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Verfahren zur Herstellung eines Cobalamin-hältigen Produktes
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Cobalamin-hältigen Produk- tes durch Abbau'eines Ausgangsmaterials, welches durch mikrobiologische Fermentation hergestellte Co- balamin-Protein-Komplexe enthält.
Es ist bekannt, dass Cyanocobalamin und andere Cobalamine, in welchen das Cyanoradikal durch ein anderes Radikal ersetzt ist, z. B. Hydroxocobalamin, für die Behandlung der perniziösen Anämie, ins- besondere wenn sie dem Patienten parenteral verabreicht werden, einen erheblichen therapeutischen Wert besitzen ; sie sind jedoch viel weniger wirksam, wenn sie oral genommen werden.
Es ist deshalb angenommen worden, dass in Fällen von perniziöser Anämie die Anwesenheit eines ändern Stoffes, der oft als"Intrinsicfaktor"bezeichnet wird, erforderlich ist, bevor eine wirksame Ab- sorption von oral verabreichten Cobalaminen erfolgen kann. In der Literatur wird im allgemeinen ange- geben, dass dieser Faktor eine proteinähnliche Natur und ein hohes Molekulargewicht haben und in der
Lage sein muss, das Cobalamin zu binden, um dessen Zerstörung im Verdauungstrakt zu verhindern und so dessen Absorption im Körper zu erhöhen.
Es sind schon verschiedene Versuche unternommen worden, um einen geeigneten, hochmolekularen Stoff aus tierischen Produkten zu isolieren, der eine"Intrinsicfaktor"-Aktivität aufweist. Beispielsweise sind Extrakte der Magenschleimhaut von Schweinen gemeinsam mit Cyanocobalamin angewendet worden (deutsche Auslegeschrift Nr. l, 000.963). Solche Komplexe sind, insbesondere auf Grund der Schwierigkeiten bei der Herstellung und Extraktion der tierischen Produkte-, schwer zu erhalten und ausserdem sind die klinischen Ergebnisse, die dabei erhalten wurden, nicht völlig zufriedenstellend. Andere Behandlungen der perniziösen Anämie auf oralem Wege bestehen in der Verwendung von relativ grossen Mengen von Rohleberextrakten oder des Cyanocobalamins selbst.
Die derzeit angewendete Behandlung dieses Zustandes besteht jedoch fast ausschliesslich in einer Injektionstherapie mit all den damit zusammenhängenden Gefahren und Unannehmlichkeiten. Die Herstellung des injizierbaren Materials ist zudem relativ schwierig und teuer.
Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von verbesserten, Cobalamin-hältigen Präparaten zu schaffen, die bei oraler Verabreichung gegen perniziöse Anämie wirksam sind. Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung eines Cobalamin-hältigen Produktes durch Abbau eines Ausgangsmaterials, welches durch mikrobiologische Fermentation hergestellte Cobalamin-Protein-Komplexe enthält, besteht in seinem Wesen darin, dass man das Cobalamin-Protein-Komplexe enthaltende Ausgangsmaterial proteolytisch zu Cobalamin-Peptid-Komplexen partiell abbaut und aus dem Abbauprodukt oral wirksame Cobalamin-Peptid-Komplexe, insbesondere mit einem Molekulargewicht unter 50000, vorzugsweise durch mehrstufige Extraktion, z.
B. durch aufeinanderfolgende Extraktion mit organischen und wässerigen Lösungsmitteln, extrahiert. Unter der Bezeichnung"Cobalamin-Peptid-Komplex"soll ein Stoff verstanden werden, der eine mit einer Cobalamingruppe verbundene Peptidgruppe oder eine Mischung solcher Verbindungen enthält.
Die Art der Bindung zwischen dem Cobalamin- und dem Peptidanteil ist derzeit unbekannt. Es kann sich beispielsweise um eine kovalente Bindung handeln, eine Wasserstoffbindung oder um eine ionische Bindung, die dissoziieren kann, wenn der Komplex in Wasser aufgelöst wird. Sie kann aber auch eine Art Adsorption zwischen dem Cobalamin- und dem Peptidteil des Komplexes enthalten.
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Die Bezeichnung "Cobalamin-Peptid-Komplex" umfasst auch einen oral wirksamen Komplex oder oral wirksame Komplexe, die mit andern Stoffen vermischt sind, z. B. mit Peptiden oder Aminosäuren.
Zur klinischenAnwendung der gemäss dem Verfahren der Erfindung hergestellten Präparate ist es nicht erforderlich, dass der Komplex isoliert wird, obwohl vorzugsweise eine gewisse Reinigung vorgenommen wird.
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amin, das unter demEinfluss vonCyanidionen inCyanocobalamin übergeführt werden kann, z. B. Hydroxocobalamin, d. i. Vitamin Bi, oder ein Cobalamin, das von den oben angegebenen Cobalaminen in bezug auf die Substituenten im Benzolring des Benzimidazolteils der Gruppe verschieden ist, z. B. das 5-Hydroxybenzimidazolderivat, das auch als Faktor III bekannt ist, oder das ein Cobalamin darstellt, in dem der Benzimidazolteil des Moleküls durch ein Vaphthimidazol ersetzt ist.
Das Cobalamin muss ferner nichttoxisch sein und bei parenteraler Verabreichung gegen perniziöse Anämie wirksam sein.
Der Cobalaminkomplex soll, um bei oraler Verabreichung gegen perniziöse Anämie besonders wirksam zu sein, ein Molekulargewicht von weniger als etwa 15000 aufweisen, das unter Anwendung bekannter Methoden ermittelt werden kann, beispielsweise durch Messung der Sedimentationskonstante in einer
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findung hergestellten Cobalamin-Peptid-Komplexe haben im allgemeinen ein Molekulargewicht von mehr als etwa 2000, obwohl Komplexe mit niedrigerem Molekulargewicht, beispielsweise von etwa 1500, bei der oralen Behandlung der perniziösen Anämie ebenfalls wirksam sein können. Dass die gemäss der Erfindung hergestellten Komplexe ein relativ niedriges Molekulargewicht haben, geht aus dem nachstehend beschriebenen Dialysetest hervor.
Bei der Dialyse liess man eine bestimmte Menge des aus einer Kultur des Streptomyces ATCC 11072 gemäss Beispiel 1 erhaltenen Komplexes durch eine Cellophanmembran mit einer Porengrösse von etwa 24 Ä-Einheiten gegen Wasser diffundieren. Ein berechnetes Molgewicht für die Komplexe kann erhalten werden, indem die entsprechenden Mengen von Cobalamin und Peptid im Komplex ermittelt werden, wobei der Peptidanteil durch Differenzbildung festgestellt wird. Es wird dann ein Molverhältnis von Co- balamin : Peptid von 1 : 1 angenommen und daraus kann ein berechnetes Molgewicht auf Basis der oben angeführten Ermittlung für den Komplex erhalten werden. Die nach dieser Methode erhaltenen berechneten Molgewichte sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben.
Es ist jedoch zu berücksichtigen, dass diese berechneten Molgewichte nicht zwangsläufig das tatsächliche Molgewicht des Komplexes geben, da sie auf Annahmen beruhen, die sich als unzutreffend erweisen können.
Tabelle 1
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<tb>
<tb> Cobalamin- <SEP> hergestellt <SEP> gemäss <SEP> Gehalt <SEP> an <SEP> Gehalt <SEP> an <SEP> Berechnetes
<tb> Peptid- <SEP> Beispiel <SEP> : <SEP> Cyano- <SEP> Peptid <SEP> Molekulargewicht
<tb> Komplex, <SEP> Nr. <SEP> cobalamin <SEP> Gew. <SEP> -0/0 <SEP>
<tb> in <SEP> Gew.
<SEP> -0/0 <SEP>
<tb> 1 <SEP> 1 <SEP> (Streptomyces <SEP> 5,5 <SEP> 37,6 <SEP> 10,500
<tb> ATCC <SEP> 11072)
<tb> 4 <SEP> 3 <SEP> (Propionibacterium <SEP> 13,2 <SEP> 86,8 <SEP> 10,250
<tb> freudenreichii)
<tb> 4A <SEP> 3 <SEP> (nach <SEP> Acetonfällung) <SEP> 15,8 <SEP> 84,2 <SEP> 8,600
<tb> 5 <SEP> 4 <SEP> (Streptomyces <SEP> 14, <SEP> 1 <SEP> 85,9 <SEP> 9,550
<tb> ATCC <SEP> 11072)
<tb> 5A <SEP> 4 <SEP> (nach <SEP> Acetonfällung) <SEP> 29,3 <SEP> 70,7 <SEP> 4,600
<tb> 7 <SEP> 5 <SEP> (Propionibacterium <SEP> 13, <SEP> 4 <SEP> 67, <SEP> 5 <SEP> 8, <SEP> 100 <SEP>
<tb> freudenreichii)
<tb>
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ren und Ultraviolett-Bereich.
Nach Hydrolyse mit 6n -Salzsäure in einem zugeschmolzenen Rohr innerhalb 24 h können bei einem i Cyanocobalamin-Peptid-Komplex, der bei einer Fermentation mit Streptomyces ATCC 11072 gemäss
Beispiel 1 erhalten worden ist, mittels Papierchromatographie unter Verwendung eines Entwicklerlösungs- mittels, wie Phenol Ammoniak und Butanol.'Essigsäure/Wasser, Reste der folgenden Aminosäuren festge- stellt werden : Glutamin- und Aminobernsteinsäuren, Glykokoll, Valin, Prolin, Arginin, Cystein oder
Cystin, Serin, Alanin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Lysin, Histidin und Threonin. Nach alkalischer ) Hydrolyse in Gegenwart von Bariumhydroxyd wurde Tryptophan nachgewiesen.
Die gleichen Aminosäurereste werden festgestellt, wenn ein Cobalamin-Peptidkomplex, der durch
Behandlung mit Propionibacterium freudenreichii gemäss Beispiel 2 erhalten wird, nach dem gleichen
Verfahren untersucht wird.
Die spektroskopische Prüfung einiger der nach dem Verfahren der Beispiele 1-5 hergestellten Cyano- cobalamin-Peptidkomplexe mit sichtbarem und ultraviolettem Licht ergibt Absorptionsspektren, wie sie in den Fig. 1-3 dargestellt sind.
Vorteilhaft werden bei der Herstellung von Präparaten, welche erfindungsgemässe Komplexe aus Kul- turflüssigkeiten oder Gemischen aus der Fermentation enthalten, ein oder mehrere Verfahrensschritte an-
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den daher vorteilhaft Mischungen dieser Komplexe oder gereinigte, den Komplex enthaltende Konzen- trate mit einem nichttoxischen festen oder flüssigen Verdünnungsmittel verwendet. Unter der Bezeichnung "nichttoxisch" ist zu verstehen, dass die Produkte in für klinische Verwendung erforderlichen Mengen nicht toxisch sind.
Es wurde gefunden, dass Mannit als festes Verdünnungsmittel geeignet ist und dass gegebenenfalls auch andere nichttoxische Feststoffe, wie Stärke oder zweibasisches Kalziumphosphat, verwendet werden können. Der Komplex kann im allgemeinen suspendiert oder in Wasser oder andern Flüssigkeiten gelöst vorliegen, welche gewünschtenfalls Stabilisierungsmittel, beispielsweise Puffer, enthalten können.
Es ist von Vorteil, den in flüssiger Form vorliegenden Präparaten Süssstoffe oder andere, den Geschmack beeinflussende Mittel zuzusetzen, um deren Bekömmlichkeit zu erhöhen. Geeignete gereinigte Produkte können aber auch ohne solche Zusätze angewendet werden ; bei festen Zubereitungen, welche in Form von Tabletten oder Kapseln vorliegen können, ist die Notwendigkeit der Geschmacksbeeinflussung verringert. In allen Fällen können andere therapeutisch wirksame Stoffe mitverwendet werden, vorausgesetzt, dass diese mit Cobalaminen und Peptiden verträglich sind.
Geeignete Stoffe, um die Präparate verträglicher zu machen, können zugesetzt werden, falls die Präparate für orale Verabreichung vorgesehen sind ; solche Stoffe sind Zucker oder andere Süssstoffe und Fruchtessenzen.
Die klinischen Ergebnisse, die bei oraler Verabreichung der gemäss den Beispielen 1, 3 und 4 hergestellten Komplexe erhalten werden, sind im Anschluss an diese Beispiele beschrieben. Diese Ergebnisse zeigen, dass nach einer Anfangsdosis des Komplexes von etwa 100 lig Cyanocobalamin täglich an perni- ziöser Anämie leidende Patienten innerhalb von 7 bis 8 Tagen einen guten Gesundheitszustand ohne Krankheitssymptome aufweisen, wobei während der übrigen Versuchsperiode täglich eine orale Dosis des Komplexes, die etwa 10-20 jug Cyanocobalamin enthält, gegeben wurde.
Die klinischen Ergebnisse zeigen ferner, dass die Cobalamin-Peptid-Komplexe gemäss der Erfindung bei der oralen benandlung der perniziösen Anämie ausserordentlich wirksam sein können, insbesondere, wenn im wesentlichen die gleiche Menge des Cyanocobalamins gegeben wird, die bei parenteraler Verabfolgung als Cyanocobalamin gleiche Wirkungen ergibt. Tägliche Dosen des Komplexes mit einem Cohalamingehalt von etwa 10 u g sind bei oraler Dauertherapie voll wirksam.
Diese Entdeckung ist als völlig unerwartet anzusprechen, da nach einer weitverbreiteten Meinung Stoffe mit hohem Molekulargewicht, wie natürliche Proteine, die dementsprechend nicht dialysierbar sind, als Intrinsicfaktor erforderlich sein sollen.
Neben den klinischen Ergebnissen, die bei der oralen Verabreichung der erfindungsgemässen Komplexe erhalten werden, wurde gefunden, dass diese bei der Reifung von megaloplastischen Zellen, d. h. die Umwandlung von unreifen roten Zellen aus dem Knochenmark perniziös anämischer Patienten zu normoplastischen oder reifen und voll ausgebildeten Zellen in vitro wirksam sind. Reines, kristallisiertes
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CyanocobaJamin benötigt den Zusatz von normalem Magensaft, bevor es als Reifungsmittel für solche megaloplastische Zellen wirksam ist (vgl. Callender & Lajtha, "Blood" Nr. 6 [1951J, 8. 1234).
DieCobaIamin-Peptidkomplexe werden aus Fermentationskulturen gewonnen ; sie werden von gewissen Mikroorganismen bei deren Züchtung in einem geeigneten Medium gebildet. Einige Stämme, die
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kannten geeigneten Stämme sind Vertreter der Gruppe Fungi, die aus den Untergruppen Myxomyceten,
Schizomyceten und Eumyceten gemäss der Definition in "Industrial Mycology" [1946J, S. l - 3, von
Smith & Raistrick (London, Arnold & Co. ) bestehen.
Besonders Vertreter der Arten Streptomyces und Propionibacterium [letztere wie in Bergey "Manual of Determinativ Bacteriology", 6. Ausgabe, Waverley Press (Baltimore) definiert ergeben, wie gefunden wurde, gute Ausbeuten an Komplexen, wobei insbesondere Streptomyces ATCC 11072, Streptomyces griseus und Propionibacterium freudenreichii hervorragend geeignet sind. Diese Mikroorganismen werden bereits bei Fermentationsverfahren-industriell-verbreitet angewendet. Propionibacterium shermanii und technicum ergeben ebenfalls gute Ausbeuten der Komplexe.
Ob ein spezieller Mikroorganismus Cobalamin produziert, kann durch Fermentation in einem geeig- neten Nährmedium, das assimilierbaren Stickstoff, Kohlenstoff und Kobalt enthält, beispielsweise Cornsteepliquor, Glukose und Kobaltchlorid, und Prüfung der Fermentationsprodukte auf Cobalamine, festgestellt werden. Wenn Cobalamine festgestellt werden, so kann die Eignung des Mikroorganismus für die
Zwecke der Erfindung dadurch ermittelt werden, dass aus dem fermentierten Produkt durch das Verfahren gemäss der Erfindung ein Cobalaminkomplex hergestellt und klinisch erprobt wird. Die Komplexe können auch auf das Vorliegen der verschiedenen andern vorstehend erwähnten Eigenschaften geprüft werden, um die Eignung des Mikroorganismus vor der klinischen Prüfung festzustellen.
Zur Herstellung der Komplexe in grösserem Umfange wird die Fermentation vorzugsweise mit ausgewählten Stämmen unter submersen Bedingungen in einem flüssigen Medium durchgeführt. Aerobe Mikroorganismen, wie Streptomyceten, benötigen im Fermentationsmedium eine Belüftung. Wenn jedoch bestimmteArten desPropionibacteriums verwendet werden, beispielsweise Propionibacterium freudenreichii, so ist es vorteilhaft, zu Beginn der Fermentationsperiode anaerobe Bedingungen im Nährmedium einzustellen, worauf eine beschränkte Zufuhr von Luft günstig ist.
Gewünschtenfalls können dem Fermentationsmedium Precursorverbindungen zugesetzt werden, vorzugsweise, nachdem das Zellwachstum in gewissem Umfange fortgeschritten ist, um von Cyanocobalamin verschiedene Cobalamin-Peptidkomplexe herzustellen. Beispielsweise kann 5-Hydroxybenzimidazol zugesetzt werden, um einen das entsprechende Cobalamin enthaltenden Komplex, der auch als Faktor III bekannt ist, herzustellen.
Beim Herstellungsverfahren können Verfahrensschritte angewendet werden, durch die eine Änderung der Art des vorhandenen Cobalamins bewirkt wird ; beispielsweise kann Hydroxocobalamin in bekannter Weise in Cyanocobalamin umgewandelt werden.
Es wird, wie z. B. aus der britischen Patentschrift Nr. 655, 485 hervorgeht, allgemein angenommen, dass Cobalamine, beispielsweise Cyanocobalamin und Hydroxycobalamin, im Fermentationsprodukt vor allem in einer "gebundenen" Form vorliegen, d. h., dass das Cobalamin mit hochmolekularen proteinähnlichen Stoffen verbunden ist ; in dieser Form scheint das Cobalamin von den meisten Mikroorganismen nicht verwertet zu werden. In dieser Form sind die Cobalamine bei oraler Verabreichung gegen pernizi- öse Anämie im wesentlichen unwirksam.
Die verschiedenen Stufen der bekannten Verfahren zur Gewinnung des Cobalamins aus Fermentationsflüssigkeiten bestehen imAbbau derCyanocobalamin-Proteinverbindung, in der die Cobalamingruppe gebunden ist, zum oral wirksamen niedermolekularen Cyanocobalamin-Peptidkomplex, in dem die Cobalamingruppe in aktiver Form (frei) vorliegt, und schliesslich zum"unverbundenen"Cyanocobalamin mit dem Molekulargewicht 1350, das im Vergleich zu den Cobalamim-Peptidkomplexen, bei der oralen Behandlung von perniziöser Anämie im wesentlichen unwirksam ist.
Zur Gewinnung der Cobalamin-Peptidkomplexe gemäss der Erfindung kann der Abbau des gebundenen Cobalamins unter Wirkung von beispielsweiseCyanidionen, proteolytischen Enzymen, Säuren, oder durch Hitzeeinwirkung, bewirkt werden. DieAbbaubehandlung kann in einem beliebigen Stadium nach Abschluss der Fermentation vorgenommen werden, beispielsweise mit der rohen Fermentationskultur oder mit Extrakten oder Konzentraten derselben.
Die den Komplex enthaltende Fermentationskultur kann unter Anwendung von für die Konzentrierung und Reinigung des ungebundenen Cyanocobalamins geeigneten Methoden angereichert werden ; zurErzie-
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lung guter Ausbeuten des Komplexes ist es aber wünschenswert, in einem vorhergehenden Verfahrensab- schnitt das Mycel des verwendeten Mikroorganismus bei einem sauren pH-Wert zu behandeln, um die co- balaminhaltigen Materialien aus der Zellsubstanz freizusetzen. Beispielsweise können die Zellen oder My- celien in der auf einen sauren pH-Wert, z. B. im pH-Bereich von 1 bis 3 eingestellten Fermentationsflüs- sigkeit suspendiert werden, worauf die Zellen oder Mycelien abfiltriert und verworfen werden.
Die erhaltenen"gebundenen"und"aktiven"Cobalamine können dann durch Adsorption an einem geeigneten Ionenaustauscher gereinigt und angereichert werden. Die Cobalamine werden danach vom
Austauscher eluiert, beispielsweise unter Verwendung von saurem Isopropanol, worauf das Eluat unter An- wendung bekannter Verfahren, wie wiederholte Extraktionen aus wässeriger Lösung in eine Phenol/Benzol- lösung und Rückextraktion aus dieser Lösungsmittelmischung in Wasser unter Zusatz von n-Butanol oder
Butylacetat, weiter angereichert und gereinigt wird.
Es hat sich als zweckmässig erwiesen, die Lösung so weit zu reinigen und einzuengen, bis sie eine
Konzentration an Gesamtcobalaminen im Bereich vonSOObisISOO ug/ml, beispielsweise etwa 1200 ug Cobalamine, ! ml der wässerigen Lösung, aufweist. Die gesamten Cobalamine können durch mikrobiolo- gische Versuche, nachdem ein aliquoter Teil der Lösung bei einem sauren PH-Wert in wässeriger Lösung so lange erhitzt worden ist, bis alles gebundene Cobalamin abgespalten ist, abgeschätzt, oder durch spek- troskopische Untersuchungen, beispielsweise unter Verwendung von Licht mit einerWellenlänge von 550 mg festgestellt werden.
Die so erhaltene Lösung wird im allgemeinen"gebundenes"und"aktives"Cobalamin enthalten, es ? ei denn, die Fermentation wurde in Gegenwart eines Precursors, beispielsweise eines Benzimidazol, z. B.
5-Hyuruxybenzimidazol, durchgeführt, wobei das entsprechende Cobalamin (Faktor III) ebenso wie Cy- anocobalamin in "gebundener" und "aktiver" Form vorliegen wird. Zur Erhöhung der Ausbeute des"ak- tiven" Cyanocobalamins kann dieses dann einem teilweisen Abbau unterworfen werden, um ein Erzeugnis mit einem gewünschten Molekulargewicht zu erhalten.
Anderseits kann jedoch eine Spaltung des"gebundenen"Materials ohne Konzentrierung durchgeführt werden ; in diesem Falle kann die Lösung des erhaltenen Komplexes abgetrennt und ohne wesentliche Einengung oder Verdünnung klinisch verwendet werden.
Eine Methode zum Abbau des"gebundenen"Cobalamins zu einem Cobalamin-Peptidkomplex mit dem gewünschten Molekulargewicht ist die Behandlung des wässerigen Konzentrates mit Cyanidionen, beispielsweise unter Zusatz von etwa 2 Gew... 11/o Kaliumcyanid pro Volumseinheit, innerhalb eines geeigneten Zeitraumes, beispielsweise innerhalb etwa 1-2 h bei Zimmertemperatur.
Wenn auch die Verwendung von Cyanidionen für den teilweisen Abbau des gebundenen Cobalamins zweckmässig ist, da der Abbau leicht geregelt werden :., ann, so ist jedoch das Verfahren gemäss der Erfindung nicht auf diese besondere Methode beschränkt. Es können auch andere Massnahmen angewendet werden, beispielsweise saure Behandlung oder eine Behandlung mit proteolytischen Enzymen, wie Pepsin, Trypsin, Chymotrypsin oder Papain. Gewünschtenfalls kann der teilweise Abbau durch Verlängerung der Behandlung der Zellen oder Mycelien bei sauren pH-Werten, die notwendig ist, um das gebundene Cobalamin aus dem Zellmaterial freizusetzen und die ausreichend sein muss, um wenigstens einen Teil des gebundenen Cobalamins zu einem Cobalamin-Peptidkomplex mit gewünschtem Molekulargewicht abzubauen, bewirkt werden.
Der notwendige Abbau kann ferner durch Erhitzen des"gebundenen"Cobal- amins, vorzugsweise in wässeriger Lösung, erreicht werden. Der Abbau kann bei einer geeigneten erhöhten Temperatur, beispielsweise oberhalb etwa 500C und vorzugsweise etwa oberhalb 800C vervollständigt werden. Es ist auch möglich, das notwendige Ausmass des Abbaues eines Teiles des Cobalamin enthaltenden Materials dadurch zu erreichen, dass die Fermentation weitergeführt wird, bis eine Autolyse der fermentierendenMikroorganismen eintritt. Ein solches Verfahren ist jedoch wenig wirksam und schwierig zu regeln und demgemäss werden andere Verfahren bevorzugt angewendet.
Die wässerige, denkomplex enthaltendelösung kann gewünschtenfalls weiter eingeengt werden, oder sie kann in diesem Zustand mit einem anorganischen oder organischen Fällungsmittel versetzt werden, um den Cobalamin-Peptidkomplex in festem Zustand abzuscheiden.
Diese Lösung kann auch, falls erforderlich, gereinigt und mit oder ohne weitere Einengung zur Herstellung von flüssigen Präparaten für klinische Zwecke benutzt werden. Hiezu wird sie wenigstens soweit verdünnt, dass die Konzentration des als Komplex vorliegenden Cobalamins weniger als 100/lg/ml und vorzugsweise weniger als 10/Jg/ml beträgt.
Das dem wässerigen Konzentrat des Cobalamin-Peptidkomplexes zugesetzte Fällungsmittel kann ein zum Aussalzen organischer Verbindungen aus wässerigen Lösungen geeignetes Mittel sein, beispielsweise anorganische Salze, wie Ammonium-, Natrium-oder Kaliumsulfat. Das Aussalzmittel wird vorteilhaft
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in einer solchen Menge zugesetzt, dass sich eine wässerige Lösung ergibt, welche 25%ig bis vollständig gesättigt ist, und vorzugsweise Ammoniumsulfat in Mengen von etwa 50 bis 7010 enthält. Der Komplex kann auch durch Zusatz organischer Fällungsmittel, wie Aceton, Propanol oder Isopropanol, abgeschieden werden.
"Unverbundene"Cobalamine können nach der Abscheidungsstufe abgetrennt werden, wodurch solche Cobalamine, die vom Komplex während der Einengungs- und Abscheidungsbehandlung gelöst worden sind, zusammen mit den vorher gebildeten in einer Extraktionsstufe entfernt werden. Gewünschtenfalls können jedoch die"unverbundenen"Cobalamine vor der Separationsstufe abgetrennt werden und der unreineKomplex ist dann zur klinischen Anwendung geeignet. Es wird jedoch vorgezogen, einen Feststoff, der von ungebundenem Cobalamin frei ist, zu isolieren und aus diesem klinisch verwendbare Präparate herzustellen,
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Mengen an"gebundenem"Cobalamin, aber das beschriebene Verfahren gewährleistet, dass wesentliche Verunreinigungen mit gebundenem Cobalamin vermieden werden.
Ein geeignetes Verfahren zur Entfernung"unverbundener"Cobalamine besteht in der Behandlung der Lösung mit Aktivkohle. Die verwendete Menge an Kohle hängt in gewissem Umfange von der Menge des "unverbundenen"Cobalaminsab : es wurde aber gefunden, dass der Zusalz einer Menge von etwa 2 Gew.- je Volumen der Lösung vorteilhaft ist. Das Cobalamin wird an der Kohle adsorbiert und der Komplex bleibt in der Lösung. Bei dieser Behandlung werden auch farbige Verunreinigungen abgetrennt und das Aussehen des Komplexes wird verbessert.
Der nach der Fällung erhaltene Feststoff kann weiter gereinigt werden, beispielsweise durch Wiederauflösen in Wasser und Waschen mit organischen Lösungsmitteln, wie Butanol und bzw. oder Benzol, sowie anschliessende Entfernung des organischen Lösungsmittels durch Destillation. Der Komplex kann dann erneut gefällt und abgetrennt werden. Diese Verfahrensschritte können wiederholt werden.
Die nachstehenden Beispiele erläutern das Verfahren gemäss der Erfindung zur Herstellung von Cobalamin-Peptidkomplexen aus Fermentationslösungen.
Beispiel l : Eine bei der Fermentation eines stickstoffhaltigen, Sojabohnenmehl, Glukose, Kaliumdihydrophosphat und Kobaltchlorid enthaltenden Nährmediums mit Streptomyces ATCC 11072 erhaltene Kultur wird 1 h auf einen pH-Wert von 2 angesäuert und dann filtriert. Das Filtrat wird über ein Ionenaustauscherharz geleitet, welches die"gebundenen"Cobalamine,"unverbundene"Cobalamine, bestehend aus Cyanocobalamin, sowie etwas Hydroxocobalamin, und etwas von dem gebildeten Peptidkomplex adsorbiert. Diese adsorbierten Stoffe werden nachstehend als"Cobalamine"bezeichnet.
Die adsorbiertenCobalamine werden dann mit sauremIsopropanol eluiert, worauf das Eluat neutrali-
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Druck eingeengt, worauf das erhaltene Konzentrat auf einen pH-Wert von 7 bis 7, 5 eingestellt wird. Dann wird die Mischung, nachdem je Vol. -Teil der Lösung 2 Gew.-o Kaliumcyanid zugesetzt worden waren, stehengelassen. Die entstehende Mischung wird zur Extraktion der Cobalamine mit einem Gemisch aus Phenol und Benzol (30/70 Viol.-%) behandelt. Die entstehende Lösung der Cobalamine in dem Phenol/Benzolgemisch wird dann mit Wasser und n-Butanol behandelt, wobei die Cobalamine in die wässerige Lösung rückextrahiert werden.
Die wässerige Lösung enthält etwa 1260 ug Gesamtcobalamine je ml, d. h."gebundene","unverbundene"und"aktive"Cobalamine (als Peptid-Komplex).
Zu 3, 2 Vol.-Teilen der entstehenden Lösungen werden 2, 5 Gew.-Teile Ammonsulfat gegeben, worauf die Mischung stehengelassen wird. Es scheidet sich eine ölige Schicht sowie eine Fällung ab ; diese werden abgetrennt und mit Wasser gemischt. Die Mischung, welche eine Emulsion bildet, wird mit Benzol gewaschen, wobei Spuren der organischen Lösungsmittel, wie Phenol und Butanol, entfernt werden.
Die gewaschene Emulsion wird dann mit Aktivkohle behandelt, um Verunreinigungen und"unverbunde- nes"Cyanocobalamin abzutrennen. Die Kohle wird dann abfiltriert, mit Wasser gewaschen und die Waschlaugen werden dem Filtrat zugesetzt. Die so erhaltene wässerige Lösung des Cyanocobalamin-Peptidkomplexes wird mit n-Butanol gewaschen und dann mit Benzol behandelt, worauf der Komplex aus der gewaschenen, wässerigen Lösung unter Zugabe einer solchen Menge Ammonsulfat gefällt wird, dass eine Konzentration von 60 g/100 ml Lösung erhalten wird. Die Fällung wird wieder gelöst und erneut zweimal auf die gleiche Art gefällt, wobei ein Cyanocobalamin-Peptidkomplex enthaltender Feststoff erhalten wird, den man an der Luft trocknet.
Bei der spektroskopischen Prüfung mit sichtbarem und ultraviolettem Licht wurde das in Fig. l dargestellte Spektrum erhalten. Die Spektren des Cyanocobalamins und einer wässerigen konzentrierten Lösung, die das Cobalamin vor allem in der gebundenen Form enthält, sind in dieser Figur zum Vergleich angegeben.
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Der Feststoff wurde auch spektrophotometrisch unter Verwendung eines Lichtes mit der Wellenlänge
550 Mikromikron geprüft ; aus dem Ergebnis wird der Cobalamingehalt berechnet. Das in dem Feststoff enthaltene Ammoniumsulfat wurde geschätzt und der restliche Peptidanteil aus der Differenz bestimmt.
Auf diese Weise wurde ermittelt, dass der Feststoff 5, 5'10 Cyanocobalamin und 37, 61o Peptid (Differenz) enthält.
Eine Probe des im Feststoff enthaltenen Komplexes wurde in der Ultrazentrifuge bei einer Umdre- hungszahl von 5,98 x 104 320 min behandelt. Dabei wurde eine unkorrigierte Sedimentationskonstante von etwa 0, 44 X 1013 Svedbergeinheiten ermittelt, aus der sich ein Molekulargewicht ergibt, das kleiner ist als das eines Proteins. Dieses Ergebnis wird auch durch das aus dem Verhältnis von Peptid und Cyano- cobalamin berechnete Molekulargewicht bestätigt.
A) Der gemäss Beispiel 1 hergestellte Cyanocobalaminkomplex (CyanocobalamingehaltlO'yo) wurde mit Mannit zu einer Mischung verarbeitet, die 0, leo des Komplexes enthielt. Diese Mischung wurde an
5 Patienten verabreicht, die an perniziöser Anämie litten. Die Patienten wurden keiner andern Behand- lung unterzogen.
Fall 1 : Einem Patienten wurde durch 8 Tage täglich oral eine Anfangsdosis der oben angegebenen
Mischung gegeben, die 780 J. Lg des Komplexes enthielt (entsprechend 100 jug Cyanocobalamin). Die täg- liche Dosis wurde für die nächsten 14 Tage auf die Hälfte vermindert. Dann wurde ein Präparat verab- reicht, das 78 ug des Komplexes (entsprechend 10 ligcyanocobalamin) enthielt. Diese Dosis wurde wäh- rend des verbleibenden Zeitraumes der Behandlung (263 Tage) gegeben und der Patient blieb bei dieser
Dosis bei guter Gesundheit und zeigte keine Symptome von perniziöser Anämie.
Fall 2 : Einem Patienten wurde durch 8 Tage täglich eineAnfangsdosis gegeben, die 780 bug-des Komplexes enthielt ; innerhalb der nächsten 14 Tage wurde die Dosis auf die Hälfte verringert. Im Hinblick auf das Alter des Patienten (72 Jahre) wurde eine 156 pg des Komplexes enthaltende Mischung (entspre- chend 20 jug Cyanocobalamin) während der nächsten 77 Tage täglich verabfolgt, worauf die Menge für die übrige Behandlungszeit (155 Tage) auf die Hälfte vermindert wurde. Der Patient blieb bei guter Gesundheit und zeigte keine Symptome der perniziösen Anämie. Wegen des Alters des Patienten stellte sich die Wirkung der Behandlung, beurteilt durch Zählen der roten Blutkörperchen und Schätzung der Hämoglobinwerte, langsamer als in andern Fällen ein.
Fall 3 ; Einem Patienten wurde durch 8 Tage täglich oral eine Mischung gegeben, die 780 J. Lg des Komplexes enthielt, worauf die Menge für die nächsten 22 Tage auf 1/5 verringert wurde. Anschliessend erfolgte eine weitere Verringerung auf die Hälfte der zuletzt genannten Menge für die nächsten 41 Tage.
In diesem Zeitpunkt wurde die Behandlung unterbrochen.
Nach 35 Tagen ohne Behandlung begann sich der Zustand des Patienten zu verschlechtern. Dies zeigte sich durch Abnahme der Anzahl der roten Blutkörperchen sowie der Hämoglobinwerte. Eine einzige Dosis, die 1560 jug des Komplexes (äquivalent 200 lig Cyanocobalamin) enthielt, wurde am 60. Tag nach Abbruch der Behandlung gegeben. 14 Tage später wurde der Patient auf eine Dauerdosis des Präparates gesetzt, die 78 pg des Komplexes enthielt. Der Patient blieb bei guter Gesundheit und zeigte während der restlichen Behandlungsperiode (105 Tage) keine Symptome der perniziösen Anämie.
Fall 4 : Einem Patienten wurde durch 7 Tage täglich ein Präparat verabreicht, das 760 pg des Komplexes enthielt. Dann wurde die Menge während des restlichen Behandlungsabschnittes (207 Tage) auf 1i10 vermindert. Der Patient blieb bei guter Gesundheit und zeigte keine Symptome von perniziöser Anämie.
Fall 5 : Einem Patienten wurde durch 8 Tage täglich ein Präparat verabreicht, das 780 lug des Komplexes enthielt. Dann wurde die Menge für die nächsten 7 Tage auf die Hälfte vermindert und innerhalb der folgenden 5 Tage erfolgte eine Verminderung der Dosis auf 1/5 der ursprünglichen Menge. Am Ende dieses Zeitabschnittes wurde die Menge des in den Präparaten enthaltenen Komplexes auf täglich 78 lag verringert. Diese Dosis wurde während der verbleibenden Behandlungsperiode (204 Tage) gegeben. Der Patient blieb bei guter Gesundheit und zeigte keine Symptome von perniziöser Anämie.
B) Eine 52 Jahre alte Patientin wurde 16Monate lang mit einem handelsüblichenOralpräparat behandelt. Während dieser Zeit sprach sie auf die Behandlung gut an, wie auf Grund der Blutkörperchenzählung und der Schätzung des Hämoglobinwertes festgestellt wurde. Die Patientin befand sich bei guter Gesundheit.
Am Ende dieses Zeitraumes begannen sich auf Grund der fortgesetzten Behandlung Schwierigkeiten beim Stehen und Gehen einzustellen, die von einer Gefühllosigkeit in den Füssen und Empfindungslosigkeit über beiden Knöcheln begleitet waren. Die Knie- und Knöchelreflexbewegungen waren verlangsamt und die Plantarreflexe waren nicht deutlich erkennbar. Die Patientin war auch nicht in der Lage, Baumwolle an den Sohlen der Füsse zu spüren.
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DieseSymptome warendaraufzurückzuführen, dass die gezählten roten Blutkörperchen etwa 4, 3 x 106 pro mm3 entsprachen und derhämoglobinwert 941a betrug, was als eine subakute kombinierte Degenerierung des Rückenmarks diagnostiziert wurde, die bekanntlich bei an perniziöser Anämie leidenden Patienten vorkommt. Die Behandlung derPatientin wurde geändert, indem ein Oralpräparat gegeben wurde, das einen nach Beispiel 1 hergestellten Cyanocobalaminkomplex in Mischung mit Mannit enthielt. In den ersten 7 Tagen wurden der Patientin täglich Präparate gegeben, die eine Menge des Komplexes entsprechend 300 tig Cyanocobalamin enthielten. Danach wurde die täglich verabreichte Menge vermindert, woei 200 pug Cyanocobalamin durch 8 Tage gegeben wurden.
Während der Behandlung zeigte sich eine Besserung des Gehvermögens und die sensorischen Symptome verschwanden. Die Werte der roten Blutkörperchen und des Hämoglobins blieben durchwegs bestehen.
C) Es ist bekannt, dass kristallisiertes Cyanocobalamin in vitro allein keine Reifung von megaloplastischen (unreifen) roten Zellen aus dem Knochenmark von an perniziöser Anämie leidenden Patienten zu Normoplasten (reife Zellen) bewirkt. (Siehe z. B. Callender & Lajtha,"Blood", 6 [1951], S. 1234.) Es wurde jedoch gefunden, dass die Cyanocobalamin-Peptidkomplexe gemäss der Erfindung eine Reifung solcher Zellen in vitro bewirken.
Die Versuche wurden mit Kulturen von megaloplastischen Zellen aus dem Knochenmark von zwei Patienten durchgeführt, die an perniziöser Anämie litten.Dabei wurde das Verfahren gemäss Callender & Lajtha (1. c.) angewendet, mit der Abweichung, dass eine Ringer'sehe Lösung an Stelle der Gey'schen verwendet und 50 Einheiten Penicillin zur Verhinderung von Infektionen während der Versuche zugesetzt wurden.
Beim Versuch wurden 7, 8 Ilg des gemäss Beispiel 1 hergestellten Cyanocobalamin-Peptidkomplexes, die 1 Mg Cyanocobalamin enthielten, verwendet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben.
Tabelle 2
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<tb> Patient <SEP> Nr. <SEP> Ursprüngliche <SEP> Zählung <SEP> Zählungen <SEP> nach <SEP> 18 <SEP> h <SEP> in <SEP> homologem
<tb> bei <SEP> Zellen <SEP> aus <SEP> dem <SEP> Serum <SEP> in <SEP> Gegenwart <SEP> des <SEP> Cyano <SEP> - <SEP>
<tb> Knochenmark <SEP> cobalamin-Peptid-Komplexes
<tb> Megaloplasten <SEP> Normoplasten <SEP> Megaloplasten <SEP> Normoplasten
<tb> 1 <SEP> 94 <SEP> 6% <SEP> 55 <SEP> 46 <SEP> % <SEP>
<tb> 2 <SEP> 90% <SEP> 10% <SEP> 35% <SEP> 65%
<tb>
Beispiel 2:
Zellen einer Kultur, welche in einem Cornsteepliquor, Glukose und Kobaltchlorid enthaltenden Nährmedium unter Verwendung eines Stammes von Propionibacterium freudenreichii gezüchtet worden war, werden zur Abtrennung des Cobalamins von dem unlöslichen Zeilmaterial als Cyanocobalamin-Peptidkomplex mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2 angesäuert und 6 h stehengelassen. Das unlösliche Material wird abfiltriert und das Filtrat wird mit einer Mischung aus Phenol und Benzol extrahiert. Die zurückbleibende Lösung wird dann mit Butylacetat und Wasser behandelt, worauf der Komplex in eine wässerige Lösung überführt wird. Das Verfahren wird so lange wiederholt, bis ein wässeriges, insgesamt 620 J.
Lg Cyanocobalamin je ml enthaltendes Konzentrat erhalten wird, in dem das Cyanocobalamin überwiegend in Form eines Peptidkomplexes vorliegt.
Dieses Konzentrat wird dann zur Entfernung der Verunreinigungen und des"unverbundenen"Cyano- cobalamins mit Aktivkohle behandelt. Nach Abfiltrieren der Kohle wird das Filtrat mit Butanol extrahiert und mitToluol zur Abtrennung des gelösten Butanols gewaschen. Das wässerige Konzentrat wird unter vermindertem Druck destilliert, um Spuren von Toluol zu entfernen, worauf erneut mit Aktivkohle behandelt und die Kohle abfiltriert wird.
Zu 9, 4 Teilen dieses wässerigen Konzentrates werden 7, 15 Teile Ammonsulfat gegeben, worauf die Fällung abfiltriert wird. Die Fällung wird in Wasser gelöst, zweimal unter gleichen Bedingungen gefällt und schliesslich an der Luft getrocknet.
Ein Teil des Komplexes wird dann wieder in Wasser aufgelöst und einer Ultrafiltration durch eine
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"Oxoid"-Membran unterworfen,die eine mittlere Porenweite von 5000 bis 10000 hat. Einige der hochmolekularen Verunreinigungen wurden vom Filter zurückgehalten.
Beispiel 3 : Einer wässerigen, 500 g Cyanocobalamin/ml enthaltenden Lösung des gemäss Beispiel 2 hergestellten Komplexes wird bei einem pH-Wert von 7 bis 7, 5 Kaliumcyanid zugesetzt, wobei eine Konzentration von 2 Gew.-lo eingestellt wird. Dann wird Ammonsulfat bis zu einer Konzentration von 12 Gew.-% zugesetzt und der Komplex wird mit n-Butanol extrahiert. Dann wurde Toluol und Wasser zugesetzt und der Komplex in eine wässerige Lösung rückextrahiert. Die so erhaltene wasserige Lösung wird mit einer Mischung aus Phenol und Toluol behandelt, bis der gesamte Komplex in die organische Phase übergeführt ist. Der Komplex wird dann durch Rückextraktion in eine wässerige Lösung unter Zusatz von Essigsäure, Butanol und Wasser in konzentrierterer Form erhalten.
Die wässerige Lösung wird abgetrennt und durch Destillation unter vermindertem Druck weiter eingeengt, wobei überschüssiges Lösungs- mittel und Cyanid entfernt werden.
Bei der Analyse des erhaltenen Komplexes wurden 13, 2% Cyanocobalamin und 86, 80/0 Peptid (durch Differenzbildung) ermittelt. Der Komplex hatte das in Fig. 2 dargestellte Absorptionsspektrum.
Einge der Komplexe waren nach Mischen mit Mannit gut verträglich und zeigen, wie später erläutert, eine hohe Wirksamkeit bei der Linderung von Symptomen von perniziöser Anämie.
Ein Teil des Komplexes wird weiter gereinigt, indem man 25 Vol. -Teile Aceton einer wässerigen Lösung des Komplexes mit der oben angegebenen Zusammensetzung zugibt ; dabei wird ein rosa gefärbtes Pulver gefällt, das an der Luft getrocknet wird.
Die so erhaltene Fällung enthält 15, 80/0 Cyanocobalamin und 84, 30/0 Peptid (Differenz). Das Absorptionsspektrum dieses Produktes ist in Fig. 2 dargestellt.
Bei der Elementaranalyse wurden die folgenden Ergebnisse erhalten : Kohlenstoff 49, 8%, Wasserstoff
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9%,wurde. Schliesslich wurde durch 80 Tage täglich ein Präparat mit 76 jug des Komplexes gegeben. Der Patient blieb bei guter Gesundheit und zeigte keine Symptome von perniziöser Anämie.
Beispiel 4 : DurchFermentation eines Nährmediums mit Streptomyces ATCC 11072 und anschlie- ssendes Ansäuern auf PH 2, Reinigung und Anreicherung durch Extraktion und Rückextraktion mit organischen Lösungsmitteln und Wasser sowie Behandlung mit Kohle, wird eine wässerige, einen Cyanocobal-
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getrennt. Das gefällte Produkt wird dann wieder in Wasser aufgelöst und durch Zusatz von 70 g Ammonsulfat je 100 ml Lösung gefällt.
Der Komplex wird weiter gereinigt, indem er in Wasser aufgelöst wird, worauf die entstehende Lösung 1 h mit 2% Kaliumcyanid bei PH 7 behandelt wird ; dann wird der Dicyano-Cobalamin-Peptidkom- plex in Gegenwart von 121o Ammonsulfat mit Butanol extrahiert. DerDicyanokomplex wird dann in Wasser rückextrahiert, indem Wasser und Toluol zugesetzt werden. Aus der angereicherten wässerigen Lösung des Dicyanokomplexes wird der Komplex mit Phenol/Toluol (30 : 70 Vol.-%) extrahiert ; dann wird nach Ansäuerung mit Eisessig in Wasser rückextrahiert. Die wässerige Lösung des so erhaltenen Cyanocobalamin- Pep'komplexes wird dann zur Entfernung der Cyanidionen und des Lösungsmittels unter vermindertem Druck destilliert.
Bei der Analyse der so erhaltenen Lösung wurde gefunden, dass der Komplex 14, 1% Cyanocobalamin und 85,9% Peptid (Differenz) enthielt.
Ein Teil des Komplexes wurde mit Mannit vermischt. In dieser Form war er gut verträglich und, wie nachstehend beschrieben, bei der Zurückdrängung von Symptomen der perniziösen Anämie sehr wirksam.
Der restliche in wasseriger Lösung enthaltene Komplex wird unter Zusatz von 25 Vol. -Teilen Aceton je Vol.-Teil der wässerigen Lösung gefällt ; das gefällte rosa gefärbte Pulver ergab nach dem Trocknen an der Luft die folgenden Analysenergebnisse : Cyanocobalamin 29, 3%, Peptid 70, 71o (Differenz).
Bei der Elementaranalyse des mit Aceton gefällten Produktes wurden folgende Ergebnisse erhalten :
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Die Absorptionsspektren sind in Fig. 3 dargestellt.
Der wie vorstehend angegeben hergestellte Komplex wurde täglich als Gemisch mit Mannit einem Patienten oral verabreicht. Diese Mischung wurde in solchen Mengen gegeben, dass dem Patienten täglich durch 7 Tage 710 ug des Komplexes (entsprechend 100 ug Cyanocobalamin) zugeführt wurden. Dann wur-
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