Die sich abscheidenden Feststoffe wurden gewaschen und dann im Vakuum getrocknet. Es wurden 1,375 g eines Produktes mit einer Wirksamkeit von 78 Mikrogramm/mg erhalten.
Beispiel 8 : Tetracyclin kann aus seinen wässerigen Lösungen bei alkalischer Reaktion durch Zugabe einer Mischung von Bariumchlorid und Magnesiumchlorid gefällt werden. Wenn beispielsweise 15 g Bariumchlorid-dihydrat und 2 g Magnesiumchlorid-hexahydrat zu einer Lösung von 3 g rohem Tetracyclin in 1 l Wasser bei PH 2, 5 zugesetzt und hierauf das PH durch Zusatz von wässeriger Natronlauge auf 8, 5 eingestellt wurde, wurde die gesamte wirksame Substanz im Niederschlag gefunden, der durch Abfiltrieren von der die Verunreinigungen enthaltenden Flüssigkeit abgetrennt wurde.
Nach Aufschlämmen des Niederschlages mit Wasser und Einstellen des PH-Wertes mit Schwefelsäure auf 1,5 und Abfiltrieren vom unlöslichen Bariumsulfat enthielt der resultierende wässerige Extrakt praktisch die gesamten, ursprünglich vorhandenen mikrobiologisch wirksamen Substanzen. Dieses Verfahren kann angewendet werden, um Tetracyclin enthaltende Lösungen und Brühen zu konzentrieren und Verunreinigungen zu entfernen.
Beispiel 9 : Durch Auflösen von rohem amorphen Tetracyclin in Wasser wurden Kristalle der freien Tetracyclinbase gebildet. Dieses rohe Material besass eine Wirksamkeit von etwa 427 Mikrogramm/mg. Die wässerige Lösung wurde durch Zugabe von Salzsäure auf PH 3 eingestellt. Dann wurde die Lösung mit n-Butanol gesättigt und einer Gegenstromverteilung mit 9 Trenntrichtern unterworfen, wobei gleiche Volumina von mit Wasser gesättigtem Butanol verwendet wurden, deren PH mit verdünnter- Salzsäure auf einen Wert von 3 eingestellt worden war. Nach der Verteilung wurden die mittleren Rohre 4,5, 6 und 7 vereinigt und das PH durch Zugabe von verdünnter Natronlauge auf einen Wert von 7 gebracht. Die Mischung wurde im Vakuum bei 40 - 500 C eingeengt.
Die sich beim Abkühlen bildenden Kristalle wurden abfiltriert und im Vakuumexsikkator über Calciumchlorid getrocknet. Das so erhaltene kristallisierte Trihydrat besass eine Wirksamkeit von 780 Mikrogramm/mg.
Toxizität von Tetracyclin : Tetracyclin zeigt geringe Toxizität bei der Verabreichung an Tieren. Die folgende Tabelle IV zeigt die relativen Mengen an Tetracyclin, Chlortetracyclin und Oxytetracyclin, die nötig sind, um Mäuse nach der Verabreichung einer einzigen Dosis in der angegebenen Weise zu töten. Daraus geht hervor, dass die Toxizität von Tetracyclin, Chlortetracyclin und Oxytetracyclin in der gleichen Grössenordnung liegt.
<Desc/Clms Page number 11>
Tabelle IV
EMI11.1
<tb>
<tb> Art <SEP> der <SEP> Tetracyclin <SEP> Chlortetracyclin <SEP> Oxytetracyclin
<tb> Verabreichung <SEP> mg <SEP> / <SEP> kg <SEP> mg <SEP> / <SEP> kg <SEP> mg <SEP> / <SEP> kg <SEP>
<tb> Intravenös <SEP> LDso <SEP> 145 <SEP> LD50 <SEP> 140
<tb> Intraperitoneal <SEP> LDgc <SEP> 355 <SEP> LDso <SEP> 365 <SEP> LD50 <SEP> 280
<tb> Subcutan <SEP> LD20 <SEP> 400 <SEP> LD1D <SEP> 400 <SEP> LD20 <SEP> 340
<tb> Oral <SEP> LD20 <SEP> 4250---LD20 <SEP> 3750
<tb>
Tierversuche an mit D. pneumoniae, K. pneumoniae und S. pyogenes infizierten Mäusen zeigen, dass Tetracyclin bei subcutaner oder oraler Verabreichung ungefähr die gleiche Wirkung wie Oxytetracyclin und Chlortetracyclin besitzt.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Gewinnung von Tetracyclin durch aerobe Züchtung von Chlortetracyclin erzeugenden Streptomyceten in einem wässerigen Nährmedium üblicher Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultur von Streptomyces aureofaciens oder seinen Chlortetracyclin erzeugenden Mutanten oder Varianten in einem Nährmedium durchgeführt wird, das im wesentlichen frei von verwertbaren Chloridionen ist und einen pH-Wert von 3, 5 bis 7, 5 aufweist, wobei das Verfahren so lange fortgesetzt wird, bis die Lösung Tetracyclin als vorherrschendes Antibioticum enthält.