KR20070014745A

KR20070014745A - 면역 증강 활성을 갖는 잎새 버섯의 액체배양물로부터분리한 세포외 생체고분자

Info

Publication number: KR20070014745A
Application number: KR1020050069643A
Authority: KR
Inventors: 양병근; 송치현; 구영아; 이용재
Original assignee: 강종석
Priority date: 2005-07-29
Filing date: 2005-07-29
Publication date: 2007-02-01
Also published as: KR100729213B1

Abstract

본 발명은 잎새 버섯(Grifola frondosa)의 액체배양물로부터 분리된 세포외 생체고분자에 관한 것으로서, 상세하게는 본 발명의 세포외 생체고분자는 항 보체 활성, 리소좀 효소의 활성화 및 NO 생산을 자극하는 활성을 가지고 있어 면역 증강용 약학조성물로 유용하게 이용할 수 있다. 본 발명의 세포외 생체고분자는 세파덱스 G-100 겔 크로마토그래피에 의해 세가지의 분획(EX-GF-Fr.I, EX-GF-Fr.II, EX-GF-Fr.III)으로 분리되는데 그 중에서 EX-GF-Fr.III은 가장 높은 항 보체 활성, 대식세포의 리소좀 효소의 활성 및 NO 생산을 한다. EX-GF-Fr.II는 비장 림프구의 증식을 활성화시키는 효과를 가지고 있다. 또한 세포외 생체고분자의 분획들은 만노우즈와 글루코우즈가 주인 당과 아스파틱산, 글루탐산, 글라이신 및 알라닌이 주인 단백질로 구성된 단백다당체이다. 따라서 본 발명의 잎새 버섯의 액체배양물로부터 분리된 세포외 생체고분자는 면역 조절 활성을 가지고 있어 면역 증강용 약학 조성물로서 유용하게 이용될 수 있다.

잎새 버섯, 세포외 생체고분자, 항 보체 활성, 면역 조절

Description

면역 증강 활성을 갖는 잎새 버섯의 액체배양물로부터 분리한 세포외 생체고분자{Exo-biopolymer isolated from submerged mycelial culture of Grifola frondosa increasing immune activity}

도 1은 잎새 버섯의 액체배양물로부터 세포외 생체고분자를 분리하는 방법을 간단하게 도시한 도이며,

도 2는 세포외 생체고분자를 세파덱스 G-100 컬럼을 이용하여 분리한 분획들의 항보체 활성을 나타낸 도이며,

도 3은 다양한 농도에서의 EX-GF-Fr.Ⅲ의 항보체 활성을 나타낸 도이며,

도 4는 칼슘이온 또는 마그네슘 이온의 존재 또는 부재의 조건에서 EX-GF-Fr.Ⅲ의 항보체 활성을 나타낸 도이며,

도 5는 유리 칼슘이온 또는 이가 금속이온의 조건에서 EX-GF-Fr.Ⅲ에 의해 전환된 C3의 교차 전기영동(CIEP, crossed immunoelectrophoresis)의 패턴을 나타낸 도이며,

도 6은 다양한 농도에서의 세포외 생체고분자의 분획들이 대식세포의 리소좀 효소의 활성에 미치는 영향을 나타낸 도이며,

도 7은 다양한 농도에서의 세포외 생체고분자의 분획들이 쥐의 복막 대식세포에 의한 NO 생산에 미치는 영향을 나타낸 도이며,

도 8은 IFN-γ의 존재 또는 부재의 경우 쥐 복막의 대식세포의 NO 생산에 대하여 EX-GF-Fr.Ⅲ가 미치는 영향을 나타낸 도이며,

도 9는 다양한 농도에서 혼합 림포사이트에 의한 세포외 생체고분자 분획들이 비장 림프구의 증식에 미치는 영향을 나타낸 도이며,

도 10은 다른 배양 배지에서의 EX-GF-Fr.Ⅱ가 비장 림프구의 증식에 미치는 영향을 나타낸 도이며,

도 11은 세포외 생체고분자 분획들의 분자량을 나타낸 도이며,

도 12는 세포외 생체고분자 분획들의 FT-IR 분광을 나타낸 도이다.

본 발명은 항 보체 활성, 대식세포의 리소좀 효소의 활성화 및 NO 생산을 자극하는 활성을 가지는 잎새 버섯의 액체배양물로부터 분리된 세포외 생체고분자에 관한 것이다.

식용 버섯은 그들의 독특하고 신비한 향미 및 민간요법에서 원기를 돋우고 의약적 특성으로 인하여 몇 세기동안 스프 또는 소스의 향신료 물질로서 영양가 많은 식품으로 알려져 있다. 몇몇 버섯의 치료적인 특성은 저혈당활성(hypoglycemic activity), 저콜레스테롤 효과(hypocholesterolemic effect), 저지방활성(hypolipidemic activity), 간보호 효과(hepatoprotective effect) 및 분열유도 (mitogenic), 항종양, 항염증 등과 같은 면역 자극 활성을 포함한 swimming endurance capacity가 시험되어 졌다. 최근 많은 연구자들이 버섯에서 새로운 기능성 물질을 찾고 있다. 버섯에서 유래한 다양한 생물학적 활성 물질들이 문헌에 기재되고 그 중에는 폴리사카라이드(polysaccharides), 테르페노이드(terpenoids), 폴리사카라이드-펩타이드 복합체(polysaccharide-peptide complexes), 단백질이 있다. 그들은 넓은 범위의 화학적 특성들을 나타내고 면역세포에서 다양한 생물학적 효과를 나타낸다.

면역 활성화 폴리사카라이드-단백질이 최근 많은 종류의 버섯에서부터 분리되었다. 예를 들어 구름버섯(Trametes versicolor)의 배양된 균사체로부터 분리된 크레스틴(Krestin), 치마버섯(Schizophyllum commune)의 약체 배양액으로부터 분리된 스키조필란(Shizophyllan), 표고버섯(Lentinus edodes)의 자실체로부터 분리된 렌티난(Lentinan), 목질버섯(Phellinus linteus)의 액체 배양액으로부터 분리된 메쉬마(Meshima)와 같은 폴리사카라이드-단백질이 있다.

잎새 버섯(Grifola frondosa)은 민주름버섯(Aphyllopherales)목 구멍장이버섯(Polyporaceae)과에 속하는 담자균류(Basidiomycete fungus)이다. 잎새버섯 자실체 분말은 마이타케 차, 완전 분말, 과립제, 음료 및 알약과 같은 건강 식품의 많은 종류로 사용되어왔다. 이 버섯의 자실체는 일본, 중국 및 미국에서 유명한 식용 버섯(maitake mushroom)이다. 이 버섯의 액체 배양된 균사체 및 자실체로부터 생산된 폴리사카라이드는 항종양, 항고혈압, 항당뇨, 산화방지제, 항고지질 효과와 같은 많은 생물학적 활성을 가지고 있다.

그러나 상기 논문 어디에도 잎새 버섯의 액체배양물로부터 분리한 세포외 생체고분자의 면역 조절 활성에 대해서는 어떠한 교시 또는 개시가 없다.

이에 따라 본 발명자들은 잎새 버섯의 액체배양물로부터 분리한 세포외 생체고분자가 탁월한 항보체 활성 및 NO 생산, 대식세포의 리소좀 효소 활성화, 비장 림프구의 증식과 같은 면역조절 활성이 있음을 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 항 보체 활성, 대식세포의 리소좀 효소의 활성화, NO 생산 및 비장 림프구의 증식을 자극하는 활성을 가지는 잎새 버섯의 액체배양물로부터 분리된 세포외 생체고분자를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항 보체 활성, 리소좀 효소의 활성화 및 NO 생산을 자극하는 활성을 가지는 잎새 버섯의 액체배양물로부터 분리된 세포외 생체고분자를 제공한다.

상기 세포외 생체고분자은 163kDa의 분자량을 갖는 분획, 40kDa의 분자량을 갖는 분획 및 2.8kDa의 분자량을 갖는 분획으로 구성되어 있음을 특징으로 한다.

상기 163kDa의 분자량을 갖는 분획은 80.35%의 당, 2.40%의 산성당 및 17.3%의 단백질로 구성되어 있으며, 주요 당은 자일로즈, 만노우즈 및 갈락토우즈, 주요 아미노산은 글루탐산과 글라이신으로 구성되어 있음을 특징으로 한다.

상기 40kDa의 분자량을 갖는 분획은 61.9%의 당, 2.90%의 산성당, 35.2%의 단백질로 구성되어 있으며, 주요 당은 만노우즈와 갈락토우즈, 주요 아미노산은 아스파틱산, 트레오닌 및 글라이신으로 구성되어 있음을 특징으로 하며,

상기 2.8kDa의 분자량을 갖는 분획은 89.30%의 당, 10.7%의 단백질로 구성되어 있으며, 주요 당은 리보우즈, 만노우즈 및 글루코우즈이며, 주요 아미노산은 아스파틱산, 글루탐산, 글라이신 및 알라닌으로 구성되어 있음을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 세포외 생체고분자를 잎새 버섯의 액체배양물로부터 분리하는 방법은 하기와 같다.

잎새 버섯은 pH 4.0의 PDB(potato dextrose broth)를 함유한 플라스크에서 약 5-30일 동안 10-30℃에서 100-300rpm의 회전식 진탕 배양기에서 종균 배양할 수 있다. 세포외 생체고분자의 생산을 위한 액체 배양 배지는 버섯완전배지(MCM)을 사용하였으며, 조성은 포도당, MgSO₄, KH₂PO₄, K₂HPO₄, 효모 추출물, 펩톤으로 구성되며, 살균 전에 pH는 4.0-5.0으로 조정할 수 있다. 액체배양은 100-300㎖의 배지를 함유한 플라스크에서 10-30일 동안 10-30℃에서 100-300rpm, pH 4-5의 회전식 진탕 배양기에서 수행할 수 있다. 배양액은 원심분리로 회수하고 그 상등액에 상등액의 2-6배 부피의 에탄올을 첨가하여 10-48시간을 두어 침전시켰다. 에탄올 침전물은 비이온화된 물에 용해, 투석한 후 동결건조를 통하여 세포외 생체고분자를 분리할 수 있다.

상기의 방법으로 분리된 세포외 생체고분자는 세파덱스 G-100 겔 크로마토 그래피 컬럼에 의해 163kDa의 분자량을 갖는 분획, 40kDa의 분자량을 갖는 분획 및 2.8kDa의 분자량을 갖는 분획으로 분리된다.

상기 163kDa의 분자량을 갖는 분획은 80.3%의 당, 2.4%의 산성당 및 17.3%의 단백질로 구성되어 있으며, 주요 당은 자일로즈, 만노우즈, 및 갈락토우즈, 주요 아미노산은 글루탐산과 글라이신으로 이루어져 있었다. 40kDa의 분자량을 갖는 분획은 61.9%의 당, 2.9%의 산성당, 35.2%의 단백질로 구성되어 있으며, 주요 당은 만노우즈와 갈락토우즈, 주요 아미노산은 아스파틱산, 트레오닌 및 글라이신으로 이루어져 있었다. 2.8kDa의 분자량을 갖는 분획은 89.3%의 당, 10.7%의 단백질로 구성되어 있으며, 주요 당은 리보우즈, 만노우즈 및 글루코우즈, 주요 아미노산은 아스파틱산, 글루탐산, 글라이신 및 알라닌으로 이루어져 있다.

2.8kDa의 분자량을 갖는 분획이 가장 탁월한 항보체 활성을 지니며, 보체 시스템에 있어서 고전 경로 및 대체 경로를 통해 항보체 활성을 나타내며, 대식세포의 리소좀 효소의 활성화 및 NO 생성을 자극하며, 40kDa의 분자량을 갖는 분획은 비장 림프구의 증식을 활성화시킨다.

따라서 본 발명은 상기와 같은 활성을 지닌 분획들을 가진 잎새 버섯의 액체배양물로부터 분리된 세포외 생체고분자를 유효성분으로 포함한 면역 증강용 약학 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 잎새 버섯은 오랫동안 생약 및 식용으로 사용되어 오던 약재로서 이들로부터 추출된 본 발명의 생체고분자 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없다.

본 발명의 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 생체고분자를 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명의 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 생체고분자을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형 제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골(macrogol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 40mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위을 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 면역증강 효과를 나타내는 상기 생체고분자 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 본 발명의 생체고분자를 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.

또한, 면역 증강을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 생체고분자의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제, 액제 등의 형태를 포함한다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트 산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 화합물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 화합물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 다만, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명의 예시일 뿐 이에 의하여 본 발명이 한정되지는 않는다.

실시예 1. 잎새 버섯의 액체배양물로부터 세포외 생체고분자의 분리, 정제

잎새 버섯(G. frondosa)은 한국농업미생물자원센터(Korean Agricultural Culture Collection)에서 분양을 받았다.

잎새 버섯은 pH 4.0의 PDB(potato dextrose broth) 100㎖을 함유한 250㎖용 플라스크에서 약 10일 동안 25℃에서 150rpm의 회전식 진탕 배양기에서 종균배양하였다. 세포외 생체고분자의 생산을 위한 액체 배양 배지는 버섯완전배지(MCM)를 사용하였으며, MCM의 조성은 포도당 20g/ℓ, MgSO₄ 0.5g/ℓ, KH₂PO₄ 0.46g/ℓ, K₂HPO₄ 1.0g/ℓ, 효모 추출물 2g/ℓ, 펩톤 2g/ℓ로 구성되며, 멸균 전에 pH는 4.0으로 조정하였다. 액체배양은 200㎖의 배지를 함유한 500㎖ 용량의 플라스크에서 20일 동 안 25℃에서 회전식 진탕배양기(150rpm, pH 5)에서 배양하였다. 배양액은 10,477×g, 20분동안 원심분리하여 회수하고 그 상등액에 상등액의 4배 부피의 에탄올을 첨가하여 24시간을 침전시켰다. 에탄올 침전물은 10 ㎎/㎖의 비이온화된 물에 용해, 3일 동안 투석한 후 동결건조를 통하여 세포외 생체고분자를 분리하였다(도 1 참조).

상기의 방법으로 분리된 세포외 생체고분자(EX-GF)는 0.2 M NaCl을 이용하여 세파덱스 G-100 겔 크로마토 그래피 컬럼에 의해 분획물을 수득하였다. 그 결과 세개의 분획을 분리하였는 바, 분획번호 21-34는 EX-GF-Fr.I, 분획번호 35-59는 EX-GF-Fr.II, 분획번호 60-79는 EX-GF-Fr.III이다.

참조예 1. 통계분석

모든 실험은 통계적 분석을 위해 3회 반복 수행하였다. 결과는 ± SD(standard deviation)으로 나타내었다.

실험예 1. 항보체 활성 측정

항보체 활성은 보체 소모 및 잔여 보체에 의한 적혈구 용해의 정도에 기초를 둔 보체 고정화 시험에 의해 측정하였다. 상기 실시예 1에서 분리된 세포외 생체고분자의 세가지 분획물들 각각을 물에 용해한 것 50㎕는 같은 부피의 NHS(normal human serum) 및 500 mg의 Mg⁺⁺ 과 150 mg의 Ca⁺⁺을 함유한 pH 7.4의 GVB(gelatin veronal buffered saline)과 혼합하였다. 상기 혼합액은 30분 동안 37℃에서 배양하고, TCH₅₀(total complement hemolysis)는 1×10⁸ cells/㎖의 EA 세포를 이용하여 측정하였다. NHS는 양성 대조군으로서 비이온화된 물(DIW)과 GVB⁺⁺로 배양하였다. 세포외 생체고분자의 항보체 활성은 대조군의 TCH₅₀의 저해율로서 나타내었다. 칼슘이온은 대체 경로가 아닌 고전적 경로를 통한 보체의 활성화에 필요하다. 대체 보체 경로는 플랫-밀스 및 이쉬자카(Platt-Mills, T. A., and K. Ishizaka, Activation of the alternative pathway of human complement by rabbit cell. Journal of Immunology, 113, pp348-358, 1974)의 방법을 응용하여 GVB^--(Mg⁺⁺-EGTA-GVB^--)에 2mM MgCl₂을 함유한 EGTA 10mM에서 측정하였다. 샘플은 30분 동안 37℃에서 Mg⁺⁺-EGTA-GVB^--와 NHS에서 배양하고, 잔여 보체 혼합물은 Mg⁺⁺-EGTA-GVB^--로 배양한 토끼 적혈구의 용혈현상에 의해 측정하였다.

상기 실험 수행의 결과, 세 가지 분획물들의 100㎍/㎖에서의 항보체 활성은 도 2에서 보는 바와 같다. 그 중에서도 가장 높은 활성은 71.1%로 EX-GF-Fr.III에서, 그 다음은 48.7%로 EX-GF-Fr.I, 21.4%로 EX-GF-Fr.II 순으로 나타남을 확인할 수 있었다(도 2에서 LPS는 리포폴리사카라이드로 양성 대조군을 나타낸다).

도 3에서 보는 바와 같이 EX-GF-Fr.III의 항보체 활성은 농도의 증가에 비례하여 증가하였다. EX-GF-Fr.III의 항보체 활성을 다양한 농도에서 양성 대조군 (LPS)과 비교하였을 때, 200㎍/㎖의 농도일 때 56.0%의 활성을 갖는 LPS보다 93.7%의 항보체 활성을 가져 현저히 탁월한 활성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

이 등(Lee H. K., K. S. Shin, C. H. Song, H. J. Sung, and H. C. Yang. The effect of nutrients on the production of anti-complementary polysaccharide by Flammulina velutipes. Kor . J. Apply. Microbiol . Biotechnol., 22, pp360-367)은 보체 시스템은 면역시스템의 숙주 방어 메커니즘에 의해 항종양 효과와 밀접한 관련이 있다고 보고하고 있다.

보체 활성화를 위해서는 몇몇 금속 이온들이 필수 불가결함은 이미 알려져 있다. 고전 경로의 활성화를 위해서는 마그네슘 이온 및 칼슘이온 모두가 필요하지만 대체 경로의 활성화에는 오직 마그네슘 이온만이 필요할 뿐이다. 만약 칼슘이온이 반응 혼합물에서 제거된다면 고전 경로는 억압되어질 것이다.

도 4에서 보는 바와 같이, GVB⁺⁺(Ca⁺⁺, Mg⁺⁺ 의 존재, 고전 및 대체 경로 모두 활성화시킴)의 조건하에서 측정된 항보체 활성은 약 93.7%으로 이는 양 경로의 활성화의 결과이다. 그러나 Mg⁺⁺-EGTA-GVB^--(Mg⁺⁺ 존재, 대체 경로를 활성화 시킴) 버퍼하에서 EX-GF-Fr.III의 항보체 활성은 오직 31.8%의 활성만을 나타냄을 확인할 수 있었다. 이는 EDTA-GVB^--(Ca⁺⁺, Mg⁺⁺ 유리, 고전경로 및 대체경로 모두 차단시킴) 시스템에서 관측된 항보체 활성에 비하여 현저히 저하된 것이다.

실험예 2. CIEP (cross immunoelectrophoresis ) 분석

실험예 1의 결과를 확인하기 위하여 하기와 같은 방법으로 CIEP를 수행하였다.

NHS에서 세포외 생체고분자에 의한 C3 보체 성분의 특정한 활성화는 C3 분해의 경쟁적 측정에 의해 분석하였다. NHS는 37℃에서 30분 동안 10mM EDTA(EDTA-GVB^--) 또는 Mg⁺⁺-EGTA-GVB^--을 포함한 GVB^--와GVB⁺⁺에서 같은 부피의 세포외 생체고분자와 함께 배양하였다. 그 후 혼합액은 C3 분해 산물의 위치파악을 위해 CIEP을 수행하였다. 10㎕의 모든 샘플은 1% 아가로스와 함께 이온 강도 0.025, pH 8.6의 발비탈 버퍼(barbital buffer)에서 첫번째 실시를 행한 후 2시간 정도 후에, 두번째 실시는 C3 및 C3b를 모두 인식할 수 있는 항 인간 보체 C3(complement C3 antiserum raised in goat, Sigma Co., U.S.A)를 함유한 겔 플레이트상에서 15 mA/plate의 전위 경사도에서 15시간 동안 수행하였다. 전기영동을 수행한 후 그 플레이트는 고정시키고 0.2% 브로모페놀 블루(bromophenol blue)로 염색하여 C3 피크와 C3b 피크의 높이 사이의 비율을 계산하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 5에서 보는 바와 같이 활성화된 C3 성분은 CIEP에서 두개의 분리된 침강 라인을 보이면서 C3a, C3b로 분해되었다. C3a, C3b의 침강라인은 GVB⁺⁺,Mg⁺⁺-EGTA-GVB^--, EDTA-GVB^-- 버퍼에서 EX-GF-Fr.III로 처리된 NHS로 부터 관찰되었다(도 5 A, B 참조). 한편, EDTA-GVB^-- 버퍼 시스템에서의 이들의 침강라인은 관찰되지 않았다(도 5 C 참조). 그러므로 EX-GF-Fr.III에 의해 활성화된 보체 시스템은 고전 경로 및 대체 경로 모두를 통하여 매개되며, 보체 시스템을 활성화시키는 주요 경로는 고전 경로를 통해서임을 확인할 수 있었다(도 5 A는 GVB⁺⁺ 로서 Ca⁺⁺, Mg⁺⁺ 이 존재하고, 도 5 B는 Mg⁺⁺-EGTA-GVB^--로서, Mg⁺⁺ 존재하는 경우이며, 도 5 C는 EDTA-GVB^--로서, 이는 Ca⁺⁺, Mg⁺⁺ 유리된 상태이다).

실험예 3. 세포외 생체고분자의 리소좀 효소 활성에 대한 효과

3-1. 실험동물의 준비

25g 내외의 무게를 가진 6주령의 수컷 C57BL/6 및 BALB/c 마우스를 대한 바이오링크사(Daehan Biolink Co., LTD)로부터 구입하였다. 상기 마우스들은 12시간 주기의 명암하에서, 55±5%의 습도, 22±2℃의 온도를 가진 방에서 상업용 사육용 사료(Sam Yang Co., Korea)로 실험기간동안 사육되었다.

3-2. 쥐의 대식세포의 준비

대식세포(Macrophages)는 10% 티오글리콜레이트 미디움 3㎖를 복강투여한 후 3일 후에 마우스로부터 채집하였다. 세포밀도는 10% 소태아혈청이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified engle medium) 배지로 1× 10⁶ cells/㎖ 정도되게 현탁하고 200㎕의 세포현탁액(2×10⁵ cells/㎖)을 96 웰 플레이트상에서 배양하였다. 부착된 대식세포는 이산화탄소의 존재하에서 2시간동안 배양함으로서 분리하고 비부착 된 대식세포를 제거하기 위해 교반 및 세척을 수행하였다.

NO(nitric oxide)의 생성 및 리소좀 효소의 활성을 측정하기 위해서 배양은 생체고분자의 첨가 또는 비첨가, IFN-γ (20 U/ml) 또는 LPS의 존재 또는 부재된 상태에서 습한 인큐베이터에서 24시간 동안 5% 이산화탄소의 존재하에서 배양하였다.

3-3. 대식세포의 리소좀 효소 활성의 측정

리소좀 효소의 활성은 조직 배양 플레이트가 깔린 96 웰 플랫을 사용하여 분석하였다. 마이크로플레이트의 대식세포 단층(2×10⁵ cells/㎖)은 0.1% 트리톤(Triton) X-100 25㎕를 첨가하여 용액화시켰다. 10mM p-니트로페닐 포스페이트 용액 150㎕ 산 포스파타아제(acid phosphatase)를 위한 기질로서 첨가하였다. 그 후 상기 웰에 구연산염 버퍼 50㎕를 첨가하였다. 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 0.2M 붕산염 버퍼(pH 9.8) 25㎕를 그 반응 혼합물에 첨가하고 405nm에서의 흡광도를 측정하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 6에서 보는 바와 같이 다양한 농도에서의 복막 대식대포의 리소좀 효소 활성화에 대한 세포외 생체고분자 분획들의 효과를 조사하였는 바, EX-GF-Fr.Ⅲ이 가장 현저히 탁월한 활성을 보였으며, 그 다음으로는 EX-GF-Fr.Ⅱ, EX-GF-Fr.Ⅰ 순으로 나타남을 확인할 수 있었다. EX-GF-Fr.Ⅲ, EX-GF-Fr.Ⅱ 각각 100, 500, 1000㎍/㎖의 농도로 대식세포를 전처리하였을 때, 리소좀 효 소 활성화는 양성 대조군인 LPS보다 현저히 탁월함을 확인할 수 있었다. EX-GF-Fr.Ⅲ 50㎍/㎖에서는 297%로 높은 활성을 보이기는 하였으나, LPS보다 낮은 수치를 보였다(도 6에 있어서 NC는 생리 식염수로 음성 대조군이며, LPS는 양성 대조군이다).

리소좀의 산 포스파타아제는 식균작용에 의해 삼켜진 외부 물질의 감소시키기 위해서 대식세포에서 가장 중요한 효소이다. 게다가 살코마 180(sarcoma 180)에서의 항종양 활성이 대식세포에서 리소좀 효소 활성화와 관련이 있다. 그러므로 상기 세포외 생체고분자 분획들은 대식세포에서 리소좀 효소의 활성화에 의해 항종양 활성을 나타나는 물질들로 간주되어 질 수 있다.

실험예 4. 세포외 생체고분자이 NO 생성에 미치는 영향

아질산염 이온은 종양세포에서 미토콘드리아의 호흡을 저해하기 때문에 대식세포의 tumoricidal acitivity에 있어서 중요한 역할을 한다. 아질산염의 축적은 산화질소(NO) 생산의 유도로서 사용되어 진다. NO 측정을 위한 과정은 그리스 반응(the Griess reaction)을 응용하였다.

100㎕의 컬쳐 상등액 또는 아질산나트륨을 동 부피의 그리스 시약(5%(w/v) 인산에 0.1%(w/v) 나프틸 에틸렌디아민 및 1%(w/v) 설파닐산(sulfanilamide)이 함유)을 혼합하였다. 그 후 상온에서 5분동안 반응시킨 후, 550nm에서 흡광도를 ELISA 리더를 이용하여 측정하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 7에서 보는 바와 같이 스크리닝 단계 동안 NO 합 성을 위한 최적의 IFN-γ농도가 20U/㎖임을 확인하였으며, 10㎍/㎖ 농도의 모든 분획들에 IFN-γ(20U/㎖)를 처리한 경우에 가장 탁월한 활성은 EX-GF-Fr.Ⅲ에서 보임을 확인할 수 있었다. 이는 IFN-γ가 NO 방출을 하는 대식세포를 활성화시키기 위해서 생체고분자과 상승적인 작용을 하는 것으로 판단된다.

EX-GF-Fr.Ⅲ의 NO 생산을 IFN-γ의 존재 또는 부재인 상태에서 100, 200, 400, 600㎍/㎖의 다양한 농도에서 비교해본 결과는 도 8에서 보는 바와 같다.

IFN-γ의 존재하에서 EX-GF-Fr.Ⅲ의 활성은 농도가 증가할수록 감소하였다. 쥐의 대식세포의 자극은 iNOS(inducible NO synthase)의 발현을 야기하고 L-아르기닌과 산소분자로부터 많은 양의 NO의 생산을 촉매하였다. 최근 몇 십년 동안 다양한 세균, 기생충, 종양에 대항한 대식세포 유래 작용분자로서 NO는 많은 주목을 받아왔다. 또한 iNOS에 의한 NO의 생성은 대식세포의 세포파괴에 영향을 미친다. 그러므로 생체고분자에 의한 NO의 생성은 in vivo에서 항균, 항종양 또는 항바이러스 작용을 가진다고 볼 수 있다.

실험예 5. 비장 림프구의 증식 활성에 대한 세포외 생체고분자의 효과

비장세포는 다음과 같은 방법으로 준비하였다. 마우스에서 비장을 분리한 후 5㎖ 주사기를 이용하여 단일 세포 부유물을 회수한 다음 원심분리(10분, 300× g)를 통해 침전물을 회수하였다. 이 침전물을 적혈구 분해 버퍼로 5번 세척한 후 상온에서 5분간 배양하였다. 그 후 RPMI-1640 배양액을 첨가하고 원심분리를 통해 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 원심분리하여 단일 세포 부유물을 세척하였 다. 그리고 0.2% 트리판 블루를 사용하여 세포 농도를 측정하여 비장 세포를 준비하였다.

BALB/c 마우스에서 분리한 비장세포(2× 10⁷ cells/㎖)를 25㎍/㎖의 마이토마이신-C와 함께 37℃에서 30분 동안 배양한 후, 10% 소태아혈청(FBS, fetal bovine serum)을 포함하는 차가운 HBSS로 2회 세척하고 세포 농도를 6~8× 10⁷ cells/㎖로 하여 37℃에서 10분 동안 배양하여 세척하였다. 상기와 같이 마이토마이신-C를 처리한 세포를 자극 세포라 한다. C57BL/6 마우스에서 비장세포를 4× 10⁷ cell/㎖의 농도로 준비하였으며, 이를 반응세포라 한다. 일면 혼합 림포사이트 배양(one-way mixed lymphocyte culture)은 RPMI-1640 배양액 200㎕ 안에 2× 10⁶ cell/㎖자극세포와 2× 10⁶ cell/㎖ 반응세포를 포함하는 배양액을 준비하고 세포외 생체고분자 분획을 첨가하거나 첨가하지 않고, Con-A나 LPS를 같이 첨가하거나 첨가하지 않거나 하여 96-웰 플레이트에 담아 5% CO2, 37℃에서 92시간 배양하였다.

그 후 MTT(Methylthiazoletetrazolium)를 첨가하고 4시간 배양하였다. 배양이 끝나면 3,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 불용성 포마즌(formazan)을 침전시키고 상등액을 제거하였다. 0.1 ㎖의 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 첨가하여 포마즌을 녹인후 540nm에서 ELISA 리더기를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

혼합된 림포사이트 반응(MLR, Mixed lymphocyte reaction)은 서로다른 기능적인 활성을 가진 세포들의 관여와 관련된 복합 과정이다. 반응인자(responder), 자극인자(stimulator)로부터 백혈구(leukocyte)를 발생시키는 증식 반응은 in vivo상태에서 발생된다. 반응인자로부터의 T 세포는 자극인자의 APC(antigen-presenting cell)에 의해 발현된 주요 조직 적합성 복합체 항원(MHC)에 의해 활성화된다.

MLR 방법에 의할 경우, 동종항원에 의해 유도된 비장 림프구의 증식은 다양한 농도의 세포외 생체고분자의 첨가에 의해 증가되었음을 도 9에서 확인할 수 있었다.

EX-GF-Fr.Ⅰ, EX-GF-Fr.Ⅲ은 양성 대조군(LPS)에 비하여 상대적으로 저조한 비장 림프구의 증식 활성을 나타내었으나, EX-GF-Fr.Ⅱ는 10㎍/㎖의 농도에서 가장 탁월한 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

서로 다른 배양 배지에서의 EX-GF-Fr.Ⅱ의 효과는 도 10에서 보는 바와 같다. Con-A 및 LPS는 일반적으로 T 및 B 림포사이트의 분열 활성을 자극하기 위한 양성 대조군으로서 사용되어 진다. 비장 림프구의 증식은 EX-GF-Fr.Ⅱ와 LPS로 처리한 경우에는 35%의 상승효과를 가짐에 반하여 비장 림프구가 EX-GF-Fr.Ⅱ 및 Con-A로 배양되었을 때는 EX-GF-Fr.Ⅱ로만 처리된 경우와 동등한 효과를 가짐을 증명한다. 이 결과는 EX-GF-Fr.Ⅱ와 LPS의 처리는 림포사이트의 증식에 상승적인 효과를 가짐을 보여주는 것이다.

그러므로 EX-GF-Fr.Ⅱ는 비장 림프구의 중요한 분열활성을 가지고 있는 것으로 판단된다.

실험예 6. 세포외 생체고분자의 분자량 측정

상기 실시예 1에서 수득한 세포외 생체고분자의 분자량은 소덱스(Shodex) GS520, GS320 및 GS220이 혼합된 컬럼을 사용한 HPLC를 이용하여 측정하였다. 표준 풀루란(Pullulans, P1600, 800, 400, 200, 100, 50, 20, 10, 5)을 분자량 측정의 표준으로서 사용하여 작성하였다.

세포외 생체고분자의 분획들의 분자량을 조사하기 위하여 표준 곡선으로 포도당(180) 및 덱스트란 시리즈; T-70(7×10⁴), T-40(4×10⁴), T-10(1×10⁴)를 사용하여 수득하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 11에서 보는 바와 같이 EX-GF-Fr.Ⅰ, EX-GF-Fr.Ⅱ, EX-GF-Fr.Ⅲ의 분자량은 세파덱스 G-100 겔 크로마토그래피에 의해 각각 약 163kDa, 40kDa, 2.8kDa임을 확인할 수 있었다.

실험예 7. 단백질 및 당 조성의 분석

7-1. 단백질 조성 분석

세포외 생체고분자의 총 단백질 성분은 소 혈청 알부민(BSA)을 이용하여 로우리(the method Lowry)의 방법을 응용하여 측정하였다(Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, L., and Randall, R. J., Protein measurementwith the Folin phenol reagent. J. Biol . Chem., 193, pp265-275., 1951). 단백질을 가수분해하여 아미노산 조성은 Na-폼 컬럼으로 바이오크롬 20(Biochrom 20, Pharmacia Biotech. Ltd., USA) 아미노산 자동 분석기를 이용하여 분석하였다.

EX-GF-Fr.Ⅰ, EX-GF-Fr.Ⅱ, EX-GF-Fr.Ⅲ의 총 단백질 성분은 각각 17.3%, 35.2%, 10.7%이며, 아미노산 조성은 하기 표 1에서 보는 바와 같다. 모든 분획들은 아스파르틴산, 글루타민산, 글라이신, 알라닌, 발린이 주요 아미노산으로 조성되어 있었다.

7-2. 당 조성 분석

표준물질로서 포도당과 만노스 1:1의 비율로된 혼합물을 이용하여 페놀-황 산 방법을 응용하여 생체고분자의 총 당 성분을 분석하였다(Dubois, M., Gilles et al., Colorimetric method for determination of sugar and related substance. Analyt. Chem., 28, pp350-356, 1956). 당 조성은 가수분해 및 아세틸레이션 방법에 기초하여 SP^TM-2380 모세관 컬럼(15m×0.25mm i.d., 0.2-㎛ 필름: SUPELCO)상에서 FID(flame-ionization detector)를 갖춘 베리안 GC3600 가스 크로마토그래피를 이용하여 분석하였다.

EX-GF-Fr.Ⅰ, EX-GF-Fr.Ⅱ, EX-GF-Fr.Ⅲ의 총 당 성분 및 조성은 GC에 의해 분석하였으며 이는 하기 표 2와 같다. EX-GF-Fr.Ⅰ, EX-GF-Fr.Ⅱ, EX-GF-Fr.Ⅲ의 중성 당 성분은 각각 80.3%, 61.9%, 89.3%이다. EX-GF-Fr.Ⅰ, EX-GF-Fr.Ⅱ의 우로닌산 성분은 각각 2.4%, 2.9%이며 주로 만노스를 함유하고 있다. 반면에 EX-GF-Fr.Ⅲ은 주로 포도당을 함유하고 있다.

단백질 조성 분석 결과

	EX-GF-Fr.Ⅰ	EX-GF-Fr.Ⅱ	EX-GF-Fr.Ⅲ
총 단백질(%)	17.30	35.20	10.70
아미노산(%)^a
아스파르틴산	8.82	13.38	10.80
트레오닌	6.43	11.55	6.52
세레린	8.07	9.77	6.15
글루타민산	10.15	9.43	12.60
프로린	0.47	0.45	0.43
글라이신	10.29	10.61	10.88
알라닌	8.57	9.60	11.75
시스테인	2.78	0.58	0.45
발린	8.84	7.25	7.45
메티오닌	4.34	0.20	0.11
이소루신	5.15	4.70	4.57
루신	7.36	8.71	8.81
티레오닌	8.66	0.13	0.66
페닐알라닌	2.20	7.24	4.25
히스티딘	0.65	1.04	2.04
라이신	3.75	2.51	7.89
아르기닌	3.48	2.84	4.64

당 조성의 분석결과

	EX-GF-Fr.Ⅰ	EX-GF-Fr.Ⅱ	EX-GF-Fr.Ⅲ
총 당(%)	80.30	61.90	89.30
우론산	2.40	2.90	-
중성 당(몰 비율)^a
람노스	0.37	0.01	0.41
푸코스	9.08	0.64	-
리보오스	0.09	0.01	1.44
아라비노스	0.08	0.02	-
자일로스	11.73	0.07	0.15
만노스	18.10	1.17	1.34
갈락토오즈	1.00	1.00	1.00
포도당	0.84	0.29	3.98

실험예 8. 세포외 생체고분자의 IR(Infrared spectroscopy) 분광기를 통한 구조분석

세포외 생체고분자 1㎎은 순수 브롬화칼륨 100㎎과 혼합하고 디스크 펠린으로 압착하였다. 전체 IR 분광(4000-400cm^-1)은 매트슨 기계인 FTIR(Fourier transform infrared spectrophotometer) 제너시스 Ⅱ로 기록하였고, 수득된 분광기록은 공개된 데이터와 비교하여 분석하였다.

잎새 버섯의 균사체(mycelia) 액체배양물로부터 수득된 세포외 생체고분자의 FT-IR 스펙트라는 KBr 펠릿에서 측정하여, 전체 IR 스펙트라(4000-400 cm^-1) 을 측정하였다.

세포외 생체고분자의 FT-IR 분광은 복잡하며 상기 방법은 보통 그들의 구조에 있어서 특정 기능성 기의 동정에 의해 제한된다. 그러나 이들 분획들의 물리화학적 분석을 함께 수행할 경우 폴리사카라이드의 구조적 정보를 수득할 수 있다. 각 세포외 생체고분자 분획들은 FT-IR상에서 KBr 태블렛(tablet)으로서 기록하였으며, 전체 IR 분광(4000-400cm^-1)를 측정하였다.

상기 실험 수행의 결과, EX-GF-Fr.Ⅰ, EX-GF-Fr.Ⅱ, EX-GF-Fr.Ⅲ의 IR 분광은 도 12에서 보는 바와 같다. 분광은 폴리사카라이드의 파장 특성에서의 흡광을 보여준다:O-H streching(3300-3500cm^-1), C-H stretching(3000-2850cm^-1), 카보닐(-CHO, -CO) streching(-1700cm^-1). 본 발명의 모든 세포외 생체고분자들은 탄수화물로 인해 1650cm^-1의 주의에서 주요 특성 흡수를 보여주었으며, 810cm^-1에서의 작은 흡수는 만노스의 특성이다. 대략 3400cm^- ¹부위는 탄수화물 링의 주요한 특성이다.

EX-GF-Fr.Ⅰ의 880cm^-1에서의 작은 날카로운 밴드는 β-글루코시드 결합을 나타낸다. EX-GF-Fr.Ⅰ, EX-GF-Fr.Ⅱ의 우론산의 분광은 1018, 1100cm^-1에서의 두개의 피크를 가진다. 그러나 EX-GF-Fr.Ⅲ은 우론산의 피크를 보이지 않았다.

상술한 바와 같이, 본 발명은 항 보체 활성, 대식세포에 대한 리소좀 효소의 활성화,NO 생산 및 비장 림프구의 증식을 자극하는 활성을 가지는 잎새 버섯의 액체배양물로부터 분리된 세포외 생체고분자를 제공한다. 본 발명의 세포외 생체고분자은 세파덱스 G-100 겔 크로마토그래피에 의해 EX-GF-Fr.I, EX-GF-Fr.II, EX-GF-Fr.III으로 분리되는데 그 중에서 EX-GF-Fr.III은 가장 높은 항 보체 활성을 가지며 이는 보체 시스템에서 고전 경로 및 대체 경로를 통해 매개되며, 대식세포에 대한 리소좀 효소의 활성화 및 NO 생산을 자극한다. 한편 EX-GF-Fr.II는 주로 비장 림프구의 증식을 활성화시키는 효과를 가지고 있다. 또한 세포외 다당체의 분획들은 만노우즈와 글루코우즈가 주인 당과 아스파틱산, 글루탐산, 글라이신 및 알라닌이 주인 단백질로 구성된 단백다당체이다. 따라서 본 발명의 잎새 버섯으로 부터 분리된 세포외 생체고분자는 면역 조절 활성을 가지고 있어 면역 증강용 약학 조성 물로서 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

항 보체 활성, 리소좀 효소의 활성화, NO 생산 및 비장 림프구의 증식능을 자극하는 활성을 가지는 잎새 버섯의 액체배양물로부터 분리된 세포외 생체고분자.
제 1항에 있어서, 상기 세포외 생체고분자은 163kDa의 분자량을 갖는 분획, 40kDa의 분자량을 갖는 분획 및 2.8kDa의 분자량을 갖는 분획으로 구성되어 있음을 특징으로 하는 세포외 생체고분자.
제 2항에 있어서, 상기 163kDa의 분자량을 갖는 분획은 80.3%의 당, 2.4%의 산성당 및 17.3%의 단백질로 구성되어 있으며, 주요 당은 자일로즈, 만노우즈, 및 갈락토우즈, 주요 아미노산은 글루탐산과 글라이신으로 이루어져 있었다. 40kDa의 분자량을 갖는 분획은 61.9%의 당, 2.9%의 산성당, 35.2%의 단백질로 구성되어 있으며, 주요 당은 만노우즈와 갈락토우즈, 주요 아미노산은 아스파틱산, 트레오닌 및 글라이신으로 이루어져 있었다. 2.8kDa의 분자량을 갖는 분획은 89.3%의 당, 10.7%의 단백질로 구성되어 있으며, 주요 당은 리보우즈, 만노우즈 및 글루코우즈, 주요 아미노산은 아스파틱산, 글루탐산, 글라이신 및 알라닌으로 구성되어 있음을 특징으로 하는 세포외 생체고분자.
제 1항의 잎새 버섯의 액체배양물로부터 분리된 세포외 생체고분자 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조첨가제를 포함하는 면역 증강용 건강기능식품.
제 4항에 있어서, 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제인 건강기능식품.