CN100471869C - 制备和检定具有可检验的口服吸收性云芝的免疫调节的肽联葡聚糖 - Google Patents

Abstract

本发明提供了刺激免疫系统的组合物和方法。这样的方法包括给药云芝的提取物、纯化的肽联葡聚糖或其活性成分。该方法特别可用于次级免疫缺陷的预防和治疗性处理，其中免疫缺陷是感染、恶性肿瘤疾病、自身免疫疾病、蛋白质损失状态、免疫抑制治疗、外科手术或麻醉的结果。

Description

制备和检定具有可检验的口服吸收性云芝的免疫调节的肽联葡聚糖

参考相关申请

本申请是2002年5月22日提交的美国申请号60/383,339的非临时申请，以其全文在此引作参考。

有关联邦资助的研究或开发下进行的发明的权益的声明

不适用

参考“序列表”，表格或以小型盘提交的计算机程序表附录

适用

发明背景

当分离的缺陷已经导致临床疾病时，个别免疫功能成分对寄主的天然防御的重要性已经非常明确地阐明了。因为这样的异常现在已经可以通过新的实验室方法来有效检测和限定，免疫缺陷疾病正在以更快的速度发现。免疫缺陷紊乱必须在两大类中考虑：初级免疫缺陷，经常由遗传决定，和次级免疫缺陷状态。后者是作为感染和侵染、肠胃紊乱、营养失调、衰老、淋巴恶性肿瘤、其他癌症和许多其他疾病的并发症而发生的。严重程度不同的免疫缺陷也遇到许多治疗模式包括癌症的放疗和化疗的副作用。从此观点来看，初级和次级免疫缺陷不是稀有的疾病。这些问题已必需研究具有免疫强化特性的新型治疗剂。

在数目逐渐增加的疾病的致病机理中发现有免疫系统的参与，已经不可避免地导致了人们试图通过操纵免疫机制的各种因素来调节这些疾病的过程。刺激免疫系统常常是缓和免疫缺陷状态的选择。这一途径，其中有几套如今可得的有效试剂(即芽孢杆菌Calmette-Guerin、内毒素)，在医药中的两个主要治疗领域——癌症和感染疾病具有特别的前景。

根据免疫监督的概念，当恶性细胞出现时，免疫系统就消除它们。T细胞和更近的巨噬细胞、天然杀伤细胞的抗癌作用已经有报道。另外，即使抗肿瘤免疫应答主要不涉及肿瘤生长的控制，似乎适当的免疫刺激可以引发有效的免疫应答或给予原本无效的反应以有效反应。所有这些考虑因素已经在癌症的治疗中为免疫刺激用作外科手术、放疗或化疗的辅助方法提供根据¹。

在动物模型的感染疾病中，免疫刺激剂也已经广泛研究。感染个体呈现被识别的免疫缺陷问题并经常显示机会微生物的感染，理论上应该从免疫治疗中获益。但是应该注意到，与免疫缺陷不显著相关的感染也可以用免疫强化剂来治疗，因为加强免疫应答可以帮助消除阻遏正常生理反应的特殊的强毒剂。另外，衰老个体的情况应该给予特别的关注，他们经常对许多疫苗缺乏反应(例如流感疫苗)。

本发明的简要说明

在一个方面，本发明提供了云芝(coriolus versicolor)的纯化的提取物，其包括至少一种含有通过(1→3)键连接的葡聚糖分子的肽联葡聚糖，具有由大小排阻层析确定的0.7kDa到5kDa的分子量；和提供免疫刺激活性。在另一方面，本发明提供了云芝的分离的肽联葡聚糖，其包含多个(1→3)键连接的葡聚糖分子，具有由大小排阻层析确定的0.7kDa到3.0kDa的分子量；以及分离的肽联葡聚糖及其活性成分具有免疫刺激活性。本发明进一步提供了包含云芝的分离的肽联葡聚糖及其活性成分的药物组合物。

在另一方面，本发明提供了从云芝纯化肽联葡聚糖的方法，其包括下列步骤：用碱处理云芝，分离上清液；将上清液进行阳离子交换，将来自阳离子交换的洗脱物进行阳离子交换；将来自阴离子交换的洗脱物通过大小分级分离技术进行分离，并且回收包含肽联葡聚糖、分子量为0.7kDa到5kDa的组分。

在另一方面，本发明提供了刺激免疫应答的方法，其包括将免疫系统的细胞与提取物、肽联葡聚糖或其活性成分接触。在另一方面，本发明提供了治疗需要免疫系统刺激的患者的方法，包括对患者给药有效量的权利要求所述的提取物、纯化的肽联葡聚糖或其活性成分来刺激免疫应答。

附图的简要说明

图1是说明CV粗取物的制备方案中所用步骤的流程图。

图2A和2B。图2A是大小排阻层析谱，其显示CV粗提取物的蛋白质成分的洗脱图。图2B是CV粗提取物的大小排阻层析谱，其显示CV粗提取物的碳水化合物成分的洗脱图。

图3说明与CV粗提取物或伴刀豆球蛋白A(Con A)体外接触的活鼠脾细胞的增殖。

图4说明与CV粗提取物或LPS体外接触的分离的鼠骨髓细胞的增殖效果。

图5说明与CV粗提取物或LPS体外接触的鼠腹膜巨噬细胞分泌一氧化氮增加。

图6A和6B。图6A说明用CV粗提取物腹膜内(i.p.)给药处理(3天服药计划)的小鼠的活脾细胞的体内效果。图6B说明用CV粗提取物腹膜内给药处理(3天服药计划)的活骨髓细胞的离体增殖效果。

图7A和7B。图7A说明用CV粗提取物口服给药治疗(7天服药计划)的正常小鼠的活脾细胞的体内效果。图7B说明用CV粗提取物口服给药处理(7天服药计划)的正常小鼠的活骨髓细胞的离体增殖效果。

图8A、8B和8C。图8A说明用CV粗提取物腹膜内给药处理(3天服药计划)的无免疫应答的小鼠的活脾细胞和活骨髓细胞的体内效果。图8B说明用CV粗提取物口服给药处理(7天服药计划)的无免疫应答的小鼠的活脾细胞和活骨髓细胞的体内效果。图8C说明用CV粗提取物口服给药处理(7天服药计划)的重度无免疫应答的小鼠的活脾细胞和活骨髓细胞的体内效果。

图9A、9B和9C。图9A说明用CV粗提取物口服给药处理(14天服药计划)的重度无免疫应答的小鼠的活脾细胞和骨髓细胞的体内效果。图9B说明用CV粗提取物口服给药处理(14天服药计划)的重度无免疫应答的小鼠的活脾细胞的离体增殖效果。图9C说明用CV粗提取物口服给药处理(14天服药计划)的重度无免疫应答的小鼠的活骨髓细胞的离体增殖效果。

图10说明用各种剂量的CV粗提取物口服给药处理(7天服药计划)的无免疫应答的小鼠的活脾细胞和骨髓细胞的体内效果。

图11说明用CV粗提取物口服给药处理，然后用2，4-二硝基-1-氟苯(DNFB)攻击的正常、免疫抑制和严重免疫抑制的小鼠的耳朵测量。

图12A、12B和12C。图12A说明用CV粗提取物口服给药处理(30天服药计划)的正常小鼠的活脾细胞和骨髓细胞的体内效果。图12B说明用CV粗提取物口服给药处理(30天服药计划)的正常小鼠的活脾细胞的离体增殖效果。图12C说明用CV粗提取物口服给药处理(30天服药计划)的正常小鼠的活骨髓细胞的离体增殖效果。

图13说明用粗CV提取物、CV-D2、CV-D3、CV-D4和CV-5体外接触的活鼠脾细胞的增殖。

图14说明用CV粗提取物、CV-E8、CV-E6、CV-E4、CV-E2、CV-E0体外接触的鼠腹膜巨噬细胞分泌一氧化氮增加。

图15是流程图，说明在从图1的粗CV提取物进一步纯化活性成分的方案中所用的步骤。

图16说明CV组分基本结构单元(中性糖、糖醛酸和蛋白质/肽)的组成与体外促有丝分裂活性的关系。

图17显示3个部分纯化的CV活性部分，即C1D5E8、C1D5E7和C1D5EX对鼠腹膜巨噬细胞分泌一氧化氮的体外刺激活性。

图18A和18B。图18A是说明CV粗提取物的分子量分布的层析谱。图18B是说明透过Caco-2细胞单层的CV粗提取物成分的分子量分布的层析谱。

图19A和19B。图19A是说明CV部分纯化的提取物C1D5E8的分子量分布的层析谱。图19B是说明透过Caco-2细胞单层的C1D5E8提取物成分的分子量分布的层析谱。

图20A和20B。图20A是说明CV部分纯化提取物C1D5E7的分子量分布的层析谱。图20B是说明透过Caco-2细胞单层的C1D5E7提取物成分的分子量分布的层析谱。

图21A和图21B。图21A是说明CV部分纯化提取物C1D5EX的分子量分布的层析谱。图21B是说明透过Caco-2细胞单层的C1D5EX提取物成分的分子量分布的层析谱。

图22说明与CV部分纯化的提取物的可渗透Caco-2细胞单层的成分或LPS接触的小鼠腹膜巨噬细胞分泌一氧化氮的体外影响。

图23A和23B。图23A说明用CV部分纯化的提取物腹膜内给药处理(3天服药计划)的无免疫应答的小鼠的活脾细胞的体内影响。图23B说明用CV部分纯化的提取物腹膜内给药处理(3天服药计划)的无免疫应答小鼠的活骨髓细胞的体内影响。

图24A和24B。图24A说明用CV部分纯化的提取物口服给药处理(7天服药计划)的无免疫应答小鼠的活脾细胞的体内影响。图24B说明用CV部分纯化的提取物口服给药(7天服药计划)的无免疫应答小鼠的活骨髓细胞的体内影响。

本发明的详细说明

I.定义

为了本发明的目的，如下定义了下面的术语：

“免疫刺激剂”、“免疫刺激试剂”和“免疫调节剂”，如本文所用，指诱导免疫应答的试剂。

“免疫原”指能够引起免疫应答或产生免疫性的试剂或物质。

“免疫原性”指免疫原诱导免疫应答的能力。

“免疫缺陷”指在免疫应答能力中的任何缺陷，如体液或细胞介导的免疫性的缺陷性生产。

“免疫活性”指对抗原或免疫原的免疫应答能力。

“非特异免疫性”指由抗体的形成和特异抗原反应淋巴细胞的生成以外的任何其他机制所产生的对病原体入侵的抗性。

“肽”指包含通过酰胺键连接的氨基酸残基的任何物质。

“多糖”指一类碳水化合物，其中该分子来自单糖亚基的聚合。多糖通常含有5个或更多个通过糖苷键相互连接的单糖亚基。

“葡聚糖”指由葡萄糖组成的多糖。

术语“免疫介导”指天然的自身免疫或炎性的过程。

提取物或组合物的活性成分是刺激免疫系统的一种成分。

术语“白细胞”指白血球。淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞是白细胞的例子。

术语“淋巴细胞”指介导体液或细胞免疫性的单核白细胞。

术语“单核细胞”指在迁移至组织中变成巨噬细胞之前，在血流中暂时循环的单核巨噬细胞白细胞。

“T细胞”指在胸腺中成熟和表达T细胞受体、CD3和CD4或CD8的淋巴细胞。存在几个被识别的T细胞亚群。

“患者”包括接受预防或治疗性处理的人和其他哺乳动物个体。

术语“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”指已经从其天然环境的成分中富集或分离的目标品种。所以，在提取物中的肽联葡聚糖是分离的，尽管它可以与其他肽联葡聚糖或其他细胞成分一起存在。该术语也可以表明，目标品种是存在的主要的大分子品种(即在摩尔基础上，它在组合物中比任何其他单个品种更丰富)。并且目标品种优选至少含有约50％(在摩尔基础上)的所有存在的大分子品种。通常，分离的、纯化的或基本纯的组合物将在组合物中含有80％到90％以上的所有大分子品种。更优选地，使目标品种纯化到基本均一(即通过常规检测方法，在组合物中不能检测到污染品种)，其中组合物基本由单一的大分子品种组成。

所有定量值包括在量的测量中表示典型实验误差的误差幅度。

II.概述

本发明提供了云芝(CV)纯化的提取物及其活性成分、纯化其的方法和利用其刺激免疫应答的方法。本发明纯化的提取物的活性成分是一种或多种低分子量的肽联葡聚糖(0.7kDa到5kDa和优选0.7kDa到3kDa)。肽联葡聚糖保留了CV粗提取物的免疫刺激特性，它们在中国人群体中作为辅助手段定期食用，已经普遍地促进改善健康和带来长寿。最近，传统的提取物已经更通常地用于治疗一般性的免疫衰弱和肿瘤。接受外科、化疗和/或放疗的癌症患者在延长口服给药传统的CV提取物后，已观察到他们的免疫和健康状态有显著提高。

本发明的提取物、肽联葡聚糖及其活性成分正如中医传统实践中的CV粗提取物，以相似方式用于在患者体内和体外刺激免疫应答。另外，本申请提供的数据表明，本发明的肽联葡聚糖可以通过肠壁吸收，允许采用传统中医的粗提取物口服给药。但是本发明的提取物和肽联葡聚糖及其活性成分具有纯度更高、药效更大和/或再现性更好的优点。本发明的提取物、肽联葡聚糖及其活性成分也可以用于进一步分离。例如，在实施例中所示的数据表明，一种或多种肽联葡聚糖的肽成分具有主要的免疫刺激活性，虽然葡聚糖成分可以给予传统的免疫刺激活性。所以，提取物和肽联葡聚糖可以用于制备分离的肽及其活性成分。

虽然对于实施本发明，认识机制是不需要的，但可以认为，作用方式明显包括淋巴细胞和骨髓细胞的增殖和巨噬细胞的活化。

III.本发明的纯化的提取物和肽联葡聚糖

本发明的纯化的提取物包括至少一种由大小排阻层析确定的分子量为0.7kDa到5kDa的肽联葡聚糖。所述至少一种肽联葡聚糖具有免疫刺激活性。免疫刺激活性可以通过在下文或实施例中所述的任何分析中的统计学上显著的应答来测量。

优选地，本发明的纯化的提取物包含至少50％、分子量为0.7kDa到5kDa的肽联葡聚糖。本发明的一些纯化的提取物包含至少60％、分子量为0.7kDa到5kDa的肽联葡聚糖。本发明的一些纯化的提取物包含至少70％、分子量为0.7kDa到5kDa的肽联葡聚糖。本发明的一些纯化的提取物包含至少80％、分子量为0.7kDa到5kDa的肽联葡聚糖。本发明的一些纯化的提取物包含至少85％、分子量为0.7kDa到5kDa的肽联葡聚糖。本发明的一些纯化的提取物包含至少90％、分子量为0.7kDa到5kDa的肽联葡聚糖。本发明的一些纯化的提取物包含至少99％、分子量为0.7kDa到5kDa的肽联葡聚糖。

肽联葡聚糖的葡聚糖成分包括通过1→3键连接的葡萄糖分子。一些提取物含有几个肽联葡聚糖，而其他含有单个肽联葡聚糖。在含有几个肽联葡聚糖的提取物中，肽成分如葡聚糖成分，在不同的肽葡聚糖中可以相同或不同。在优选的提取物中，肽联葡聚糖的平均分子量是0.7到3kDa。在一些提取物中，肽联葡聚糖的平均分子量是0.7kDa或1.0kDa。分子量不超过3kDa在保证通过肠壁时是有优势的。本发明的一些肽联葡聚糖进一步的特征是在水、乙醇和丙酮中可溶，在氯仿和二氯仿中不溶，和缺乏吸湿性。

IV.制备本发明的纯化的提取物和肽联葡聚糖

I.制备云芝的活性水提取物

正如图1的流程图所示，可以从干的CV果实体中通过用液体溶剂抽提果实体和浓缩得到的溶液形成浓缩的提取物来制备CV的活性水相提取物。在一些方法中，将干的CV果实体浸软、脱色，并在稀释的碱溶液如0.01N氢氧化钠溶液中煮沸。其他碱性溶液如氢氧化钾也可以利用。在这一加热条件下，这些碱性水溶液提取剂的浓度优选为0.1N以避免可能的活性损失。提取后，例如通过过滤除去不溶性物质，并且通过离心或其他方法澄清剩余的产物。浓缩清亮的上清液，并且在存储之前冻干、备用。

冻干的上清液经鉴定，其肽组成按重量计约4-6％，优选4.7％，(在实验误差范围内)，由Bradford分析确定。优选的提取物按重量计具有由酚硫酸方法所确定的50％-60％(优选55％)的葡萄糖化合物。优选的提取物按重量计具有约4-6％，优选约4.8％的糖醛酸化合物。

2.制备CV提取物的纯化或部分纯化的活性组分

在图15中的流程图显示了制备部分纯化的提取物的示例方法。将干的粗CV提取物溶于水，并通过离心除去水溶性较小的物质。pH 4的水溶性CV提取物中的阳离子物质可以通过阳离子交换树脂吸收并除去。然后，通过对带负电荷的分子有选择性的任何技术可以进一步纯化活性成分。优选利用阴离子交换树脂DEAE纤维素。部分纯化的组分可以通过乙醇梯度分级分离或根据它们的分子量分离分子的凝胶过滤来进一步分级分离。优选的的分子量范围是0.7-3kDa。在五步的乙醇梯度中，从所有步骤中分离出活性组分，除了95％的水醇可溶性物质以外。利用本领域已知的一些标准方法如层析可以达到进一步的纯化。例如，通过肽酶处理可以从肽成分中分离出肽联葡聚糖的葡聚糖成分。通过葡聚糖酶处理，可以从葡聚糖成分中分离肽。通过选择性的蛋白质水解消化可以制备肽联葡聚糖的肽片段。通过凝胶电泳，任选在两维中，可以分离单个肽联葡聚糖和切出分离带。

V.确定纯化的提取物和活性成分的免疫刺激活性的方法

对不同的细胞类型，免疫刺激活性有不同的效果。对于不成熟的免疫细胞，当其受到免疫刺激剂攻击时，发生了一系列生化事件，包括磷脂合成增加，和二价阳离子通透性提高。然后不久发生了蛋白质、RNA和最终DNA的合成。最后的现象是DNA合成增加(这最终导致了细胞分裂)，形成淋巴细胞和骨髓细胞活化的定量测定的基础。通过采用一种掺入新合成DNA中的核苷酸前体，含氚的胸腺嘧啶(³H-Tdr)来脉冲标记培养物，从而测量DNA的合成。通过闪烁计数确定掺入的³H-Tdr相对于DNA合成速率的量。闪烁计数产生了通常用作标准测量促有丝分裂原反应性的每分钟计数(CPM)的数据。通过在对照培养物中测量CPM，使刺激培养物的CPM标准化以产生称为刺激指数的比例。

效应免疫细胞如巨噬细胞当被免疫刺激剂激活时能够分泌胞毒介质(例如NO^-)和细胞因子(例如白介素和组织坏死因子)。由于巨噬细胞只在免疫原刺激基础上分泌NO^-，提高巨噬细胞的NO^-的产生通常用作定量免疫原的免疫刺激活性的方法。在与免疫刺激剂温育的过程中，巨噬细胞产生的高活性NO^-将很快氧化成更稳定的亚硝酸盐(NO₂ ^-)。然后培养物上清液中的亚硝酸离子的量可以通过Griess反应来测量。

免疫刺激活性也可在免疫性的体内模型中测量。这些模型具有在整个动物水平整合免疫应答的优点。对免疫性的体内影响进行评估的可获得的模型包括重要的免疫器官的细胞性(活成分细胞的数目)和迟发型过敏性的检测。免疫学研究的最新趋势已经朝着更加重视利用离体淋巴细胞增殖反应以证明免疫反应性的方向发展^3，4。离体分析实验利用了培养的淋巴细胞增殖的能力，因为体外增殖是淋巴细胞已被充分识别的特性，并且已经显示与寄主免疫性有良好的关系。在药物治疗结束后，处死动物，回收免疫活性细胞。然后，细胞在体外培养一定时期，评估含氚胸腺嘧啶的细胞吸收。虽然，大多数免疫活性细胞培养时是可以增殖的，但不得不用免疫刺激剂，例如Con A和LPS来增强增殖以达到可测量的水平³。

迟发型过敏性反应与细胞介导的免疫性有良好的关系。接触超敏感性是一类迟发型过敏性；在皮肤表面的抗原，主要是半抗原，通过Langerhans细胞吸收、加工并呈递给T CD4⁺淋巴细胞，该淋巴细胞最终导致血管舒张和耳朵肿涨。强烈的接触性致敏物，如二硝基氟苯(DNFB)用于小鼠中诱导接触敏感性反应，其强度可以通过用药物处理动物或与化学物接触来调节。在致敏之前立即和致敏后24小时用数字卡尺测量耳朵的厚度。耳朵厚度的增加是延迟类型超敏感性的良好指征。

在临床和临床前研究中，对患者也可以测量免疫刺激活性，这表明免疫刺激剂具有增强癌症常规性治疗的临床效率，从无免疫应答状态恢复免疫功能和增强对感染的抗性的能力，这主要是由于他们的免疫防御系统的非特异刺激²。非特异免疫性可以通过抗原，或更直接地通过免疫原来加强。在分子水平，免疫原具有称为抗原决定簇的特殊结构单元，可以与某些免疫细胞的表面受体交联，导致克隆扩充或活化。

当在其中一种上述分析中引发统计学上显著的反应时，本发明的提取物或肽联葡聚糖或其活性成分具有免疫刺激活性。通常，将对提取物或肽联葡聚糖或其活性成分的反应与对照或空白对照剂比较。

VI.肠通透性

本发明的纯化的提取物、肽联葡聚糖及其活性成分也可以通过肠筛选其通透性。这在允许口服给药时是有的。筛选可以采用Caco-2细胞系，这是一个从结肠瘤派生的分化很好的人肠细胞系，其作为体外研究肠吸收的肠上皮细胞的替代物已经过严格验证。在人中的生物利用率与用

插入片段中的Caco-2单层得到的通透性结果之间的良好关系已经确立。通过大小排阻层析和上面所述的生物实验可以鉴定能够跨越Caco-2单层转运的成分的分子量分布和免疫原性^5，6。通透性也可以在体内动物模型中测量。

VII.对细胞反应的体外方法

CV提取物、肽联葡聚糖或活性成分可以用于许多体外或离体方法中。在一些方法中，分析对这些试剂的细胞反应得到了使这些试剂的剂量方案体内最佳的信息。在一些方法中，CV提取物、肽联葡聚糖或活性成分用作阳性对照来筛选其他药物对脾细胞或骨髓细胞的增殖或巨噬细胞的分泌的影响。如果阳性对照刺激脾细胞或骨髓细胞的增殖或巨噬细胞的分泌，而候选药物在平行反应中没有作用，那么可以得出结论，测试药物是无效的。在其他方法中，从有免疫紊乱的患者中得到增殖的PMB。用CV提取物、肽联葡聚糖或活性成分来离体处理淋巴细胞，然后返回给患者。正如利用刺激免疫系统的其他试剂，如Con A或LPS，CV提取物、肽联葡聚糖或活性成分也可以作为科研试剂上市，给学术团体研究细胞的活化状态或用作对照来发现刺激免疫系统的其他试剂。

VIII.经受治疗的患者

经受治疗的患者包括有免疫缺陷之风险，但还没有免疫缺陷的个体，以及目前正患有免疫缺陷的患者。免疫缺陷导致对机会感染的敏感性增强。所以，用CV提取物或肽联葡聚糖或其活性成分治疗的患者对机会感染的敏感性下降。

这些方法特别适用于治疗从初级病症产生的次级免疫缺陷。在一些紊乱中，次级免疫缺陷可能是短暂的，并且患者可能随着初级疾病，如结核病、麻风病的恰当治疗变成免疫活性。在其他病症中，次级免疫缺陷可能变成永久的，例如先天性风疹。所以，治疗方案可以根据初级病症来变化。各种紊乱是与次级免疫缺陷相关的，次级免疫缺陷可能是由感染、恶性肿瘤疾病、自身免疫疾病、蛋白质损失状态、免疫抑制治疗、外科手术或麻醉造成的。

可以导致次级免疫缺陷的感染包括：风疹、先天性风疹、麻疹、麻风病、结核病、球虫病、慢性感染、急性病毒感染、细胞肥大病毒、多重病毒感染和重复病毒感染。

可以导致次级免疫缺陷的恶性肿瘤疾病包括：霍奇金(Hodgkin)病、急性白血病、慢性白血病、非淋巴癌和骨髓瘤。

可以导致次级免疫缺陷的自身免疫疾病包括：全身性红斑狼疮(SLE)、类风湿关节炎和慢性活动肝炎。

可以导致次级免疫缺陷的蛋白质损失状态包括：肾病综合症和蛋白质损失肠病。

可以导致次级免疫缺陷的免疫抑制治疗包括：皮质类固醇、胞毒药物、烷化剂、抗代谢物、抗胸腺细胞球蛋白、辐射、环孢菌素、phenytoin和青霉胺。

可以导致次级免疫缺陷的其他病症包括：糖尿病、酒精肝硬变、营养失调、灼伤、结节病、脾切除术、镰刀细胞病、尿毒症、衰老、亚急性硬化性全脑炎、唐氏综合征(Down’s syndrome)、新生儿和早产儿。

VIII.治疗方法、药物组合物和给药方法

A.治疗方法

在预防性应用中，将药物组合物或药物以足以预防、减少或阻止免疫紊乱发展的量对易于发展成免疫紊乱或有此危险的患者给药。在治疗应用中，将组合物或药物以足以逆转、阻止或至少部分阻止免疫紊乱症状的量对怀疑发展或已经患有免疫疾病的患者给药。在预防和治疗方案中，通常以几个剂量给药本发明的云芝提取物或肽联葡聚糖或活性成分直至达到足够的反应。但是，在预防和治疗方案中，可以单个剂量给药本发明的提取物、肽联葡聚糖或活性成分或CV部分纯化的提取物，直至达到足够的反应。通常，监测治疗并给予重复的剂量。另外，治疗方案可以利用与治疗其他免疫介导的紊乱中所用的那些相似的剂量、给药途径和给药频率。

可以根据治疗的疾病、哺乳动物的种类和特定的给药方式来改变CV提取物、肽联葡聚糖或其活性成分与载体物质结合后所产生的单个剂量形式的量。对任何特定患者而言，“有效剂量”、“可药用剂量”或“可药用量”可以根据各种因素，包括所用的特定化合物的活性、物种、年龄、体重、总的健康状况、性别和正被治疗的患者的饮食；给药的时间和途径；代谢或排泄的速度；同时给药或过去已经给药的其他药物；免疫疾病的类型和严重程度；副作用的严重性，患者是动物还是人等。通常，患者是人，但是非人哺乳动物包括转基因哺乳动物也可以治疗。

对于本发明的方法中所用的任何提取物、肽联葡聚糖或活性成分，最初可以从非人动物模型估计人的有效剂量。利用本领域已知的参数，通过临床医生可以确定有效剂量。一般而言，开始时，剂量稍低于最佳有效剂量。然后，通过小量的增加提高剂量直至达到有效剂量(参见，Merck诊断和治疗手册，第16版，22卷，1992，Berkow，Merck研究实验室，Rathway，新泽西，引入本文作为参考)。

剂量需要滴定以使安全性和功效最佳。本文所述的化合物的毒性和治疗功效可以通过实验动物中的标准药物方法，例如通过确定LD₅₀(致死达到50％测试群体的剂量)和ED₅₀(在50％测试群体中治疗有效的剂量)来确定。毒性与治疗效果之间的剂量比例是治疗指数，并可以表达成LD₅₀与ED₅₀之间的比例。显示高治疗指数的化合物是优选的。从这些非人动物研究得到的数据可以用于配制人利用时没有毒性的剂量范围。这样的化合物的剂量优选位于包括小的或无毒性的ED₅₀的循环浓度的范围之内。恰当的配方、给药途径和剂量可以通过单个医师根据患者病症来选择(参见，例如Fingl等(1975)，治疗的药物原理(The Pharmacological Basis of Therapeutics)，第1章，引入本文作为参考)。

在一些方法中，CV提取物、肽联葡聚糖或活性成分以口服给药，剂量为每天1.0mg到1000mg/kg体重，剂量优选为20mg/kg到50mg/kg。在其他方法中，CV提取物、肽联葡聚糖或活性成分以口服给药，剂量为每天0.001mg到100mg/kg。CV提取物、肽联葡聚糖或活性成分可以以每天单个剂量或以每天多个剂量给药。在一些方法中，CV提取物、肽联葡聚糖或其活性成分以口服给药，每天剂量相当于每天每公斤体重至少50mg的CV粗提取物。

B.药物组合物和给药方法

CV提取物、肽联葡聚糖及其活性成分可单独以可药用盐或其可水解前体的形式，或以药物组合物形式来递送或施用给哺乳动物，例如病人或个体，在药物组合物中该化合物是以有效剂量与适当的载体或一种或多种赋形剂混合。固体口服剂量是优选的药物组合物。有效的方案指，药物或药物组合以有效量和频率，并通过适当的途径给药，至少可检测地预防、延迟、抑制或逆转至少一种免疫紊乱症状的发展。“有效剂量”、“可药用剂量”或“可药用量”指以适当的治疗方案给药时，CV提取物、肽联葡聚糖或其活性成分为达到所需的结果，例如刺激免疫应答，预防、延迟、抑制或逆转免疫紊乱症状或免疫紊乱发展的有效量。

CV提取物、肽联葡聚糖或其活性成分用于本发明的方法中时可以作为药物组合物单独，和/或与各种其他的可药用成分一起给药。药物组合物可以是固体(如粉末、颗粒、糖衣丸、片剂或丸剂)、半固体(如凝胶、糖浆或油膏)、液体或气体(如气雾剂或吸入剂)的形式。

用于本发明的适当的配方可以在Remington药物科学(Mack出版社，1985)，Philadephia，PA，第17版)和Langer，科学(1990)，249：1527-1533中找到，引入本文作为参考。本文所述的药物组合物可以常规方式配制，即混合、溶解、造粒、制成糖衣丸、研磨、乳化、包囊、包埋或冻干工艺。

CV提取物、肽联葡聚糖或活性成分可以和常用的赋形剂、稀释剂或载体一起配制并压成片剂，或配制成酏剂或方便口服给药的溶液。CV提取物、肽联葡聚糖或活性成分也可以配制成持续释放的剂量形式等。化合物的给药可以各种方法进行，包括口服、口腔、直肠、肠胃外、腹膜内、经皮、气管内、静脉内、皮下和肌内给药。口服给药是优选的。化合物可以以补给或持续释放的制剂形式局部给药而不是全身性方式给药。另外，化合物可以脂质体给药。进一步，化合物可以与食物结合而食用，或与可消费液体结合而作为饮料饮用。

为了口服给药，化合物可以采取以常规方式配制的丸剂、片剂、胶囊、粉末或颗粒形式。为了口服给药，组合物可以是流体形式，例如溶液、悬浮液或乳液。

为了口腔给药，化合物可以采取以常规方式配制的片剂或锭剂形式。

为了吸入给药，根据本发明使用的化合物是以气雾喷剂的形式从受压容器、喷雾器或注射喷洒器中利用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他适当的气体或从无推进剂的干粉吸入器中方便地递送出来。在受压气雾剂的情况中，剂量单位可以通过提供递送计量的阀来确定。用于吸入器或吹入器的明胶的胶囊和软片可以配制成含有化合物和适当粉底如乳糖或淀粉的粉末混合物。

化合物可以配制成通过注射，例如通过大丸药注射或连续输注用于肠胃外给药。注射的制剂可以表示成单位剂量形式，例如，安瓿或多剂量的容器，其中加入防腐剂。组合物可以采取如油基或水溶液载体中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制试剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。肠胃外给药的组合物配制成无菌、基本等渗并且完全符合美国食品和医药管理局的优质生产规范(GMP)条例。

CV提取物、肽联葡聚糖或活性成分也可以配制成直肠组合物，如栓剂或滞留的灌肠剂，例如含有常规的栓剂基质，如可可油、碳蜡、聚乙二醇或其他甘油，所有这些在体温中溶化，但在室温下仍然是固化的。

除了上述制剂以外，CV提取物、肽联葡聚糖或活性成分也可以配制成补给品。如此长期作用的制剂可以通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射给药。所以，例如，化合物可以与适当的聚合物或疏水物质(例如作为可接受油中的乳液)或离子交换树脂，或作为微溶性衍生物，例如作为微溶性盐来配制(参见例如，Urquhart等(1984)，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.24:199；Lewis编，1981，杀虫剂和药物释放，Plenum出版社，纽约，N.Y.，美国专利号3,773,919和3,270,960，引入本文作为参考)。

或者，可以利用疏水性药物化合物的其他递送系统。脂质体和乳液是众所周知的疏水药物的递送媒介物或载体的例子。在一些方法中，长期循环的，即stealth脂质体可以利用。在Woodle等，美国专利号5,013,556中概括地描述了这样的脂质体，其教导引入作为参考。本发明的化合物也可以通过受控释放方法、持续释放方法和/或递送装置如美国专利号3,845,770；3,916,899；3,536,809；3,598,123和4,008,719中所述的那些来给药，这些公开内容引入作为参考。

药物组合物也可以包括适当的固体或凝胶相载体或赋形剂。这样的载体或赋形剂的例子包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和多聚物如聚乙二醇。

XI.实施例

通过说明而不是限制的方式提供了下面的实施例。所以，通过选择试剂以及试剂的浓度、温度和其他可变参数可以举例本发明的应用，但不认为是对其的限制。本领域的那些专业技术人员将容易认识到非关键的参数，这些参数可以改变来完成本文所述的发明。

实施例1

云芝的粗提取物的制备

进行下面的步骤制备云芝(CV)粗提取物。将千的云芝(CV)果实体浸软。然后切碎浸软的CV果实体。从浸软、切碎的CV果实体除去色素。接着，抽提CV果实体。在碱性水溶液，例如氢氧化钠或氢氧化钾中煮沸CV果实体完成抽提。小于0.1N的碱性水溶液是优选的。在抽提步骤后，粗CV提取物的制备可以包括一个或多个以下步骤：例如通过过滤除去不溶性物质；例如通过离心澄清提取物；例如通过旋转蒸发器浓缩提取物；例如通过冻干器冷冻提取物或冷干提取物。得到的粗CV提取物然后可以利用或储存备用。

图1是说明CV粗提取物的制备方案步骤的流程图。通过在1L去离子水中浸泡约1小时使300g干的云芝(CV)果实体浸软。在滗析去离子水后，切碎浸软的CV果实体。从浸软、切碎的CV果实体可除去色素。在3L去离子水中浸没过夜，实现除去浸软、切碎的CV果实体的色素。通过在2L的0.01N氢氧化钠中温和恒定搅拌下煮沸浸软、切碎的CV果实体进行CV果实体的抽提。

将提取物倾倒在粗布上，除去不溶性物质，布中包裹了不溶性物质。4000rpm离心10分钟使得到的上清液澄清。然后，通过在80℃旋转蒸发，浓缩澄清的上清液，直到体积减少50％。接着，在-70℃冷冻澄清、浓缩的上清液，并且冻干。得到的粗CV提取物具有约43g到47g的干质量，颜色为黑棕色，并且质地蓬松。粗CV提取物可以立即使用或储存备用。

实施例II

粗CV提取物的物理和化学特征

分析CV粗提取物，评估其溶解度、熔点、降解温度和吸湿性。用于分析的方法和各个结果表示在表I中。

表1

 

结果	方法
		在水中高度可溶	在2毫升溶剂的玻璃试管中溶解10毫克的CV提取物。超声波破碎30分钟。在254nm处测量吸光度。
在乙醇中比水中更不溶	如上所述，除了溶剂是乙醇
		在丙酮中比水中更不溶	如上所述，除了溶剂是丙酮
在氯仿中不溶	如上所述，除了溶剂是氯仿
		在二氯甲烷中不溶	如上所述，除了溶剂是二氯甲烷
没有确定的熔点温度	1.差示扫描热量测定法利用了Perkin Elmer Pyris 1差示扫描热量计(带有Pyris Manager软件)。将样品放置于密封的铝盘中，在氮气净化下以10℃/分钟的加热速度，从40℃到90℃扫描(参见Ford，J.L.和Timmins P.Pharmaceutical Thermail Analysis-Techniques andApplications，Ellis Horwood Ltd.，Chichester，WestSussex，England，1989.)2.热重量分析利用了带有热分析控制器TAC 7/DX的PerkinElmer热重量分析仪TGA7。将样品放置于开放的盘中，以10℃/分钟的加热速度从40℃到110℃扫描(参见Ford，J.L.和Timmins P.PharmaceuticalThermal Analysis-Techniques and Applications，EllisHorwood Ltd.，Chichester，West Sussex，England，1989.)
		没有确定的降解温度	1.如上所述进行差示扫描热量测定法2.如上所述进行热重量分析
非吸湿性在恒定的相对湿度(RH)下温育后观察到的重量变化：在10-70％RH下温育14天后重量增加<5％	Chu K.K.W.和Chow A.H.L.，Pharm.Res.2000，17(9)：1133-1137。

分析CV粗提取物以确定平均分子量，以及中性糖、糖醛酸和肽/蛋白质的w/w百分数。还分析了CV粗提取物中葡萄糖作为单糖成分的存在和葡聚糖键(1→3)的存在。鉴定了CV粗提取物中存在的肽成分与碳水化合物成分的键合。用于分析和鉴定的方法，和各自结果表示在表II中。

表II

 

结果	方法
		平均分子量：2.6kDa分子量范围：0.5-40kDa	色谱
肽/蛋白质：4.7％w/w	Bradford，M.M.，Anal.Biochem.1976，72:248-254的Bradford实验
		中性糖：55％w/w	Dubois，M.等，Anal.Chem.，1956，28:350-356的酚硫酸方法
糖醛酸：4.8％w/w	Blumenkrantz，N.等，Anal.Biochem.1973，54:484-489的咔唑(Carbozole)分析
		作为单糖成分的葡萄糖	由Zhang Y.W.等，1997，63(00)：393-399的方法所确定的酸水解由Kiyohara，H.等，Carbohydr.Res.，1998，182:259-275的方法所确定的糖醇乙酸酯衍生作用由Kiyohara，H.等，Carbohy dr.Res.，1998，182:259-275所述的气相色谱
(1→3)葡聚糖	由Hakomori，S.，生物化学杂志，东京，1964，55：205-208的方法所确定的甲基化作用由Zhang Y.W.等，1997，63(00)：393-399的方法所确定的酸水解由Kiyohara，H.等，Carbohydr.Res.，1998，182:259-275的方法所确定的糖醇乙酸酯衍生作用由Kiyohara，H.等，Carbohydr.Res.，1998，182:259-275的方法所确定的GC/MS
		与碳水化合物成分紧密连接的肽成分	在不同色谱分析中两个成分的共洗脱

通过大小排阻层析确定粗CV提取物的平均分子量。将200μl的1-2mg/ml水溶液样品注射到高效液相色谱(HPLC)系统上(快效液相层析系统，Pharmacia)，在Superose 12 10/30柱中运行，用0.2M NaCl溶液pH7.0洗脱。然后，将洗脱液加样到2×40cm Superdex 75 10/30柱上，并用200mM乙酸铵pH7.0洗脱。收集洗脱液为1ml的组分。随后，将这些组分用作分析的样品。在210nm处通过分离过程监测UV吸光度。

样品的分子量范围是0.5-40kDa。样品的平均分子量为2.6kDa。

参考利用各种碳水化合物标准构建的校准曲线确定分子量。

图2A是大小排阻层析谱，显示CV粗提取物的蛋白质成分的洗脱图。样品中的蛋白质含量通过在254nm处监测含蛋白质的物质的洗脱图来检测(参见表II)。图2B是CV粗提取物的大小排阻层析谱，显示CV粗提取物的碳水化合物成分的洗脱图。在洗脱液中的碳水化合物含量通过酚硫酸测试来检测(参见表II)。

体外研究

实施例III

与CV粗提取物体外接触的活鼠脾细胞的增殖

通过颈位错处死三只ICR小鼠。麻醉取出处死的小鼠的脾。通过在不锈钢筛上温和挤压每个脾分离脾细胞。合并从每个小鼠分离的脾细胞，将得到的细胞悬浮液以1600rpm离心3分钟，倾弃上清液。在细胞沉淀中加入约6毫升的溶解缓冲液，以破坏沉淀中存在的红血球。随后用PBS洗去残留的溶解缓冲液。然后，在完全细胞培养基中悬浮脾细胞。

通过台盼蓝排除试验评估细胞悬浮液的生存力(参见Parslow T.G.免疫应答，医学免疫学；Sities D.P.，Terr A.I.，Parslow T.G.编Appletonand Lange：London，1997；第63-73页)。把活细胞悬浮液的细胞密度调节到2×10⁶细胞/毫升。将100μl细胞悬浮液接种到96孔的微滴平板(NUNC^TM)上。

然后，将接种的细胞与下列材料接触：(1)100μl的CV粗提取物的样品(终浓度1-500μg/ml)，(2)100μl的伴刀豆球蛋白A(Con A)(Sigma)(终浓度为0.016-4.0μg/ml)，作为阳性对照或(3)100μl的培养基，作为阴性对照。

然后，将接触细胞在加湿的95％ O₂和5％ CO₂空气中37℃下温育72小时。第54小时，用0.5μ Ci/10μl/孔的³H-甲基胸腺嘧啶脉冲标记细胞。然后在第72小时，用细胞收集器将细胞收集在玻璃纤维滤纸上，使用闪烁计数确定相对于DNA合成所掺入的³H-甲基胸腺嘧啶的量。通过阴性对照细胞中的CPM将接触细胞的每分钟计数(CPM)标准化以产生刺激指数。将接触细胞中的³H-甲基胸腺嘧啶的细胞掺入数(每分钟计数(CPM))除以阴性对照细胞的掺入数计算刺激指数。

在低Con A浓度时，用CV提取物处理小鼠的脾细胞的增殖活性是剂量依赖的。在ConA浓度为50μg/ml时，用CV提取物处理小鼠的脾细胞的增殖活性是对照的20倍。用浓度为100μg/ml到350μg/ml的CV粗提取物处理，并用浓度约1μg/ml到约3μg/ml的Con A刺激小鼠的脾细胞的增殖性反应是相似的。将结果表达为刺激指数(参见图3)。

实施例IV

与CV粗提取物体外接触的鼠骨髓细胞

通过颈位错处死5只ICR小鼠。麻醉取出处死小鼠的股骨。尽可能地清除与股骨连接的肌肉，取骨髓塞。用配有25G针头的2ml针筒装上PBS冲洗骨髓塞。合并从每个骨髓塞分离的骨髓细胞。制备细胞悬浮液，如实施例III所述测试细胞悬浮液的生存力。调节活细胞悬浮液的密度以产生4×10⁶个细胞/ml的细胞悬浮液。将100μl的细胞悬浮液接种在96孔的微滴平板(NUNC^TM)上。

然后，将细胞与下列材料接触：(1)100μl的CV粗提取物样品(终浓度25-200μg/ml)，(2)100μl的脂多糖(LPS)(Sigma)(终浓度2.5-20μg/ml)，作为阳性对照，或(3)100μl的培养基，作为阴性对照。将接触的细胞在95％ O₂和5％ CO₂的大气中37℃下温育120小时。第104小时，用0.5μCi/10μl/孔的³H-甲基胸腺嘧啶脉冲标记细胞。第120小时，收获细胞，并如上实施例III确定刺激指数。

图4说明了用CV粗提取物或LPS体外接触分离的鼠骨髓细胞的增殖效果。将结果表示为刺激指数。CV粗提取物显示在其浓度为200μg/ml时，骨髓增殖40倍。骨髓细胞与CV粗提取物接触的增殖反应比相似相对浓度的LPS时的反应更大。

实施例IV

与CV粗提取物体外接触的鼠巨噬细胞

用1ml的3％w/v的巯基乙酸盐水溶液腹膜内注射10只ICR小鼠。3天后，通过颈位错处死小鼠。打开腹膜并用PBS灌洗空隙来收获巨噬细胞。合并每个处死小鼠的PBS灌洗液。制备细胞悬浮液，如实施例III所述测试细胞悬浮液的生存力。调节活细胞悬浮液的密度以产生4×10⁶细胞/ml的细胞悬浮液。将100μl细胞悬浮液接种在96孔的微滴平板(NUNC^TM)上。

在加湿的95％ O₂和5％ CO₂的大气中，允许细胞37℃下于微滴平板的孔的底部附着1小时。接着，小心除去孔中的上清液。然后，将细胞与下列材料接触：(1)200μl浓度为25-200μg/ml的CV粗提取物，(2)200μl浓度为0.125-1μg/ml的LPS(Sigma)，作为阳性对照，或(3)200μl完全细胞培养基，作为阴性对照。将接触的细胞在加湿的95％ O₂和5％ CO₂的大气中37℃下温育24小时。

第24小时，由Griess反应确定无细胞的培养基中存在的硝酸盐的量(参见Green L.C.等，生物流体中的硝酸盐、亚硝酸盐和[15N]硝酸盐的分析，Anal.Biochem.，1982，126:131-138)。从各个微滴平板的孔中吸取150μl无细胞培养基的等分试样，并在新鲜微滴平板的孔中与50μl的Griess试剂反应10分钟。然后，在540nm处，利用微滴平板读数器(BTI，ELX800)测量等分试样的吸光度。

图5说明了与CV粗提取物或LPS体外接触的鼠腹膜巨噬细胞分泌一氧化氮提高。用CV粗提取物处理的鼠腹膜巨噬细胞的增殖活性导致一氧化氮分泌提高，在CV浓度小于约100μg/ml时是剂量依赖的。与浓度超过100μg/ml的CV粗提取物接触的细胞的增殖活性没有提高。LPS的增殖活性在低的LPS浓度时是剂量依赖的。

体外研究

实施例VI

对正常小鼠给药CV粗提取物

研究设计

20只ICR小鼠分成4组，每组各5只。如表III所示，组1用CV粗提取物腹膜内给药处理；组2用普通盐水腹膜内给药处理，作为阴性对照；组3用CV粗提取物口服给药处理；和组4用去离子水口服给药，作为阴性对照。利用胃内管强迫喂小鼠来完成口服给药。

表III显示了每个组的剂量和服药计划。在第4天处死组1和组2的小鼠。在第8天处死组3和组4的小鼠。

第1天，称重CV粗提取物，并溶于去离子水中，调节溶液的浓度到5mg/ml。将溶液超声波处理30分钟，以4000rpm离心10分钟除去任何不溶性物质，然后通过无菌的0.22μm过滤器(IWAKI)过滤到无菌瓶中。将溶液储存在4℃备用。

表III

 

处理组	小鼠数目	CV剂量	CV服药计划	给药途径
					1	5	50mg/kg/天(0.25ml的5mg/ml溶液注射入约25g的小鼠中)	第1、2和3天	腹膜内注射
2	5	0.25ml无菌普通盐水pH7.4	第1、2和3天	腹膜内注射
					3	5	50mg/kg/天(0.25ml的5mg/ml溶液口服喂进约25g的小鼠中)	第1-7天	口服
4	5	0.25ml去离子水	第1-7天	口服

1.腹膜内给药CV粗提取物对来自正常小鼠的活鼠脾细胞体内增殖的影响

当与对照小鼠(组2)比较时，对小鼠(组1)腹膜内给药CV粗提取物提高了体内活脾细胞的数目58.6％(参见图6A)。如上实施例III所述收获和分离脾细胞。制备细胞悬浮液，如实施例III所述测试细胞悬浮液的生存力。

2.腹膜内给药CV粗提取物对来自正常小鼠的LPS刺激的鼠骨髓细胞离体增殖的影响

用CV粗提取物腹膜内给药的小鼠(组1)的骨髓细胞显示了比对照小鼠(组2)的骨髓细胞更高的离体LPS刺激的增殖活性(参见图6B)。如上实施例IV所述收获和分离骨髓细胞。如上实施例IV所述测试CV粗提取物对骨髓细胞的增殖活性。

3.口服给药CV提取物对来自正常小鼠的活鼠脾细胞体内增殖的影响

当与对照小鼠(组4)比较时，给小鼠(组3)口服给药CV粗提取物提高了体内活脾细胞的数目40％(参见图7A)。如上实施例III所述收获和分离脾细胞。制备细胞悬浮液，并如上实施例III所述测试细胞悬浮液的生存力。

4.口服给药CV提取物对来自正常小鼠的LPS刺激的骨髓细胞离体增殖的影响

用CV粗提取物口服给药处理的小鼠(组3)骨髓细胞显示了比对照小鼠(组4)的骨髓细胞更高的离体LPS刺激的增殖活性(参见图7B)如上实施例IV所述收获和分离骨髓细胞。如上实施例IV所述测试CV粗提取物对骨髓细胞的增殖活性。

实施例VII

对无免疫应答的小鼠或重度无免疫应答的小鼠给药CV粗提取物研究设计

将40只ICR小鼠分成8组，每组为5只。第1天，通过腹膜内注射20mg/kg的环磷酰胺来免疫抑制组1-4的小鼠。同样在第1天，通过腹膜内注射100mg/kg的环磷酰胺来严重免疫抑制组5-8的小鼠(参见表IV的环磷酰胺剂量和服药计划)。在免疫抑制后第5、6和7天，组1用CV粗提取物腹膜内注射给药处理；组2用正常的普通盐水腹膜内给药处理。在免疫抑制后第1-7天，组3用CV粗提取物口服给药处理，以及组4用去离子水处理。在严重免疫抑制后第1-7天，组5用CV粗提取物口服给药处理；和组6用去离子水处理。在严重免疫抑制后第1-14天，组7用CV粗提取物口服给药处理；和组8用去离子水处理(参见表IV的CV粗提取物剂量、服药计划和给药途径)。组2、4、6和8是阴性对照组。第8天处死组1-6的小鼠。组7和组8的小鼠在第15天时处死。

用如下制备的环磷酰胺溶液注射组1-4。从Asta Medica购买环磷酰胺200mg/瓶(Endoxan-Asta)。按说明书指导，用无菌去离子水复溶环磷酰胺。用无菌普通盐水调节溶液的浓度到1mg/ml，在无菌瓶中等分，并储存在-80℃。在无菌条件下制备环磷酰胺溶液。第1天，将环磷酰胺溶液解冻，注射入组1-4的小鼠中。

用如对组1-4所述制备的环磷酰胺溶液注射组5-8，除了将溶液浓度调节到5mg/ml以外。第1天，将环磷酰胺解冻，并注射入组5-8的小鼠中。

如上实施例VI所述，制备CV粗提取物用于腹膜内或口服给药。

表IV

处理组	小鼠数目	环磷酰胺剂量和服药计划	CV剂量和服药计划	给药途径
					1	5	第1天，20mg/kg/天(0.5ml的1mg/ml溶液注射入约25g的小鼠)	第5、6和7天，50mg/kg/天(0.25ml的5mg/ml溶液口服喂进约25g的小鼠中)	腹膜内注射
2	5	第1天，20mg/kg/天(0.5ml的1mg/ml溶液注射入约25g的小鼠中)	第5、6和7天，0.25ml正常的无菌盐pH7.4(0.25ml的5mg/ml溶液口服喂进约25g的小鼠)	腹膜内注射
					3	5	第1天，20mg/kg/天(0.5ml的1mg/ml溶液注射入约25g的小鼠中)	第1-7天，50mg/kg/天(0.25ml的5mg/ml溶液口服喂进约25g的小鼠)	口服
4	5	第1天，20mg/kg/天(0.5ml的1mg/ml的溶液注射入约25g的小鼠中)	第1-7天，0.25ml去离子水	口服
					5	5	第1天，100mg/kg/天(0.5ml的5mg/ml溶液注射入约25g的小鼠中)	第1-7天，50mg/kg/天(0.25ml的5mg/ml溶液口服喂进约25g的小鼠)	口服
6	5	第1天，100mg/kg/天(0.5ml的5mg/ml溶液注射入约25g的小鼠中)	第1-7天，0.25ml去离子水	口服
					7	5	第1天，100mg/kg/天(0.5ml的5mg/ml溶液注射入约25g的小鼠中)	第1-14天，50mg/kg/天(0.25ml的5mg/ml溶液口服喂进约25g的小鼠)	口服
8	5	第1天，100mg/kg/天(0.5ml的5mg/ml溶液注射入约25g小鼠中)	第1-14天，0.25ml去离子水	口服

1.腹膜内给药CV粗提取物对来自无免疫应答小鼠的活鼠脾细胞体内增殖的影响

与对照小鼠(组2)比较，对免疫抑制小鼠(组1)腹膜内给药CV粗提取物显著提高了体内活脾细胞的数目(p<0.001)(参见图8A)。如实施例III所述收获和分离脾细胞。制备细胞悬浮液，如实施例III所述测试细胞悬浮液的生存力。

2.腹膜内给药CV粗提取物对来自无免疫应答小鼠的活鼠骨髓细胞体内增殖的影响

用CV粗提取物腹膜内给药处理的小鼠(组1)的骨髓细胞比对照小鼠(组2)的骨髓细胞显著提高了体内活骨髓细胞的数目(p<0.05)(参见图8A)。如实施例IV所述收获和分离骨髓细胞。如实施例III所述测试骨髓细胞的生存力。

3.口服给药(7天服药计划)CV粗提取物对来自无免疫应答的小鼠活鼠脾细胞体内增殖的影响

与对照小鼠(组4)比较，对免疫抑制小鼠(组3)口服给药CV粗提取物不会提高体内活脾细胞的数目(参见图8B)。并且如实施例III所述收获和分离脾细胞。制备细胞悬浮液，并且如实施例III所述测试细胞悬浮液的生存力。

4.口服给药(7天服药计划)CV提取物对来自无免疫应答的小鼠的活小鼠骨髓细胞体内增殖的影响

用CV粗提取物口服给药处理的小鼠(组3)的骨髓细胞与对照小鼠(组4)的骨髓细胞比较显著提高了体内活骨髓细胞的数目(p<0.005)(参见图8B)。并且如实施例IV所述收获和分离骨髓细胞。制备细胞悬浮液，如实施例III所述测试细胞悬浮液的生存力。

5.口服给药CV粗提取物(7天服药计划)对来自重度无免疫应答的小鼠的活鼠脾细胞体内增殖的影响

与对照小鼠(组6)比较，对重度无免疫应答的小鼠(组5)口服给药CV粗提取物提高了体内活脾细胞的数目。但是，提高的数量在统计学上不显著(参见图8C)。如实施例III所述收获和分离脾细胞。制备细胞悬浮液，如实施例III所述测试细胞悬浮液的生存力。

6.口服给药CV粗提取物(7天服药计划)对来自重度无免疫应答的小鼠的活鼠骨髓细胞体内增殖的影响

与对照小鼠(组6)比较，对重度无免疫应答的小鼠(组5)的口服给药CV粗提取物显著提高了体内活骨髓细胞的数目(p<0.01)(参见图8C)。并且如实施例IV所述收获和分离骨髓细胞。制备细胞悬浮液，如实施例III所述测试细胞悬浮液的生存力。

7.口服给药(14天服药计划)CV粗提取物对来自重度无免疫应答的小鼠的活鼠脾细胞体内增殖的影响

当与对照小鼠(组8)比较时，对免疫抑制的小鼠口服给药CV粗提取物不增加体内活脾细胞的数目(参见图9A)。如实施例III所述收获和分离脾细胞。制备细胞悬浮液，如实施例III所述测试细胞悬浮液的生存力。

8.口服给药(14天服药计划)CV提取物对来自重度无免疫应答的小鼠的活鼠骨髓细胞体内增殖的影响

当与对照小鼠(组8)比较时，用CV粗提取物口服给药处理的小鼠(组7)的骨髓细胞显著增加了体内活骨髓细胞的数目(P<0.05)(参见图9A)。如实施例IV所述收获和分离骨髓细胞。如实施例IV所述测试CV粗提取物对骨髓细胞的增殖活性。

9.口服给药CV提取物(14天服药计划)对来自严重免疫抑制的小鼠的Con刺激脾细胞离体增殖的影响

用CV粗提取物口服给药处理的小鼠(组7)的脾细胞比对照小鼠(组8)的脾细胞显示了更大的离体增殖活性(参见图9B)。如实施例III所述收获和分离脾细胞。如实施例III所述测试CV粗提取物对脾细胞的增殖活性。

10.口服给药CV提取物对来自重度无免疫应答的小鼠的LPS刺激的骨髓细胞离体增殖的影响

用CV粗提取物口服给药处理的小鼠(组7)的骨髓细胞比对照小鼠(组8)的骨髓细胞显示了更大的离体LPS刺激的增殖活性(p<0.05)(参见图9C)。如实施例IV所述收获和分离骨髓细胞。如实施例IV所述测试CV粗提取物对骨髓细胞的增殖活性。

实施例VIII

无免疫应答的小鼠中的剂量反应研究

研究设计

将20只ICR小鼠分成4组，每组各5只。第1天，通过腹膜内注射20mg/kg环磷酰胺来免疫抑制组1-4的小鼠(参见表V的环磷酰胺剂量和服药计划)。在给药环磷酰胺后第1-7天，用5，20和50mg/kg/天的CV粗提取物口服给药处理组1、2和3的小鼠。在环磷酰胺给药后第1-7天，用去离子水处理组4的小鼠(参见表V的CV粗提取物剂量和服药计划)。组4是阴性对照组。组1-4的小鼠在第8天处死。

制备环磷酰胺并且如实施例VII中所述给药。

如实施例VI中所述制备用于口服给药50mg/kg/天的CV粗提取物。如实施例VI所述制备口服给药5mg/kg/天和20mg/kg/天CV提取物，除了将溶液浓度分别调节至0.5mg/ml和2mg/ml。

表V

 

处理组	小鼠数目	环磷酰胺剂量和服药计划	CV剂量和服药计划	给药途径
					1	5	第1天，20mg/kg/天(0.5mg的1mg/ml溶液注射入约25g的小鼠中)	第1-7天，5mg/kg/天(0.25ml的0.5mg/ml溶液口服喂进约25g的小鼠)	口服
2	5	第1天，10mg/kg/天(0.5ml的1mg/ml溶液注射入约25g的小鼠中)	第1-7天，20mg/kg/天(0.25ml的2mg/ml溶液口服喂进约25g的小鼠)	口服
					3	5	第1天，20mg/kg/天(0.5ml的1mg/ml溶液注射入约25g的小鼠中)	第1-7天，50mg/kg/天(0.25ml的5mg/ml溶液口服喂进约25g的小鼠)	口服
4	5	第1天，20mg/kg/天(0.5ml的1mg/ml的溶液注射入约25g的小鼠中)	第1-7天，0.25ml去离子水	口服

1.口服给药不同剂量的CV提取物对来自免疫抑制的小鼠的活鼠脾细胞体内增殖的影响

当与对照小鼠(组4)比较时，对小鼠(组1)以5mg/kg/天和对小鼠(组2)以20mg/kg/天口服给药CV粗提取物，以剂量依赖的方式提高了体内活脾细胞的数目(参见图10)。当与对照小鼠(组4)比较时，以50mg/kg/天对小鼠(组3)口服给药CV粗提取物不会增加体内活脾细胞的数目(参见图10)。组3的小鼠中发现的数据与如上所讨论的实施例VIII和图8A中出现的结果一致。

如实施例III中所述收获和分离脾细胞。制备细胞悬浮液，并如上实施例III所述测试细胞悬浮液的生存力。

2.口服给药不同剂量的CV提取物对来自免疫抑制的小鼠的活鼠骨髓细胞体内增殖的影响

当与对照小鼠(组4)比较时，对小鼠(组1)以5mg/kg/天，对小鼠(组2)以20mg/kg/天，对小鼠(组3)以50mg/kg/天口服给药CV粗提取物，以剂量依赖的方式提高了体内活骨髓细胞的数目(参见图10)。当与对照组小鼠(组4)比较时，对组2的小鼠口服给药CV提取物提高了骨髓细胞的增殖(p<0.01)；和当与对照小鼠组(组4)比较时，对组3的小鼠口服给药CV提取物提高了骨髓细胞的增殖(p<0.001)。

如实施例IV所述收获和分离骨髓细胞。制备细胞悬浮液，并且如实施例III所述测试细胞悬浮液的生存力。

实施例IX

对正常小鼠、无免疫应答的小鼠和重度无免疫应答的小鼠口服给药：对细胞介导的免疫应答的影响

研究设计

利用小鼠模型来确定细胞介导的免疫应答的增加。接触超敏感性是细胞介导的免疫应答。这一模型的基础是标准的接触超敏感性研究，这依赖于对小鼠耳朵肿胀的测量来确定接触超敏感性的表达。

然后，将36只小鼠分成6组，每组各6只。为了允许将来鉴定个体，在其尾巴上标记各个小鼠。组1和组2是正常小鼠；组3和4是无免疫应答的小鼠，和组5和6是重度无免疫应答的小鼠。在第1-7天时，组1、3和5用50mg/kg/天的CV粗提取物口服给药处理。在第1-7天，组2、4和6用0.25ml去离子水口服给药处理。在第3和4天，所有36只小鼠用2，4-二硝基-1-氟苯(DNFB)致敏。在第7天，用DNFB攻击所有36只小鼠。在第8天，对所有36只小鼠进行耳朵测量(参见表VI)。

如上文实施例VI所述制备CV粗提取物用于对组1、3和5口服给药。如上文实施例VI和表III所述给药CV粗提取物(同时参见表VI中CV粗提取物剂量和服药计划)。

如上文实施例VII所讨论，制备环磷酰胺用于存储和给药。如上文实施例VII和表IV中所述，第1天给药20mg/kg来免疫抑制组3和4的小鼠。如上文实施例VII和表IV中所述，第1天给药100mg/kg来严重免疫抑制组5和6的小鼠(参见表VI的环磷酰胺剂量和服药计划)。

在第3和第4天，如下用2，4-二硝基-1-氟苯(DNFB)致敏所有36只小鼠。通过用吸管将25μl的0.25％w/v的DNFB直接应用到各个小鼠剃光的腹部，并通过将5μl的0.25％w/v的DNFB直接施加到各个小鼠的脚蹼来完成接触。在第7天，如下用2，4-二硝基-1-氟苯(DNFB)攻击所有36只小鼠。通过用吸管将10μl的0.20％w/v的DNFB直接施加到各只小鼠每个耳朵的两侧来完成接触。在第8天，利用数字卡尺，即Mitutoyo数字测微计对耳朵厚度进行耳朵测量。

表VI

 

处理组	小鼠数目	环磷酰胺的剂量(腹膜内给药)和服药计划	DNFB剂量和服药计划	CV剂量(口服给药)和服药计划
					1	6	N/A	第3和4天，25μl的0.25％w/v的DNFB涂在剃光的腹部和5μl涂在各个脚蹼上。第7天，10μl的0.2％w/v的DNFB涂在每个耳朵两侧。第8天，测量耳朵厚度。	第1-7天，50mg/kg/天(0.25ml)(0.25ml的5mg/ml溶液口服喂进约25g的小鼠)
2	6	N/A	与组1相同	第1-7天，0.25ml去离子水
					3	6	第1天，20mg/kg/天(0.5ml的1mg/ml的溶液注射入约25g的小鼠中)	与组1相同	第1-7天，50mg/kg/天(0.25ml的5mg/ml溶液口服喂进25g的小鼠)
4	6	第1天，20mg/kg/天，(0.5ml的1mg/ml的溶液注射入约25g的小鼠中)	与组1相同	第1-7天，0.25ml去离子水
					5	6	第1天，100mg/kg/天(0.5ml的5mg/ml溶液注射入约25g的小鼠中)	与组1相同	第1-7天，50mg/kg/天(0.25ml的5mg/ml溶液口服喂进约25g的小鼠)
6	6	第1天，100mg/kg/天(0.5ml的5mg/ml溶液注射入约25g的小鼠中)	与组1相同	第1-7天，0.25ml去离子水

1.用CV提取物口服给药处理正常小鼠的结果

如小鼠耳朵肿胀测量所示，正常小鼠(组1)比对照小鼠(组2)有更显著高的超敏感性反应(p<0.05)(参见图11)。

2.用CV提取物口服给药处理免疫抑制小鼠的结果

如小鼠耳朵肿胀测量所示，免疫抑制小鼠(组3)比对照小鼠(组4)有更显著高的超敏感性反应(p<0.05)(参见图11)。

免疫抑制的小鼠(组3)的超敏感性反应与对照小鼠(组2)中的超敏感性反应显著不同。

3.用CV提取物口服给药处理严重免疫抑制的小鼠的结果

如小鼠耳朵肿胀测量，严重免疫抑制的小鼠(组5)比对照小鼠(组6)有更显著高的超敏感性反应(p<0.001)(参见图11)。

严重免疫抑制小鼠(组5)的超敏感性反应(p<0.001)比在免疫抑制小鼠(组3)(p<0.05)或在正常小鼠(组1)(p<0.05)中观察到的超敏感性反应更大。

实施例X

对正常小鼠长期(30天)口服给药CV提取物

研究设计

将10只ICR小鼠分成两组，每组各5只。如表VII所示，组1用CV粗提取物口服给药处理，以及组2用去离子水口服给药处理，作为阴性对照。表VII显示各个组的剂量和服药计划。两个组的小鼠在第31天时处死。如上文实施例VI中所讨论，制备CV粗提取物、储存和给药(同时参见表VII)。

表VII

 

处理组	小鼠数目	CV剂量	CV服药计划	给药途径
					1	5	50mg/kg/天(0.25ml的5mg/ml溶液口服喂进约25g的小鼠)	第1-30天	口服
2	5	0.25ml去离子水	第1-30天	口服

1.长期口服给药(30天)CV粗提取物对来自正常小鼠的活鼠脾细胞体内增殖的影响

当与对照小鼠(组2)比较时，对小鼠(组1)口服给药CV粗提取物不会显著提高体内活脾细胞的数目(参见图12A)。如实施例III所述收获和分离脾细胞。制备细胞悬浮液，并如上文实施例III所述测试细胞悬浮液的生存力。

2.长期口服给药CV粗提取物对来自正常小鼠的LPS刺激的鼠骨髓细胞体内增殖的影响

当与对照小鼠(组2)比较时，对小鼠(组1)口服给药CV粗提取物不会显著增加体内活骨髓细胞的数目(参见图12A)。如实施例IV所述收获和分离骨髓细胞。如上文实施例III所述测试骨髓细胞的生存力。

3.长期口服给药CV粗提取物对来自正常小鼠的活鼠脾细胞离体增殖的影响

用CV粗提取物(组1)处理的脾细胞的增殖反应比对照小鼠(组2)的增殖反应更大(参见图12B)。如实施例III所述收获和分离脾细胞。制备细胞悬浮液，并如上文实施例III所述测试细胞悬浮液的生存力。用ConA刺激脾细胞，并且如上文实施例V所讨论计算刺激指数。

4.长期口服给药CV粗提取物对来自正常小鼠的LPS刺激的骨髓细胞离体增殖的影响

用CV粗提取物口服给药处理的小鼠(组1)的骨髓细胞比对照小鼠(组2)的骨髓细胞显示了更大的离体LPS刺激的增殖活性(参见图12C)。

如实施例IV所述收获和分离骨髓细胞。如上文实施例IV所述测试CV粗提取物对骨髓细胞的增殖活性。

实施例XI

口服给药CV粗提取物的急性毒性

第1天，用1g/kg的CV粗提取物口服给药处理各个性别的5只ICR小鼠，观察毒性信号14天。在观察期，没有小鼠死亡，并在整个观察期，10只小鼠中没有一只显示任何毒性信号。

如上文实施例VI所述，制备CV粗提取物用于对10只小鼠口服给药(除浓度以外)。一次性给药CV粗提取物。

对10只小鼠给药的CV粗提取物是无内毒素污染的。将2mg/ml的CV粗提取物样品进行内毒素测试。利用Limulus AmebocyteLysate(LAL)测试试剂盒(Cape Cod Ltd.)进行测试，检测极限是0.25EU/ml LAL。

实施例XII

负电荷密度对肽联葡聚糖的免疫活性的影响

将通过阴离子交换层析方法分级分离到各种负电荷密度组中的CV肽聚葡聚糖即C1D2、C1D3、C1D4和C1D5的体外免疫活性进行比较。图13说明了与C1D2、C1D3、C1D4和C1D5体外接触的活鼠脾细胞的增殖。在多种组分中观察到了大的免疫力差异。高负电密度的肽联葡聚糖比低负电密度组分和未分级分离的CV提取物展示了更高的最大活性(即平稳水平)和潜力(即在低样品浓度时活性陡峭上升)。这表明负电密度是CV派生的肽联葡聚糖的免疫原性的重要决定簇。如上文实施例III所述评估了体外的免疫活性。

实施例XIII

分子量对肽联葡聚糖的免疫活性的影响

对组分C1E8、C1E6、C1E4、C1E2和C1E0确定体外免疫活性。图14说明鼠腹膜巨噬细胞与C1E8、C1E6、C1E4、C1E2和C1E0体外接触后引起一氧化氮分泌增加。免疫活性没有限定到特别的分子量范围。C1E8、C1E6、C1E4、C1E2和C1E0提供了相似的剂量反应图，在100和200μg/ml之间达到平稳态。最大(平稳)活性随着组分的分子量提高而提高。如上文实施例III所述评估体外免疫活性。

实施例XIV

制备云芝部分纯化的提取物

云芝(CV)部分纯化的提取物的制备方法是将通过实施例I所述方法制备的CV粗提取物溶解，进行两步层析分离和一步乙醇分级分离。将CV粗提取物溶液进行第一步层析，例如CM纤维素柱，以除去阳离子物质。将得到的洗脱液进行第二步层析，例如DEAE纤维素柱以结合阴离子物质。然后这一洗脱液根据分子量进行分离，方案为例如乙醇分级分离或凝胶过滤。得到的洗脱液，CV部分纯化的提取物，可以通过任何纯化技术进一步纯化，从CV部分纯化的提取物中除去阳离子。

图15说明在图1的粗CV提取物的活性成分进一步纯化方案中所用步骤的流程图。将如实施例I方法制备的1.0g的CV粗提取物溶于去离子水中。溶解的CV粗提取物在4000rpm下离心10分钟，除去不溶性物质。接着，通过0.45μm滤纸(IWAKI)过滤上清液进一步除去不溶性颗粒。

用0.5M NaOH洗涤3次，每次30分钟平衡600ml的Fibrous(Sigma)CM纤维素开放玻璃柱(Bio-Rad)，然后用0.5M HCl洗涤3次，每次30分钟。用去离子水平衡柱。

然后，将上清液过柱，收集洗脱液(参见图15的缓冲液条件)。分析组分活性。将具有活性的组分C1过DEAE纤维素柱，收集洗脱液(参见图15的缓冲液条件)。分析组分活性。组分C1D5进行乙醇分级分离(参见图15的缓冲液条件)，并且如实施例III所述利用鼠脾细胞分析得到的组分的活性。CV部分纯化的提取物组分C1D5E8、C1D5E7、C1D5E4和C1D5EX展示了活性。冻干组分C1D5E8、C1D5E7、C1D5E4和C1D5EX，分别称重为5、14、49和13mg。对组分C1D5E8、C1D5E7、C1D5E4和C1D5EX另进行纯化步骤，特别是除去阳离子分子的那些步骤。

实施例XV

在CV肽联葡聚糖中作为抗原决定簇的肽成分的作用

这一实施例与具有体外促有丝分裂活性的CV组分基本结构单元的组合物(中性糖、糖醛酸和蛋白质/肽)相关。图16显示了体外促有丝分裂反应的刺激指数和各个组分的基本结构单元的含量之间的关系。对于分析的CV组分，肽含量与促有丝分裂活性密切相关(r＝0.99，p<0.05)。促有丝分裂活性和糖醛酸含量之间的相关系数在10％水平几乎不显著(r＝0.61)，与中性糖的关系不显著。如上文实施例III所述评估体外免疫活性。

实施例XVI

CV部分纯化组分的物理化学和生物学特征

确定组分C1D5E8、C1D5E7和C1D5EX的分子量范围和平均分子量(参见表A)。

表A

C1D5E8、C1D5E7和C1D5EX的分子量范围

 

组分	最初的(kDa)
		C1D5E8	0.7-2.6；平均＝0.8
C1D5E7	1.6-52；平均＝2.6
		C1D5EX	0.8-111(峰严重拖尾)；平均＝6.2

确定组分C1D5E8、C1D5E7和C1D5EX中中性糖、糖醛酸和蛋白质的含量(参见表B)。

表B

C1D5E8、C1D5E7和C1D5EX的化学组成

 

组分	碳水化合物含量(％总质量)	糖醛酸含量(％总质量)	蛋白质(％总质量)
				C1D5E8	18.77±1.20	1.32±0.15	5.04±0.21
C1D5E7	33.72±1.48	5.23±4.28	12.01±0.24
				C1D5EX	75.86±6.82	16.95±0.92	8.76±0.31

如实施例II所述，对于组分C1D5E8、C1D5E7和C1D5EX确定中性糖、糖醛酸和蛋白质的含量。根据GC/MS分析，葡萄糖是唯一可检测的单糖。葡萄糖分子是通过1→3键连接的。

确定组分C1D5E7的蛋白质/肽成分的氨基酸序列是Asp-Cys-Pro-Pro-Cys-Glu(SEQ ID NO：1)。利用氨基酸测序仪(装有HPLC系统的Hewlett Packard 1000A蛋白质测序仪)确定了SEQ ID NO：1。

确定CV部分纯化的组分C1D5E8、C1D5E7和C1D5EX的免疫活性(参见图15)。图17显示三个部分纯化的活性CV组分即C1D5E8、C1D5E7和C1D5EX对鼠腹膜巨噬细胞分泌一氧化氮的刺激活性。发现所有CV部分纯化的组分与LPS具有同样的活性和效力(参见图17)。

实施例XVII

CV粗提取物和CV部分纯化的提取物的分子量对肠通透性的影响

在体外利用Caco-2细胞单层Transwell方法确定CV粗提取物和CV部分纯化的提取物组分C1D5E8、C1D5E7和C1D5EX的肠通透性。比较天然CV样品及其可渗透Caco-2细胞的化合物的分子量分布。利用与Supedex 75 10/30柱偶联的HPLC系统进行分析。洗脱缓冲液是200mM氯化钠溶液、pH7.0，洗脱液在UV210nm处监测。

所有实验是在温控条件下37℃时进行的。将掺有80mM氯化镁和90mM氯化钙的磷酸缓冲盐(PBS)用作所有通透性测量的转运缓冲液。实验前，用转运缓冲液洗涤细胞单层两次。将1.5ml含有待测样品的转运缓冲液加入到Caco-2细胞单层的基底外侧。37℃平衡30分钟后，将样品溶液与Transwell一起转移到先用2.6ml转运缓冲液填充的成簇的平板上。实验结束时，在基底外侧收集透过细胞的成分。将收集的样品脱盐和冻干，用于随后的化学和生物鉴定。

1.CV粗提取物

下面表C显示可透过Caco-2细胞单层的CV粗提取物成分(kDa)。

图18A是CV粗提取物的大小排阻层析谱，以及图18B说明在转运研究后收集的CV粗提取物可渗透Caco-2细胞的内容物。按实施例I制备的CV粗提取物，分子量范围为0.5-40kDa，平均为2.6kDa。如图18B所示，7.07和8.89ml处洗脱的峰存在于基底室中收集的每个样品(包括对照，即不含CV粗提取物)中。这一结果表明，峰对于CV粗提取物样品不是天生的，但可能是由于从Caco-2细胞中侵蚀掉的大分子。17.67ml组分中洗脱的峰似乎是由于CV粗提取物中存在的小分子，而不是生物活性葡聚糖。根据图18A和18B中所示的分子量图，我们得出结论，低分子量成分比高分子量成分更容易跨越单层。另外，我们还得出结论，3kDa可能是肠吸收CV粗提取物的分子量上限。

表C

C1D5E8、C1D5E7和C1D5EX的分子量范围

 

	可渗透Caco-2细胞单层的成分(kDa)
		CV粗提取物	0.3-5(但主要在0.3-3之间)平均＝0.7

2.CV部分纯化的提取物C1D5E8、C1D5E7和C1D5EX

下面表D显示可渗透Caco-2细胞单层的组分C1D5E8、C1D5E7和C1D5EX的成分(kDa)。

图19A是C1D5E8中可以渗透Caco-2细胞的物质的大小排阻层析谱。C1D5E8的平均分子量是0.8kDa。如图19B所示，肽联葡聚糖的主要量洗脱在16.73ml组分中，表明在C1D5E8中存在的约0.7kDa的成分转运跨过体外吸收模型的单层。

图20A是在C1D5E7中可渗透Caco-2细胞的物质的大小排阻层析谱。C1D5E7具有的平均分子量为2.6kDa(参见图20A)。在转运研究结束时，在Caco-2细胞单层的基底侧只有更低分子量的成分可以检测到(即平均分子量为1.2kDa)(参见图20B)。

图21A是C1D5EX中可渗透Caco-2细胞的物质的大小排阻层析谱。C1D5EX的平均分子量估计约为6kDa(参见图21A)。图21B表明除了在17.67ml处洗脱的小分子量以外，非常少量的其他成分也通过肠屏障渗透到单层的基底外侧。

表D

C1D5E8、C1D5E7和C1D5EX的分子量范围

 

组分	对Caco-2细胞单层可渗透的成分(kDa)
		C1D5E8	0.3-2；平均＝0.7
C1D5E7	0.3-5(但主要在0.3-3之间)；平均＝1.2
		C1D5EX	检测到不显著的量

实施例XVIII

与CV部分纯化的提取物的可渗透Caco-2细胞的成分体外接触的鼠巨噬细胞

图22说明用CV部分纯化提取物的可渗透Caco-2细胞的成分或LPS接触的鼠腹膜巨噬细胞对一氧化氮分泌的体外影响。所有CV部分纯化的样品的可渗透细胞的成分是免疫活性的，并且所有样品比LPS有更大的活性。较低分子量组分和中等分子量组分C1D5E8、C1D5E7分别比更高分子量组分C1D5EX显示有更强的活性。在C1D5E8和C1D5E7中的肽联葡聚糖具有的平均分子量小于约3kDa。

实施例XIX

对正常小鼠给药CV部分纯化的提取物

研究设计

将25只ICR小鼠分成5组，每组各5只。如表VIII所示，如下处理各组。组1用CV部分纯化的提取物C1D5E8腹膜内给药处理；组2用CV部分纯化的提取物C1D5E7腹膜内给药处理；组3用CV部分纯化的提取物C1D5E4腹膜内给药处理；组4用CV部分纯化的提取物C1D5EX腹膜内给药处理；和组5用普通盐水腹膜内给药处理，作为阴性对照。

表VIII表明每个组的剂量和服药计划。在第8天处死组1-5的小鼠。

制备和储存CV粗提取物，如上文实施例VI所述，用于腹膜内或口服给药。

表VIII

 

处理组	小鼠数目	环磷酰胺剂量和服药计划	CV剂量和服药计划	给药途径
					1	5	第1天，20mg/kg/天(0.5ml的1mg/ml溶液注射入约25g的小鼠中)	C1D5E8第5-7天，50mg/kg/天(0.25ml的5mg/ml溶液注射入约25g的小鼠中)	腹膜内
2	5	第1天，20mg/kg/天(0.5ml的1mg/ml溶液注射入约25g的小鼠中)	C1D5E7第5-7天，50mg/kg/天(0.25ml的5mg/ml溶液注射入约25g的小鼠中)	腹膜内
					3	5	第1天，20mg/kg/天(0.5ml的1mg/ml溶液注射入约25g的小鼠中)	C1D5E4第5-7天，50mg/kg/天(0.25ml的5mg/ml溶液注射入约25g的小鼠中)	腹膜内
4	5	第1天，20mg/kg/天(0.5ml的1mg/ml溶液注射入约25g小鼠中)	C1D5EX第5-7天，50mg/kg/天(0.25ml的5mg/ml溶液注射入约25g的小鼠中)	腹膜内
					5	5	第1天，20mg/kg/天(0.5ml的1mg/ml溶液注射入约25g的小鼠)	第5-7天，0.25ml无菌普通盐水溶液pH7.4	腹膜内

1.腹膜内给药CV部分纯化的提取物对来自正常小鼠的活鼠脾细胞体内增殖的影响

当与对照小鼠(组5)比较时，所有组(组1-4)(p<0.001)显示体内活脾细胞的数目增加(参见图23A)。组1-3中，C1D5E8、C1D5E7和C1D5E4分别显示脾细胞数提高了约100％。组4中，C1D5EX(最高分子量的CV部分纯化的提取物)表明脾细胞数提高约64％。

如实施例III所述收获和分离脾细胞。制备细胞悬浮液，并如上文实施例III所述测试细胞悬浮液的生存力。

2.腹膜内给药CV部分纯化的提取物对来自正常的小鼠的活骨髓细胞体内增殖的影响

所有组(组1-4)表明了当与对照组(组5)比较时，体内活骨髓细胞数增加(参见图23B)。只有组4中的C1D5EX表现出活骨髓细胞数在统计学上显著增加(p<0.002)。

如实施例IV所述收获和分离骨髓细胞。制备细胞悬浮液，并如上文实施例III所述测试细胞悬浮液的生存力。

实施例XX

对无免疫应答的小鼠给药CV部分纯化的提取物

一般材料和方法

将25只ICR小鼠分成5组，每组各5只。如表IX所示，如下处理各组。如上文实施例VII所述免疫抑制组1-5的小鼠。组1用CV部分纯化的提取物C1D5E8口服给药处理；组2用CV部分纯化的提取物C1D5E7口服给药处理；组3用CV部分纯化的提取物C1D5E4口服给药处理；组4用CV部分纯化的提取物C1D5EX口服给药处理；和组5用去离子水口服给药处理，作为阴性对照。表IX表明各个组的剂量和服药计划。组1-5的小鼠在第8天处死。

如实施例VII所述制备和给药环磷酰胺。如上文实施例VI所述，制备和储存CV粗提取物用于腹膜内或口服给药。

表IX

 

处理组	小鼠数目	CV部分纯化的片段和剂量	CV服药计划	给药途径
					1	5	C1D5E850mg/kg/天(0.25ml的5mg/ml溶液口服喂进约25g的小鼠)	第1-7天	口服
2	5	C1D5E750mg/kg/天(0.25ml的5mg/ml溶液口服喂进约25g的小鼠)	第1-7天	口服
					3	5	C1D5E450mg/kg/天(0.25ml的5mg/ml溶液口服喂进约25g的小鼠)	第1-7天	口服
4	5	C1D5EX50mg/kg/天(0.25ml的5mg/ml溶液口服喂进约25g的小鼠)	第1-7天	口服
					5	5	0.25ml去离子水	第1-7天	口服

1.口服给药CV部分纯化的提取物对来自无免疫应答的小鼠的活鼠脾细胞体内增殖的影响

当与对照小鼠(组5)比较时，对组1-4的小鼠口服给药CV部分纯化的提取物提高了体内活脾细胞的数目(参见图24A)。当与对照小鼠(组5)比较时，对组1给药C1D5E8显著提高了(p<0.01)体内活脾细胞的数目(增加了66％)。当与对照小鼠(组5)比较时，对组2给药C1D5E7显著提高了(p<0.01)体内活脾细胞的数目。当与对照小鼠(组5)比较时，对组3给药C1D5E4显著提高了(p<0.05)体内脾细胞的数目。当与对照小鼠(组5)比较时，对组4给药C1D5EX没有显著增加体内活脾细胞的数目。

如实施例III所述收获和分离脾细胞。制备细胞悬浮液，并且如实施例III所述测试细胞悬浮液的生存力。

2.口服给药CV部分纯化的提取物对来自无免疫应答的小鼠的活骨髓细胞体内的增殖的影响

所有组(组1-4)表明了当与对照小鼠(组5)比较时，体内活骨髓细胞的数目增加(参见图24B)。

当与对照小鼠(组5)比较时，对组1给药C1D5E8显著增加了(p<0.001)体内活骨髓细胞的数目。当与对照小鼠(组5)比较时，对组2、组3和组4分别给药C1D5E7、C1D5E4、C1D5EX显著增加了(p<0.05)体内的活骨髓细胞的数目。

如实施例IV所述收获和分离骨髓细胞。制备细胞悬浮液，并如上文实施例III所述测试细胞悬浮液的生存力。

1.物种维持

由香港中文大学的动物房提供了癌症研究所(ICR)的小鼠(近交系)。每个笼子饲养的小鼠不到20只。在温度维持在18-26℃、相对湿度维持在约40-70％的设备中饲养小鼠。光/暗循环维持在12小时的间隔。以啮齿动物食物饮食标准喂养小鼠。用于上述实施例的小鼠重量在25-30g，且是8-12周龄。

2.Caco细胞培养物

将Caco-2细胞(购自美国典型培养物保藏中心，Rockwille，Md.)在补充有25mM D-葡萄糖，含有10％ FBS、1％必需氨基酸、1％L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)的DMEM培养基(所有试剂来自Gibbs BRL，生命技术公司，Gaithersburg，Md.)中，37℃、5％ CO₂和90％ O₂大气下生长和日常维持。在约70％汇合时，用0.05％胰蛋白酶—EDTA收获细胞，并以细胞密度3×10⁵细胞/滤器接种在聚碳酸酯滤器上，其先用I型胶原蛋白包被(3.0μm孔，4.71cm²生长区域)，位于Transwell细胞培养室内(购自Costar-Corning，Rockwille，MD)。每48小时置换培养基(在Transwell插入体(insert)中1.5ml，和在成簇平板中2.6ml)。接种后第21到25天时，利用单层。

3.缓冲液

溶解缓冲液

8.29g NH₄Cl

1.002g NaHCO₃

29.2mg EDTA

所有试剂都溶于1L去离子水中，pH调节到7.2，并通过0.22μm无菌滤器过滤灭菌。

4.完全细胞培养基

用10％的v/v胎牛盐水(FBS)、100IU/ml青霉素和100μg/ml的链霉素掺入RMPI 1640培养基(Gibco)中。

所有上面引证的出版物和专利申请是以全文引入作为参考的，对于所有目的都相同，就象单个出版物或专利申请都特定和单独地在引入作为参考。虽然为清晰和理解目的，通过说明和实施例本发明已经详细叙述了，但很显然在所附权利要求书的范围内，某些变化和修改是可以进行的。除非另从上下文中可以明了，否则本申请书中所述的发明的元素、步骤、特征和实施方案可以相互结合利用。

参考文献

1.Parslow T.G.免疫应答，医学免疫学(Medical Immunology)；Stites D.P.，Terr A.I.，Parslow T.G.编，Appleton and Lange：London，1997；第63-73页。

2.Tsukagoshi S.Krestin(PSK).癌症治疗综述(Cancer treatmentreview)1984，11，第131-155页。

3.Descotes J.细胞介导的免疫性分析，免疫毒性入门(AnIntroduction to Immunotoxicity)；Taylor & Francis Ltd；London，1999；第103-110页。

4.Descotes J.免疫抑制的评估策略，免疫毒性入门(AnIntroduction to Immunotoxicity)；Taylor & Francis Ltd；London，1999；第125-136页。

5.Lennernas H.人肠的通透性，J.Pharm.Sci.，1998，87(4)，第403-410页。

6.Borchardt R.T.，Hidalgo I.J.，Hillgren K.M.，Hu M.细胞培养物的药物应用：综述，Pharmaceutical Applications of Cell and TisssueCulture to Drug Transport；Wilson G.编；Plenum press：New York，1991；第1-14页。

7.Lee V.H.L.肽和蛋白质的药物递送，Trends and FuturePerspectives，Peptide and Protein Drug Dilivery；Lee V.H.L.，Hashida M.，Mizushima Y.编；哈佛学术出版社：London，1995；第3-15页。

8.Ueno S.，Yoshikumi C.，Omura Y.，Fujii T.，Wada T.，TakahashiE.，Hirose F.美国专利4,699,787；含氮多糖，1987年11月13日。

9.Ueno S.，Yoshikumi C.，Omura Y.，Fujii T.，Wada T.，TakahashiE.，Hirose F.美国专利4,851,395：含氮多糖，1989年7月25日。

10.Ikuzawa M.，Oguchi Y.，Matsunaga K.，Toyoda N.，Furusho T.，Fujii T.，Yoshikumi C.美国专利4,820,689：含有糖蛋白的药物组合物，1989年4月11日。

11.Ikuzawa M.，Oguchi Y.，Matsunaga K.，Toyoda N.，Furushe T.，Fujii T.，Yoshikumi C.美国专利5,008,243：含有糖蛋白的药物组合物，1991年4月6日。

12.Suguira M.，Ohno H.，Sasaki Y.，Hama K.美国专利4,225,673：具有抗肿瘤活性的葡聚糖，1980年9月30日。

13.Yang M.P.，Chen G.美国专利5,824,648：Rnase-CV(云芝)，1998年10月20日。

14.Yang M.P.，Chen G.美国专利6,087,335：Rnase-CV(云芝)，2000年7月11日。

序列表

<110>香港中文大学(THE CHINESE UNIVERSTITY OF HONG KONG)

<120>制备和检定具有可检验的口服吸收性云芝的免疫调节的肽联葡聚糖

(PREPARATION AND STANDARDIZATION OF IMMUNOMODULATORY PEPTIDE-LINKED

GLUCANS WITH VERIFIABLE ORAL ABSORBABILITY FROM CORIOLUS VERSICOLOR)

<130>SPI031063-47

<150>USP 60/383,339

<151>2002-05-22

<150>USP 10/236,996

<151>2002-09-06

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>6

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>云芝提取物组分C1D5E7中的蛋白/肽成分

<400>1

Claims (53)

1.一种云芝的纯化的提取物，其包括至少一种含有通过(1→3)键连接的葡萄糖分子的肽联葡聚糖，所述肽联葡聚糖具有由大小排阻层析确定的0.3kDa到5kDa的分子量，并且具有免疫刺激活性。

2.权利要求1所述的纯化的提取物，其中分子量是0.7kDa。

3.权利要求1所述的纯化的提取物，其中平均分子量是2.6kDa。

4.权利要求1所述的纯化的提取物，其中肽联葡聚糖溶于水、乙醇和丙酮，不溶于氯仿和二氯仿，并且是非吸湿的。

5.权利要求1的纯化的提取物，其中肽联葡聚糖能够进行由Caco-2细胞单层Transwell方法确定的肠吸收。

6.权利要求2所述的纯化的提取物，其中肽联葡聚糖能够进行由Caco-2细胞单层Transwell方法确定的肠吸收。

7.权利要求3所述的纯化的提取物，其中肽联葡聚糖能够进行由Caco-2细胞单层Transwell方法确定的肠吸收。

8.权利要求1所述的纯化的提取物，其制备步骤如下：

用碱处理云芝，并分离上清液；

将上清液进行阳离子交换；

将来自阳离子交换的洗脱物进行阴离子交换；

将来自阴离子交换的洗脱物通过大小分级分离技术进行分离，并且收集含有至少一种肽联葡聚糖的组分。

9.权利要求8所述的纯化的提取物，其中大小分级分离技术是分子排阻层析或乙醇分级分离。

10.权利要求8所述的纯化的提取物，其中阳离子交换是在CM纤维素柱上进行的。

11.权利要求8所述的纯化的提取物，其中阴离子交换是在DEAE纤维素柱上进行的。

12.一种云芝的分离的肽联葡聚糖，所述分离的肽联葡聚糖包括通过(1→3)键连接的多个葡萄糖分子以及分子量由大小排阻层析确定为0.7kDa到3.0kDa，所述分离的肽联葡聚糖及其活性成分具有免疫刺激活性。

13.权利要求12所述的肽联葡聚糖，其中所述活性成分是肽联葡聚糖的肽成分。

14.权利要求12所述的肽联葡聚糖，其中所述活性成分是肽联葡聚糖的葡聚糖成分。

15.权利要求12所述的肽联葡聚糖，其中平均分子量为0.8kDa。

16.权利要求12所述的肽联葡聚糖，其中分子量是0.7kDa。

17.权利要求12所述的肽联葡聚糖，其中平均分子量为2.6kDa。

18.权利要求12所述的肽联葡聚糖，其中平均分子量小于3.0kDa。

19.权利要求12所述的肽联葡聚糖，其中肽联葡聚糖能够进行由Caco-2细胞单层Transwell方法确定的肠吸收。

20.权利要求13所述的肽联葡聚糖，其中活性成分能够进行由Caco-2细胞单层Transwell方法确定的肠吸收。

21.权利要求14所述的肽联葡聚糖，其中活性成分能够进行由Caco-2细胞单层Transwell方法确定的肠吸收。

22.权利要求12所述的肽联葡聚糖，其特征还在于氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

23.权利要求12所述的肽联葡聚糖，其制备步骤如下：

用碱处理云芝，并分离上清液；

将上清液进行阳离子交换；

将来自阳离子交换的洗脱物进行阴离子交换；和

将来自阴离子交换的洗脱物通过大小分级分离技术进行分离并收集肽联葡聚糖的组分。

24.权利要求23所述的肽联葡聚糖，其中大小分级分离技术是分子排阻层析或乙醇分级梯度。

25.权利要求23所述的肽联葡聚糖，其中阳离子交换是在CM纤维素柱上进行的。

26.一种药物组合物，其含有前述权利要求任一项所述的提取物或分离的肽联葡聚糖。

27.一种纯化肽联葡聚糖的方法，其中所述方法包括如下步骤：

用碱处理云芝，并分离上清液；

将上清液进行阳离子交换；

将来自阳离子交换的洗脱物进行阴离子交换：和

将来自阴离子交换的洗脱物通过大小分级分离技术进行分离，并收集含有肽联葡聚糖、分子量为0.7-5kDa的组分。

28.权利要求27所述的方法，其中处理步骤包括：

浸软云芝的果实体；

用碱提取浸软的云芝果实体，以得到提取物；

从提取物中除去不溶性物质；

澄清第一提取物的上清液：和

浓缩上清液得到第三提取物，其中将第三提取物进行阳离子交换。

29.权利要求28所述的方法，其中碱提取步骤包括将浸软的云芝果实体在碱性水溶液中煮沸。

30.权利要求29所述的方法，其中碱性水溶液选自氢氧化钠溶液和氢氧化钾溶液。

31.权利要求29所述的方法，其中碱性水溶液的当量浓度小于或等于0.1N。

32.权利要求29所述的方法，其中碱性水溶液的当量浓度为0.01N。

33.权利要求27所述的方法，其中通过过滤从第一提取物中除去不溶性物质。

34.权利要求29所述的方法，其中含有肽联葡聚糖、分子量为0.7-5kDa的组分是通过离心澄清获得的。

35.权利要求29所述的方法，其中含有肽联葡聚糖、分子量为0.7-5kDa的组分是通过旋转蒸发、冷冻或冻干浓缩获得的。

36.权利要求27所述的方法，其中含有肽联葡聚糖的组分的分子量是0.7kDa到3.0kDa。

37.一种体外刺激免疫应答的方法，其包括将免疫系统的细胞与权利要求1-25任一项所述的提取物、肽联葡聚糖或其活性成分接触。

38.权利要求37所述的方法，其中细胞是脾细胞或骨髓细胞，以及接触引发细胞的增殖反应。

39.权利要求37所述的方法，其中细胞是巨噬细胞，以及接触引发细胞分泌一氧化氮。

40.权利要求1-25任一项权利要求所述的提取物、纯化的肽联葡聚糖或其活性成分在治疗需要免疫系统刺激的患者的药物组合物制备中的用途，所述药物组合物能够刺激所述患者的免疫应答。

41.权利要求40所述的用途，其中患者是免疫缺陷的。

42.权利要求40所述的用途，其中患者是无症状但易受免疫缺陷影响的。

43.权利要求40所述的用途，其中免疫缺陷是感染、恶性肿瘤疾病、自身免疫疾病、蛋白质损失状态、免疫抑制治疗、外科手术或麻醉的结果。

44.权利要求43所述的用途，其中感染选自风疹、先天性风疹、麻疹、麻风病、结核病、球孢子菌病、慢性感染、急性病毒感染、巨细胞病毒、多重病毒感染和反复病毒感染。

45.权利要求43所述的用途，其中恶性肿瘤疾病选自霍奇金病、急性白血病、慢性白血病、非淋巴癌和骨髓瘤。

46.权利要求43所述的用途，其中自身免疫疾病选自全身性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎和慢性活动肝炎。

47.权利要求43所述的用途，其中蛋白质损失状态选自肾病综合症和蛋白质损失性肠病。

48.权利要求43所述的用途，其中免疫抑制治疗选自皮质类固醇、胞毒药物、烷基化试剂、抗代谢物、抗胸腺细胞球蛋白、辐射、环孢菌素、phenytoin和青霉胺。

49.权利要求43所述的用途，其中免疫缺陷是选自下组一种病症的结果：糖尿病、酒精肝硬变、营养不良、灼伤、结节病、脾切除术、镰状细胞性贫血、尿毒症、衰老、亚急性硬化性全脑炎、唐氏综合征、新生儿和早产儿。

50.权利要求40所述的用途，其中免疫应答包括脾细胞或骨髓细胞的增殖，或巨噬细胞分泌一氧化氮。

51.权利要求40所述的用途，其中免疫缺陷是患者的获得性免疫缺陷。

52.权利要求51所述的用途，其中获得性免疫缺陷是人免疫缺陷病毒(HIV)感染的结果。

53.权利要求52所述的用途，其中患者正患有或易受选自下组的紊乱的影响：1型疱疹病毒、2型疱疹病毒、巨细胞病毒、水痘、腺病毒(adenovirus)、EB病毒、HTLV-1、HTLV-III、白色假丝酵母(Candidaalbicans)、新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)、诺卡氏菌种(Nocardia sps.)、Pneumocystis carinii、鼠弓形体(Toxoplasma gondii)、Isospora sp、Cyptosporidium、Giardia lamblia、Entamoebahistolytica、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、细胞内鸟分支杆菌(Mycobacterium avium-intracellulare)、堪萨斯分支杆菌(Mycobacteriumkansasii)、军团菌(Legionella sp)、密螺旋体(Treponema sp)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、唾液弯曲螺杆菌(Campylobacter sp)、奈瑟氏球菌(Neisseria sp)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、志贺氏菌(Shigella)、沙门氏茵(Salmonella sp)和衣原体(Chlamydia)。

Images