KR100943716B1 - 글리코겐의 물리화학적 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 글리코겐 - Google Patents

Abstract

글리코겐을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 당질원료를 산성조건에서 가열하는 공정을 포함한다. 당질원료는 다당 또는 올리고 당일 수 있다. 혹은 당질원료는 Panax notoginseng(田七人參), 윤난산치(玄南文三七)분말, 인삼, 소맥분, 대두, 콩가루, 시이타케 버섯 및 커피 추출잔여물로 구성된 군에서 선택된 식물소재일 수 있다. 대표적으로 상기 글리코겐은 10,000이하의 분자량을 가지는 분자를 포함한다. 상기 글리코겐은 [α]D+197°의 비선광도(specific rotation) 및 ¹H NMR 스펙트럼에서 5.37ppm 및 4.95~5.33ppm의 아노머릭 양자(anomeric proton) 피크를 가진다.

글리코겐 제조, 식물 소재, Panax notoginseng

Description

글리코겐의 물리화학적 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 글리코겐 {Method of Physicochemically Producing Glycogen and Glycogen Obtained By The Same}

본 발명은 전분, 셀룰로오즈, 덱스트린, 프룰란 등의 다당류, 말토오즈 등의 올리고당 및 상기 당을 포함하는 소맥분, Panax notoginseng (田七人參)등의 당질원료로부터 글리코겐을 물리화학적으로 생성하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 얻어진 글리코겐 및 상기 글리코겐의 이용에 관한 것이다.

글리코겐은 식물의 저장다당인 전분과 같이 글루코오스로 구성되는 호모폴리사카라이드이다. 글리코겐은 D-글루코오즈가 α-1,4 글리코시드 결합으로 결합된 폴리머 구조를 가지고, 8~10개의 글루코스 잔기 당 1개의 α-1,6 글리코시드 결합에 의한 측쇄잔기를 가지는 고도로 얽힌 망상구조를 가지고 있다.

글리코겐은 동물의 저장다당으로 알려져 있다. 동물에서는 거의 대부분의 세포에서 과립상태(글리코겐 과립)로 존재하고, 특히 간 및 근육에 많이 존재한다고 열려져 있다. 근 글리코겐은 근수축의 에너지원이며, 간의 글리코겐은 공복시 혈당유지를 위하여 사용된다. 따라서, 이러한 성질의 차이에 의하여 글리코겐의 기능의 차이를 가져온다. 근 글리코겐은 100만~200만의 분자량을 가진다. 간 글리코겐은 500만~600만 정도의 분자량을 가지며, 때때로 분자량이 2000만에 달하는 것도 있다(Iwanami seibutsugaku Jiten[생물학 사전], 4판, p354, Iwanami-shoten (Tokyo) 1996년 3월 21일 발행).

글리코겐은 동물의 저장다당인 한편, 간기능을 향상시키는 작용을 나타낸다고도 알려져 있다. 또한 오징어 및 가리비에서 추출된 글리코겐은 강한 항종양활성을 나타낸다는 보고가 있다(Takata, Y. et al., J. Mar, Biotech., 6:208-213, 1998). 이러한 글리코겐은 기능성 식품의 새로운 소재로서 유용성을 가지고 이를 응용하기 위한 개발이 진행되고 있다.

글리코겐은 동물체 내에서 글루코오스 등의 단당으로부터 생합성된다.

일반적으로, 다당의 당사슬을 합성하는 방법은 화학적 방법과 효소적 방법이 있으며, 두 방법 모두 당의 헤미아세탈 고리를 형성하는 아노머 위치의 OH기를 이탈기로서 먼저 활성화시켜, 다른 당이나 생성분으로 치환시키는 것을 원리로 하고 있다. 이제까지 화학적 방법을 이용하여, 시알릴 Le^x 갱글리오시드(sialyl Le^x ganglioside; 세포접착 분자 또는 암 관련 항원에 관한 연구에 획기적인 성과를 가져왔다), 칼리케마이신(calicheamicin; 암억제작용을 가진다) 등이 개발되었으며, 효소적 방법을 이용하여, 싸이클로덱스트린(cyclodextrin; 포접작용을 가진다), 커플링 당(치아우식을 덜 유발하는 대체 감미료) 등의 다당이 개발되고 있다.

다당의 당사슬 합성을 위한 화학적 방법에 있어서는, 예를 들면, 긴사슬 올 리고당을 산분해시켜, 생성된 각 종 단당에 희석시킨 산을 가하면 역반응에 의하여 올리고당의 혼합물이 생성되는 것이 알려져 있다. 또한, 효소적 방법으로는 슈크로오즈에 당가수분해효소인 인버타아제(invertase)를 고농도 및 고온으로 작용시키면, 슈크로오즈 한 분자당 절단된 과당이 1~3분자 전이되어 프락토올리고당이 생성되는 것으로 알려져 있다.

일반적으로, 다당의 당사슬을 화학적으로 합성하기 위해서는, 당의 공여체, 당의 수용체 및 프로모터가 필요하다. 게다가 당의 공여체 및 당의 수용체 또는 필요에 따른 이들의 유도체의 제조 및 용매, 탈수제, 온도 등의 인자를 엄격히 결정할 필요가 있으며, 또한 보호기의 전환 또는 제거 혹은 특정의 수산기만을 유리시키는 것 등의 복잡한 공정이 필요하다. 따라서, 다당의 당사슬을 화학적으로 합성하는 것은 용이하지 않다. 그러므로, 당의 공여체 및 당의 수용체 및 상기 인자는 각각의 기질마다 개별적으로 결정하여야 한다. 원료가 되는 기질의 종류에 상관없이 일반적으로 적용될 수 있는 당결합 방법은 알려져 있지 않다.

발명의 개시

본 발명자는 다당의 합성방법에 관하여 예의 연구한 결과, 저장다당을 포함하는 식물 및 다당 자체를 산(acid)의 존재하에 가열·가압 처리하는 것에 의하여 글리코겐이 생성되는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다. 본 발명에 의하면, 전분 등의 다당류를 다량 함유하는 식물 및 전분, 프룰란, 셀룰로오즈, 글루코만난, 자일란 및 덱스트란 등을 원료로 하여 간단한 조작으로 글리코겐을 다량 제 공할 수 있다. 본 발명자는 또한, 수득한 글리코겐의 물성을 분석하는 것에 의하여 본 발명을 완성하게 되었다. 본 발명에 따르면, 글리코겐, 특히 10,000 이하의 분자량을 가지는 저분자 글리코겐을 제공할 수 있다.

본 발명자들은 먼저 "효우멘코시쯔-노-코케이부츠-까라노-유콘세이분-노-츠우슈츠-호우호-오요비-덴친간뉴쇼쿠요우소세이부츠"[일본특허 출원 2001-280812, 2001년 9월 14일 출원(표면경질의 고형물로부터의 유효성분의 추출물 및 덴틴함유 식용조성물)]에 있어서, Panax notoginseng으로부터 먼저 미네랄류를 추출한 후, 추출잔여물로부터 희석 에탄올용액을 이용하여 유기성분을 추출하는 2단계 추출법을 개시하고, 무기 및 유기의 양성분을 고농도로 함유하면서도 수용성인 Panax notoginseng 추출물 분말을 제조하는 방법을 나타내었다. 상기 Panax notoginseng 추출물 분말 중에는 약 86%의 당류가 함유되어 있다. 또한, 본 명세서에서 사용하는 "%"는 특정한 지정이 없으면 중량 %를 의미한다.

본 발명자는, 특정한 논리에 구속되는 것을 바라지 않으나, 상기 당류 함량이 많은 점 및 Panax notoginseng의 항간염작용이 진세노사이드 화합물에 의한 것만은 아니라고 생각하였다. 본 발명자는, 상기 Panax notoginseng 추출물 분말 중에 존제하는 당질에 관하여 예의 연구하여, 그 중의 하나가 간기능을 향상시키는 작용에 관여하는 글리코겐인 것을 확인하였다. 본 발명자들은 상기 글리코겐을 정량하고 본 발명을 완성하게 되었다.

그 결과, Panax notoginseng 자체에는 약 4.42% 밖에 함유되어 있지 않은 글리코겐이, Panax notoginseng 추출물 분말에는 약 37.45% 함유되어 있는(원료중량 비로는 약 29.15%) 것을 확인하였다. 상기 Panax notoginseng 추출물로부터 글리코겐을 정제하여, NMR 측정에 의하여 글리코겐인 것을 확인하였다. 또한, 글리코겐 정제과정에서, 여러 분자량을 가지는 글리코겐이 생성되어 있는 것도 확인하였다. 상기 사실로부터, 산 및 가압조작에 의하여 당성분의 트랜스글리코실화 반응이 일어나, 글리코겐이 생성되었다고 판단되어진다.

본 발명은, 글리코겐을 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 당질원료를 산성조건에서 가열·가압하는 공정을 포함한다.

상기 당질원료는 다당 또는 올리고당인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 당질원료는 글루코스의 호모폴리사카라이드인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 당질원료는 전분, 푸룰란, 덱스트란 또는 셀룰로오스인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 당질원료는 Panax notoginseng, 윤난산치(玄南文三七)분말, 인삼, 소맥분, 대두, 콩가루, 시이타케 버섯 및 커피 추출잔여물로 구성된 군에서 선택된 식물소재인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 식물소재는 가공되지 않은 식물 그 자체, 과립형태 또는 분말형태인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 가열 공정은 유기산 존재 하에 수행하는 것이 바람직하다.

상기 유기산은 구연산인 것이 바람직하다.

상기 가열 공정은, 상기 당질원료에 대하여 약 10 중량%의 구연산이 존재하 는 조건에서 수행하는 것이 바람직하다.

상기 가열공정은 가압조건에서 수행하는 것이 바람직하다.

본 발명은 또한, 식물 추출물에 관한 것으로, 상기 식물 추출물은 식물 유래의 글리코겐을 함유하고, 식물소재를 산성조건에서 가열·가압하는 공정을 포함하는 방법에 의해 제조하여 얻을 수 있다.

상기 방법은 상기 식물소재를 산성조건에서 가열·가압하는 공정으로 얻어진 추출액을 추출잔여물로부터 분리하는 공정, 상기 추출액 또는 추출잔여물을 유기용매로 추출하는 공정을 더 포함할 수 있다.

대표적으로 상기 식물추출액은 식물유래의 글리코겐을 높은 농도로 함유하고, 다음과 같은 방법으로 제조한다. 식물체의 원형(이하 "가공되지 않은 형태"로 또는 식물체의 전체 또는 일부는 "가공되지 않은 조직"으로 기재함), 과립형태 및 분말형태를 산성수용액과 함께 일정시간 가열한 후, 다시 가압·가열처리하여 얻어진 추출액 및 그 잔여물로 얻어진 고형물을 약 40~60% 에탄올로 가온추출하여 얻어진 추출물을 혼합한 후, 이를 농축한다. 수득한 식물추출액은 분말화에 의하여 추출물 분말형태로 하여도 좋다.

대표적으로, 상기 산성조건을 만들기 위해서는 유기산을 첨가하는 것이 바람직하며, 산성조건은 pH 6이하로 하는 것이 바람직하다. 상기 유기산은 구연산을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 본 명세서에서 사용하는 "식물 유래의 글리코겐"이라는 용어는 식물체(뿌리, 줄기, 잎)에 함유되어 있는 글리코겐, 또는 식물체에 포함된 당류에서 형성된 글리코겐을 말한다. 또한, 본 명세서에서 사용하는 "식물소 재"라는 용어는 식물체(뿌리, 줄기, 잎), 상기 식물체의 절단, 분쇄 등의 처리를 거쳐 얻어진 임의의 형태의 일부(입자형태, 절편형태 등), 식물체 또는 그 일부의 추출물 등을 말한다.

본 발명은 또한, 10,000 이하의 분자량을 가지는 글리코겐에 관한 것이다.

대표적으로, 상기 글리코겐은 약 3,000, 약 9,000 또는 약 9, 500의 분자량을 가진다.

본 발명은 또한, 10,000 이하의 분자량을 가지는 글리코겐을 주성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다.

상기 조성물은 약 320,000의 분자량을 가지는 글리코겐 및 약 3,000의 분자량을 가지는 글리코겐을 포함할 수 있다.

상기 조성물은 [α]_D + 197˚의 비선광도(specific rotation) 및 ¹H NMR 스펙트럼에서 5.37ppm 및 4.95~5.33ppm의 아노머릭 양자(anomeric proton) 피크를 가지는 글리코겐을 포함할 수 있다.

상기 조성물은 약 280,000의 분자량을 가지는 글리코겐 및 약 9,000의 분자량을 가지는 글리코겐을 포함할 수 있다.

상기 조성물은 [α]_D +178˚의 비선광도(specific rotation) 및 ¹H NMR 스펙트럼에서 4.97ppm 및 5.22~5.33ppm의 아노머릭 양자(anomeric proton) 피크를 가지는 글리코겐을 포함할 수 있다.

상기 조성물은 약 3,000,000의 분자량을 가지는 글리코겐, 약 1,200,000의 분자량을 가지는 글리코겐 및 9,500의 분자량을 가지는 글리코겐을 포함할 수 있다.

상기 조성물은 [α]_D +174˚의 비선광도(specific rotation) 및 ¹H NMR 스펙트럼에서 5.38ppm 및 4.96ppm의 아노머릭 양자(anomeric proton) 피크를 가지는 글리코겐을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기의 식물추출물을 포함하는 식용조성물에 관한 것이다. 상기 식용조성물은 상기의 식물추출물 또는 추출물 분말을 글리코겐 성분으로서 배합하여 조제할 수 있다.

도 1은 본 발명에 의한 글리코겐의 생성률을 시간에 따라 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명의 조성물의 HPLC 분석의 크로마토그램을 나타낸 것이다.

도 3A는 본 발명의 조성물에 포함된 글리코겐의 NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다. 도 3A의 (a)는 본 발명의 조성물에 포함된 Panax notoginseng 유래의 정제 글리코겐의 NMR 스펙트럼이고, 도 3A의 (b)는 표준 글리코겐의 NMR 스펙트럼이다.

도 3B는 본 발명의 조성물에 포함된 글리코겐의 NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다. 도 3B의 (c)는 덱스트란 유래의 정제 글리코겐의 NMR 스펙트럼이고, 도 3B의 (d)는 전분 유래의 정제 글리코겐의 NMR 스펙트럼이다.

이하, 본 발명의 실시의 형태에 관하여 상세히 서술한다.

본 발명의 글리코겐의 시작재료가 되는 당질원료는 대표적으로 전분, 셀룰로오스, 덱스트란, 프룰란 등의 다당류 및 말토오즈 등의 올리고당이다.

Panax notoginseng 등의 당을 포함하는 천연 식물소재를 당질원료로서 그대로 이용하여도 좋다. Panax notoginseng은 진세노사이드, 미네랄 및 비타민을 높은 농도로 포함하고 있으며, 산지, 수확시기에 상관없이 가공되지 않은 형태, 또는 파쇄·분쇄한 세립자, 미립자 및 미분말 중 어느 하나의 형태를 본 발명의 글리코겐의 시작재료로서 사용할 수 있다.

본 발명의 글리코겐은 상기 당질 원료를 산성 조건에서 가열·가압하는 공정을 포함하는 방법에 의해 제조된다.

상기 산성 조건은 인산, 염산 등의 무기산을 첨가하는 것에 의하여 달성될 수 있다. 또는 상기 산성 조건은, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 사과산, 젖산, 호박산, 글루콘산 및 글루쿠론산, 상기 유기산들의 나트륨 또는 칼슘 염, 및 상기 산들의 혼합물을 이용하여 달성할 수 있다. 상기 초산은 식초(합성식초와 사과식초, 과실식초, 해조식초, 와인 식초 등의 양조식초 및 상기 식초를 임의의 배합으로 혼합한 혼합물을 포함한다)를 첨가할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 산성 조건은 구연산, 초산을 사용하여 달성할 수 있다. 가장 바람직하게는 상기 산성 조건은 구연산을 사용하여 달성할 수 있다.

상기 무기산 또는 유기산은, 상기 당질원료를 포함하는 수용액이 pH 6 이하, 바람직하게는 pH 5~1의 범위가 되도록 충분한 양, 통상 당질원료에 대하여 0.1~20 중량% 범위, 보다 바람직하게는 1~15 중량% 범위, 가장 바람직하게는 5~10중량%의 범위로 첨가할 수 있다. 통상, 당질원료에 첨가되는 산은 당질원료에 대하여 2~15배 용량, 바람직하게는 당질원료에 대하여 8~10배 용량의 물에 용해한 후 당질원료에 첨가한다.

상기 당질원료를 산성조건에서 가열하는 공정은, 대기압조건, 약 100℃의 온도에서, 통상 10분 ~ 수시간 동안, 바람직하게는 30분 ~ 2시간 동안 수행한다. 또는 상기 가열 공정은 1~1.3kgf/㎠의 가압 하에서 75~125℃의 온도 범위(용기에 따라 다름)에서 수행할 수 있다. 이 경우, 필요에 따라 당질원료를 포함하는 산 함유용액은 가압 하에서 가열하기 전에, 대기압 하 약 100℃의 온도에서, 통상 10분 ~ 수시간 동안, 바람직하게는 30분 ~ 2시간 동안 예비가열시켜 글리코겐의 생성효율을 증대시킬 수 있다.

본 발명의 글리코겐을 제조하는 방법은 가열시킨 당질원료로부터 글리코겐을 포함하는 용액을 분리하는 공정을 더 포함할 수 있다. 상기 글리코겐을 포함하는 용액을 분리하는 공정은, 여과, 원심분리 등의 당해분야의 공지의 방법에 의하여 실시할 수 있다. 수득된 글리코겐을 포함하는 용액은, 동결건조, 스프레이건조 등 당해 분야의 공지의 방법에 의하여 농축 또는 건조하여 글리코겐 함유 분말을 얻을수 있다.

필요에 따라 본 발명의 글리코겐은 상기 글리코겐 함유 분말을 더 정제하여 얻을 수 있다. 글리코겐의 정제는 당해분야에서 이미 알려진 수단을 이용하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 카즈오마츠다 저서인 "타토우-노-분리세이세이호우 (다당의 분리·정제법)", p.130-131, 1989를 참조한 방법을 들 수 있다. 상기와 같은 방법은 알코올을 이용한 분별침전법이 있다. 대표적인 알코올로서 메탄올 및 에탄올을 사용할 수 있다. 필요에 따라서, 글리코겐 함유 분말은 상기의 처리를 수행하기 전에, 단백질 제거 처리 등을 실시할 수 있다. 상기와 같은 단백질 제거 처리로는 트리클로로아세트산 처리, 알코올 또는 클로로포름 등의 용매를 사용한 처리가 알려져 있다. 수득된 정제 글리코겐은 겔 여과, 비선광도(specific rotation), NMR 측정시험 등의 공지의 방법을 사용하여, 분자량, 분자량 분포, 글루코오스 결합양식 등의 물성을 분석하여, 그 구조를 해석할 수 있다.

이하, 본 발명의 글리코겐 함유 분말의 효율적 제조법의 대표적 예를 나타내었다.

적절하게 과립화된 Panax notoginseng을 10 중량% 구연산 수용액과 함께 90~100℃에서, 필요에 따라 교반하면서 1시간 동안 가열한다. 그 후 1.1~1.3kgf/㎠으로 유지하면서, 압력을 올리기 시작한 때부터 2시간에 걸쳐 가압·가열한 후, 여과 등의 통상의 방법에 따라 추출액과 고형분의 추출잔여물을 분리한다. 수득된 추출액을 건조처리(동결건조, 스프레이 건조 등)하여 본 발명의 글리코겐 함유 분말을 얻는다. 또한, 상기 사용하는 Panax notoginseng은 가공하기 않은 조직, 과립 또는 분말 중 어느 것이라도 좋다.

또한, 상기의 예에서는 당질원료로서 Panax notoginseng을 사용한 예를 기재 하였지만, 당질원료로서는 Panax notoginseng에 한정되지 않고, 소맥분, 대두, 인삼, 건강(乾姜) 및 심황 등의 식물소재를 Panax notoginseng에 대신하여 사용하여도 좋으며, 상기 식물소재에 함유되어 있는 유효성분을 잃지 않고 각 식물 소재에 포함된 당을 글리코겐으로 변환하여 각각의 글리코겐 함유 분말을 얻을 수 있다. 게다가, 본 발명의 글리코겐의 제조방법은 상기 식물소재를 대신하여, 다당, 올리고당 등의 당 자체를 시작원료로서 사용할 수도 있다. 또한, 본 발명에서 사용되는 당질 원료는 상기의 예에 한정되지 않는다는 것은 말할 필요도 없다.

본 발명의 글리코겐 함유 분말은 물에 대하여 매우 잘 녹는 것이 큰 특징이다. 그 때문에, 액상, 겔상 혹은 고형상의 식품조성물로서 종류를 한정되지 않고 이용가능하다. 본 발명의 글리코겐 함유 분말은 예를 들면, 청량음료수, 쥬스, 차, 젤리, 푸딩, 빵, 쿠키, 캬라멜, 오카키(쌀과자) 등에 첨가하거나, 필요에 따라서 전분, 덱스트린, 유당 등의 부형제, 그 밖의 식용조성물의 추출물제, 색소, 향료 등과 함께 분말, 과립, 정제로 가공하거나, 젤라틴 등의 피복제를 사용하여 캡슐로 성형가공하여 건강식품이나 영양보조식품 등으로서 사용하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 글리코겐 함유분말을 이용가능한 식용조성물은 상기의 예에 한정되지 않는다는 것은 말할 것도 없다.

또한, 글리코겐 함유 분말의 식용조성물에 대한 사용량은, 당해 식용조성물의 종류나 상태 등에 의하며, 약 0.1~100중량% 범위에서 첨가할 수 있다.

본 발명의 글리코겐 함유 분말은, 식물소재 중의 유효성분이 수용성의 성상을 가지고 추출되기 때문에, 다른 물질과의 배합조정이 용이하며, 기능성 인자로서 의 효과를 높일 수 있다.

이하, 본 발명의 실시예를 이용하여 설명한다. 이하의 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. Panax notoginseng 추출물 분말의 조제

과립상(2~3mmφ)의 Panax notoginseng 91kg, 구연산 9 kg 및 물 550L를 가압장치가 장착된 탱크에 넣고, 90~96℃에서 1시간 가열한 후, 1.1kgf/㎠의 가압상태로 1시간 동안 유지하였다. 얻어진 반응액을 NA500여과지를 장착한 가압여과장치에서 여과하여 추출액을 분취하였다. 그 후, 탱크 안의 Panax notoginseng의 추출잔여물에 45중량%의 에탄올 용액 700L를 가하여, 65℃에서 2시간 가열환류를 행하였다. 얻어진 반응액을 NA500여과지를 장착한 가압여과장치에서 여과하여 추출액을 분취하였다. 상기와 같이 얻어진 구연산 추출액 및 에탄올 추출액을 혼합하여, 농축하고, 얻어진 농축액을 스프레이 건조법에 의해 건조하여 65.76kg의 추출물 분말(동결건조 분말)을 얻었다. 상기와 같이 얻어진 추출물 분말 내에 존재하는 성분을 분석하였다. 표 1에는 글리코겐의 측정 결과를 나타내었다.

표 1의 a)에 나타낸 바와 같이, Panax notoginseng의 추출물 분말 중에는 37.45%의 글리코겐이 포함되어 있었다. 또한, 글리코겐은, 굴 추출물 식품규격 기준(일본건강·영양식품협회)을 사용하여 측정하였으며, 표 1의 글리코겐 농도(%)는 동결건조에 의해 얻어진 추출물 분말의 글리코겐 함량을 중량%로, 그리고 글리코겐 생성율은 상기 추출물 분말의 글리코겐의 중량을 원료의 중량으로 나눈 수치이다(원료 비환산).

표 1의 a)에는 다음에 서술한 실시예 4에 기재된 것과 같이, 10~30g의 추출물 분말을 사용하는 것을 제외하고는, 동일한 방법에 의하여, 윤난산치(玄南文三七)분말, 가공하지 않은 형태의 인삼의 추출물 분말, 소맥분 추출물 분말, 가공하지 않은 형태의 대두 추출물 분말, 콩가루 추출물 분말 및 시이타케의 추출물 분말을 수득하여, 그 중에 포함된 글리코겐을 측정한 결과들도 동시에 나타내었다. 표 1의 a)에 나타낸 것과 같이, 윤난산치(玄南文三七)가루, 가공하지 않은 형태의 인삼의 추출물 분말, 소맥분 추출물 분말, 가공하지 않은 형태의 대두 추출물 분말, 콩가루 추출물 분말 및 시이타케의 추출물 분말에는, 글리코겐이 각각 32.70중량%, 18.29중량%, 47.06중량%, 5.82중량%, 44.03중량% 및 1.74중량% 포함되어 있다. 표 1의 b)의 결과에 대해서는 다음에 서술한 실시예 4에서 설명하였다.

a) 본 발명의 방법에 따른 식물체로부터의 글리코겐의 생성

시료	FD*분말 중의 글리코겐 농도(%)	원료 당 글리코겐 생성률(%)
Panax notoginseng 분말 Panax notoginseng의추출물 분말	- 37.45	(4.42) 29.15
윤난산치 가루 윤난산치 가루 추출물 분말	- 32.70	(1.51) 20.05
인삼의 가공하지 않은 조직의 추출물 분말	18.29	5.49
소맥분 추출물 분말	47.06	32.70
대두 추출물 분말	5.82	1.60
콩가루 콩가루 추출물 분말	- 44.03	(0.47) 2.02
시이타케 시이타케 추출물 분말	- 1.74	(0.15) 0.75
영지 영지 추출물 분말	2.28	(2.55) 0.27
아가리쿠스 추출물*1 아가리쿠스 추출물 분말	- 1.67	(32.53) 0.87
커피 추출잔여물	8.64	-*2

^*FD: 동결건조(Freeze-dry)를 나타냄. ( )안의 수치는 식물의 원래 함유량을 나타냄.

^*1125℃에서 가압하여 뜨거운 물로 추출하였다.

^*2커피 추출잔여물은 수분함량이 불명확하여 계산할 수 없었다.

b)

시료	글리코겐 정량치(%)
편자황(片仔廣: 국내용)	3.49
편자황(수출용)	2.65

실시예 2. 글리코겐 생성조건의 검토

다음으로, 가압시간을 변화시켜 글리코겐 생성률을 비교하였다.

4개의 삼각플라스크의 각각에 175ml의 물을 30~35g의 가공되지 않은 형태의 Panax notoginseng 및 Panax notoginseng의 9중량%에 상당하는 구연산을 첨가하여 식품포장용 랩필름으로 뚜껑을 씌우듯이 덮어, 오토클레이브에서 1~1.2kgf/㎠의 가압조건으로 10분, 20분, 35분 및 60분간 각각 열을 가하여 끓인다. 각 반응물을 실온에서 냉각시킨 후, 용액부분을 원심분리(3,000rpm, 5분간)시켜 추출액을 얻는다. 침전잔여물은 처음의 Panax notoginseng이 남아있는 삼각플라스크로 각각 되담고, 50% 에탄올 용액 200ml과 함께 환류응축기에 장착하여 85℃에서 1~1.5시간 가온하였다. 수득된 가열용액은 실온에서 냉각시킨 후, 원심분리(5,000rpm, 10분간)하여 에탄올 추출용액을 분취하여, 먼저 분취한 추출액과 혼합하여 감압조건에서 농축한 후 스프레이 건조처리를 수행하여 각각 분말화하였다.

수득된 추출물 분말의 생성량 및 그 속에 포함된 글리코겐의 측정결과는 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 추출물 분말의 수율은 35분의 감압시간에서 74%의 최고치를 나타내었고, 글리코겐 생성율은 10분에 약 40%에 달하여, 이 이후 60분까지는 별다른 변화가 없었다. 그러므로, 1.1~1.2kgf/㎠의 가압조건에서 가압시간은 35분으로 충분하다고 판단된다.

실시예 3

실시예 2에서 구한 1.1~1.2kgf/㎠, 35분의 가압조건에 있어서, 구연산 농도를 변화시켜 글리코겐 생성률을 비교하였다. 구연산 농도를 원료에 대하여 5, 6, 7, 8, 및 9%로 변화시킨 것을 제외하고는 실시예 2와 동일하게 처리를 수행하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다. 표 2에서 나타낸 것과 같이, 9%의 구연산 첨가량에 있어서, 41.4%의 글리코겐 생성률 최고치를 나타내었다.

글리코겐 생성의 구연산 농도 의존성

원료에 대한 구연산 첨가농도	글리코겐 생성률 (%)	추출물의 양 (%)
9%	41.4	74.0
8%	38.3	72.3
7%	35.6	68.9
6%	29.1	66.6
5%	30.9	63.2

실시예 4

Panax notoginseng의 시료에 대하여 실시예 2와 동일한 가압조건에서 추출을 행하여, 본 발명의 추출법에 따른 글리코겐의 생성을 검토하였다.

윤난산치(玄南文三七)분말, 윤난산치(玄南文三七)분말의 추출물 분말, 가공하지 않은 형태의 인삼의 추출물 분말, 소맥분 추출물 분말, 가공하지 않은 형태의 대두 추출물 분말, 콩가루, 콩가루 추출물 분말, 시이타케, 시이타케 추출물 분말, 영지, 영지 추출물 분말 및 커피 추출잔여물 10~30g을 실시예 2와 동일하게, 1.1~1.2kgf/㎠, 35분의 가압조건에서 처리하여, 최종적으로 동결건조 분말을 수득하고, 그 중의 글리코겐 양을 측정하였다. 상기 표 1에 그 결과를 나타내었다.

표 1의 a)에 나타낸 바와 같이, Panax notoginseng 자체에는 4.42% 밖에 함유되어 있지 않은 글리코겐이, Panax notoginseng 추출물 분말에는, 원료환산해서 29.15% 포함하고 있어, 본 발명의 가압처리에 의하여 글리코겐 양이 6.5배 이상 증가하는 것으로 나타났다. 마찬가지로, Panax notoginseng인 [윤난산치(玄南文三七) 분](등록상표)의 글리코겐 함유량은 1.51%였으나, 본 발명의 추출법으로 얻은 추출물 분말 중에는 20.05%의 글리코겐이 존재하였으며, 글리코겐 양이 13.3 배로 증가하는 것으로 나타났다.

Panax notoginseng과 같은 속의 인삼(Panax ginseng) 및 가공하지 않은 건조 대두의 추출물 분말 중의 글리코겐의 양은, 원료환산하였을 때 각각 5.49% 및 1.60%로 Panax notoginseng과 비교하여 큰 차이가 나게 작았다. 소맥분 추출물 분말 중의 글리코겐 양은 원료환산하여 32.78%의 글리코겐 양을 나타내었다.

대두로 부터 생성된 콩가루 및 콩가루 추출물 분말의 글리코겐 양은 원료환산하여 각각 0.47% 및 2.02%로, 본 발명의 추출법에 의하여 글리코겐이 약 4.3배로 증가하는 것으로 나타났다.

버섯류 중의 시이타케 및 이의 추출물 분말 중의 글리코겐 양은 원료환산하여 각각 0.15% 및 0.75%로, 본 발명의 추출법에 의하여 글리코겐이 약 5배로 증가 하는 것으로 나타났다.

커피 추출잔여물 추출물 분말 중의 글리코겐의 양은 추출물 분말 환산으로 8.64%이었다.

그러나, 영지 및 아가리쿠스 버섯에서는 원래 함유하고 있는 글리코겐이 본 발명의 추출법에 의하여 감소하는 결과를 얻었다.

상기 결과로부터, 산(酸) 존재 하의 가열 및 가압이라는 물리화학적 방법에 의하여, 식물 유래의 글리코겐이 대량 생성되는 것이 분명해졌다. 버섯류 중 시이타케에는 항종양활성을 가지는 β-글루칸인 렌티난(lentinan)이 존재하고, 아가리 쿠스 버섯에도 항종양활성을 가지는 β-글루칸이 존재하지만, 본 발명의 방법에 의하여 양자 간에 글리코겐이 시이타케의 경우는 증가한 반면, 아가리쿠스 버섯에서는 감소하는 현저하게 다른 결과를 인식하게된 것은 매우 주목할 만하다.

또한, 표 1의 b)에 나타낸 편자황은 Panax notoginseng을 85% 포함하는 한방약이다. 편자황은 Panax notoginseng 자체와 차이가 없는 3% 전후의 글리코겐을 함유하고 있었다.

실시예 5

게다가, 식물기원의 원료에 대하여, 본 발명의 추출법에 따른 글리코겐 양의 생성 증가를 확인하기 위하여, 각종 당류를 원료로 사용하여 실시예 2와 동일한 방법으로 처리하여 글리코겐 양을 측정하였다. 표 3에 그 결과를 나타내었다.

a) 본 발명의 방법에 따른 각종 당류, 올리고당 및 다당으로부터의 글리코겐 생성

시 료	글리코겐 생성율(%)
감자 전분 (불용성)	23.04
옥수수 전분 (불용성)	12.02
가용성 전분	0.82
셀룰로오스	0.65
프룰란	36.78
덱스트란 (덱스트란 상층액체) (덱스트란 하층액체)	71.26 (32.60) (38.66)
라피노오즈	0.39
말토오즈	0.28
트레할로오즈	0
슈크로오즈	0
글루코오스	0

b)

시 료	글리코겐 정량치 (%)
표준 글리코겐(Wako Pure chemical Industries, Ltd.)	79.99
표준 글리코겐(시그마, 굴 글리코겐)	51.24

원료료서는 고등식물의 종자, 뿌리, 뿌리줄기 등에 대량으로 함유되어 있는 전분을 이용하였다. 전분은 D-글루코오스로 구성된 다당이다.

i) 감자전분

감자전분에 구연산을 첨가한 시료와 첨가하지 않은 시료를 제조하였다. 두 시료는 흰색의 불용물질이 존재하는 흰색의 탁한 수용액 형태로 수득되었다. 두 시료를 1.1kgf/㎠에서 35분간 가압처리하면 구연산 첨가시료는 불용물이 없는 잘 흘러내릴 수 있는 액체로 되었으나, 구연산을 첨가하지 않은 시료는 투명해지기는 하였으나 불용성물질이 아직 존재하였다. 이 때문에, 구연산을 첨가하지 않은 시료는 잔여하는 불용성물질을 원심분리에 의해 제거하여 투명한 시료액을 얻었다.

구연산 첨가시료에 대해서는 침전물이 없었기 때문에 얻어지 반응액에 45% 농도가 되도록 에탄올을 첨가하고, 구연산을 첨가하지 않은 시료에 대하여는 분리한 불용성 물질에 45%의 에탄올을 첨가하여 각각 1시간 가열하였다. 얻어진 반응액에는 구연산 첨가 시료에서는 약간의 침전이 생겼으며, 구연산을 첨가하지 않은 시료에서는 실크와 같은 형태의 침전이 생성되었다. 상기 침전물을 제거한 용액을 상기 가압조작 후 얻어진 반응액과 각각 혼합하여, 각각을 농축한 후, 동결건조 분말을 얻어 분말의 글리코겐 양을 측정하였다.

그 결과, 표 3에 나타낸 것과 같이, 본 발명의 방법을 적용한 감자전분으로부터는 23.04%에 달하는 다량의 글리코겐이 검출되었으며, 대조군인 구연산을 첨가하지 않은 경우, 동결건조 분말 중에는 글리코겐이 전혀 검출되지 않았다.

ii) 옥수수전분

옥수수전분에 대해서도 감자전분과 마찬가지로 구연산을 첨가한 시료에 구연산을 첨가한 시료와 구연산을 첨가하지 않은 시료를 조제하였다. 가압반응 후에는 두 시료 모두 겔 상으로 되어, 용액부분과 침전물로 분리가 되지 않았기 때문에, 두 시료에 직접 에탄올을 45% 농도가 되도록 첨가하여, 1시간 동안 가온하였다. 그 결과 구연산을 첨가한 시료에서는 가루형태의 불용물이 수득되었고, 여과에 의하여 이를 분리제거하고 용액부분을 얻었다. 구연산을 첨가하지 않은 시료에서는 연속된 천 형태의 불용물질이 생성되었다. 이것을 유리봉으로 감아서 제거하여 투명한 용액부분을 얻었다. 각각의 용액부를 일정량까지 농축한 후, 동결건조에 의하여 추출물 분말을 얻었다. 얻어진 추출물 분말의 글리코겐을 정량하였다. 그 결과 구연산을 첨가하지 않은 경우, 추출물 분말에는 글리코겐이 전혀 검출되지 않았는데 비하여, 구연산을 첨가한 경우는 12.02%의 글리코겐을 확인할 수 있었다.

iii) 가용성 전분

표 3에 나타낸 것과 같이, 가용성 전분에 대해서는, 본 발명의 추출법에 의하여 0.82%의 글리코겐이 생성되었다.

iv) 셀룰로오즈, 프룰란 및 덱스트란

셀룰로오즈, 프룰란 및 덱스트란에 대해서는, 본 발명의 추출법에 의하여 0.65%, 36.78% 및 71.26%의 글리코겐이 생성되었다. 덱스트란의 경우, 가압처리 후와 45%의 에탄올 용액 첨가 후의 가열처리의 두 반응 후의 용액이 2층으로 분리되었기 때문에, 상층부 및 하층부의 용액을 각각 분리한 후 농축한 동결건조 분말을 얻었다. 상층부 및 하층부의 동결건조분말 중에는 각각 32.60% 및 38.66%, 합계 71.26%의 글리코겐이 존재하였다.

v) 라피노오즈, 말토오즈, 트레할로오즈, 슈크로오스 및 글루코오스

한편, 3당류의 라피노오즈, 2당류의 말토오즈, 트레할로오즈 및 슈크로오즈 및 단당류인 글루코오스를 이용한 경우, 라피노오즈와 말토오즈에서는 본 발명의 추출법에 의하여 각각 0.39% 및 0.28%의 글리코겐이 생성되었으나, 트레할로오즈, 슈크로오즈 및 글루코오스를 원료로 이용한 경우는 글리코겐이 측정되지 않았다.

2당류를 원료로한 경우에서 글리코겐의 생성 유무는 말토오즈가 환원당인데 비하여, 트레할로오즈 및 슈크로오즈는 비환원당인 것에 기인한다고 생각되어진다. 트레할로오즈 및 슈크로오즈를 원료로 한 경우, 글리코겐 이외의 다당이 생성된다고 예상된다. 글루코오스는 다당화하는 것이 어렵하다고 생각된다.

상기와 같이 본 발명의 추출법을 다당류에 적용한 경우에 있어서도 글리코겐의 생성을 확인한 것으로부터, 산의 존재 하에 가압하는 물리화학적 방법에 의하 여, 식물기원의 글리코겐이 생성하는 것을 확인하였다.

또한, 예를 들면, Panax notoginseng 및 덱스트란의 혼합물을 원료로 사용한 경우, 각각 단독으로 원료로 사용한 경우와는 다른 구조의 글리코겐을 생성한다고 예상된다. 게다가, 커피 추출잔여물 중에 다량으로 함유된 만난(mannan)으로부터 글리코겐을 생성하는 새로운 사업의 전개도 기대할 만 하다.

실시예 6

굴 추출물 50%, 실시예 2와 동일한 조건으로 얻어진 Panax notoginseng 추출물 분말 28.9% 및 러브리왁스(lubriwax) 3%를 혼합하여 체에 거른 후, 유당 20%, 칼슘 트리포스페이트 1% 및 슈크로오스 지방산 에스테르 2.0%를 첨가하여 잘 혼합한다. 이를 정제형태로 만들어, 셰락(shellac) 코팅한 후, 폴리싱(광택내기)을 행하여 정제형의 식용조성물을 제작하였다.

실시예 7

실시예 2와 동일한 조건에서 얻은 Panax notoginseng 추출물 분말 62.5% 및 멀티톨(multitol) 12.2%를 예비배합한 후, 프룰란 0.5%를 첨가하여 예비과립(수분 1~2% 함유)을 만들었다. 상기 예비과립에 발효 심황 16.8%와 러프리왁스 8%를 첨가하여, 잘 혼합한 후, 다시 본격적으로 배합하여 정제형태로 만들었다. 이 정제를 효모 랩(wrap)과 글리세린으로 코팅하여 정제형의 식용조성물을 제작하였다.

실시예 8

비타민 E 10.0중량%, 말토오즈 6.6중량% 및 칼슘포스페이트 1.6중량% 상당량을 혼합기로 혼합하여 예비배합 분말을 만들고, 이것을 실시예 2와 동일한 조건에서 얻은 Panax notoginseng 추출물 분말 20.9중량%, 전분 10중량% 및 유당-분말 셀룰로오스 45중량%를 잘 섞어 체에 걸렀다. 이것을 혼합기에 투입하고, 더하여 슈크로오스 지방산 에스테르 5중량%, 칼슘 포스페이트 0.9중량% 및 유당-분말 셀룰로오스 5중량%를 첨가하여 혼합하였다. 상기 분말을 정제형태로 만든 후, 셰락(shellac) 코팅한 후, 폴리싱(광택내기)을 행하여 정제형의 식용조성물을 제작하였다.

실시예 9

실시예 2와 동일한 조건에서 얻어진 Panax notoginseng 추출물 분말 48.99중량%, 비타민 C 5.6중량%, 비타민 B₆ 염산염 0.12중량%, 슈크로오즈 에스테르 5중량% 및 결정형 셀룰로오즈 6.04중량%를 혼합하여 여기에 31.25중량%의 환원 맥아당 수용액을 배합하여 정제형태로 만든 후, 셰락(shellac) 10중량% 에탄올 용액을 정제에 대하여 7~8%가 되는 양으로 첨가한 후, 이를 분무하여 셰락(shellac) 코팅을 행하여 식용조성물을 제작하였다.

실시예 10. 정제 글리코겐의 조제

1. 감자전분 및 덱스트란으로부터의 글리코겐의 조제

실시예 5의 i)에 따라 얻어진, 감자전분 유래의 글리코겐 함유분말 20g을 정제수 200ml에 녹여 완전히 용해시킨다. 상기 무색의 용액을 95℃에서 20분간 가열한 후 실온에서 서서히 식힌 후 5℃에서 1.5시간 동안 냉각 시킨다. 용액 중 약간의 흰색의 탁도가 관찰되어, 8,500rpm에서 6분간 원심분리하여 흰색의 탁한 물질을 제거하였다. 수득된 맑은 액체를 5℃로 냉각한 후, 5% 농도가 되도록 트리클로로아세트산을 첨가해서 5℃에서 하룻밤 방치하였다. 그 후 원심분리(8,500rpm, 6분간)하여 침전을 제거하고, 얻어진 상청액을 3배 부피의 메탄올에 첨가하여 발생한 침전물을 원심분리(8,500 rpm, 10분간)하여 수집하였다. 수득된 침전을 메탄올 및 에탄올로 순차적으로 세정하였다. 상기 침전물을 진공건조기 안에서 실온에서 2시간 건조하여 크루드한 글리코겐을 얻었다.

상기 얻어진 크루드한 글리코겐 20g을 셀로판 튜브에 넣어, 1.4~1.5L의 정제수에 대하여 5℃에서 3일간 투석을 행하였다. 투석 기간 동안, 하루에 한 번씩 정제수를 새로 교체하였다. 그 후, 투석 튜브 내의 액체를 동결건조하여 얻어진 건조 분말을 정제 글리코겐으로서 수득하였다.

다음으로, 실시예 5의 iv)에 기재된 방법으로 수득한 덱스트란 유래의 글리코겐 함유 분말로부터도 동일한 방법으로 정제 글리코겐을 얻었다. 얻어진 정제 글리코겐의 수율은 감자 전분 및 덱스트란과 비교하여 각각 16.2% 및 18.2%이었다.

얻어진 상기 정제 글리코겐 시료의 물성을 표 4에 나타내었다.

물성	당질원료 유래 글리코겐		표준물질
	감자전분 유래 정제 글리코겐	덱스트란 유래 정제 글리코겐	그래뉼 당	글루코오스	글리코겐 (Wako Pure chemical)
당도	7.5%	5.0%	5.0%	5.6%	5.0%
요오드 반응	적자색으로 변함	붉은기가 옅은 적자색으로 변함	연황색	담황색	담갈색
글리코겐 함량	50.8%	60.0%	-	-	79.99%

또한, 표 4에 있어서, 당도는 각 시료의 5% 수용액을 조제하여, 그 당도를 당도계(아타고사 제조)를 사용하여 측정하였다. 요오드 반응은 0.01mol/L의 요오드용액을 사용하여 수행하였다. 또한, 정제 글리코겐 중의 글리코겐 함량은 굴 추출물 식품규격기준(일본 건강·영양식품협회)를 사용하여 측정한 결과이다.

2. Panax notoginseng으로부터의 정제 글리코겐의 조제

실시예 1의 방법으로 수득한 Panax notoginseng으로부터의 얻어진 글리코겐함유 분말 30g을 정제수 300ml에 녹이면 불용성물질이 생기므로, 원심분리(8,500rpm, 6분간, 10℃)에 의하여 상기 불용성 물질을 제거하여 갈색의 상청액을 얻었다. 상기 상청액을 95℃에서 20분간 가열한 후 실온에서 서서히 식힌 후, 5℃에서 1.5시간 동안 냉각하였다. 이때 용액의 탁도가 증가되어서, 8,500rpm에서 6분간 원심분리하여 탁한 성분을 제거하여 상청액을 얻었다. 상기 상청액을 5℃에서 냉각하여, 농도가 5%로 되도록 트리클로로아세트산을 첨가하여 5℃에서 하룻밤 둔다. 그 후 원심분리(8,500rpm, 6분간)에 의하여 침전을 제거하고, 얻어진 상청액을 3배 부피의 메탄올에 첨가하였다. 이때 생성된 담갈색의 침전을 원심분리하여 수집하였다. 얻어진 침전을 메탄올로 세정한 후, 디메틸설폭사이드(DMSO) 약 200ml에 녹여, 원심분리(6,500rpm, 10분, 10℃)로 불용성 물질을 제거한 후, 얻어진 상청액에 3배 부피의 에탄올을 첨가하여 재침전시켰다. 상기 에탄올 재침전에 의한 정제를 2번 반복하였다. 얻어진 유백색의 침전을 실온에서 진공건조하여 24.7g의 건조분말을 얻었다. 상기 건조분말 20g을 정제수 140ml에 용해하여, 이소아밀알코올 36ml과 클로로포름 108ml의 혼합용액을 첨가하여 10시간 동안 천천히 진탕하였다. 상기 용액을 정치한 후 생기는 물층을 분취하여, 원심분리(7,500rpm, 30분, 10℃)하였다. 상기 단백질 제거 조작을 이소아밀알코올 36ml과 클로로포름 108ml의 혼합용액을 첨가하여 2회 반복한 후, 황백색 용액층을 셀로판 튜브에 옮겨, 1.4~1.5L의 정제수에 대하여 5℃에서 3일간 투석하였다. 투석기간 동안 하루에 한번씩 새 정제수로 갈아주었다. 얻어진 투석 튜브 내의 액을 동결건조하여 정제 글리코겐 13.4g을 얻었다(글리코겐 함량 69.0%: 글리코겐 비율 11.9%). 상기 정제산물은 적자색의 요오드 반응을 나타내었다.

실시예 11. 정제 글리코겐의 해석

1. 분자량

실시예 10에서 얻어진 정제 글리코겐의 분자량을 겔 여과법에 의하여 측정하였다.

1.1. 시료의 조제

전분, 덱스트란 및 Panax notoginseng으로부터 얻어진 정제 글리코겐을 각각 3.16mg, 3.32mg 및 3.33mg 칭량하였다. 각각의 정제 글리코겐을 1ml의 정제수에 용 해하여, 그중 50㎕를 HPLC분석에 사용하였다.

1.2. HPLC 장치 및 측정 조건

HPLC 분석조건은 하기와 같다.

HPLC 장치: 자외선 분광광도계 검출기 SPD-6A를 장착한 LC-7A(Shimazu corporation)

칼럼:Shodex Asahipak CS-620(50cm×7.6mm I.D.)(Showa Denko 제조)

이동상: 정제수

이동상의 유속: 0.8ml/분

검출파장:UV280nm

1.3. 결과

표준물질로서 프룰란 및 글루코스올리고머를 사용하여 작성한 교정곡선(calibration curve)을 사용하여, HPLC 분석에 있어서 유지시간(rentention time)으로 부터 각각의 시료에 포함된 글리코겐의 분자량을 측정하였다. 각 분석에 있어서, HPLC분석의 크로마토그램의 일 예를 도 2에 나타내었다. 도 2의 (a)는 덱스트란 유래의 정제 글리코겐, 도 2의 (b)는 Panax notoginseng 유래의 정제 글리코겐, 그리고, 도 2의 (c)는 글리코겐 유래의 정제 글리코겐의 크로마토그램을 각각 나타낸다. 또한, 도 2의 (a), (b) 및 (c)의 각각에 있어서, 같은 시료에 대하여, 좌측의 크로마토그램은 자외선 분광광도계 검출기에 의해 측정된 결과를 나타내고, 우측의 크로마토그램은 시사굴절계(differential refractometer) 검출기에 의해 측정된 결과를 나타낸다. 도 2에서 나타난 바와 같 이 각 시료는 다른 분자량을 가지는 복수분자종으로 구성되어져 있는 것이 명확해졌다. 이들의 각각의 분자량과 전체에 대한 비율을 표 5에 나타내었다.

물성	당질원료 유래의 글리코겐
	감자전분	덱스트란	Panax notoginseng
분자량(비율)	320,000(14.4%) 3,000(84.3%) <180(1.3%)	280,000(4.9%) 9,000(95.1%)	3,000,000(14.3%) 1,200,000(25.1%) 9,500(60.6%)

표 5에서 나타내 것과 같이, 전분으로부터 얻어진 글리코겐은 분자량 3,000을 주성분으로 포함하고, 덱스트란으로부터 생성된 글리코겐은 분자량 9,000의 분자를 주성분으로 포함하며, Panax notoginseng으로부터 생성된 글리코겐은 분자량 9,500(60.6%)의 분자를 주성분으로 각각 포함하는 것으로 밝혀졌다.

Panax notoginseng으로부터 생성된 글리코겐에 비하여, 전분 및 덱스트란으로부터 생성된 글리코겐은 작은 분자량을 가지고 있다는 것은 특징적이다. 문헌에 기록된 수치(생물학사전, iwanami syoten, 전술)에 의하면, 간의 글리코겐의 분자량은 5~10×10⁶, 근육의 글리코겐의 분자량은 1~2×10⁶이며, 이에 비하여, 3종의 정제 글리코겐 모두 비교적 저분자량의 분자로 구성된 글리코겐인 것이 밝혀졌다.

2. 비선광도(specific rotation)

실시예 10에서 얻어진 정제 글리코겐을 각 0.1g 씩 정밀하게 측정하여, 정제수에 첨가하여 20ml로 만들었다. 각 시료용액을, 길이 200nm의 측정관에 옮겨 비선 광도계 (Elmer 사 제조)를 사용하여 비선광도를 측정하였다.

그 결과, 전분, 덱스트란 및 Panax notoginseng으로부터 생성된 각각의 정제 글리코겐의 측정치는 [α]_D+197.2°, [α]_D+178.4° 및 [α]_D+174.1°이었다.

문헌치(생물학사전(제3판), 동경화학동인, p.402, 1998년 10월 8일 발행)에 의하면, 글리코겐 용액의 비선광도는 [α]_D+191~+200°(전분의 비선광도는 [α]_D+202°)이다. 상기 범위 내에 있는 비선광도를 나타낸 것은 전분 유래의 정제 글리코겐뿐이며, Panax notoginseng 및 덱스트란 유래의 정제 글리코겐 용액의 비선광도는 문헌치보다 낮았다.

3. ¹H NMR 측정

실시예 10과 동일한 방법으로 얻어진 정제 글리코겐을 ¹H NMR측정에 의하여 특징을 밝혔다. 글리코겐은 글루코오스로 구성된 호모폴리사카라이드이며, 글루코오스 유래의 아노머릭 양자를 표지함으로써, 글리코겐임을 동정할 수 있다. ¹H NMR측정은 다음과 같이 수행하였다.

3.1 시료의 조제

전분 및 덱스트란 유래의 정제 글리코겐 용액: 각각 11mg/0.65ml D₂O 용액을 조제하였다. 글리코겐 시약(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.: 표준물질) 및 Panax notoginseng 유래의 정제 글리코겐: 각각 10mg/0.65ml D₂O 용액을 조제하였다.

3.2. 측정 조건

UNITY INOVA 600형 장치(Varian Co. 제조)를 다음의 조건으로 사용하였다.

관측주파수 599.6MHz; 온도 45℃; 관측폭: 6KHz; 펄스폭 30°; 펄스 반복시간 7초.

3.3 결과

(1) 표준물질

글리코겐 시료(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)에서는 5.39ppm 부근과 4.98ppm 부근에 아노머릭 양자 피크가 관측되었다. 아노머릭 양자 피크의 일 예를 도 3A의 (b)에 나타내었다.

5.39ppm의 피크는 α-1,4 결합에 기인한다.4.98ppm의 피크는 α-1,6결합에 기인한다. α-1,6결합은 약 5%이었다. 또한, 1~3.3 pp에 불순물로 추정되는 피크가 관찰되었다.

(2) Panax notoginseng 유래의 정제 글리코겐

도 3A의(a)에 나타낸 것과 같이, 실시예 10의 2에서 수득된 Panax notoginseng 추출물 분말 유래의 정제 글리코겐은, 도 3A의 (b)에 나타낸 표준 글리코겐(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)과 마찬가지로, 5.38ppm의 α-1,4 결합, 4.96ppm의 α-1,6결합의 아노머릭 양자 피크를 가져, 글리코겐인 것을 확인하 였다. Panax notoginseng 추출물 분말 유래의 정제 글리코겐과 표준 글리코겐 사이에서, 5.38ppm 및 4.96ppm의 아노머릭 양자의 각 시그널의 높이 비를 비교하면, Panax notoginseng 추출물 분말 유래의 정제 글리코겐에서는 약 10:1(70.9/7.1), 그리고, 표준 글리코겐에서는 약 20.1(80.2/4.4)이었고, 상기 차이는 Panax notoginseng 추출물 분말 유래의 정제 글리코겐과 표준 글리코겐과는 당 사슬 구조에 있어서, 분지(branch)의 정도 등의 미세구조가 다르다는 것을 시사하며, 미세구조와 항종양활성과의 관련성을 나타내는 보고(Yosiaki Takata et al., J. Mar. Biotech., 6:208-213, 1998)를 고려한다면, 상기 미세구조의 차이가 Panax notoginseng의 항종양활성에 관련된다고 생각되어진다. 또한, 불순물로 추정되는 피크는 Panax notoginseng 정제 글리코겐에서는, 1.2ppm 및 2.7ppm에 존재하는 것 뿐이며, 1~3.3ppm에 불순물로 추정되는 피크가 존재하는 표준 글리코겐과 비교하여, 그 정제도가 높은 것으로 나타났다. α-1,6결합은 약 10%이었다.

(3) 전분 유래의 정제 글리코겐

전분 유래의 정제 글리코겐에서는, 5.37ppm, 5.33 ppm 및 4.95ppm에서 아노머릭 양자 피크가 관측되어(도 3B의 (d)), 상기의 글리코겐 시약의 아노머릭 양자 피크와 잘 일치하였다.

5.37ppm의 피크는 α-1,4 결합에 기인할 수 있다. 전분 유래의 정제 글리코겐은 일반적으로 피크가 예리하고 분해능이 좋은 스펙트럼을 나타낸다. 이것은 상기에 나타낸 바와 같이, 전분 유래의 정제 글리코겐이, 글리코겐 시약보다도 분자 량이 작은 분자를 포함하기 때문으로 생각된다. α-1,6 결합은 약 8%이었다.

(4)덱스트란 유래의 정제 글리코겐

덱스트란 유래의 정제 글리코겐에서는, 주로 4.97ppm의 아노머릭 양자 피크가 관측되었다(도 3B의 (c)). 상기 피크는 α-1,6결합에 기인한다. 덱스트란은 α-1,6결합 주체의 글루코오스 호모폴리사카라이드이기 때문에, α-1,4 결합에 기인하는 5.3ppm부근의 피크가 적지만, 덱스트란 유래의 글리코겐에서는, 상기 피크가 한층 더 적었다.

4. 단당조성

실시예 13과 동일한 방법으로 얻어진 각종 당질 원료로부터 얻어진 정제 글리코겐의 수용액에 디아스타아제(diastase)를 첨가하여 정제 글리코겐을 효소분해하였다. 수득된 각각의 분해액을, 실리카겔 플레이트에 스팟팅하여, 이소프로판올 및 정제수(16:4)의 혼합용액을 전개용매로하여 TLC분석을 행하였다. 전개 종료 후 플레이트를 꺼내어, 실온에서 건조하였다. 상기 플레이트에 희석된 황산용액을 분무하여 115℃에서 약 3분간 가온하였다.

그 결과, 모든 정제 글리코겐의 산분해 용액에서 표준물질인 글루코오스(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.제조)와 일치하는 Rf값인 0.59의 스팟이 나타났다(결과는 나타내지 않음). 상기 결과에 의하여, 모든 정제 글리코겐이 글루코오스를 단당조성으로 하고 있다는 것을 확인하였다. 반면에 효소분해 처 리 전의 각종 당질원료로부터 얻어진 정제 글리코겐을 같은 용매로 전개하였을 때는 표준 글리코겐 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)과 마찬가지로, 스팟이 원점에 머물러 전개되지 않았다.

실시예 12. 정제 글리코겐의 간기능 개선 시험

상기 실시예 10의 2에 기재된 방법으로 얻어진 Panax notoginseng 유래의 정제 글리코겐을 마우스 복강내에 투여하여, in vivo에 있어서의 간기능 개선기능을 시험하였다.

1. 피험체

In vivo실험은 ICR 유도 수컷 마우스(MDS Pharm Service 사 제조, 체중 22±2g)을 사용하여 수행하였다.

2. 피험시료

정제 글리코겐 및 실리마린(Silymarin: 등록상표)(시그마사 제조)을 피험시료로하여 사용하였다. 실리마린은 간기능 개선 효과를 나타내는 양성 대조군이다. 글리코겐 및 실리마린은 2% Tween 80(등록상표)(Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제조)을 포함하는 0.9% 식염수에 일정 농도가 되도록 용해시켜 사용하였다.

3. 투여량

정제 글리코겐은 마우스 1마리 당 300mg/kg 또는 400mg/kg(글리코겐 군), 음성 대조군으로는 2% Tween 80을 포함하는 0.9% 식염수를 10ml/kg(대조군), 양성대조군의 실리마린은 100mg/kg(실리마린 군)을 각각 복강 내에 투여하였다.

4. 시험방법

1군 당 각 5마리의 ICR 유도 수컷 마우스(22±2g)을 사용하였다. 각 마우스에 50% 올리브유에 용해시킨 사염화탄소 용액(0.1ml/kg)을 1회 주사하여 간 장해를 유도하였다. 시험시료는 사염화탄소 투여 30분전, 투여 후 4시간 및 8시간에 300mg/kg 또는 400mg/kg을 각각 복강 내에 투여하였다. 마지막 투여 후 24시간 후에 마우스를 희생시켜 혈액을 채취하고, 혈청 GPT(SGPT) 및 GOT(SGOT)수준을 통상의 행하여지는 (각각 GPT 측정키트 및 GOT 측정키트(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)를 사용한다), 자동분석기에 의한 분광광도법(자외선법)으로 측정하였다.

5. 실험결과

표 6에 측정결과를 나타내었다.

Panax notoginseng유래의 정제 글리코겐에 의한 간기능 개선 효과

피험시료	투여량	SGPT(IU/L)	SGOT(IU/L)
음성대조군	10ml/kg×3	3506.4±252.7(-)	2681.6±205.7(-)
정제 글리코겐	300mg/kg×3 400mg/kg×3	3113.6±123.1(11%) 3158.4±141.5(10%)	2287.2±219.1(15%) 2261.5±127.5(16%)
실리마린	100mg/kg×3	1005.6±140.2(71%)	548.8±76.5(80%)

표 6에 있어서, 상기 숫자 (IU/L)는 SGPT 및 SGOT의 측정결과를 각군에 있어서 5 마리의 마우스의 평균치를 나타낸 것이다. 평균치의 뒤에 기재된 괄호 안의 수치는 각군의 측정 결과를 대조군의 측정결과에 대하여 저하율로 표시한 수치이다.

간기능 개선 효과는, 일반적으로, SGPT 및 SGOT의 수치 수준이 대조군보다 낮게 되는 것에 의하여 평가된다. 표 6에 나타낸 것과 같이, 글리코겐 군에서는 300mg/kg 및 400mg/kg 투여에 있어서, SGPT에 관하여는 10~11%, SGOT에 관하여는 15~16%의 저하율을 각각 나타내어, 정제 글리코겐의 완만한 간기능 개선 효과를 나타내었다. 양성 대조군의 실리마린에서는, SGPT에 대하여는 71%, SGOT에 대해서는 80%의 현저한 간기능 개선 효과가 나타났다. 또한, SGPT 및 SGOT에 대하여 저하율이 30% 이상의 경우가, 높은 간기능 개선 효과를 가진다고 판단된다.

실시예 13. Panax notoginseng 추출물의 간기능 개선 시험

피험시료로서 상기 실시예 1에 기재된 방법에 따라 얻어진 Panax notoginseng 추출물 분말을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 12와 동일한 방법으로 간 기능 개선 시험을 수행하였다. 시험결과를 표 7에 나타내었다.

Panax notoginseng추출물 분말에 의한 간기능 개선 효과

피험시료	투여량	SGPT(IU/L)	SGOT(IU/L)
음성대조군	10ml/kg×3	3752.4±301.0(- -)	2097.6±250.9(- -)
Panax notoginseng추출물 분말	300mg/kg×3	1096.8±131.0(71%)	656.4±113.9(69%)
실리마린	100mg/kg×3	1603.2±236.3(57%)	764.4±66.7(64%)

표 7에 있어서, 표 6과 마찬가지로 상기 숫자 (IU/L)는 SGPT 및 SGOT의 측정결과를 각 군에 있어서 5 마리의 마우스의 평균치로 나타낸 것이다.

평균치의 뒤에 있는 괄호 안의 수치는 각 군의 측정결과를 대조군의 측정결과에 대하여 저하율로 표시한 수치이다.

표 7에서 나타난 것과 같이, Panax notoginseng 추출물 분말군은 SGPT에 대하여 71%, SGOT에 대하여 69%의 저하율을 각각 나타내어 Panax notoginseng 추출물이 높은 간기능 개선 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

다당체와 전분을 다량 함유하는 식물체 등을 산성조건에서 가열·가압처리한다는, 기질특이성이 없는 매우 간단한 조작으로, 글리코겐을 제조하는 기술을 제공한다. 본 발명의 방법에 의하면, 각종의 원료로부터 다양한 글리코겐을 제공할 수 있다. 상기 글리코겐의 성질을 분석하는 것에 의하여, 식품원료, 수액(infusion solution)원료 등으로 이용가능한 소재를 제공할 수 있다.

글리코겐은 동물에 있어서, 저장당으로서 뿐만아니라 , 간기능 향상 작용을 나타낸다고 알려져 있다. 또한, 오징어, 가리비 등으로 부터 추출된 글리코겐은 강한 항종양활성을 나타낸다고 보고되고 있어, 새로운 기능성 식품으로서의 글리코겐 의 용도가 기대되고있다.

글리코겐, 특히 10,000이하의 분자량을 갖는 저분자 글리코겐을 제공할 수 있다. 전분 등의 다당류를 다량 함유하는 식물 및 전분, 플룰란 및 덱스트란 등을 원료로하여 간단한 조작으로 얻어지는 글리코겐을 제공할 수 있다.

Claims (23)

1. 압력 1 ~ 1.3 kgf/cm² , 온도 75~ 125℃ 및 pH 1 ~ 5의 조건에서 5 ~ 9 중량% 농도의 구연산 존재하에 당질원료를 가열·가압하는 공정을 포함하는 글리코겐의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 당질원료는 다당 또는 올리고당인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 당질원료는 글루코오스의 호모폴리사카라이드인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 당질원료는 전분, 셀룰로오스 또는 덱스트란인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제4항에 있어서, 전분은 풀루란인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 당질원료는 Panax notoginseng(田七人參), 인삼, 소맥분, 대두, 콩가루, 시이타케 버섯 및 커피 추출잔여물로 구성된 군에서 선택되는 식물소재인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 식물소재는 가공되지 않은 형태의 조직, 과립 또는 분말 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 삭제
9. 제1항에 있어서, 상기 가열하는 공정은 상기 당질원료에 대하여 중량이 8~9%의 구연산의 존재 하에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 압력 1 ~ 1.3 kgf/cm², 온도 75~ 125℃ 및 pH 1 ~ 5의 조건에서 5 ~ 9 중량% 농도의 구연산 존재하에 당질원료를 가열·가압하는 공정을 포함하는 방법에 의하여 제조되고, 식물 유래 글리코겐을 함유하는 식물 추출물.
11. 제10항에 있어서, 당질원료는 가공되지 않은 형태의 조직, 과립 또는 분말 형태인 것을 특징으로 하는 식물 추출물.
12. 제10항에 있어서, 상기 당질원료를 pH 1 ~ 5의 조건에서 가열·가압하는 공정으로 수득된 추출액을 추출잔여물에서 분리하는 공정 및 상기 추출액 또는 상기 추출 잔여물을 유기용매로 추출하는 공정을 더 포함하는 식물 추출물.
13. 압력 1 ~ 1.3 kgf/cm², 온도 75~ 125℃ 및 pH 1 ~ 5의 조건에서 5 ~ 9 중량% 농도의 구연산 존재하에 당질원료를 가열·가압하는 공정을 포함하는 방법에 의하여 제조되고, 10,000 이하의 분자량을 가지는 글리코겐을 주성분으로 함유하는 간 기능 향상용 조성물.
14. 제13항에 있어서, 320,000의 분자량을 가지는 글리코겐 및 3,000의 분자량을 가지는 글리코겐을 포함하는 조성물.
15. 제14항에 있어서, [α]_D+197°의 비선광도 및 ¹H NMR스펙트럼에서 5.37ppm 및 4.95~5.33ppm의 아노머릭 광자 피크를 가지는 글리코겐을 포함하는 조성물.
16. 제13항에 있어서, 280,000의 분자량을 가지는 글리코겐 및 9,000의 분자량을 가지는 글리코겐을 포함하는 조성물.
17. 제16항에 있어서, [α]_D+178°의 비선광도 및 ¹H NMR스펙트럼에서 4.97ppm 및 5.22~5.33ppm의 아노머릭 광자 피크를 가지는 글리코겐을 포함하는 조성물.
18. 제13항에 있어서, 3,000,000의 분자량을 가지는 글리코겐, 1,200,000의 분자량을 가지는 글리코겐 및 9,500의 분자량을 가지는 글리코겐을 포함하는 조성물.
19. 제18항에 있어서, [α]_D+174°의 비선광도 및 ¹H NMR스펙트럼에서 5.38ppm 및 4.96ppm의 아노머릭 광자 피크를 가지는 글리코겐을 포함하는 조성물.
20. 제10항의 식물 추출물을 함유하는 식용조성물.
21. 삭제
22. 삭제
23. 삭제

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