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BEREICH DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verwendungen
zur Förderung
der Nervenregeneration oder zur Prävention oder Hemmung von neuronaler
Degeneration, um die Wirkungen von Verletzungen oder Krankheiten
des Nervensystems (NS) zu verbessern. Insbesondere betrifft die
Erfindung Zusammensetzungen, die Copolymer 1 (Cop 1) oder ein mit
Cop 1 verwandtes Peptid oder Polypeptid, und/oder aktivierte T-Zellen,
die mit Cop 1 oder einem mit Cop 1 verwandten Peptid oder Polypeptid
behandelt werden, umfassen, um die Nervenregeneration zu fördern oder
um neuronale Degeneration zu verhindern oder zu hemmen, die durch
eine Nervenverletzung oder -Krankheit innerhalb des zentralen Nervensystems oder
des peripheren Nervensystems eines menschlichen Individuums verursacht
wird. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können allein
verabreicht werden, oder können
fakultativ in jeder gewünschten Kombination
verabreicht werden.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Das
Nervensystem umfasst das zentrale und das periphere Nervensystem.
Das Zentralnervensystem (ZNS) besteht aus dem Gehirn und dem Rückenmark;
das periphere Nervensystem (PNS) besteht aus allen anderen neuronalen
Elementen, nämlich
den Nerven und Ganglien außerhalb
des Gehirns und des Rückenmarks.
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Ein
Schaden des Nervensystems kann aus einer traumatischen Verletzung,
wie einem eindringenden Trauma oder einem stumpfen Trauma, oder
einer Krankheit oder Störung,
einschließlich
der Alzheimer Krankheit, der Parkinsonschen Krankheit, der Huntington
Krankheit, amyotropher Lateralsklerose (ALS), diabetischer Neuropathie,
seniler Demenz und Ischämie
herrühren.
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Die
Aufrechterhaltung der Unversehrtheit des zentralen Nervensystems
ist ein komplexer „Balanceakt", bei dem Kompromisse
mit dem Immunsystem zu schließen sind.
In den meisten Geweben spielt das Immunsystem beim Schutz, bei der
Reparatur und der Heilung eine wichtige Rolle. Im Zentralnervensystem
sind immunologische Reaktionen auf Grund seines einzigartigen Immunprivilegs
relativ beschränkt
(Streilein, 1993, 1995). Eine wachsende Anzahl an Nachweisen zeigt
an, dass das Versagen des zentralen Nervensystems, beim Säuger nach
einer Verletzung eine funktionale Erholung zu erzielen, einen ineffektiven
Dialog zwischen dem beschädigten
Gewebe und dem Immunsystem wiederspiegelt. Die eingeschränkte Kommunikation
zwischen dem Zentralnervensystem und Makrophagen im Blut beeinträchtigt die
Fähigkeit
axotomisierter Axone erneut zu wachsen; Transplantate von aktivierten
Makrophagen können
das erneute Wachstum des Zentralnervensystems fördern (Lazarov Spiegler et
al, 1996; Rapalino et al, 1998).
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Es
wurde gezeigt, dass aktivierte T-Zellen unabhängig von ihrer Antigenspezifität in das
Parenchym des Zentralnervensystems eindringen, es scheinen jedoch
nur T-Zellen dort zu bleiben, die in der Lage sind, mit einem Zentralnervensystem-Antigen
zu reagieren (Hickey et al, 1991; Werkele, 1993; Kramer et al, 1995). T-Zellen,
die mit Antigenen der weißen
Substanz des Zentralnervensystems reagieren, wie basisches Myelinprotein
(MBP), können
die paralytische Krankheit experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis
(EAE) innerhalb von wenigen Tagen nach ihrer Inokulierung in unbehandelte
Empfängerratten
induzieren (Ben-Nun, 1981a). Anti-MBP-T-Zellen können ebenfalls an der menschlichen
Krankheit Multiple Sklerose beteiligt sein (Ota, K. et al, 1990;
Martin, 1997). Trotz ihres pathogenen Potenzials sind jedoch anti-MBP-Zellclone
im Immunsystem gesunder Personen vorhanden (Burns, 1983; Pette,
M. et al, 1990; Martin et al, 1990; Schluesener et al, 1985). Aktivierte
T-Zellen, die normalerweise das intakte Zentralnervensystem patroullieren,
reichern sich transient an Orten mit Läsionen der weißen Substanz
des Zentralnervensystems an (Hirschberg et al, 1998).
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Eine
katastrophale Konsequenz von Verletzungen des zentralen Nervensystems
ist, dass der primäre Schaden
häufig
mit dem schrittweisen sekundären
Verlust von benachbarten Neuronen verbunden ist, die durch die anfängliche
Verletzung offensichtlich unbeschädigt oder nur marginal beschädigt waren
(Faden et al, 1992; Faden 1993; McIntosh, 1993). Die primäre Läsion verursacht
Veränderungen
in den extrazellulären Ionenkonzentrationen,
die Zunahme der Menge an freien Radikalen, die Freisetzung von Neurotransmittern, die
Entfernung von Wachstumsfaktoren und lokale Entzündungen. Diese Veränderungen
lösen eine
Kaskade destruktiver Vorgänge
in den benachbarten Neuronen aus, die der primären Verletzung anfänglich entkommen sind
(Lynch et al, 1994; Bazan et al, 1995; Wu et al, 1994). Dieser sekundäre Schaden
wird durch die Aktivierung von spannungsabhängigen oder Agonistgesteuerten
Kanälen,
Ionenlecks, Aktivierung von calciumabhängigen Enzymen wie Proteasen,
Lipasen und Nucleasen, Mitochondrien-Dysfunktion und Energieverlust vermittelt,
was in neuronalem Zelltod kulminiert (Yoshina et al, 1991; Hovda
et al, 1991; Zivin et al, 1991; Yoles et al, 1992). Der weitverbreitete
Verlust von Neuronen, der über
den Verlust hinausgeht, der direkt durch die primäre Verletzung
verursacht wird, wurde „sekundäre Degeneration" genannt.
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Einer
der üblichsten
Vermittler, die eine Eigenvermehrung der Krankheit verursachen,
auch wenn der primäre
Risikofaktor entfernt oder abgeschwächt ist, ist Glutamat, eine
excitatorische Aminosäure,
die in der Lage ist, eine duale Aktivität zu zeigen: sie spielt eine
zentrale Rolle im normalen Zentralnervensystem (ZNS), wobei sie
als wichtiger Neurotransmitter fungiert, sie wird jedoch toxisch,
wenn ihre physiologischen Mengen überstiegen werden. Von einem
Anstieg des Glutamats wurde bei vielen ZNS-Störungen berichtet. In seiner Rolle
als excitatorische Verbindung ist Glutamat einer der üblichsten
Vermittler von Toxizität
bei akuten und chronischen degenerativen Störungen (einschließlich der
Degeneration des Sehnervs beim Glaucom) (Pitt et al, 2000 und Schoepp
et al, 1996). Endogenes Glutamat wurde dem Hirnschaden zugeschrieben,
der akut nach Status epilepticus, cerebraler Ischämie oder
traumatischen Gehirnverletzungen auftritt. Es kann ebenfalls zur
chronischen Neurodegeneration in Störungen wie amyotropher Lateralsklerose
und Chorea Huntington beitragen.
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Intensive
Forschung wurde darauf verwendet, die cytotoxische Wirkung von Glutamat
durch die Verwendung von örtlich
wirkenden Wirkstoffen wie NMDA-Rezeptorantagonisten
(Brauner-Osborne et al, 2000) abzuschwächen. Herkömmliche Therapie dieser Art
ist oft nicht zufriedenstellend, wobei es jedoch bei der Neutralisation
der toxischen Wirkung wahrscheinlich ist, dass es mit der physiologischen
Funktion interferiert. Beim Menschen haben solche Verbindungen psychotrope
und andere Nebenwirkungen, die sie als therapeutische Mittel ungeeignet
werden lassen. Sie haben auch den Nachteil, dass sie mit der essenziellen
physiologischen Funktion von Glutamat als einem ubiquitären ZNS-Neurotransmitter
interferieren. Da die Glutamat-Aktivität für die normale physiologische
Funktion essenziell ist, jedoch potenziell nach akuter Verletzung
oder bei chronischen ZNS-Störungen
verheerend ist, muss jeder Versuch, seine gefährliche Wirkung zu neutralisieren, dies
tun, ohne seine essenzielle Aktivität an anderen Stellen im Körper zu
eliminieren.
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Eine
andere tragische Folge von Verletzungen des zentralen Nervensystems
ist, dass Neuronen im Säuger-Zentralnervensystem
nach einer spontanen Verletzung keine spontane Regeneration erfahren.
Somit verursacht eine Verletzung des zentralen Nervensystems eine
ständige
Verschlechterung motorischer und sensorischer Funktionen.
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Läsionen des
Rückenmarks
ergeben anfänglich,
unabhängig
von der Schwere der Verletzung, eine vollständige funktionale Lähmung, bekannt
als Spinalschock. Eine spontane Erholung von Spinalschock kann beobachtet
werden, die wenige Tage nach der Verletzung beginnt und innerhalb
von drei oder vier Wochen langsam aufhört. Je weniger schwer die Verletzung,
desto besser das funktionelle Ergebnis. Das Ausmaß der Erholung
ist eine Funktion der Menge an unbeschädigtem Gewebe minus dem Verlust
auf Grund von sekundärer
Degeneration. Eine Erholung von der Verletzung würde durch neuroprotektive Behandlung
verbessert werden, die die sekundäre Degeneration reduzieren
könnte.
Zum Beispiel ist ein Ausschalten der Wirkung von Glutamat ein häufiges Ziel
der neuroprotektiven Wirkstoffentwicklung. Unter den Wirkstoffen,
die für
diesen Zweck entwickelt werden, sind N-Methyl-D-aspartat(NMDA)-Rezeptor oder alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazol-propionsäure(AMPA)-Rezeptorantagonisten.
Diese Wirkstoffe werden unvermeidlicherweise schwere Nebenwirkungen
haben, da sie mit der Funktion der NMDA- und AMPA-Rezeptoren interferieren,
die für
die ZNS-Aktivität
entscheidend sind. Einer der am intensivsten untersuchten NMDA-Rezeptor-Antagonisten ist
MK801, das eine wirksame Neuroprotektion bereitstellt, jedoch mit
schweren Nebenwirkungen. Bei Tiermodellen von cerebraler Ischämie und
traumatischer Hirnverletzung schützen
NMDA- und AMPA-Rezeptorantagonisten gegen akute Hirnschädigung und
verzögerten
Verhaltensmängel.
Solche Verbindung werden am Menschen getestet, eine therapeutische
Wirksamkeit muss jedoch noch etabliert werden. Andere klinische
Zustände,
die auf Wirkstoffe reagieren können,
die auf die Übertragung durch
Glutamat wirken, umfassen Epilepsie, Amnesie, Angst, Hyperalgesie
und Psychose (Meldrum, 2000).
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Im
Labor der vorliegenden Erfinder wurde kürzlich entdeckt, dass aktivierte
T-Zellen, die ein
Antigen des Nervensystems (NS) des Patienten erkennen, die Nervenregeneration
fördern
beziehungsweise die Neuroprotektion übertragen. Es wird sich auf
die PCT-Veröffentlichung
WO 99/60021 bezogen.
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Genauer,
es wurde gezeigt, dass T-Zellen, die auf MBP reagieren, in Rattenmodellen
von teilweise gequetschtem Sehnerv (Moalem et al, 1999) und bei
Verletzung des Rückenmarks
(Hauben et al, 2000) neuroprotektiv sind. Bis vor kurzem dachte
man, dass das Immunsystem Immunzellen bei der Beteiligung an der Reparatur
des Nervensystems ausschloss. Es war recht überraschend festzustellen,
dass NS-spezifische aktivierte T-Zellen bei der Förderung
der Nervenzellregeneration oder dem Schutz des Nervensystem-Gewebes vor
sekundärer
Degeneration, die einem Schaden, der durch Verletzung oder Krankheit
des ZNS oder PNS verursacht wurde, folgen kann, verwendet werden
können.
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NS-spezifische
aktivierte T-Zellen, wie in der Veröffentlichung WO 99/60021 beschrieben,
sind aktivierte T-Zellen, die eine Spezifität für ein Antigen des NS eines
Patienten haben. Das Antigen, das verwendet wurde, um den T-Zellen
die Spezifität
zu verleihen, kann ein eigenes NS-Antigen des Patienten sein, ein
Peptid, das davon abstammt, oder ein NS-Antigen eines anderen Individuums
oder sogar einer anderen Art, oder ein Peptid, das davon abstammt,
solange die aktivierte T-Zelle ein Antigen im NS des Patienten erkennt.
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Die
NS-spezifischen aktivierten T-Zellen sind für die Verwendung zur Förderung
der Nervenregeneration oder zur Vorbeugung oder Hemmung der Wirkungen
einer Erkrankung. Wenn die behandelte Erkrankung eine Autoimmunerkrankung
ist, bei der das Autoimmun-Antigen ein NS-Antigen ist, sind die
T-Zellen, die zur Behandlung einer durch eine solche Erkrankung
verursachten neuronalen Störung
oder Degeneration verwendet werden, nicht gegen das gleiche an der
Krankheit beteiligten Autoimmun-Antigen aktiviert.
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Die
vorstehend zitierte PCT-Veröffentlichung
WO 99/60021 offenbart, dass eine Therapie zur Linderung der Wirkungen
von Verletzung oder Erkrankung, die eine Verabreichung von NS-spezifischen
aktivierten T-Zellen umfasst, gegebenenfalls in Kombination mit
einem NS-spezifischen Antigen oder einem davon abgeleiteten Peptid
erfolgen kann. Ein NS-spezifisches Antigen wie in der WO 99/60021
definiert, bezieht sich auf ein Antigen, das spezifisch T-Zellen
aktiviert, so dass nach der Aktivierung die aktivierten T-Zellen
sich an einer Verletzungs- oder Erkrankungsstelle in dem NS des
Patienten anreichern. Weiterhin kann die orale Verabreichung von
NS-spezifischem Antigen oder einem davon abgeleiteten Peptid mit
einer aktiven Immunisierung kombiniert werden, um eine kritische
T-Zell-Antwort unmittelbar nach der Verletzung zu erzeugen.
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In
dieser vorherigen Erfindung kann das NS-spezifische Antigen, das
verwendet wird, um die T-Zellen in vitro oder in vivo zu aktivieren,
oder um den Patienten zu immunisieren, ein Antigen sein, das von
NS-Gewebe erhalten wird, vorzugsweise von Gewebe an einer Stelle
der NS-Verletzung oder -Krankheit. Es stellte sich heraus, dass
natürliche
oder synthetische Antigene oder Epitope MBP, MOG, PLP, MAG, S-100, β-Amyloid,
Thy-1, P0, P2 und einen Neurotransmitter-Rezeptor umfassen. Spezifische veranschaulichende
Beispiele für
solche nützlichen
NS-spezifischen Antigene, die in WO 99/60021 offenbart sind, sind
menschliches MBP, menschliches Proteolipid-Protein (PLP) und menschliches
Oligodendrocyten-Glycoprotein.
Ebenfalls offenbart wurden Peptide, die von NS-spezifischen Selbst-Antigenen oder Derivaten
von NS-spezifischen Antigenen abstammen, die T-Zellen aktivieren,
jedoch keine Autoimmunkrankheit induzieren, wie ein Peptid, das
die Aminosäuren
51–70
von basischem Myelinprotein (MBP) umfasst.
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Der
Wirkmechanismus solcher NS-spezifischer T-Zellen muss noch entdeckt
werden, jedoch legt die massive Anreichung von exogen verabreichten
T-Zellen an der Stelle der ZNS-Verletzung nahe, dass die Gegenwart
von T-Zellen an der Stelle der Verletzung eine hervorstechende Rolle
bei der Neuroprotektion spielt. Es scheint jedoch, dass die Anreichung,
obwohl eine notwendige Bedingung, für den Zweck nicht ausreicht, da
sich T-Zellen, die für
das nicht-Selbst-Antigen Ovalbumin spezifisch sind, ebenfalls an
der Stelle anreichen, jedoch keine neuroprotektive Wirkung haben
(Hirschberg et al, 1998).
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Ein
basisches synthetisches Zufalls-Copolymer, das aus L-Ala-, L-Glu-,
L-Lys- und L-Tyr-Resten
besteht, im molaren Verhältnis
von etwa 6 Teilen Ala zu 2 Teilen Glu zu 4,5 Teilen Lys zu einem
Teil Tyr, und das ein Molekulargewicht von 15.000–25.000
hat, wurde zuerst im US-Patent Nr. 3.849.550 als Mittel zur Behandlung
oder zur Prävention
von experimenteller allergischer Encephalomyelitis (EAE), einer
Krankheit, die Multipler Sklerose (MS) ähnelt, die in empfänglichen
Tieren induziert werden kann, beschrieben. Es zeigte sich, dass
Sätze von
diesem Copolymer mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von
23.000, genannt Copolymer 1 oder Cop 1, beim Schutz und bei der
Unterdrückung
von EAE bei verschiedenen Tierarten sehr wirksam waren (Teitelbaum
et al, 1971, 1974a, 1974b).
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Später zeigte
sich, dass Cop 1 die Anzahl von Rückfällen bei Patienten mit schubförmigem Form
von MS (Bornstein et al, 1990; Sela et al, 1990; Johnson et al,
1994) reduzierte. Copolymer 1, in Form der Acetatsalze von synthetischen
Polypeptiden, die L-Glu, L-Ala, L-Tyr und L-Lys mit einer durchschnittlichen
molaren Fraktion von 0,141, 0,427, 0,095 und 0,338 enthalten, ist
aktiver Bestandteil von COPAXONE®, einem
Medikament zur Behandlung von Multipler Sklerose.
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Es
ist somit offensichtlich, dass die Wirkung von Copolymer 1 bei der
Behandlung von MS im Erreichen einer Unterdrückung oder Deaktivierung von
Autoimmun-T-Zell-Reaktivität
gegen Myelin-Antigene bei Patienten mit Multipler Sklerose liegt.
Zu diesem Zweck wird Copolymer 1 ohne Adjuvans durch tägliche subkutane Injektion
verabreicht.
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Cop
1 wurde ursprünglich
hergestellt, um MBP nachzuahmen und um EAE zu induzieren, es wurde jedoch
herausgefunden, dass es nicht encephalitogen ist und dass es sogar
EAE, das durch MBP (Teitelbaum et al, 1971), (PLP) (Teitelbaum et
al, 1996) oder (MOG) (Ben-Nun et al, 1996) induziert wird, unterdrückt. Die genauen
Mechanismen, durch die Cop 1 die Entwicklung von EAE verhindert
und Multiple Sklerose (MS) verbessert, sind noch nicht bekannt.
Trotzdem sind einige wichtige immunologische Eigenschaften dieses
Copolymers aufgetaucht. Untersuchungen zeigten eine teilweise Kreuzreaktivität von Cop
1 mit MBP sowohl auf der Ebene der T-Zellen (Webb et al, 1973) als
auch der Antikörper
(Teitelbaum et al, 1988). Cop 1 kann als ein Antagonist des T-Zell-Antigenrezeptors
für das
immun-dominante MBP-Epitop
(Aharoni, 1998) dienen. Es kann auch an verschiedene MHC Klasse
II-Moleküle binden
und sie von einer Bindung an T-Zellen mit spezifischen Antigen-Erkennungseigenschaften
abhalten (Fridkis-Hareli et al, 1999a). Bei Wiederkäuern induziert Cop
1 regulatorische Zellen, die wahrscheinlich als Zuschauer-Suppressoren von
encephalitogenen T-Zellen wirken (Aharoni, 1998). Es zeigte sich,
dass der adoptive Transfer solcher T-Zellen die Entwicklung von
EAE, das durch MBP (Aharoni et al, 1993), PLP (Aharoni, 1998) oder
das gesamte Rückenmarks-Homogenat (Aharoni
et al, 1997) induziert war, verhindert. Des Weiteren wurde von einem
direkten Hinweis darauf berichtet, dass es sowohl eine kompetitive
Interaktion von Cop 1 und damit in Verbindung stehenden Copolymeren
und Kollagen II (CII)- Peptid
mit den mit rheumatoider Arthritis (RA) in Verbindung stehenden
HLA-DR-Molekülen und
eine Hemmung der CII-spezifischen Zellreaktionen gab, was nahe legt,
dass diese Verbindungen gegen rheumatoide Arthritis wirksam sein
können
(Fridkis-Hareli, 1998, 1999b).
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Die
orale Verabreichung von Autoantigen zur Erhaltung von „oraler
Toleranz" wurde
für die
Behandlung verschiedener Autoimmunkrankheiten offenbart. Zum Beispiel
offenbart
EP 359 783 die
orale Verabreichung von MBP für
die Behandlung von Multipler Sklerose. Die internationalen PCT-Veröffentlichungen
WO 91/12816, WO 91/08760 und WO 92/06704 offenbaren alle die Behandlung
anderer Autoimmunkrankheiten, wobei das orale Toleranzverfahren
mit verschiedenen Auto-Antigenen
verwendet wird. Die Behandlung von Multipler Sklerose durch die
Aufnahme oder Inhalation von Copolymer 1, um eine Unterdrückung der
autoimmunen T-Zellreaktion auf Myelin-Antigene zu erreichen, wurde
in der PCT-Veröffentlichung
WO 98/30227 offenbart.
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Verbindungen,
die mit Copolymer 1 in Verbindung stehen, wurden ebenfalls untersucht
und es wurde herausgefunden, dass sie ähnliche Eigenschaften wie Copolymer
1 haben. Zum Beispiel binden Copolymere, die aus drei der vier Aminosäuren zusammengesetzt
sind, die in Copolymer 1 zu finden sind, an gereinigte MHC Klasse
II-Moleküle
(Fridkis-Hareli et al., 1999a, WO 005250). Zusätzlich wurden Bindungsmotive
von Copolymer 1 an mit multipler Sklerose und rheumatoider Arthritis
in Verbindung stehende HLA-DR-Moleküle kürzlich erläutert (Fridkis-Hareli et al,
1999b). Von diesen Bindungsmotiven können Polypeptide einer festgelegten Sequenz
leicht vorhergesagt und auf die Bindung an die Peptid-Bindungstasche der
HLA-DR-Moleküle
getestet werden. Von diesen Peptiden würde erwartet, dass sie auf
eine Weise wirken, die der von Cop 1 selbst ähnlich ist. Beispiele für solche
synthetischen Peptide sind in WO 005249 offenbart.
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Ein
Zitat oder eine Identifizierung eines Dokuments in diesem Abschnitt
oder einem anderen Teil dieser Anmeldung soll nicht als Zugeständnis verstanden
werden, dass ein solches Dokument als Stand der Technik für die Erfindung
erhältlich
ist.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung ist auf Verwendungsmöglichkeiten und Zusammensetzungen
für die
Förderung
der Nervenregeneration oder die Prävention oder Inhibition von
neuronale Degeneration, zur Verbesserung und Behandlung der Auswirkungen
einer Verletzung oder Krankheit des Nervensystems (NS) gerichtet. Die
vorliegende Erfindung basiert zum Teil auf der unerwarteten Entdeckung
der Anmelder, dass gegen Cop 1 aktivierte T-Zellen die Nervenregeneration
fördern
oder Neuroprotektion verleihen. Sie basiert weiterhin zum Teil auf
der unerwarteten Entdeckung der Erfinder, dass aktivierte T-Zellen
gegen Cop 1 die Nervenzellen vor Glutamat-Toxizität schützen. Wie
hierin verwendet bezieht sich „Neuroprotektion" auf die Prävention
oder Inhibition von degenerativen Wirkungen einer Verletzung oder
Krankheit im NS, einschließlich
dem Schutz vor den sekundären
neurodegenerativen Wirkungen, die sogar dann fortbestehen, wenn
der primäre
Risikofaktor entfernt oder abgeschwächt wird. Dies umfasst sowohl
den Schutz der weißen
Substanz als auch der grauen Substanz. Bis vor kurzem wurde angenommen,
dass das Immunsystem Immunzellen von der Teilnahme an der Reparatur
des Nervensystems ausschloss. Es war recht überraschend festzustellen,
dass Cop 1-aktivierte Zellen verwendet werden können, um die Nervenregeneration
zu fördern
oder um Gewebe des Nervensystems vor sekundärer Degeneration zu schützen, das
einer Schädigung,
verursacht durch Verletzung oder Krankheit des ZNS oder PNS, folgen
kann. „Aktivierte
T-Zellen", wie hierin
verwendet, umfasst (i) T-Zellen,
die durch Exposition zu Cop 1 oder ein Cop 1-verwandtes Peptid oder
Polypeptid aktiviert wurden und (ii) Abkömmlinge solche aktivierter
T-Zellen. In einer Ausführungsform
beschreibt die vorliegende Erfindung Arzneimittel, die eine therapeutisch
wirksame Menge von Cop 1-spezifischen aktivierten T-Zellen umfasst
und bedient sich solcher Zusammensetzungen für die Herstellung eines Medikaments
zur Förderung
der Nervenregeneration oder zur Prävention oder Inhibition von
neuronaler Degeneration im ZNS oder PNS, in einer Menge, die zur
Verbesserung der Auswirkungen einer Verletzung oder Krankheit des
NS wirksam ist. „Cop
1-spezifische aktivierte T-Zellen", wie hierin verwendet, bezieht sich
auf aktivierte T-Zellen, die eine Spezifität zu Cop 1 oder ein Cop 1-verwandtes
Peptid oder Polypeptid haben.
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Die
Cop 1-spezifischen aktivierten T-Zellen werden verwendet für die Herstellung
eines Medikaments zur Förderung
der Nervenregeneration oder zur Prävention oder Inhibition sekundärer degenerativen
Wirkungen, die einer primären
NS-Verletzung oder den Auswirkungen von neurodegenerativen Vorgängen, verursacht
durch eine Krankheit oder einen Zustand, wie im folgenden Abschnitt
(3) beschrieben, jedoch ausschließlich Multipler Sklerose, folgen
können.
Nichtbeschränkende
Beispiele, einschließlich
Glaukom, Schlaganfall, Ischämie,
Schussverletzungen und Hirnschädigungen,
die durch gefährliche
Sportarten verursacht werden. Die Cop 1-spezifischen aktivierten
T-Zellen dienen nicht nur der Bereitstellung von Neuroprotektion
gegen primäre
und sekundäre
Risikofaktoren, die mit Myelin (weiße Substanz) in Verbindung
stehen, sondern, im Hinblick auf den nachgewiesenen Schutz gegen
Glutamat-Toxizität,
ebenfalls gegen primäre
und sekundäre
Risikofaktoren, die mit den neuronalen Zellkörpern selbst (graue Substanz)
in Verbindung stehen. Somit ist zu erwarten, dass Cop 1-spezifische
aktivierte T-Zellen für
den Zweck der vorliegenden Erfindung nützlich sind und durch bekannte
Immuntherapie-Verfahren nicht vorgeschlagen würden. Des Weiteren wirkt Cop
1 nicht nur über
Kreuzreaktion mit Myelin, da es vor Glutamat-Toxizität schützt. Es
muss auch eine regulatorische Aktivität haben, wie zum Beispiel durch
die Erzeugung von regulatorischen Zellen oder regulatorischen Stoffen.
Hinsichtlich dieser regulatorischen Aktivität wird erwartet, dass die Cop
1-Impfung und die Cop 1-spezifischen
aktivierten T-Zellen auch die weiße und die graue Substanz vor
einem Schaden durch oxidativen Stress und andere Schadensquellen
an Nervenzellen schützen.
Zusätzlich
kann die vorliegende Erfindung auf Grund dieser regulatorischen
Aktivität
auch verwendet werden, um Nervenzellen nicht nur vor Multipler Sklerose,
wie auf dem Fachgebiet empfohlen, sondern auch vor anderen Autoimmunkrankheiten
als Multipler Sklerose zu schützen.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch Arzneimittel, die eine
therapeutisch wirksame Menge an Cop 1 oder einem Cop 1-verwandten
Peptid oder Polypeptid umfassen und Verwendungsmöglichkeiten solcher Zusammensetzungen
für die
Herstellung eines Medikaments zur Förderung der Nervenregeneration
oder zur Prävention
oder Inhibition von neuronaler Degeneration im ZNS oder PNS, wobei
die Menge zur Aktivierung von T-Zellen in vivo oder in vitro wirksam
ist, worin die aktivierten T-Zellen
die Auswirkungen einer Verletzung oder Krankheit des NS hemmen.
In der Praxis der Erfindung kann die Verwendung von Cop 1-spezifischen aktivierten
T-Zellen für die Herstellung
eines Medikaments zur Therapie für
die Verbesserung und Behandlung der Auswirkungen einer Verletzung
oder einer Krankheit optional in Kombination mit Cop 1 oder einem
mit Cop 1 verwandten Peptid oder Polypeptid stattfinden. Zusätzlich ist
die Verwendung von Cop 1 oder einem mit Cop 1 verwandten Peptid-
oder Polypeptid-Antigen zur Herstellung eines Medikaments, das für die orale
Verabreichung geeignet ist, zur Neuroprotektion nach Priming mit
Cop 1, das in einem Adjuvans verabreicht ist, wirksam. Somit kann
orales Cop 1 verwendet werden, um die Aktivität der T-Zellen nach der primären Aktivierung eines
solchen Cop 1, vorzugsweise in einem Adjuvans, zu verstärken, um
direkt nach der Verletzung eine kritische T-Zellreaktion aufzubauen.
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Des
Weiteren beschreibt die Anmeldung, dass Zellbanken eingerichtet
werden können,
um mit Cop 1 sensibilisierte T-Zellen für neuroprotektive Behandlung
von Individuen zu einem späteren
Zeitpunkt, an dem sie gebraucht werden, zu lagern. In diesem Fall
können
autologe T-Zellen von einem Individuum erhalten werden. Alternativ
können
allogene oder semi-allogene T-Zellen gelagert werden, so dass eine
Bank von T-Zellen, jeweils von den üblichsten MHC-Klasse II-Typen
vorhanden sind. Im Fall, dass ein Individuum wegen einer Verletzung
behandelt werden muss, werden vorzugsweise autologe, gelagerte T-Zellen
für die
Herstellung eines Medikaments verwendet, sind jedoch autologe T-Zellen
nicht erhältlich,
so sollten Zellen verwendet werden, die ein MHC-Typ II-Molekül mit dem
Patienten gemein haben, und es würde
erwartet, dass diese in dem Individuum verwendbar sind. Die Zellen
werden vorzugsweise nach Exposition zu Cop 1 oder einem mit Cop 1
verwandten Peptid oder Polypeptid in aktiviertem Zustand gelagert.
Die Zellen können
jedoch auch in ruhendem Zustand gelagert werden und aktiviert werden,
wenn sie aufgetaut und für
die Verwendung vorbereitet sind. Die Zelllinien der Bank sind vorzugsweise
kryokonserviert. Die Zelllinien sind auf eine Weise hergestellt, wie
auf dem Fachgebiet wohlbekannt ist. Wenn die Zellen aufgetaut sind,
werden sie vorzugsweise vor der Injektion gezüchtet, um nicht lebensfähige Zellen
zu eliminieren. Während
dieser Züchtung
können
die Zellen unter Verwendung des Cop 1-Antigens oder -Peptids wie
in der ursprünglichen
Aktivierung aktiviert oder reaktiviert werden. Alternativ kann eine
Aktivierung durch Züchtung
in Gegenwart eines Mitogens wie Phytohämagglutinin (PHA) oder Concanavalin
A (vorzugsweise ersteres) erreicht werden. Dies wird die Zellen
in einen noch höheren
Aktivierungszustand bringen. Die wenigen Tage, die man benötigt, um
die Zellen zu züchten, sollten
für den
Patienten nicht schädlich
sein, da die Behandlung gemäß der vorliegenden
Erfindung zu jeder Zeit bis zu einer Woche nach der Verletzung stattfinden
kann, um noch wirksam zu sein. Alternativ können die gelagerten Zellen,
wenn die Zeit drängt,
direkt nach dem Auftauen verabreicht werden.
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KURZE BESCHREIBUNG DER
ZEICHNUNGEN
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1A und 1B sind
Graphiken, die die Anzahl von markierten (überlebenden) RGCs/mm2 in Netzhäuten zeigen, die von Ratten
ausgeschnitten waren, denen PBS in unvollständigem Freund's Adjuvans (IFA)
(in den Figuren mit PBS gekennzeichnet) oder Cop 1-spezifische T-Zellen
in IFA (als Tcop1 gekennzeichnet) direkt nach leichter (1A)
oder schwerer (1B) Verletzung des Sehnervs
injiziert worden war.
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2A und 2B sind
Graphiken, die den ELISA von sezernierten neurotrophen Faktoren
darstellen. Ratten-anti-MBP (weiße Säulen in 2A)- oder
-anti-Cop 1 (schwarze Säulen
in 2A)-T-Zellen wurden 48 Stunden mit ihrem spezifischen
Antigen in Stimulierungsmedium gezüchtet. Die T-Zellüberstände wurden
aufgefangen und einem Sandwich-ELISA unterzogen. Die Graphik zeigt
die Konzentration von NT3, BDNF, NGF und NT-4/5, die in jeder Probe
sezerniert wurden. Die Verhältnisse
der Mengen an BDNF oder NT-3, die durch anti-Cop 1-T-Zellen sezerniert
wurden, zu den Mengen, die durch anti-MBP-T-Zellen sezerniert wurden,
sind in 2B gezeigt. Die mittleren Verhältnisse ± SD von
fünf unabhängigen Versuchen
mit Neurotrophin (NT) werden gezeigt.
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3 ist
eine Graphik, die zeigt, wie eine Immunisierung mit Cop 1 Sehnervenfasern
vor sekundärer Degeneration
schützt.
Direkt nach leichter Verletzung des Sehnervs wurden Ratten subkutan
mit PBS in IFA oder Cop 1 in IFA immunisiert. Um die sekundäre Degeneration
festzustellen, wurde zwei Wochen nach der Quetschverletzung die
Neurotracer-Färbung
4-Di-10-Asp distal zur Stelle der Verletzung auf den Sehnerv aufgetragen.
Fünf Tage
später
wurden die Ratten getötet
und ihre Netzhäute
wurden ausgeschnitten und flach aufpräpariert. Markierte (überlebende)
RGCs von vier Feldern, die sich in jeder Netzhaut in etwa demselben Abstand
von der Papille befanden, wurden unter dem Fluoreszenzmikroskop
gezählt.
Die neuroprotektive Wirkung der Cop 1-Immunisierung im Vergleich
zu der der PBS-Injektion
war signifikant (P < 0,05,
Students t-Test). Die Ergebnisse sind die Summe von zwei Versuchen.
Jede Gruppe enthielt acht bis zehn Ratten.
-
4 ist
eine Graphik, die zeigt, wie eine Immunisierung mit Cop 1 die Sehnervenfasern
vor Glutamat-Toxizität
schützt.
Mäuse wurden
mit Cop 1 immunisiert, das in vollständigem Freunds Adjuvans (CFA) emulgiert
war, und Kontrollmäusen
wurde CFA allein injiziert. Einem Auge jeder Maus wurde dann Kochsalzlösung allein
und dem anderen Kochsalzlösung,
die 200 nMol Glutamat enthielt, injiziert. Sieben Tage nach der Glutamat-Verabreichung
wurden die Netzhäute
ausgeschnitten und flach aufpräpariert.
Markierte (überlebende)
retinale Ganglionzellen (RGCs) wurden gezählt. Die Säulen zeigen die übriggebliebenen
RGCs als prozentualer Anteil der Kontrolle für die mit CFA behandelten Mäuse, die
entweder Kochsalzlösung
oder Kochsalzlösung
mit Glutamat erhielten, und die mit CFA-Cop 1 behandelten Mäuse, die
entweder Kochsalzlösung oder
Kochsalzlösung
mit Cop 1 erhielten.
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5A und 5B zeigen,
dass die Immunisierung mit pMOG (5A) oder
die passive Übertragung
von anti-MBP-Zellen (5B) die Mäuse-RGCs vor der Glutamat-Toxizität nicht
schützt.
In 5A wurden C57BL/6J-Mäuse 14 Tage bevor ihre RGCs
durch intravitreale Injektion von L-Glutamat (200 nMol) direkt einer
Glutamat-Toxizität
ausgesetzt wurden, mit pMOG immunisiert. Vier Tage später wurden
die RGCs mit FluoroGold rückläufig markiert,
und diesem folgte nach drei Tagen ein Ausschneiden der Netzhaut
und Zählen (vgl.
Abschnitt Material und Methoden von Beispiel 3, Versuch 2). RGC-Überleben
wird als Mittelwert ± SEM pro
mm2 ausgedrückt. Es wurden zwischen den
Gruppen, die mit pMOG in CFA behandelt wurden (n = 8) und der Kontrollgruppe,
die mit PBS in CFA behandelt wurde (n = 7) keine signifikanten Unterschiede
des RGC-Überlebens
beobachtet. In 5B wurde Glutamat intravitreal
in Lewis-Ratten injiziert. Vier Tage später wurden die RGCs durch Aufbringen
der Färbung
4-Di-10-Asp markiert, und diesem folgte nach fünf Tagen ein Ausschneiden der
Netzhaut und Zählen.
Es ist zu bemerken, dass sich das Überleben der Netzhaut in der
mit T-Zellen behandelten Gruppe nicht signifikant von dem in der
Kontrollgruppe unterschied (Anzahl von RGCs pro mm2,
Mittelwert ± SEM
(n = 6 in jeder Gruppe).
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6A und 6B zeigen
das Eindringen von Lymphocyten nach intravitrealer Injektion von
Glutamat. Glutamat wurde intravitreal in C57bl/6-Mäuse injiziert.
Nach 24 h wurde das Auge entfernt und für die Histologie weiterverarbeitet.
Mit H&E gefärbte Schnitte
(10 μm dick)
sowohl von den mit Glutamat injizierten (6A) als
auch den Kontrollmäusen
(6B) sind gezeigt. Balken = 200 μm.
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7 zeigt
die Überlebensrate
retinaler Ganglionzellen nach Verletzung des Sehnervs. Die RGCs
von adulten Balb/c Inzuchten wurden 10 Tage nachdem sie mit 50 μg Cop-1,
das in CFA emulgiert war, immunisiert worden waren, rückläufig mit
FluoroGold markiert (vgl. Abschnitt Material und Methoden von Beispiel
3, Versuch 2). Kontrollmäusen
wurde PBS in CFA injiziert (n = 8 – 12 in jeder Gruppe). Drei
Tage nach Markieren der RGCs wurden die Mäuse einer schweren Quetschverletzung
des intraorbitalen Abschnitts des Sehnervs unterworfen. Zwei Wochen
nach der Verletzung wurden die Netzhäute ausgeschnitten und ihre
markierten RGCs wurden gezählt
(vgl. Abschnitt Material und Methoden von Beispiel 3, Versuch 2).
Verglichen mit den nicht-immunisierten Kontrollen waren die Überlebensraten
bei Mäusen,
die mit Cop-1 in CFA immunisiert waren, signifikant höher (p < 0,001, Students
t-Test).
-
8A–8D zeigen
die Neuroprotektion vor Glutamat-Toxizität durch aktive Immunisierung
mit Cop-1. In 8A wurden Mäuse zehn Tage vor Glutamat-Injektion durch subkutane
Injektion mit Cop-1 in CFA (5 mg/ml Bakterien) immunisiert, oder
ihnen wurde PBS in CFA injiziert. Die Ergebnisse eines Versuchs
sind gezeigt (n = 5 in jeder Gruppe). Die Anzahl an überlebenden
RGCs pro mm2 (Mittelwert ± SEM)
war bei den mit Cop-1 immunisierten Mäusen signifikant höher als
bei den Mäusen,
denen PBS in CFA injiziert worden war, oder bei den Mäusen, die
nur Glutamat erhielten (p < 0,02,
2-tailed t-Test). Die Injektion mit PBS in CFA hatte auf die Anzahl
der RGCs keine nachweisbare Wirkung. Der Versuch wurde dreimal wiederholt,
mit identischen Ergebnissen. Insgesamt wurden 13 Tiere in der mit
Cop-1 behandelten Gruppe und 15 Tiere in der mit PBS behandelten
Gruppe getestet. In 8B wurden Mäuse direkt nach der intravitrealen
Injektion von Glutamat mit Cop-1,
das in CFA emulgiert war (5 mg/ml Bakterien), immunisiert. Die Anzahl
der überlebenden
RGCs pro mm2 (Mittelwert ± SEM)
wurde eine Woche später
bestimmt. Die Ergebnisse eines Versuchs sind gezeigt. Die Wirkung
der Immunisierung mit Cop-1 war signifikant (p < 0,05; 2-tailed t-Test; n = 12 bei
Cop-1 und n = 8 bei der Kontrolle). Dieser Versuch wurde unter Verwendung
von 11 Mäusen
für die
Cop-1-Immunisierung und 8 Mäusen
für die
Injektion mit PBS in CFA (5 mg/ml Bakterien) wiederholt. In 8C folgte
das RGC-Überleben der
Glutamat-Beeinträchtigung
und der sofortigen Immunisierung mit Cop-1 in Adjuvans, das 0,5
mg/ml Bakterien enthielt. Die Anzahl überlebender RGCs pro mm2 war bei den mit Cop-1 immunisierten Mäusen signifikant
höher (n
= 15) als bei den Mäusen,
denen Glutamat (n = 5) injiziert wurde (p < 0,04; 2-tailed t-Test). In 8D wurde
das Überleben
von RGCs nach der zuvor durchgeführten
Immunisierung, sofort danach, beziehungsweise 48 Stunden nach der
Beeinträchtigung
mit Glutamat gezeigt. Die Säulen
zeigen die zusammengenommenen Ergebnisse, die für alle Mäuse, die mit jeder Behandlung
untersucht wurden, gesammelt aus wiederholten Versuchen. Es wurde
keine Wirkung beobachtet, wenn die Immunisierung 48 h nach der Beeinträchtigung
durchgeführt
wurde.
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9 zeigt,
dass die Cop-1-Immunisierung Mäuse
nicht vor NMDA-Toxizität
schützt.
Zehn Tage vor der Injektion von NMDA (75 nMol), wurden die Mäuse (n =
5 –7)
durch subkutane Injektion von Cop-1 in CFA oder mit PBS in CFA immunisiert.
Die Markierung der RGCs und das Zählen lebensfähiger RGCs
unter dem Fluoreszenzmikroskop waren wie für 5A beschrieben.
RGC-Überleben
bei mit Cop-1 immunisierten Mäusen,
ausgedrückt
als prozentualer Anteil an Überleben
in einem normalen Auge, ähnelte
dem bei mit PBS injizierten Mäusen
(p = 0,55, Students t-Test), was anzeigt, dass keine Neuroprotektion
erreicht wurde.
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10 zeigt,
dass Cop-1-reaktive T-Zellen RGCs vor Glutamat-Toxizität schützen. Direkt
nach der Injektion von Glutamat (200 nMol) wurden den Mäusen Cop-1-reaktive
T-Zellen oder PBS injiziert. Die Auftragung von Färbung, die
Herstellung und das Zählen
von RGCs, sowie die Berechnung des RGC-Überlebens waren wie für 5B beschrieben.
Signifikant mehr markierte RGCs sind in den Netzhäuten von
Mäusen
zu sehen, denen Cop-1-reaktive T-Zellen injiziert worden waren,
als in den Netzhäuten
von PBS-injizierten Kontrollmäusen
(p < 0,0007, Students
t-Test).
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11A–11D zeigen die Wirkung von chronisch erhöhter IOP-
und Cop-1-Immunisierung
auf retinale Ganglionzellen bei Lewis-Ratten. In 11A ergibt eine Laser-Kauterisation, die einen
Verschluss der episkleralen und limbalen Venen verursacht, einen
Anstieg von IOP und nachfolgenden Tod von retinalen Ganglionzellen.
Drei Wochen nach dem Lasern lag das mittlere IOP bei 30,4 ± 0,42
mm Hg (Mittelwert ± SEM,
n = 5) bei Ratten, die einem venösen
Verschluss ausgesetzt waren, im Vergleich zu 15,8 ± 0,2 mm
Hg (n = 7) bei unbehandelten Ratten. In 11B wurden
drei Wochen nach venösem
Verschluss bei den mit Laser behandelten Ratten 19,9% ± 0,51
% (Mittelwert ± SEM)
weniger retinale Ganglionzellen gezählt als bei den unbehandelten
Ratten. In 11C reduziert eine Immunisierung
mit Cop-1 direkt nach venösem
Verschluss den Verlust an retinalen Ganglionzellen. Die Ratten wurden
direkt nach dem Lasern mit Cop-1 (200 μg) in CFA immunisiert (n = 15)
oder mit PBS in CFA injiziert (n = 13). Drei Wochen später wurden
die Retinas ausgeschnitten und im Ganzen aufpräpariert, und die Anzahl an
retinalen Ganglionzellen, die zuvor mit Rhodamindextran markiert
waren, wurde gezählt.
Die Säulen
stellen den Verlust an retinalen Ganglionzellen in jeder Gruppe von Ratten
dar, berechnet als prozentualer Anteil an retinalen Ganglionzellen
in unbehandelten Ratten (Mittelwert ± SEM). Die Differenz hinsichtlich
der Anzahl an retinalen Ganglionzellen in den 2 Gruppen war signifikant
(p < 0,0001, 2-tailed
t-Test). In 11D wurde die Wirkung von verzögerter Immunisierung mit Cop-1
auf Verlust von retinalen Ganglionzellen durch Immunisierung von
Ratten 10 Tage nach venösem
Verschluss untersucht. Die Säulen
stellen den Verlust an retinalen Ganglionzellen in Gruppen dar,
die mit Cop-1 (n = 5) oder PBS (n = 4) behandelt worden waren, berechnet
als prozentualer Anteil der Anzahl an retinalen Ganglionzellen (Mittelwert ± SEM)
bei unbehandelten Tieren. Eine Tendenz zu einer neuroprotektiven
Wirkung wurden nach verzögerter
Immunisierung mit Cop-1 beobachtet; der Unterschied war nur im 1-tailed
t-Test signifikant (p = 0,04).
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
-
Hauptsächlich um
die Erklärung
zu erleichtern, wird die detaillierte Beschreibung der vorliegenden
Erfindung in folgende Unterabschnitte geteilt: (1) Cop 1-spezifische
aktivierte T-Zellen; (2) Cop 1 und Cop 1-verwandte Peptide und Polypeptide;
(3) Therapeutische Verwendungen; (4) Formulierungen und Verabreichung; (5)
Einrichtung autologer Zellbanken für T-Lymphocyten; (6) Beispiele;
und (7) Diskussion der Ergebnisse.
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(1) Cop 1-spezifische
aktivierte T-Zellen
-
Cop
1-spezifische aktivierte T-Zellen (ATCs) sind T-Zellen, die in Gegenwart
von Cop 1 oder einem Cop 1-verwandten Peptid oder Polypeptid aktiviert
wurden, wie in Abschnitt (2) definiert. Solche ATCs können für die Herstellung
eines Medikaments zur Behandlung, z.B. Verbesserung oder Hemmung
der Auswirkungen einer Verletzung oder Krankheit des ZNS oder PNS,
die eine Degeneration ergeben, oder zur Förderung der Regeneration im
NS, insbesondere im ZNS, verwendet werden. Zusätzlich wird, da Glutamat bei
allen neurodegenerativen Krankheiten, ob chronisch oder akut, ein
Vermittler ist, beabsichtigt, dass solche ATCs zum Schutz von ZNS-Zellen
vor Glutamat-Toxizität
und zur Behandlung von Krankheiten oder Zuständen, die durch Glutamat-Toxizität verursacht
oder verschlimmert wurden, wie abnormaler intraocularer Druck, verwendet
werden. Die Cop 1-spezifischen aktivierten T-Zellen sind bevorzugt
autolog, am stärksten
bevorzugt von den CD4- und/oder
CD8-Phänotypen,
aber sie können
auch allogene T-Zellen von verwandten Spendern, z.B. Geschwistern,
Eltern, Kindern beziehungsweise HLA-passende oder teilweise passende,
semi-allogene oder vollständig
allogene Spender sein. Zusätzlich
zur Verwendung von autologen T-Zellen, die zur Herstellung eines Medikaments
von der Person isoliert wurden, umfasst die vorliegende Erfindung
auch die Verwendung von semi-allogenen T-Zellen zur Herstellung
eines Medikaments zur Neuroprotektion. Diese T-Zellen können als kurz-
oder langfristige Linien hergestellt werden und durch herkömmliche
Kryokonservierungsverfahren zum Auftauen und zur Verabreichung,
entweder direkt oder nach Inkulturnahme über 1–3 Tage, an ein Individuum, das
an einer Verletzung des zentralen Nervensystems leidet und das eine
T-Zell-Neuroprotektion braucht, gelagert werden.
-
Die
Verwendung von semi-allogenen T-Zellen basiert auf der Tatsache,
dass T-Zellen ein spezifisches Antigen-Epitop, das durch fremde
Antigen-aufweisende Zellen (APC) gezeigt wird; erkennen können, vorausgesetzt,
dass die APC das MHC-Molekül, Klasse
I oder Klasse II, auf das die spezifische reaktive T-Zellpopulation
beschränkt
ist, zusammen mit dem Antigen-Epitop exprimieren, das von den T-Zellen
erkannt wird. Somit wird eine semi-allogene Population von T-Zellen,
die mindestens ein allelisches Produkt der MHC-Moleküle des Individuums,
vorzugsweise ein HLA-DR
oder ein HLA-DQ oder ein anderes HLA-Molekül erkennen kann und die für ein Cop
1-Epitop spezifisch ist, in der Lage sein, die Antigene zu erkennen,
die mit Cop 1 in dem Bereich, wo das NS des Individuums beschädigt ist,
kreuzreagieren, und die notwendige neuroprotektive Wirkung erzeugen.
Es gibt wenig oder keinen Polymorphismus in den Adhäsionsmolekülen, den
Leukocyten-Migrationsmolekülen
und Hilfsmolekülen,
die für
die T-Zellen notwendig sind, um zu dem Schadensbereich zu wandern,
sich dort anzuhäufen
und eine Aktivierung zu durchlaufen. Somit werden die semi-allogenen
T-Zellen in der Lage sein, zu der Stelle im ZNS, das eine Neuroprotektion
braucht, zu wandern und sich anzuhäufen und werden aktiviert,
um die gewünschte
Wirkung zu erzielen.
-
Es
ist bekannt, dass semi-allogene T-Zellen durch das Immunsystem des
Individuums abgestoßen werden,
aber diese Abstoßung
braucht etwa 2 Wochen, um sich zu entwickeln. Somit haben die semi-allogenen
T-Zellen ein zweiwöchiges
Fenster für
die Gelegenheit, Neuroprotektion auszuüben. Nach zwei Wochen werden
die semi-allogenen T-Zellen vom Körper des Individuums abgestoßen, aber
diese Abstoßung
ist für das
Individuum von Vorteil, da es das Individuum von den fremden T-Zellen
befreien und alle nachteiligen Folgen der aktivierten T-Zellen verhindern wird.
Somit stellen die semi-allogenen T-Zellen einen wichtigen Sicherheitsfaktor
zur Verfügung
und sind eine bevorzugte Ausführungsform.
-
Es
ist bekannt, dass sich die meisten Individuen in einer Population
eine relativ kleine Zahl an HLA-Klasse II-Molekülen teilen. Zum Beispiel exprimieren
etwa 50% der jüdischen
Bevölkerung
das HLA-DR5-Gen. Somit wäre
eine Bank spezifischer T-Zellen, die auf Cop 1-Epitope reagieren,
die sich auf HLA-DR5 beschränken,
für 50%
dieser Population nützlich.
Die gesamte Population kann im Wesentlichen durch eine kleine Zahl
an zusätzlichen
T-Zelllinien abgedeckt werden, die auf wenige andere vorherrschende HLA-Moleküle wie DR1,
DR4, DR2, etc. beschränkt
sind. Somit kann eine funktionale Bank einheitlicher T-Zelllinien
hergestellt und für
die sofortige Verwendung bei fast jedem Individuum einer gegebenen
Population gelagert werden. Eine solche T-Zellbank würde jedes
technische Problem der Gewinnung einer ausreichenden Zahl an spezifischen
T-Zellen von dem
Individuum, das während
des offenen Fensters der Behandlungsmöglichkeit eine Neuroprotektion
braucht, lösen.
Die semi-allogenen Zellen werden, nachdem sie ihre Rolle der Neuroprotektion
erfüllt
haben, sicher abgestoßen.
Diese Ausführungsform
der Erfindung widerspricht der Verwendung der autologen T-Zellen,
wie hierin beschrieben, nicht und ist zusätzlich dazu.
-
Die
Cop 1-spezifischen aktivierten T-Zellen sind vorzugsweise nicht
abgeschwächt,
obwohl abgeschwächte
Cop 1-spezifische aktivierte T-Zellen verwendet werden können. T-Zellen
können
unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt
sind, abgeschwächt
werden, einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf Gamma-Bestrahlung, z.B. 1,5–10,0
Rad (Ben-Nun et al, 1981 b; Ben-Nun et al, 1982); und/oder durch
Druckbehandlung, zum Besipiel wie in U.S.-Patent Nr. 4,996,194 (Cohen et al) beschrieben. In
einer bevorzugten Ausführungsform
werden die Cop 1-spezifischen aktivierten T-Zellen wie nachstehend beschrieben
isoliert. T-Zellen können
gemäß Verfahren,
die auf dem Fachgebiet bekannt sind (Mor et al, 1995) isoliert und
gereinigt werden. Für
ein veranschaulichendes Beispiel vgl. Abschnitt (6), Beispiel 1.
-
Zirkulierende
T-Zellen eines Individuums, die Cop 1 erkennen, werden unter Verwendung
bekannter Verfahren isoliert und vermehrt. Um Cop 1-spezifische
aktivierte T-Zellen zu erhalten werden T-Zellen isoliert und die
Cop 1-spezifischen ATCs werden dann durch ein bekanntes Verfahren
(Burns et al, 1983; Pette et al, 1990; Martin et al, 1990; Schluesener
et al, 1985; Suruhan-Dires Keneli et al, 1993) vermehrt.
-
Während der
Aktivierung der T-Zellen ex vivo können die T-Zellen durch Züchten in
einem Medium, dem mindestens ein geeigneter wachstumsfördernder
Faktor zugesetzt war, aktiviert werden. Für diesen Zweck geeignete wachstumsfördernde
Faktoren umfassen uneingeschränkt
Cytokine, zum Beispiel Tumor-Nekrosefaktor α (TNF-α), Interleukin 2 (IL-2) und
Interleukin 4 (IL-4).
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In
einer Ausführungsform
stellen die aktivierten T-Zellen endogen einen Stoff her, der die
Auswirkungen einer Verletzung oder Krankheit im NS verbessert.
-
In
einer anderen Ausführungsform
stellen die aktivierten T-Zellen endogen einen Stoff her, der andere Zellen,
einschließlich,
jedoch nicht beschränkt
auf transformierenden Wachstumsfaktor-β (TGF-β), Nerven-Wachstumsfaktor (NGF),
neurotrophen Faktor 3 (NT-3), neurotrophen Faktor 4/5 (NT-4/5),
von Hirn abgeleiteten neurotrophen Faktor (BDNF); Interferon-γ (IFN-γ) und Interleukin-6
(IL-6), stimuliert,
wobei die anderen Zellen, direkt oder indirekt die Auswirkungen
von Verletzung oder Krankheit verbessern.
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Nach
ihrer Vermehrung in vitro werden die T-Zellen zur Herstellung eines
Medikaments verwendet, das geeignet ist, an ein Säuger-Individuum
verabreicht zu werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Medikament
geeignet, an ein menschliches Individuum verabreicht zu werden.
T-Zellexpansion wird vorzugsweise unter Verwendung von Cop 1 oder
einem Cop 1-verwandten Peptid oder Polypeptid durchgeführt. Cop
1-aktivierte T-Zellen können
direkt verwendet werden oder sie können, z.B. durch Kryokonservierung,
wie nachstehend beschrieben, für
die spätere
Verwendung konserviert werden. Cop 1-spezifische aktivierte T-Zellen
können
auch unter Verwendung von zuvor kryokonservierten T-Zellen, d.h.
nach Auftauen der Zellen, gewonnen werden, die T-Zellen können mit
Cop 1 oder einem Cop 1-verwandten
Peptid oder Polypeptid, optimalerweise zusammen mit peripheren Blut-Lymphocyten (PBL),
inkubiert werden, um eine Herstellung Cop 1-spezifischer ATCs zu
erhalten.
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Wie
für den
Fachmann offensichtlich können
die T-Zellen z.B. durch Kryokonservierung, entweder vor oder nach
der Kultur, konserviert werden. Kryokonservierungsmittel, die verwendet
werden können,
umfassen Dimethyl-Sulfoxid
(DMSO) (Lovelock et al, 1959; Ashwood-Smith, 1961), Glycerin, Polyvinylpyrrolidon
(Rinfret, 1960), Polyethylenglykol (Sloviter et al, 1962), Albumin, Dextran,
Saccharose, Ethylenglycol, i-Erythrit, D-Ribit, D-Mannit (Rowe et
al, 1962), D-Sorbit, i-Inosit, D-Lactose, Cholinchlorid (Rowe et
al, 1962), Aminosäuren (Phan
The Tran et al, 1960a), Methanol, Acetamid, Glycerinmonoacetat (Lovelock,
1954), anorganische Salze (Phan The Tran et al, 1960b; Phan The
Tran et al), und DMSO kombiniert mit Hydroxyethylstärke und
menschlichem Serumalbumin (Zaroulis et al, 1980), sind jedoch nicht
darauf beschränkt.
-
Kritisch
ist eine kontrollierte Abkühlungsrate.
Verschiedene kryoprotektive Mittel (Rapatz et al, 1968) und verschiedene
Zelltypen haben hinsichtlich der Auswirkungen der Abkühlungsgeschwindigkeit
auf das Überleben
von Zellen und auf ihr Transplantationspotenzial verschiedene optimale
Abkühlungsraten.
Vgl., z.B., Rowe et al (1962b); Rowe (1966); Lewis et al, (1967);
und Mazur, (1970). Die Wärme
bei der Fusionsphase, bei der Wasser zu Eis wird, sollte minimal
sein. Das Kühlungsverfahren
kann z.B. durch die Verwendung eines programmierbaren Gefriergeräts oder
eines Methanolbad-Verfahrens durchgeführt werden.
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Programmierbare
Gefriergeräte
erlauben die Bestimmung optimaler Abkühlungsraten und erleichtern eine
reproduzierbare Standard-Abkühlung.
Programmierbare Gefriergeräte
mit einer kontrollierten Rate, wie Cryomar oder Planar erlauben
eine Feinabstimmung des Gefriervorgangs hin zur gewünschten
Kurve der Abkühlungsrate.
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Nach
gründlichem
Einfrieren können
die Zellen schnell in ein kryogenes Langzeit-Aufbewahrungsgefäß überführt werden.
In einer Ausführungsform
können
die Proben in mechanischen Gefriergeräten, wie Gefriergeräten, die
eine Temperatur von etwa –80°C oder etwa –20°C aufrechterhalten,
kryogen gelagert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform
können
die Proben in flüssigem
Stickstoff (–196°C) oder dessen
Dampf kryogen gelagert werden. Eine solche Aufbewahrung wird durch
die Erhältlichkeit
von hocheffizienten Flüssig-Stickstoff-Kühlschränken, die
großen
Thermosbehältern ähneln, mit
einem extrem niedrigen Vakuum und innerer Super-Isolierung in der Weise, dass Hitzeverlust
und Stickstoffverluste auf einem absoluten Minimum gehalten werden,
stark begünstigt.
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Betrachtungen
und Verfahren für
die Handhabung, Kryokonservierung und langfristige Lagerung von T-Zellen
können
zum Beispiel in den folgenden Dokumenten, Gorin (1986) und International
Atomic Energy Agency (1969) gefunden werden.
-
Andere
Verfahren der Kryokonservierung lebensfähiger Zellen oder Modifikationen
davon sind erhältlich
und für
die Verwendung in z.B. Kaltmetall-Spiegelverfahren vorgesehen. Vgl. Livesey
et al (1987); Linner et al (1986); vgl. auch U.S.-Patent Nr. 4,199,022
durch Senken et al, U.S.-Patent Nr. 3,753,357 von Schwartz und U.S.-Patent
Nr. 4,559,298 von Fahy.
-
Gefrorene
Zellen werden vorzugsweise schnell (z.B. in einem Wasserbad, das
bei 37–47°C gehalten wird)
aufgetaut und sofort nach dem Auftauen gekühlt. Es kann wünschenswert
sein, die Zellen zu behandeln, um das Klumpen von Zellen bei Auftauen
zu verhindern. Um Klumpen zu verhindern, können verschiedene Verfahren
verwendet werden, einschließlich,
jedoch nicht beschränkt
auf Zusetzen von DNAse vor oder nach dem Einfrieren (Spitzer et
al, 1980), Dextran von niedrigem Molekulargewicht und Citrat, Citrat,
Hydroxyethylstärke
(Stift et al, 1983) oder saurer Citrat-Dextrose (Zaroulis et al,
1980), etc.
-
Das
Gefrierschutzmittel sollte, wenn es für Menschen toxisch ist, vor
der therapeutischen Verwendung der aufgetauten T-Zellen entfernt
werden. Ein Weg, auf dem das Gefrierschutzmittel entfernt werden
kann, ist durch Verdünnung
auf unbedeutende Konzentration.
-
Sind
gefrorene T-Zellen einmal aufgetaut und gewonnen, werden sie wie
hierin in Bezug auf nicht-gefrorene T-Zellen beschrieben, verwendet,
um eine neuronale Regeneration zu fördern. Einmal aufgetaut können die
T-Zellen sofort verwendet werden, wenn man annimmt, dass sie vor
dem Einfrieren aktiviert wurden. Vorzugsweise werden die aufgetauten
Zellen jedoch vor Injektion in den Patienten gezüchtet, um nicht-lebensfähige Zellen
auszuschließen.
Des Weiteren kann im Verlauf dieser Züchtung über einen Zeitraum von etwa einem
bis drei Tagen ein geeignetes Aktivierungsmittel zugesetzt werden,
um die Zellen zu aktivieren, wenn die gefrorenen Zellen ruhende
Zellen waren, oder um den Zellen dabei zu helfen, eine höhere Aktivierungsrate zu
erreichen, wenn sie vor dem Einfrieren aktiviert waren. Üblicherweise
ist Zeit zur Verfügung,
um einen solchen Züchtungsschritt
vor der Verabreichung in Form eines Medikaments zu erlauben, da
die T-Zellen bis zu einer Woche nach der Verletzung und wahrscheinlich
länger
verabreicht werden können,
und immer noch ihre neuroregenerative und neuroprotektive Wirkung
behalten.
-
(2) Cop 1 und Cop 1-verwandte
Peptide und Polypeptide
-
Arzneimittel,
die Cop 1 oder ein Cop 1-verwandtes Peptid- oder Polypeptid-Antigen oder ein
Derivat davon umfassen, können
für die
Verhinderung oder Hemmung der Auswirkungen von Verletzung oder Krankheit,
die eine NS-Degeneration
ergeben, zur Förderung
der Nervenregeneration im NS, insbesondere im ZNS, zum Schutz der
ZNS-Zellen vor Glutamat-Toxizität
oder zur Behandlung von Verletzung oder Krankheiten, die durch Glutamat-Toxizität verursacht
oder verschlimmert wurden, verwendet werden. Zusätzlich können Cop 1 oder ein Cop 1-verwandtes Peptid-
oder Polypeptid-Antigen oder ein Derivat davon für die Aktivierung von T-Zellen
in vivo oder in vitro verwendet werden. In einer Ausführungsform
wird die Verwendung von Cop 1 oder einem Cop 1-verwandten Peptid-
oder Polypeptid-Antigen oder einem Derivat davon für die Herstellung
eines Medikaments zur Förderung
der Nervenregeneration, oder zur Verhinderung oder Hemmung der Auswirkungen
von ZNS- oder PNS-Verletzung oder -Krankheit in einem Säuger bereitgestellt,
worin das Cop 1- oder Cop 1-verwandte Peptid- oder Polypeptid-Antigen
oder das Derivat davon T-Zellen in vivo aktiviert, um eine T-Zellpopulation herzustellen,
die sich an einer Verletzungs- oder Krankheitsstelle des ZNS oder
PNS anhäuft.
In einer anderen Ausführungsform
wird Cop 1 oder ein Cop 1-verwandtes Peptid- oder Polypeptid-Antigen
oder ein Derivat davon für
die Herstellung eines Medikaments verwendet, das geeignet ist, zum
Schutz von ZNS-Zellen
vor Glutamat-Toxizität
oder zur Behandlung einer Verletzung oder Krankheit verabreicht
zu werden, die durch Glutamat-Toxizität verursacht oder verschlimmert
wird. Die Zusammensetzung, die in der vorliegenden Erfindung verwendet
wird, kann Cop 1 oder ein Cop 1-verwandtes Peptid oder Polypeptid
sein. Für den
Zweck der vorliegenden Erfindung soll „Cop 1 oder ein Cop 1-verwandtes
Peptid oder Polypeptid" jedes Peptid
oder Polypeptid einschließlich
eines Zufalls-Copolymers umfassen, das funktionell mit basischem
Myelinprotein (MBP) kreuzreagiert, und das in der Lage ist, mit
MBP auf dem MHC Klasse II-Molekül
in der Antigen-Präsentation
zu konkurrieren.
-
Die
Zusammensetzung kann Zufalls-Copolymere umfassen, die eine geeignete
Quantität
einer Aminosäure
mit positiver elektrischer Ladung, wie Lysin oder Arginin, zusammen
mit einer Aminosäure
mit einer negativen elektrischen Ladung (vorzugsweise in geringerer
Menge), wie Glutaminsäure
oder Asparaginsäure, optional
in Kombination mit einer elektrisch neutralen Aminosäure wie
Alanin oder Glycin, die als Auffüller
dienen, und optional mit einer Aminosäure, die so adaptiert ist,
dass sie immunogene Eigenschaften auf das Copolymer überträgt, wie
zum Beispiel eine aromatische Aminosäure wie Tyrosin oder Tryptophan
einschließen. Solche
Zusammensetzungen können
alle umfassen, die in WO 005250 offenbart sind.
-
Genauer,
die Zusammensetzung zur Verwendung in der vorliegenden Zusammensetzung
umfasst mindestens ein Copolymer, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend
aus Zufallscopolymeren, die eine Aminosäure umfassen, ausgewählt aus
jeder von mindestens dreien der folgenden Gruppen:
- (a) Lysin und Arginin;
- (b) Glutaminsäure
und Asparaginsäure;
- (c) Alanin und Glycin;
- (d) Tyrosin und Trypthophan.
-
Die
Copolymere zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung zur Herstellung
eines Medikaments können
aus L- oder D-Aminosäuren
oder Gemischen davon zusammengesetzt sein. Wie dem Fachmann bekannt
ist, kommen L-Aminosäuren in
den meisten natürlichen
Proteinen vor. D-Aminosäuren
sind jedoch im Handel erhältlich
und können
mit einigen oder allen Aminosäuren
substituiert werden, die verwendet werden, um die Terpolymere und
andere Copolymere der vorliegenden Erfindung herzustellen. Die vorliegende
Erfindung zieht Copolymere in Betracht, die sowohl D- als auch L-Aminosäuren enthalten,
sowie Copolymere, die im Wesentlichen entweder aus L- oder D-Aminosäuren bestehen.
-
In
einer Ausführungsform
der Erfindung enthält
das Copolymer vier verschiedene Aminosäuren, jede von einer unterschiedlichen
der Gruppen (a) bis (d). Ein bevorzugtes Copolymer gemäß dieser
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung umfasst in Kombination Alanin, Glutaminsäure, Lysin
und Tyrosin, mit einer positiven elektrischen Nettoladung und einem
Molekulargewicht von etwa 2.000 bis etwa 40.000 Dalton, vorzugsweise
von etwa 2.000 bis etwa 13.000 Dalton. Das am meisten bevorzugte
Beispiel ist Copolymer 1 (Cop 1) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht
von etwa 4.700 bis etwa 13.000 Dalton. Bevorzugte Molekulargewichts-Bereiche
und Verfahren zur Herstellung einer bevorzugten Form von Copolymer
1 sind im U.S.-Patent Nr. 5,800,808 beschrieben. Es ist deutlich,
dass dies nur als Beispiel gegeben ist und dass die Zusammensetzung
sowohl in Hinsicht auf die Bestandteile als auch auf die relativen
Anteile der Bestandteile variiert werden kann, wenn man sich an
die vorstehenden allgemeinen Kriterien hält. Somit kann das Copolymer
ein Polypeptid von etwa 15 bis etwa 100, vorzugsweise von etwa 40
bis 80 Aminosäuren
Länge sein.
-
In
einer anderen Ausführungsform
enthält
das Copolymer drei verschiedene Aminosäuren, jede von einer unterschiedlichen
von drei Gruppen aus den Gruppen (a) bis (d). Diese Copolymere werden
hierin als Terpolymere bezeichnet.
-
In
einer Ausführungsform
enthalten die Terpolymere zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung Tyrosin,
Alanin und Lysin, im Folgenden als YAK bezeichnet. Die durchschnittliche
molare Fraktion der Aminosäuren
in diesen Terpolymeren kann variieren. Zum Beispiel kann Tyrosin
in einer molaren Fraktion von etwa 0,005 bis etwa 0,250 vorliegen;
Alanin kann in einer molaren Fraktion von etwa 0,3 bis etwa 0,6
vorliegen; und Lysin kann in einer molaren Fraktion von etwa 0,1
bis etwa 0,5 vorliegen. Das durchschnittliche Molekulargewicht liegt
zwischen 2.000 und etwa 40.000 Dalton und vorzugsweise zwischen
etwa 3.000 bis etwa 35.000 Dalton. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform
liegt das durchschnittliche Molekulargewicht bei etwa 5.000 bis
etwa 25.000 Dalton. Es ist möglich,
Arginin für
Lysin, Glycin für
Alanin und/oder Tryptophan für
Tyrosin zu ersetzen.
-
In
einer anderen Ausführungsform
enthalten die Terpolymere zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung
Tyrosin, Glutaminsäure
und Lysin, im Folgenden bezeichnet als YEK. Die durchschnittliche
molare Fraktion der Aminosäuren
in diesen Terpolymeren kann variieren: Glutaminsäure kann in einer molaren Fraktion
von etwa 0,005 bis etwa 0,300 vorliegen, Tyrosin kann in einer molaren
Fraktion von etwa 0,005 bis etwa 0,250 vorliegen, und Lysin kann
in einer molaren Fraktion von etwa 0,3 bis etwa 0,7 vorliegen. Das
durchschnittliche Molekulargewicht liegt zwischen 2.000 und etwa
40.000 Dalton und bevorzugt zwischen etwa 3.000 und etwa 35.000
Dalton. In einer stärker
bevorzugten Ausführungsform
liegt das durchschnittliche Molekulargewicht bei etwa 5.000 bis
etwa 25.000 Dalton. Es ist möglich,
Asparaginsäure
für Glutaminsäure, Arginin
für Lysin
und/oder Tryptophan für
Tyrosin zu ersetzen.
-
In
einer anderen Ausführungsform
enthalten die Terpolymere zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung
Lysin, Glutaminsäure
und Alanin, im Folgenden bezeichnet als KEA. Die durchschnittliche
molare Fraktion der Aminosäuren
in diesen Polypeptiden kann ebenfalls variieren: Zum Beispiel kann
Glutaminsäure in
einer molaren Fraktion von etwa 0,005 bis etwa 0,300 vorliegen,
Alanin kann in einer molaren Fraktion von etwa 0,005 bis etwa 0,600
vorliegen, Lysin kann in einer molaren Fraktion von etwa 0,2 bis
etwa 0,7 vorliegen. Das durchschnittliche Molekulargewicht liegt
zwischen 2.000 und 40.000 Dalton und bevorzugt zwischen etwa 3.000
und 35.000 Dalton. In einer stärker
bevorzugten Ausführungsform
liegt das durchschnittliche Molekulargewicht bei etwa 5.000 bis
etwa 25.000 Dalton. Es ist möglich,
Asparaginsäure
für Glutaminsäure, Glycin
für Alanin
und/oder Arginin für
Lysin zu ersetzen.
-
In
einer anderen Ausführungsform
enthalten die Terpolymere zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung
Tyrosin, Glutaminsäure
und Alanin, im Folgenden bezeichnet als YEA. Die durchschnittliche
molare Fraktion der Aminosäuren
in diesen Polypeptiden kann variieren. Zum Beispiel kann Tyrosin
in einer molaren Fraktion von etwa 0,005 bis etwa 0,250 vorliegen,
Glutaminsäure
kann in einer molaren Fraktion von etwa 0,005 bis etwa 0,300 vorliegen,
und Alanin kann in einer molaren Fraktion von etwa 0,005 bis etwa
0,800 vorliegen. Das durchschnittliche Molekulargewicht liegt zwischen
2.000 und etwa 40.000 Dalton und bevorzugt zwischen etwa 3.000 und
etwa 35.000 Dalton. In einer stärker
bevorzugten Ausführungsform
liegt das durchschnittliche Molekulargewicht bei etwa 5.000 bis
etwa 25.000 Dalton. Es ist möglich,
Tryptophan für
Tyrosin, Asparaginsäure
für Glutaminsäure und/oder
Glycin für
Alanin zu ersetzen.
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In
einer stärker
bevorzugten Ausführungsform
ist die molare Fraktion der Aminosäuren der Terpolymere etwa so,
wie sie für
Copolymer 1 bevorzugt ist. Die molare Fraktion der Aminosäuren in
Copolymer 1 ist etwa 0,14 Glutaminsäure, etwa 0,43 Alanin, etwa
0,10 Tyrosin und etwa 0,34 Lysin. Das am meisten bevorzugte durchschnittliche
Molekulargewicht für
Copolymer 1 liegt zwischen etwa 5.000 und etwa 9.000 Dalton. Es
wird erwartet, dass die Aktivität
von Copolymer 1 für
die hierin offenbarten Verwendungsmöglichkeiten bestehen bleibt,
wenn eine oder mehrere der folgenden Substitutionen gemacht werden:
Asparaginsäure
für Glutaminsäure, Glycin
für Alanin,
Arginin für
Lysin und Tryptophan für
Tyrosin.
-
Die
molaren Verhältnisse
der Monomere des stärker
bevorzugten Terpolymers von Glutaminsäure, Alanin und Tyrosin, oder
YEA ist etwa 0,21 bis etwa 0,65 bis etwa 0,14.
-
Die
molaren Verhältnisse
der Monomere des stärker
bevorzugten Terpolymers von Glutaminsäure, Alanin und Lysin, oder
KEA ist etwa 0,15 bis etwa 0,48 bis etwa 0, 36.
-
Die
molaren Verhältnisse
der Monomere des stärker
bevorzugten Terpolymers von Glutaminsäure, Tyrosin und Lysin, oder
YEK ist etwa 0,26 bis etwa 0,16 bis etwa 0,58.
-
Die
molaren Verhältnisse
der Monomere des stärker
bevorzugten Terpolymers von Tyrosin, Alanin und Lysin, oder YAK
ist etwa 0,10 bis etwa 0,54 bis etwa 0,35.
-
Die
Terpolymere können
durch jedes Verfahren, das für
den Fachmann erhältlich
ist, hergestellt werden. Zum Beispiel können die Terpolymere unter
Kondensationsbedingungen unter Verwendung des gewünschten
molaren Verhältnisses
von Aminosäuren
in Lösung,
oder durch synthetische Festphasen-Verfahren hergestellt werden. Kondensationsbedingungen
umfassen die richtige Temperatur, pH-Wert und Lösungsmittelbedingungen zur
Kondensation der Carboxylgruppe einer Aminosäure mit der Aminogruppe einer
anderen Aminosäure,
um eine Peptidbindung zu erzeugen. Kondensationsmittel, zum Beispiel
Dicyclohexylcarbodiimid, können
verwendet werden, um die Bildung der Peptidbindung zu erleichtern.
Gruppen können
verwendet werden, um funktionelle Gruppen, wie die Seitenkettenreste
und einige der Amino- oder Carboxylgruppen gegen unerwünschte Nebenreaktionen
zu schützen.
-
Zum
Beispiel kann das Verfahren, offenbart im U.S.-Patent 3,849,650,
in dem die N-Carboxyanhydride von Tyrosin, Alanin, y-Benzylglutamat
und N-ε-Trifluoracetyl-lysin
bei Umgebungstemperatur in wasserfreiem Dioxan mit Diethylamin als
Initiator, polymerisiert werden, verwendet werden. Die γ-Carboxylgruppe der
Glutaminsäure
kann durch Bromwasserstoffsäure
in Eisessig von Schutzgruppen befreit werden. Die Trifluoracetylgruppen
werden durch 1 molares Piperidin von Lysin entfernt. Der Fachmann
versteht, dass das Verfahren angepasst werden kann, um Peptide und
Polypeptide herzustellen, die die erwünschten Aminosäuren enthalten,
das heißt,
drei der vier Aminosäuren
in Copolymer 1, durch selektive Entfernung der Reaktionen, die mit irgendeinem
von Glutaminsäure,
Alanin, Tyrosin oder Lysin in Verbindung stehen. Zum Zweck dieser
Anwendung bedeuten die Begriffe „Umgebungstemperatur" und „Raumtemperatur" eine Temperatur
im Bereich von etwa 20 bis etwa 26°C.
-
Das
Molekulargewicht der Terpolymere kann während der Polypeptidsynthese
oder nach Herstellung der Terpolymere angepasst werden. Um das Molekulargewicht
während
der Polypeptidsynthese anzupassen, werden die synthetischen Bedingungen
oder die Mengen an Aminosäuren
so angepasst, dass die Synthese stoppt, wenn das Polypeptid die
ungefähre
Länge,
die erwünscht
ist, erreicht. Nach der Synthese können Polypeptide mit dem erwünschten
Molekulargewicht durch jedes verfügbare Größenselektionsverfahren, wie
die Chromatographie der Polypeptide auf einer nach Molekulargewicht
trennenden Säule
oder einem Gel und Auffangen der erwünschten Molekulargewichtsbereiche
erhalten werden. Die vorliegenden Polypeptide können ebenfalls teilweise hydrolysiert
werden, um Spezies mit hohem Molekulargewicht zu entfernen, zum
Beispiel durch saure oder enzymatische Hydrolyse, und dann gereinigt
werden, um die Säure
oder die Enzyme.
-
In
einer Ausführungsform
können
die Terpolymere mit einem erwünschten
Molekulargewicht durch ein Verfahren hergestellt werden, das die
Reaktion eines geschützten
Polypeptids mit Bromwasserstoffsäure
einschließt,
so dass ein Trifluroacetyl-Polypeptid mit dem gewünschten
Molekulargewichtsprofil gebildet wird. Die Reaktion wird für einige
Zeit und bei einer Temperatur durchgeführt, die durch eine oder mehrere
Testreaktionen vorherbestimmt ist. Während der Testreaktion werden
Zeit und Temperatur variiert und der Molekulargewichtsbereich eines
bestimmten Satzes der Test-Polypeptide wird bestimmt. Die Testbedingungen,
die den optimalen Molekulargewichtsbereich für diesen Ansatz an Polypeptiden
zur Verfügung
stellen, werden für
den Ansatz verwendet. Somit kann ein Trifluoracetyl-Polypeptid, das das
erwünschte
Molekulargewichtsprofil hat, durch ein Verfahren, das die Reaktion
des geschützten
Polypeptids mit Bromwasserstoffsäure über einen
Zeitraum und eine Temperatur, die durch Testreaktion vorherbestimmt
sind, einschließt,
hergestellt werden. Das Trifluoracetyl-Polypeptid mit dem erwünschten
Molekulargewichtsprofil wird dann weiter mit einer wässrigen Piperidinlösung behandelt,
so dass ein Polypeptid mit niedriger Toxizität, das das gewünschte Molekulargewicht
hat gebildet wird.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird eine Testprobe von geschütztem
Polypeptid aus einem bestimmten Ansatz über etwa 10–50 Stunden bei einer Temperatur
von etwa 20–28°C mit Bromwasserstoffsäure ungesetzt.
Die besten Bedingungen für
diesen Ansatz werden durch einen Durchlauf von mehreren Testreaktionen
bestimmt. In einer Ausführungsform
wird das geschützte
Polypeptid zum Beispiel über
etwa 17 Stunden bei einer Temperatur von etwa 26°C mit Bromwasserstoffsäure ungesetzt.
-
Da
Bindungsmotive von Cop 1 an MS-assoziierte HLA-DR-Moleküle bekannt
sind (Fridkis-Hareli et al, 1999b), können Polypeptide mit festgesetzter
Sequenz gut hergestellt und auf die Bindung an die Bindungstasche
der NLA-DR-Moleküle
getestet werden, wie in der Veröffentlichung
von Fridkis-Hareli et al (1999b) beschrieben. Beispiele für solche
Peptide sind die, die in WO 005249 beschrieben werden. 32 der Peptide,
die in der Anmeldung spezifisch offenbart sind, werden in der hier
folgenden Tabelle 1 dargestellt. Es ist zu erwarten, dass solche
Peptide und andere, ähnliche
Peptide eine ähnliche
Aktivität
wie Cop 1 haben. Dies kann jedoch leicht durch Testen ihrer Fähigkeit
zur Aktivierung von T-Zellen gemäß der vorliegenden
Erfindung bestimmt werden. Dies alles kann ohne unzumutbare Versuche
durchgeführt
werden. Es wird ebenfalls in Betracht gezogen, dass solche Peptide
und andere ähnliche
Peptide innerhalb der Definition von Cop 1-verwandten Peptiden oder
Polypeptiden sind und dass ihre Verwendung als Teil der vorliegenden
Erfindung betrachtet wird.
-
-
Das
bevorzugte Copolymer zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung
ist Copolymer 1, hierin auch als Cop 1 bezeichnet. Copolymer 1 wurde
in mehreren Ländern
unter dem Markennamen COPAXONE®, Glatiramer-Acetat, zur
Behandlung von Multipler Sklerose (MS) zugelassen. COPAXONE® ist
eine Marke von Teva Pharmaceuticals Ltd., Petah Tikva, Israel. Mehrere
klinische Studien zeigten, das Copolymer 1 mit nur geringfügigen Nebenwirkungen,
meist leichten Reaktionen an der Injektionsstelle, gut toleriert
wird (Johnson et al, 1995).
-
(3) Therapeutische Verwendungsmöglichkeiten
-
Die
in den Abschnitten (1) bis (2) beschriebenen Zusammensetzungen können verwendet
werden für die
Herstellung eines Medikaments zur Förderung der Nervenregeneration
oder die Verhinderung oder Hemmung von sekundärer Degeneration, die andernfalls
nach primärer
NS-Verletzung, z.B. geschlossenen Kopfverletzungen und stumpfem
Trauma, wie jenen, die durch die Teilnahme an gefährlichen
Sportarten verursacht werden, eindringendes Trauma, wie Schussverletzungen,
hämorrhagischem
Schlaganfall, ischämischem Schlaganfall,
Glaukom, cerebraler Ischämie
oder Verletzungen, die durch chirurgische Eingriffe wie der Tumorentfernung
verursacht werden, verwendet werden. Zusätzlich können solche Zusammensetzungen
für die Herstellung
eines Medikaments zur Verbesserung der Auswirkungen von Krankheiten
verwendet werden, die in einen degenerativen Prozess münden, z.B.
eine Degeneration, die entweder in der grauen oder in der weißen Substanz
(oder beiden) als eine Folge verschiedener Krankheiten oder Störungen,
einschließlich
ohne Einschränkung:
diabetischer Neuropathie, seniler Demenz, Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit,
Gesichtsnerven (Bells)-Lähmung, Glaukom,
Chorea Huntington, amyotropher Lateralersklerose (ALS), Status epilepticus,
nicht-arterieller optischer Neuropathie, invertebralem Bandscheibenvorfall,
Vitaminmangel, Prionenkrankheiten wie der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit, Carpaltunnel-Syndrom,
peripheren Neuropathien, die mit verschiedenen Krankheiten assoziiert
sind, einschließlich,
jedoch nicht beschränkt
auf Urämie,
Porphyrie, Hypoglykämie,
Sjorgen Larsson-Syndrom, akuter sensorischer Neuropathie, chronischer
ataxischer Neuropathie, biliärer
Zirrhose, primärer
Amyloidose, obstruktiven Lungenkrankheiten, Acromegalie, Malabsorptions-Syndromen, Polycythemia
vera, IgA- und IgG-Gammapathien, Komplikationen verschiedener Wirkstoffe (z.B.
Metronidazol) und Toxinen (z.B. Alkohol oder Organosphosphaten),
Charcot-Marie-Tooth-Krankheit, Ataxia telangectasia, Friedreichs
Ataxie, amyloiden Polyneuropathien, Adrenomyeloneuropathie, axonaler Riesen-Neuropathie,
Refsum-Krankheit, Fabry-Krankheit, Lipoproteinämie, etc.. In Anbetracht der
Ergebnisse hinsichtlich der vor Glutamat-schützenden Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung umfassen andere klinische Zustände, die
gemäß der vorliegenden
Erfindung behandelt werden können,
Epilepsie, Amnesie, Angst, Hyperalgesie, Psychose, Anfälle, abnormal
erhöhten
intraokularen Druck, oxidativer Stress und Opiat-Toleranz und -abhängigkeit.
Zusätzlich
kann die vor Glutamat-schützende
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung, d.h. die Behandlung einer Verletzung
oder einer Krankheit, die durch Glutamat-Toxizität verursacht oder verschlimmert
wird, wie die Entfernung eines Tumors vom ZNS und anderen Formen
chirurgischer Eingriffe am ZNS, post-operative Behandlungen umfassen.
Im Hinblick auf die Tatsache, dass herausgefunden wurde, dass Cop
1-Immunisierung überraschenderweise
beim Schutz gegen Glutamat-Toxizität nützlich ist, wird erwartet,
dass die Verwendung von Cop 1 für
die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung, oder die Behandlung
mit Cop1-verwandten T-Zellen gemäß der vorliegenden
Erfindung bei der Behandlung der vorstehend aufgelisteten Zustände wirksam
sein wird, nicht nur in der späten
Phase, wenn Myelin beeinträchtigt wird,
sondern auch in den frühen
Stadien, in denen die Neuronen durch Faktoren angegriffen werden,
die einen Anstieg der Glutamatwerte auf toxische Werte verursachen.
Somit ist die vorliegende Erfindung für jede Indikation, d.h. chronische
oder akute Neurodegeneration, die durch einen Anstieg der Glutamatwerte
verursacht oder verschlimmert wird, einschließlich der frühen Stadien
von ischämischem
Schlaganfall, Alzheimer-Krankheit, etc. nützlich. Des Weiteren führt dieser
Schutz vor Glutamat-Toxizität
dazu, dass die Rolle von Cop 1 nicht auf ihre Kreuzreaktivität mit Myelin
beschränkt
ist. Es muss auch eine regulatorische Aktivität haben, wie zum Beispiel durch
die Erzeugung regulatorischer Zellen oder regulatorischer Stoffe.
Im Hinblick auf diese regulatorische Aktivität wird erwartet, dass Cop 1-Impfung
und Cop 1-spezifische aktivierte T-Zellen ebenfalls die weiße Substanz
und die graue Substanz vor Schaden schützt, der durch oxidativen Stress
und andere Schadensquellen an Nervenzellen verursacht wird. Zusätzlich kann
die vorliegende Erfindung auf Grund dieser regulatorischen Aktivität ebenfalls
verwendet werden, um Nervenzellen nicht nur vor Multipler Sklerose,
wie auf dem Stand der Technik vorgeschlagen wurde, sondern auch
vor anderen Autoimmunkrankheiten als Multipler Sklerose zu schützen. In
einer bevorzugten Ausführungsform
werden die aktivierten T-Zellen oder die Immunisierungszusammensetzung,
umfassend Cop 1 oder ein Cop 1-verwandtes Peptid oder Polypeptid
der vorliegenden Erfindung verwendet, um Krankheiten oder Störungen zu
behandeln, bei denen die Förderung
der Nervenregeneration oder die Verhinderung oder Hemmung von sekundärer neuraler
Degeneration angezeigt ist, jedoch ausschließlich Multipler Sklerose und
Neoplasien. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Zusammensetzungen
der vorliegenden Erfindung dafür
geeignet, an ein menschliches Individuum verabreicht zu werden.
Wie im Vorstehenden offenbart, wurde Cop 1 als ein Mittel zur Erhaltung
der Suppression oder Deaktivierung der autoimmunen T-Zellreaktivität auf Myelinantigene
bei Multiple Sklerose-Patienten verwendet. Zu diesem Zweck wurde
Cop 1 ohne Adjuvans durch tägliche
subkutane Injektion verabreicht. Der Stand der Technik offenbart
auch die Verabreichung von Cop 1 auf oralem Weg an Multiple Sklerose-Patienten,
was auch darauf abzielt, die Suppression der autoimmunen T-Zellreaktion
auf Myelin-Antigene zu induzieren. Es ist zu bemerken, dass diese
Verwendungen von Cop 1 sich auf dem Fachgebiet zur Behandlung von
Multipler Sklerose fundamental von der Verwendung von Cop 1 zur
Neuroprotektion unterscheiden, was das Thema der vorliegenden Erfindung
ist. Zuerst, wie in WO99/60021 aus dem Labor der vorliegenden Erfinder
gezeigt, wird die Neuroprotektion durch die Aktivierung von Autoimmunzellen
vermittelt, die spezifisch auf Myelin-Antigene gerichtet sind. Daher
ist es höchst überraschend,
dass Cop 1, ein Mittel, das zur Suppression der T-Zell-Autoimmunität hergestellt
ist, eine Wirkung haben soll, die die Aktivierung spezifischer Anti-Myelin-T-Zell-Autoimmunität benötigt. Zweitens
basiert die Verwendung von Cop 1 zur Neuroprotektion gemäß der vorliegenden
Erfindung auf der Verabreichung von anti-Cop 1-T-Zellen, was nicht
der Weg ist, wie Cop 1 zur Behandlung von Multipler Sklerose verwendet
wird. Drittens zieht die vorliegende Erfindung in einer bevorzugten
Ausführungsform
die Verwendung von Cop 1 für
die Herstellung eines Medikaments in Betracht, das geeignet ist,
in Adjuvantien, wie unvollständigem
Freundschem Adjuvans oder komplettem Freundschen Adjuvans verabreicht
zu werden, und das eine Art einer Cop 1-Herstellung ist, die zuvor
nicht für
die Behandlung von Multipler Sklerose oder einen anderen therapeutischen
Zweck verwendet wurde. Während
die vorliegende Erfindung die orale Verabreichung des beschriebenen
Medikaments, das Cop 1 zur Neuroprotektion umfasst, in Betracht
zieht, folgt dies immer einer primären Aktivierung mit Cop 1,
vorzugsweise in einem Adjuvans. Somit kann orales Cop 1 verwendet
werden, um die Aktivität
der T-Zellen nach der primären
Aktivierung mit Cop 1 zu verstärken.
Entsprechend sind die Zusammensetzung und ihre Wirkungsweise und
Neuroprotektion sowohl praktisch als auch konzeptuell neu. Für den Durchschnittsfachmann,
der mit der Verwendung von Cop 1 bei der Suppression oder Deaktivierung
der T-Zellreaktivität
auf Myelin-Antigenen vertraut ist, wäre es nicht offensichtlich,
Cop 1 auf eine Weise, die speziell dafür angelegt ist, T-Zellen, zu
aktivieren, die spezifisch auf Myelin-Antigene gerichtet sind, auf
Grund ihrer heilsamen Wirkung bei der Neuroprotektion, einschließlich der Verbesserung
des degenerativen Prozesses, der durch Atuoimmunkrankheiten verursacht
wird, zu verwenden. Cop 1-aktivierte T-Zellen können ebenfalls für die Herstellung
eines Medikaments zur Verbesserung der degenerativen Wirkung verursacht
durch Neoplasmen ohne Verwendung von Immuntheraphieverfahren verwendet
werden. T-Zellen,
die mit Cop 1 aktiviert werden, werden sich an der Stelle der neuralen
Degeneration anreichern und die Hemmung dieser Degeneration erleichtern.
-
(4) Formulierungen und
Verabreichung
-
Arzneimittel
zur Verwendung gemäß der vorliegenden
Erfindung können
auf herkömmliche
Weise unter Verwendung eines oder mehrerer physiologisch verträglicher
Träger
oder Exzipienten formuliert werden. Der/die Träger muss/müssen „verträglich" in dem Sinne sein, dass sie mit den
anderen Bestandteilen der Zusammensetzung kompatibel sind und für ihren
Empfänger
nicht schädlich
sind. Die folgende beispielhafte Darstellung von Trägern, Verabreichungsweisen,
Dosierungsformen etc., werden als bekannte Möglichkeiten aufgelistet, von
denen die Träger,
Verabreichungsweisen, Dosierungsformen etc., zur Verwendung mit
der vorliegenden Erfindung ausgewählt werden können. Der
Durchschnittsfachmann wird jedoch verstehen, dass jede ausgewählte gegebene
Formulierung und Verabreichungsweise zuerst getestet werden sollte,
um festzustellen, dass es die gewünschten Ergebnisse erzielt.
Somit muss zum Beispiel die bestimmte Formulierung und Verabreichungsweise,
wenn das aktive Prinzip Cop 1 oder ein Cop 1-verwandtes Peptid oder
Polypeptid ist, gewährleisten,
dass das aktive Prinzip als Impfstoff wirkt, um die dagegen aktivierten
T-Zellen in vivo anzuheben. Wird eine derartige Immunantwort nicht
erreicht, dann sollte diese bestimmte Formulierung und Verabreichungsweise
nicht gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden.
-
Ähnlich sollten,
wenn das aktive Prinzip aktivierte T-Zellen sind, die bestimmte
Formulierung und Verabreichungsweise getestet werden, um sicherzustellen,
dass die aktiven T-Zellen, die verabreicht werden, den Blutstrom
in aktivem Zustand erreichen, so dass sie gemäß der vorliegenden Erfindung
zur Stelle der Verletzung im ZNS kommen können.
-
Der
Begriff „Träger" betrifft ein Verdünnungsmittel,
Adjuvans, einen Excipienten oder ein Vehikel, mit dem das Therapeutikum
verabreicht wird. Die Träger
in der vorliegenden Zusammensetzung können ein Bindemittel, wie mikrokristalline
Cellulose, Polyvinylpyrrolidon (Polyvidon oder Povidon), Gummi-Tragant, Gelatine,
Stärke,
Lactose oder Lactose-Monohydrat; ein Desintegrationsmittel, wie
Alginsäure,
Maisstärke
und Ähnliches;
ein Schmier- oder Oberflächenmittel
wie Magnesiumstearat, oder Natriumlaurylsulfat; ein Gleitmittel
wie kolloidales Silikondioxid, ein Süßmittel wie Saccharose oder
Saccharin; und/oder ein Geschmacksmittel wie Pfefferminz, Methyl-Salicylat,
oder Orangengeschmack umfassen.
-
Verabreichungsverfahren
umfassen parenterale, z.B. intravenöse, intraperitoneale, intramuskuläre, subkutane,
mucose (z.B. orale, intranasale, buccale, vaginale, rektale, intraokulare),
intrathekale, topische und intradermale Wege. Die Verabreichung
kann systemisch oder lokal sein.
-
Für die orale
Verabreichung kann die pharmazeutische Herstellung in flüssiger Form,
zum Beispiel Lösungen,
Sirups oder Suspensionen sein oder sie kann als Wirkstoffprodukt
zur Wiederherstellung vor der Verwendung mit Wasser oder anderen
geeigneten Vehikeln präsentiert
werden. Solche flüssigen
Herstellungen können
durch herkömmliche
Methoden mit pharmazeutisch verträglichen Additiven wie Suspensionsmitteln (z.B.
Sorbitsirup, Cellulose-Derivate oder hydrierte essbare Fette); Emulgatoren
(z.B. Lecithin oder Gummi arabicum); nicht-wässrigen Vehikeln (z.B. Mandelöl, Ölestern
oder fraktionierten Pflanzenölen);
und Konsevierungsmitteln (z.B. Methyl- oder Propyl-p-hydroxybenzoaten
oder Sorbinsäure)
hergestellt werden. Die Arzneimittel können zum Beispiel in Form von
Tabletten oder Kapseln sein, hergestellt durch herkömmliche
Verfahren mit pharmazeutisch verträglichen Excipienten wie Bindemitteln
(z.B. vorgelatinisierter Maisstärke,
Polyvinylpyrrolidon oder Hydroxypropylmethylcellulose); Füllmitteln
(z.B. Lactose, microkristalliner Cellulose oder Calciumhydrogenphosphat);
Schmiermitteln (z.B. Magnesiumstearat, Talk oder Kieselerde); Disintegrationsmitteln
(z.B. Kartoffelstärke
oder Natriumstärkeglycolat);
oder Befeuchtungsmitteln (z.B. Natrium-laurylsulfat). Die Tabletten
können
durch Verfahren beschichtet sein, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt
sind.
-
Herstellungen
zur oralen Verabreichung können
passend formuliert sein, so dass sie eine kontrollierte Freisetzung
der aktiven Verbindung gewährleisten.
-
Für die buccale
Verabreichung können
die Zusammensetzungen die Form von Tabletten oder Pastillen annehmen,
die auf herkömmliche
Weise hergestellt sind.
-
Die
Zusammensetzungen können
für die
parenterale Verabreichung durch Injektion, z.B. durch Bolus-Injektion
oder kontinuierliche Infusion formuliert sein. Formulierungen für die Injektion
können
in Einheits-Dosierungsform, z.B. in Ampullen oder in Behältern mit
mehreren Dosen mit zugesetztem Konservierungsmittel präsentiert
werden. Die Zusammensetzungen können
Formen wie Suspensionen, Lösungen
oder Emulsionen in öligen
oder wässrigen
Vehikeln annehmen und können
Formulierungsmittel wie Suspensions- Stabilisations- und/oder Dispersionsmittel
enthalten. Alternativ kann der aktive Bestandteil vor der Verwendung in
Pulverform für
die Verarbeitung mit einem geeignete Vehikel, z.B. sterilem pyrogenfreiem
Wasser vorliegen.
-
Die
Zusammensetzungen können
auch in rektalen Zusammensetzungen wie Zäpfchen oder Retentions-Enemata,
die zum Beispiel herkömmliche
Zäpfchen-Grundstoffe wie Kakaobutter
oder andere Glyceride enthalten, formuliert werden.
-
Für die Verabreichung
durch Inhalation werden die Zusammensetzungen zur Verwendung gemäß der vorliegenden
Erfindung normalerweise in Form einer Aerosolspray-Präsentation
aus unter Druck stehenden Packungen oder einem Zerstäuber, unter
Verwendung eines geeigneten Treibgases, z.B. Dichlordifluormethan,
Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder einem
anderen geeigneten Gas zur Verfügung
gestellt. Im Fall eines Aerosols mit Druckausgleich kann die Dosierungseinheit
durch Bereitstellen eines Ventils zur Abgabe einer gemessenen Menge
bestimmt werden. Kapseln und Kartuschen z.B. mit Gelatine, zur Verwendung
in einem Inhalationsgerät
oder Ballon, können
so formuliert werden, dass sie ein Pulvergemisch der Verbindung
und eine geeignete Pulver-Grundlage wie Lactose oder Stärke enthalten.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
sind Zusammensetzungen, die Cop 1-aktivierte T-Zellen, eine Cop 1- oder
ein Cop 1-verwandtes Peptid oder Polypeptid umfassen, gemäß Routineverfahren
als Arzneimittel, die für
die intravenöse Verabreichung
an Menschen adaptiert sind, formuliert. Typischerweise sind Zusammensetzungen
für die
intravenöse
Verabreichung Lösungen
in sterilem isotonischem wässrigem
Puffer. Dort wo nötig,
kann die Zusammensetzung auch ein Lösungsmittel und ein lokales
Anästhetikum
wie Lignocain umfassen, um den Schmerz an der Injektionsstelle zu
lindern. Im Allgemeinen werden die Bestandteile entweder getrennt
oder miteinander vermischt angewendet. Dort wo die Zusammensetzung
durch Infusion verabreicht werden soll, kann sie in einer Infusionsflasche,
die steriles Wasser von pharmazeutischem Grad oder Kochsalzlösung enthält, dispensiert
werden. Dort wo die Zusammensetzung durch Injektion verabreicht
wird, kann eine Ampulle sterilen Wassers oder Kochsalzlösung enthält für die Injektion
bereitgestellt werden, so dass die Bestandteile vor der Verabreichung
vermischt werden können.
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Pharmazeutische
Zusammensetzungen, die Cop 1 oder Cop 1 verwandtes Peptid oder Polypeptid
enthalten, können
optional mit einem Adjuvans auf die für Immunisierungen übliche Weise
verabreicht werden. Nicht-beschränkende
Beispiele für
solche Adjuvantien umfassen Alaun und unvollständiges Freundsches Adjuvans.
Andere Arten, die Immunogenität
des verabreichten Peptids oder Polypeptids zu verbessern, umfassen
die Verabreichung in Form eines Aggregats oder Komplexes mit Albumin
oder mit anderen Trägern,
wie dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der Impfstoffe wohlbekannt
ist. Metabolisierbare Lipidemulsionen wie Intralipid oder Lipofundin
können
ebenfalls als Vehikel für
die Cop 1-Therapie auf die in WO 97/02016 offenbarte Weise verwendet
werden. Während
von diesen Materialien bekannt ist, dass sie eine Verschiebung des
Cytokins TH1 zu TH2 verursachen, gibt es keinen Grund zu der Annahme,
dass TH2-Cytokine für
den Zweck der vorliegenden Erfindung nicht verwendbar und vielleicht
sogar vorzuziehen sind.
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Wird
Cop 1 oral eingeführt,
kann es mit anderen Nahrungsmittelformen vermischt werden und in
fester, halbfester, suspendierter oder emulgierter Form aufgenommen
werden; und es kann mit pharmazeutisch verträglichen Trägern, einschließlich Wasser,
Suspensionsmitteln, Emulgatoren, Geschmacksverstärkern und Ähnlichen vermischt werden.
In einer Ausführungsform
ist die orale Zusammensetzung mit einem erst im Darm löslichen Überzug versehen.
Die Verwendung von erst im Darm löslichen Überzug ist auf dem Fachgebiet wohlbekannt.
Zum Beispiel lehrt Lehman (1971) darmlösliche Überzüge wie Eudragit S und Eudragit
L. Das Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2. Ausgabe, lehrt ebenfalls
die Anwendung von Eudragit S und Eudragit L. Ein Eudragit, das in
der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist L30D55.
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Cop
1 kann in einigen der vorstehend erwähnten Formen ebenfalls nasal
durch Inhalation oder Nasentropfen verabreicht werden. Des Weiteren
kann die orale Inhalation verwendet werden, um Cop 1 zu den Schleimhautauskleidungen
der Luftröhre
und der Bronchialwege zu transportieren.
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Die
Erfindung beschreibt ebenfalls eine pharmazeutische Packung oder
einen pharmazeutischen Kit, die einen oder mehrere Behälter umfassen,
die mit einem oder mehreren der Bestandteile der Arzneimittel der Erfindung
gefüllt
sind.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird in Betracht gezogen, die Arzneimittel der Erfindung an einen
Säuger,
vorzugsweise einen Menschen, kurz nach Verletzung oder den Nachweis
einer degenerativen Läsion
im NS zu verabreichen. Die therapeutischen Verwendungsmöglichkeiten
der Erfindung können
die Verabreichung von Cop 1-aktivierten T-Zellen oder Cop 1 oder
Cop 1-verwandtem
Peptid oder Polypeptid oder eine Kombination davon umfassen. Verwendet
man eine Kombinationstherapie, so kann Cop 1 vor, gleichzeitig mit
oder nach Verabreichung von Cop 1-aktivierten T-Zellen verabreicht
werden.
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In
einer Verabreichungsform sind die Zusammensetzungen der Erfindung
geeignet, in Kombination mit einem oder mehreren der folgenden verabreicht
zu werden: (a) mononucleäre
Phagocyten, vorzugsweise gezüchtete
Monocyten (wie in PCT-Veröffentlichung
Nr. WO97/09985 beschrieben, die hierin unter Bezugnahme gänzlich eingeschlossen
ist), die stimuliert wurden, um ihre Fähigkeit zur Förderung
neuronaler Regeneration zu fördern;
(b) einem neurotrophen Faktor, wie dem saurem Fibroblasten-Wachstumsfaktor;
und (c) einem anti-entzündlichen
therapeutischen Stoff (z.B. einem anti-entzündlichem Steroid wie Dexamethason
oder Methylprednisolon, oder einem nicht-steroidalen anti-entzündlichen
Peptid wie Thr-Lys-Pro (TKP)).
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In
einer anderen Ausführungsform
werden mononucleäre
Phagocytenzellen gemäß der PCT-Veröffentlichung
Nr. WO 97/09985 und der U.S.-Patentanmeldung Seriennummer 09/041,280,
eingereicht am 11. März
1998, in die Stelle der Verletzung oder der Läsion innerhalb des ZNS, entweder
gleichzeitig, vor oder nach der parenteralen Verabreichung von Cop
1-aktivierten T-Zellen, Cop 1 oder einem Cop 1-verwandten Peptid
oder Polypeptid injiziert.
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In
einer anderen Ausführungsform
von Cop 1-aktivierten T-Zellen kann Cop 1 oder ein Cop 1-verwandtes
Peptid oder Polypeptid als einzelne Dosis verabreicht werden oder
sie können,
vorzugsweise in Intervallen von zwei Wochen und dann in aufeinanderfolgenden
längeren
Intervallen einmal im Monat, einmal im Vierteljahr, einmal alle
sechs Monate, etc. wiederholt werden. Der Verlauf der Behandlung
kann mehrere Monate, mehrere Jahre oder gelegentlich auch über die
Lebensdauer des Individuums andauern, abhängig von dem Zustand, der behandelt
wird. Im Fall einer ZNS-Verletzung kann die Behandlung im Bereich
zwischen mehreren Tagen bis Monaten oder sogar Jahren liegen, bis
sich der Zustand stabilisiert hat und es kein oder nur ein begrenztes
Risiko der Entwicklung einer sekundären Degeneration gibt. Bei
einer chronischen Erkrankung am Menschen oder bei der Parkinson-Krankheit
kann die therapeutische Behandlung gemäß der Erfindung über das
Leben andauern.
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Wie
für den
Fachmann offensichtlich sein wird, hängt die therapeutische Wirkung
zeitweise vom Zustand oder der Krankheit, die behandelt werden sollen,
vom Alter und Gesundheitszustand, von anderen körperlichen Parametern (z.B.
Geschlecht, Gewicht etc.) des Individuums sowie von verschiedenen
anderen Faktoren ab, z.B. davon, ob das Individuum andere Arzneistoffe
einnimmt, etc.
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Die
optimale Dosis der therapeutischen Zusammensetzungen, umfassend
Cop 1-aktivierte T-Zellen der Erfindung, ist proportional zur Anzahl
der Nervenfasern, die durch Verletzung oder Krankheit an der behandelten
Stelle beeinträchtigt
sind. In einer bevorzugten Ausführungsform
liegt die Dosis im Bereich zwischen etwa 5 × 106 bis
etwa 107 Zellen zur Behandlung einer Läsion, die
etwa 105 Nervenfasern beeinträchtigt,
wie etwa der vollständigen
Durchtrennung des optischen Nervs einer Ratte, und liegt etwa im
Bereich von 107 bis etwa 108 Zellen
bei der Behandlung einer Läsion,
die etwa 106–107 Nervenfasern
beeinträchtigt,
wie einer vollständigen
Läsion
des optischen Nervs beim Menschen. Wie für den Fachmann offensichtlich
sein wird, kann die Dosis der T-Zellen im Verhältnis zur Anzahl an Nervenfasern,
von denen an der Läsion
oder der Stelle der Verletzung angenommen wird, dass sie beeinträchtigt sind,
herauf- oder heruntergesetzt werden.
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(5) Einrichtung autologer
Zellbanken für
T-Lymphocyten
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Um
sekundären
Schaden nach Nervenverletzung zu minimieren, können Patienten durch Verabreichung
eines Medikaments einschließlich
autologer oder semi-allogener T-Lymphocyten, die auf Cop 1 oder
ein Cop 1-verwandtes Peptid oder Polypeptid sensibilisiert sind,
behandelt werden. Da das mögliche
Zeitfenster bis jetzt noch nicht genau definiert wurde, sollte sobald
wie möglich,
vorzugsweise innerhalb einer Woche nach der primären Verletzung, eine Therapie
angewendet werden, um die Erfolgschancen zu maximieren.
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Um
die Lücke
zwischen der Zeit, die für
die Aktivierung benötigt
wird und der Zeit, die für
die Behandlung gebraucht wird, zu überbrücken, kann mit persönlichen
Vorräten
autologer T-Lymphocyten, die für
die zukünftige
Verwendung für
die neuroprotektive Therapie gegen sekundäre Degeneration im Fall einer
NS-Verletzung hergestellt
sind, eine Bank eingerichtet werden. T-Lymphocyten werden aus dem
Blut isoliert und dann für
Cop 1 oder ein Cop 1-verwandtes Peptid oder Polypeptid sensibilisiert.
Die Zellen werden dann eingefroren und üblicherweise unter dem Namen
der Person, Identitätsnummer
und Blutgruppe in einer Zellbank gelagert, bis sie gebraucht werden.
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Zusätzlich können im
Fall von traumatischen Störungen
des NS wie Ischämie
oder mechanischer Verletzung sowie für behandelte neurodegenerative
Zustände
wie der Alzheimer-Krankheit oder der Parkinson-Krankheit autologe
Stammzellen aus dem ZNS prozessiert und für potenzielle Verwendung durch
einen einzelnen Patienten gelagert werden. Alternativ können semi-allogene
oder allogene T-Zellen zur Verwendung durch jede Person, die ein
MHC-Typ II-Molekül
mit der Quelle der T-Zellen
gemeinsam hat, in Banken eingefroren gelagert werden.
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Die
folgenden Beispiele veranschaulichen bestimmte Merkmale der vorliegenden
Erfindung.
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(6) Beispiele
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Materialien und Methoden
für die
Beispiele 1 und 2
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Tiere.
Durch Inzucht erzeugte weibliche adulte Lewis-Ratten (8–12 Wochen
alt) wurden durch das Animal Breeding Center des Weizmann Institute
of Science bereitgestellt. Die Ratten wurden in einem licht- und temperaturgesteuerten
Raum untergebracht und in jedem Experiment nach dem Alter zusammengebracht.
Die Tiere wurden gemäß den Regulierungen,
die durch IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) formuliert
sind, behandelt.
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Antigene.
Basisches Myelinprotein (MBP) aus dem Rückenmark von Meerschweinchen
und Ovalbumin (OVA) wurden von Sigma (St. Lewis, MO) bezogen. Das
Cop 1, das in den vorliegenden Beispielen verwendet wurde, war das Produkt
COPAXONE® von
Teva Pharmaceuticals (Israel), wobei das Produkt im Handel bezogen
wurde.
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Antikörper. Monoclonaler
Mäuse-anti-Ratten-T-Zellrezeptor
(TCR) wurde freundlicherweise von Dr. Boris Reizis bereitgestellt.
Cy-3-konjugiertes Ziegen-anti-Maus-IgG
(mit minimaler Kreuzreaktion auf Ratten-, menschliche, Rinder- und
Pferde-Serumproteine) wurde bei Jackson ImmunoResearch (West Grove,
PA) bezogen.
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T-Zelllinien.
T-Zelllinien wurden durch Drainieren von Lymphknotenzellen, die
von Lewis-Ratten erhalten wurden, die mit den vorstehenden Antigenen
(Ben-Nun et al, 1981a) immunisiert worden waren, erzeugt. Das Antigen
wurde in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (1 mg/ml) gelöst und mit
einem gleichen Volumen an unvollständigem Freundschem Adjuvans
(IFA) (Difco Laboratories, Detroit, MI), das mit 4 mg/ml Myobacterium
tuberculosis (Difco) ergänzt
war, emulgiert. Zehn Tage nachdem das Antigen in 0,1 ml der Emulsion
in die Hinterpfotenballen der Ratten injiziert worden war, wurden
die Ratten getötet
und ihre drainierten Lymphknoten wurden chirurgisch entfernt und
dissoziiert. Die Zellen wurden gewaschen und mit dem Antigen (10 μg/ml) in
Stimulierungsmedium, das Dulbeccos modifiziertes Eagle Medium (DMEM)
ergänzt
mit L-Glutamin (2 mM), 2-Mercaptoethanol
(5 × 10–5M),
Natriumpyruvat (1 mM), Penicillin (100 IU/ml), Streptomycin (100 μg/ml), nicht-essenzielle
Aminosäuren
(1ml/100 ml) und autologes Serum 1 % (Vol./Vol.) enthielt, aktiviert. Nach
Inkubation über
72 Stunden bei 37°C,
98% relativer Feuchtigkeit und 10% CO2 wurden
die Zellen auf ein Vermehrungsmedium bestehend aus DMEM, L-Glutamin,
2-Mercaptoethanol, Natriumpyruvat, nicht-essenziellen Aminosäuren und
Antibiotika in denselben Konzentrationen wie vorstehend mit Zusetzen
von 10% foetalem Kälberserum
(FCS) (Volumen/Volumen) und 10% T-Zell-Wachstumsfaktor, abgeleitet
von dem Überstand
von mit Concanavalin A (ConA)-stimulierten Milzzellen (Gillis et
al, 1978), überführt. Die
Zellen wurden 4–10
Tage in Vermehrungsmedium gezüchtet,
bevor sie erneut mit ihrem Antigen (10 μg/ml) in Gegenwart von bestrahlten
(2000 rad) Thymuszellen (107 Zellen/ml)
in Stimulierungsmedium stimuliert wurden. Die T-Zelllinien wurden durch wiederholte
Stimulierung und Vermehrung vermehrt (Ben-Nun et al, 1982).
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Quetschverletzung
des Sehnervs. Der Sehnerv wurde wie vorstehend beschrieben einer
Quetschverletzung unterzogen (Duvdevani et al, 1990). Kurz, Ratten
wurden durch intraperitoneale (i.p.) Injektion von Rompun (Xylazin,
10 mg/kg; Vitamed, Israel) und Vetalar (Ketamin, 50 mg/kg; Fort
Dodge Laboratories, Fort Dodge, IA) tief anästhesiert. Unter Verwendung
eines binokular arbeitenden Mikroskops wurde im rechten Auge eine
laterale Canthotomie durchgeführt
und die Netzhaut wurde seitlich zur Hornhaut eingeschnitten. Nach
Abtrennung der Retractor bulbi-Muskeln wurde der Sehnerv intraorbital
durch stumpfe Durchtrennung exponiert. Unter Verwendung einer kalibrierten
Kreuzwirkungs-Zange wurde der Sehnerv 1–2mm vom Auge entfernt einer
Quetschverletzung unterzogen. Milde und schwere traumatische Verletzungen
wurden in Kurzzeit-Versuchen (2 Wochen) zugefügt, da es sich zeigte, dass
dieser Zeitraum für
ein Aufzeigen von sekundärer Degeneration
und seiner Reaktion auf Behandlung optimal war (Yoles, 1988). Den
unverletzten kontralateralen Nerv ließ man ungestört.
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Messung
der sekundären
Degeneration durch retrograde Markierung retinaler Ganglionzellen.
Die sekundäre
Degeneration der Axone des optischen Nervs und ihrer anhängenden
Ganglionzellen (RGCs) wurde nach Anwendung der fluorescenten lipophilen
Färbung
4-(4-(Didecylamino)styryl)-N-methylpyridin-Iod (4-Di-10-Asp) (Molecular
Probes Europe BV, Niederlande) 2 Wochen nach der Quetschverletzung
distal zur Stelle der Läsion
gemessen. Da nur Axone, die intakt sind, die Färbung zurück zu ihren Zellkörpern transportieren
können,
stellt die Anwendung der Färbung
distal zur Läsionsstelle
nach zwei Wochen sicher, dass nur Axone, die sowohl die primäre Verletzung
als auch die sekundäre
Degeneration überlebt
haben, gezählt
werden. Dieser Ansatz ermöglichte
eine Differenzierung zwischen Neuronen, die noch funktionell intakt
sind, und Neuronen, in denen die Axone verletzt, die Zellkörper jedoch
noch lebensfähig
sind, da nur die Neuronen, deren Fasern morphologisch intakt sind,
Färbung
aufnehmen können,
die distal zur Stelle der Verletzung aufgebracht ist, und sie zu
ihren Zellkörpern
transportieren können.
Unter Verwendung dieses Verfahrens spiegelt die Anzahl an markierten
RGCs die Anzahl an noch funktionierenden Neuronen verlässlich wieder.
Die Markierung und die Messung wurden wie folgt durchgeführt: der
rechte optische Nerv wurde zum zweiten Mal exponiert, wiederum ohne
die retinale Blutversorgung zu beschädigen. 1–2 mm von der distalen Begrenzung
der Verletzungsstelle wurde eine vollständige Axotomie durchgeführt, und
feste Kristalle (0,2–0,4
mm Durchmesser) von 4-Di-10-Asp wurden an der Stelle der neu gebildeten
Axotomie hinterlegt. Fünf
Tage nach Aufbringen der Färbung
wurden die Ratten getötet.
Die Netzhaut wurde vom Auge abgelöst, als abgeflachtes ganzes
Präparat
in 4% Paraformaldehyd-Lösung präpariert
und durch Fluoreszenz-Mikroskopie auf markierte RGCs untersucht.
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Enzymverbundener
Immunabsorptions-Test. Anti-MBP T-Zellen wurden über eine Woche in einem Vermehrungsmedium
gezüchtet,
dann mit PBS gewaschen und in Stimulierungsmedium resuspendiert.
Die T-Zellen (0,5 × 106 Zellen/ml) wurden in Gegenwart von bestrahlten
Thymocyten (107 Zellen/ml) mit ConA (1,25 μg/ml), oder
mit MBP-Antigen (10 μg/ml)
oder mit Cop 1-Antigen (10 μg/ml)
oder mit OVA-Antigen (10 μg/ml), oder
mit keinem Antigen bei 37°C,
98% relativer Feuchtigkeit und 10% CO2 in
Stimulierungsmedium inkubiert. Zusätzlich wurden bestrahlte Thymocyten
(107 Zellen/ml) allein in Stimulierungsmedium
inkubiert. Nach 48 Stunden wurden die Zellen zentrifugiert und ihre Überstände wurden
aufgefangen und Proben genommen. Die Konzentrationen an Neurotrophin
(NT)-3, Nerven-Wachstumsfaktor (NGF) und NT-4/5 in den Proben wurden durch
Bestimmen mit enzymverbundenen Sandwich-Immunabsorptionstest (ELISA)-Kits
(Promega, Madison, WI) und Vergleich mit einem NT-Standard (Absorptionsmessung
bei 450 nm unter Verwendung eines ELISA-Lesegeräts) bestimmt. Die Konzentrationen
von Gehirn abgeleitetem neurotrophem Faktor (BDNF) in den Proben
wurden mit einem empfindlichen Sandwich-ELISA bestimmt. Kurz, Platten
mit 96 Vertiefungen und flachem Grund wurden mit einem Hühner-anti-Mensch-BDNF-Antikörper (Promega,
Madison, WI) in 0,025 M NaHCO3 und 0,025
M Na2CO3 (pH 8,2)
beschichtet. Rekombinantes menschliches BDNF (als Standard verwendet;
Research Diagnostics, Flanders, NJ) wurde in Reihenverdünnungen
in Blocking-Lösung
enthaltend 3% Rinderserum-Albumin
(BSA), 0,05% Polyoxyethylensorbitanmonolaureat (Tween-20), und 1
% FCS in PBS (pH 8,2) verwendet. Gebundenes BDNF wurde durch Inkubieren
der Platten mit einem Mäuse-anti-Mensch-BDNF-Antikörper (Research
Diagnostics) und danach mit Peroxidase-konjugiertem Ziegen-anti-Maus-IgG
(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) in Blocking-Lösung nachgewiesen.
Die Platten wurden unter Verwendung eines 3, 3', 5, 5'-Tetramethylbenzidin-Flüssigsubstratsystems
(Sigma, St. Louis, MO) entwickelt. Die Reaktion wurde durch Zusetzen
von 1 M H3PO4 gestoppt,
und die optische Dichte wurde bei 450 nm bestimmt. Die Ergebnisse
für jeden
Versuch wurden als die Menge an sezerniertem NT pro 1 ml Probe, nach
Subtraktion der Hintergrund-Mengen der bestrahlten Thymocyten, die
mit dem Stimulierungsmedium inkubiert worden waren, berechnet.
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Immunhistochemie.
Longotudinale-Gefrierschnitte (10 μm dick) der Nerven wurden auf
mit Gelatine beschichtete Glas-Träger gegeben und bis zur Präparierung
für Fluoreszenz-Färbung eingefroren.
Die Schnitte wurden 10 Min bei Raumtemperatur fixiert, zweimal mit
doppelt destilliertem Wasser gewaschen und drei Minuten in PBS,
das 0,05% Tween-20 enthielt, inkubiert. Die Abschnitte wurden dann
eine Stunde bei Raumtemperatur mit monoclonalen Mäuse-anti-Ratten-Antikörpern gegen
TCR (Hunig, 1989), die in PBS, das 3% FCS und 2% BSA enthielt, verdünnt waren,
inkubiert. Die Schnitte wurden dann drei Mal mit PBS, das 0,05% Tween-20
enthielt, gewaschen und mit Cy3-konjugiertem Ziegen-anti-Maus-IgG (mit minimaler
Kreuzreaktion mit Ratten-, menschlichen, Rinder- und Pferde-Serumproteinen; Jackson
ImmunoResearch, West Grove, PA) für 1 Stunde bei Raumtemperatur
inkubiert. Die Schnitte wurden mit PBS, das Tween-20 enthielt, gewaschen und
mit Glycerin, das 1,4-Diazobicyclo-(2, 2, 2)octan enthielt, behandelt,
um eine Fluoreszenzlöschung
zu hemmen. Die Schnitte wurden mit einem Zeiss Universal Fluoreszenzmikroskop
sichtbar gemacht.
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BEISPIEL 1: NEUROPROTEKTION
DURCH ANTI-COP 1 T-ZELLEN
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Adoptiver Transfer von
T-Zellen, die auf Cop 1 reagieren, ist im verletzten optischen Nerv
neuroprotektiv
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In
einer vorherigen Studie wurde aus dem Labor der vorliegenden Erfinder
gezeigt, dass nach aktuem ZNS-Trauma bei der Ratte ein passiver
Transfer von enzephalitogenen T-Zellen, der für ZNS eigene Antigene wie MBP
spezifisch ist, die Ausbreitung einer Schädigung verhindert und somit
die sekundäre
Degeneration eindämmt
(vgl. WO 99/60021). Hier wird die neuroprotektive Wirkung von T-Zellen,
die auf Cop 1 reagieren, gezeigt, wobei die T-Zellen, anders als
MBP-reaktive T-Zellen,
nicht enzephalitogen sind. Direkt nach leichter (1A),
oder schwerer (1B) Verletzung des Sehnervs
wurde Ratten PBS in IFA oder Cop 1-spezifische T-Zellen in IFA injiziert. Um die sekundäre Degeneration
festzustellen, wurde zwei Wochen nach der Verletzung die Neurotracer-Färbung 4-Di-10-Asp
distal zur Stelle der Verletzung auf den Sehnerv aufgetragen. Nach fünf Tagen
wurden die Ratten getötet
und ihre Netzhäute
wurden ausgeschnitten und flach präpariert. Markierte (überlebende)
RGCs von vier Feldern, die sich ungefähr in demselben Abstand von
der Papille in jeder Netzhaut befinden, wurden unter einem Fluoreszenz-Mikroskop
gezählt.
Die Ergebnisse sind in 1A und 1B gezeigt.
Die neuroprotektive Wirkung der Cop 1-reaktiven T-Zellen im Vergleich
zu der von PBS war sowohl für
leichte (P < 0,005,
Students t-Test) als auch für
schwere (P < 0,05,
Students t-Test) Quetschverletzung signifikant. Die Ergebnisse sind
die Summe von drei Versuchen. Jede Gruppe enthielt sechs bis zehn Ratten.
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Cop 1-reaktive T-Zellen
akkumulieren sowohl in verletztem als auch in unverletztem Nervengewebe
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Im
Labor der vorliegenden Erfinder wurde vor kurzem gezeigt, dass dem
passiven Transfer von anti-MBP-T-Zellen in quetschverletzte Ratten
eine starke Anhäufung
der injizierten T-Zellen an der Stelle der Verletzung folgt. Der
passive Transfer von Cop 1-reaktiven T-Zellen in der vorliegenden
Studie verursachte ebenfalls eine signifikante Anhäufung der
injizierten T-Zellen an der Verletzungsstelle im Vergleich zur Anhäufung von
endogenen anti-MBP-T-Zellen bei den mit PBS behandelten verletzten
Ratten. Die T-Zell-Anhäufung
bei den mit Cop 1 behandelten Ratten war am Tag 7 nach der Injektion
am größten. Diese
Ergebnisse stimmen mit früheren
Ergebnissen mit injizierten T-Zelllinien verschiedener Spezifitäten überein.
In dieser Studie war die T-Zell-Anhäufung an der Stelle der Läsion bei
verletzten Nerven nicht-selektiv, im Gegensatz zu unverletzten Nerven,
bei denen man nur T-Zellen,
die für
ZNS-eigene Antigene spezifisch waren, angehäuft fand. Somit stellt eine
Anhäufung
von T-Zellen gegen Cop 1 im verletzten Nerv keinen Hinweis auf eine
Kreuzerkennung mit einem der vorhandenen ZNS-Proteine und damit
auf Aktivität
dar. T-Zellen gegen Cop 1, ähnlich
wie T-Zellen gegen MBP häuften
sich jedoch im unverletzten Nerv an, anders als T-Zellen gegen OVA
(Ergebnisse nicht gezeigt). Obwohl es eine geringere Anhäufung von
T-Zellen, die auf Cop 1 reagierten als von T-Zellen, die für MBP spezifisch
waren, gab, unterstützen
diese Ergebnisse weiterhin den Hinweis auf eine Kreuzreaktivität zwischen
Cop 1 und MBP in vivo.
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Cytokin- und Neurotrophin-Profile
von injizierten T-Zellinien spezifisch für MBP und Cop 1
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Überstände von
unstimulierten T-Zellen oder von T-Zellen, die über 48 Stunden mit ConA-Mitogen
stimuliert wurden, oder MBP-Antigen oder Cop 1-Antigen in Stimulierungsmedium
wurden einem Sandwich-ELISA unterzogen. Die gezüchteten Medien, die Produkte
enthielten, die von diesen Zellen sezerniert wurden, wurden aufgefangen
und ihre Cytokin-Inhalte wurden durch ELISA quantifiziert. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 2 gezeigt. Die aktivierten T-Zellen sezernierten
viel höhere
Mengen an Cytokinen als die nicht-stimulierten T-Zellen. Die mit
MBP stimulierten T-Zellen exprimierten vorzugsweise das für Th1 spezifische
Cytokin INF, wohingegen die mit Cop 1 stimulierten T-Zellen vorzugsweise
das für
Th2 spezifische Cytokin IL-10 exprimierten. Die größten Mengen
an sezernierten Cytokinen wurden in den Überständen von T-Zellen nachgewiesen, die
mit ConA stimuliert wurden (Tabelle 2).
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Die
Hochregulierung der neurotrophen Expression und die Sezernierung
durch T-Zellen, die durch ihre spezifischen Antigene aktiviert sind,
wurde kürzlich
im Labor der vorliegenden Erfinder gezeigt. In einem Versuch, einen
Einblick in den Mechanismus zu erhalten, dem die T-Zell-vermittelte
Neuroprotektion unterliegt, wurden die T-Zell-Überstände in der vorliegenden Studie
einem ELISA unterzogen, um die Neurotrophin (NT)-Profile von T-Zellen
zu bestimmen, die für
die Neuroprotektion verantwortlich sind. Die Cop 1-stimulierten T-Zellen
sezernierten sowohl NGF als auch NT-4/5, jedoch in geringeren Mengen
als jenen, die von den Anti-MBP-Zellen sezerniert wurden. Relativ
zur Herstellung durch anti-MBP-T-Zellen war die Herstellung von NT-3
durch die Cop 1-stimulierten T-Zellen nicht signifikant; die Herstellung
von BDNF war jedoch massiv (2A). Demnach
produzierten die Cop 1-stimulierten T-Zellen geringere Mengen aller
untersuchten neurotrophen Faktoren, mit der bemerkenswerten Ausnahme
von BDNF (2A). Vier unabhängige Bestimmungen
der Mengen an NT-3 und BDNF, sezerniert durch die unterschiedlich
stimulierten T-Zellen, ergaben ähnliche
Ergebnisse. In jedem Fall stellten Cop 1-stimulierte T-Zellen etwa
2,5 Mal mehr BDNF her als Anti-MBP-T-Zellen und nur 10% der Mengen an NT-3
(2B).
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BEISPIEL 2: IMPFUNG MIT
COP 1
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Impfung
mit Cop 1 schützt
Sehnervenfasern vor sekundärer
Degeneration Dieses Beispiel soll zeigen, dass die Impfung mit Cop
1 in IFA mit einem Booster, der zwei Tage später gegeben wird, eine Immunantwort ergibt,
die für
die Neuroprotektion innerhalb des kritischen Zeitfensters stark
genug ist.
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Anästhetisierte
Ratten wurden leichter traumatischer Verletzung des Sehnervs unterzogen,
sofort mit Cop 1 in IFA geimpft, und ein Booster wurde zwei Tage
später
gegeben. Nach zwei Wochen wurden die RGCs rückläufig markiert, und fünf Tage
später
wurden die Ratten getötet
und ihre Netzhäute
ausgeschnitten. Ratten, die mit Cop 1 geimpft waren, zeigten im
Vergleich zu Kontrollratten, denen PBS in IFA injiziert wurde (3), einen
Hinweis auf signifikante Neuroprotektion.
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BEISPIEL 3: SCHUTZ VOR
GLUTAMAT-TOXIZITÄT
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Versuch 1: Impfung mit
Cop 1 schützt
Sehnervenfasern vor Glutamat-Toxizität
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Auf
Grund der vielversprechenden Neuroprotektion verletzter Nerven,
erhalten durch Immunisierung mit Cop 1, ist es wichtig, herauszufinden,
ob die Protektion auf einen Nervenschaden beschränkt ist, der durch ein Trauma
verursacht ist, oder ob es allgemeiner eine Neuroprotektion vor
feindlichen Umweltbedingungen, verursacht durch Glutamat-Toxizität, wäre. Entsprechend
wurde der folgende Versuch durchgeführt.
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Immunisierung.
C57B1/6J-OLA-Mäusen
(8–10
Wochen alt) wurden jede mit insgesamt 75 μg Cop 1 injiziert, das mit einem
gleichen Volumen vollständigem
Freundschen Adjuvans (CFA), das 5 mg/ml H37 RA-Mycobakterien (Difco)
enthielt, emulgiert war. Mäusen
aus einer zweiten Gruppe wurde eine Emulsion von phosphatgepufferter
Kochsalzlösung
(PBS) in CFA injiziert. Die Emulsion, mit einem Gesamtvolumen von
0,1 ml, wurde 10 Tage bevor Glutamat in die Netzhaut eingeführt wurde,
infradermal injiziert.
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Glutamat-Toxizität. Zehn
Tage nach der Immunisierung wurden die Mäuse anästhesiert, und 1 μl Kochsalzlösung, die
200 nMol Glutamat enthielt, wurde in den Glaskörper des rechten Auges injiziert.
In das linke Auge wurde nichts injiziert und es diente als Kontrolle.
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Markierung
von retinalen Ganglionzellen. Drei Tage (72 Stunden) vor Erfassung
des RGC-Überlebens wurde
jede Maus anästhesiert
und in ein stereotaktisches Gerät
platziert. Der Schädel
wurde exponiert und trocken und sauber gehalten. Das Bregma wurde
identifiziert und markiert. Der bestimmte Injektionspunkt lag in
einer Tiefe von 2 mm von der Hirnoberfläche, 2,92 mm hinter dem Bregma
in der anteroposterioren Achse und 0,5 mm lateral zur Mittellinie.
Ein Fenster wurde oberhalb der bestimmten Koordinaten in der rechten
und der linken Hemisphäre
in den Schädel
gebohrt. Die Neurotracer-Färbung
FluoroGold (4% Lösung
in Kochsalzlösung;
Fluorochrom, Denver, CO) wurde dann unter Verwendung einer Hamilton-Spritze
eingebracht (1 μl,
in einer Rate von 0,5 μl/min).
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Erfassung
des RGC-Überlebens.
Sieben Tage nach der Glutamat-Verabreichung
wurden die Augen enukleiert und ihre Netzhäute wurden abgelöst und als
abgeflachte Gesamtpräparate
in 4% Paraformaldehyd-Lösung
aufpräpariert.
Markierte Zellen von 6 bis 8 Feldern identischer Größe (0,078
mm2), die sich etwa 1 mm entfernt vom Sehnervenkopf
befanden, wurden unter dem Fluoreszenzmikroskop gezählt und
gemittelt. Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt.
Es wurde herausgefunden, dass die Glutamat-Toxizität in den
Kontrollen etwa 4-Mal höher
war als in Mäusen,
die mit Cop 1 immunisiert waren.
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Versuch 2: Impfung zum
Schutz von Neuronen gegen Glutamat-Toxizität und Augenhochdruck
-
In
dieser Studie wird gezeigt, dass die aktive oder passive Immunisierung
mit einem Peptid, das von Myelin-Oligodendrocyten-Glycoprotein (MMOG)
abgeleitet ist, oder mit MBP, das wirksame Neuroprotektion nach
axonaler Verletzung bereitstellt (Moalem et al., 1999a; Moalem et
al., 1999b und Fisher et al., 2000), die Neuronen nicht vor der
Toxizität,
die durch Glutamat verursacht wird, schützt. Ein Schutz vor Glutamat-Toxizität wurde
jedoch durch Impfung mit Cop-1 erzielt. Es zeigte sich weiterhin,
dass die Immunisierung mit Cop-1 einen hochwirksamen Schutz vor
dem Tod der retinalen Ganglionzellen zur Verfügung stellt, der im Rattenmodell durch
Augenhochdruck durch Glaukom induziert wird, unter Bedingungen,
bei denen der Druck hoch bleibt und durch die Immunisierung nicht
beeinträchtigt
wird.
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Materialien und Methoden
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Tiere.
Alle Tiere wurden nach den Vorschriften, die vom Institutional Animal
Care and Use Committee formuliert wurden, behandelt. Mäuse der
C57BL/6J- und Balb/c-Stämme
im Alter von 8–13
Wochen und durch Inzucht gezüchtete
adulte Lewis Ratten im im Alter von 8–12 Wochen wurden vom Animal
Breeding Center des Weizmann Institute of Science geliefert und
in licht- und temperaturkontrollierten Räumen untergebracht. Die Tiere
wurden in jedem Versuch nach Alter und Größe zusammengebracht. Vor ihrer
Verwendung in Versuchen wurden die Tiere durch intraperitoneale
Verabreichung von 80 mg/kg Ketamin und 16 mg/kg Xylazin anästhesiert.
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Antigene.
Cop-1 wurde von Teva Pharmaceuticals (Petah Tikva, Israel) bezogen.
Myelin-Oligondendrocyten-Glycoprotein (MOG)-Peptid (pMOG) 1–22 (GQFRVIGPGHPIRALVGDEAEL)
(SEQ ID NR:33) wurde unter Verwendung des Fmoc-Verfahrens mit einem
automatischen multiplen Peptid-Synthesegerät (AMS422, Abimed, Langenfeld,
Deutschland) im Labor von Prof. M. Fridkin am Department of Chemistry
des Weizmann Institute of Science synthetisiert. MBP aus dem Rückenmark
von Meerschweinchen wurde von Sigma (Israel) bezogen.
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Immunisierung.
Mäuse oder
Ratten wurden mit 75 μg
beziehungsweise 100 μg
Cop-1 oder 300 μg pMOG,
das mit einem gleichen Volumen an vollständigem Freundschen Adjuvans
(CFA) emulgiert war, das 0,5 oder 5 mg/ml Myobacterium tuberculosis
enthielt, immunisiert. Die Emulsion (Gesamtvolumen 0,15 ml) wurde
subcutan an eine Stelle in der Seite injiziert. Eine Woche später gab
man den mit pMOG immunisierten Mäusen
auf der anderen Seite eine identische Immunisierung als Booster.
Den Kontrollmäusen
wurde phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in CFA (Difco, Detroit,
Michigan, USA) injiziert.
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Quetschverletzung
des Sehnervs. Mäuse
oder Ratten wurden anästhesiert
und im intraorbitalen Abschnitt des Sehnervs, 1–2 mm vom Augapfel entfernt,
einer Quetschverletzung unterzogen. Mit Hilfe eines binokular arbeitenden
Mikroskops wurde die Bindehaut eingeschnitten und der Sehnerv exponiert.
Unter Verwendung einer kalibrierten Kreuzzange und unter besonderer
Vorsicht, damit man die Blutzufuhr nicht unterbricht, wurde der
Sehnerv 2 s (Mäuse)
beziehungsweise 3 s (Ratten) gequetscht.
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Glutamat-
und NMDA-Injektionen. Das rechte Auge der anästhesierten Maus oder Ratte
wurde mit einer 27er Nadel im oberen Teil der Lederhaut punktiert,
und eine 10-μl
Hamilton-Spritze mit einer 10 Gange-Nadel wurde bis zum Glaskörper eingeführt. Mäusen wurde
ein Gesamtvolumen von 1 μl
(200 nMol) L-Glutamat oder 1 μl
N-Methyl-D-aspartat (NMDA; 75 nMol; RBI, Boston, MA), gelöst in Kochsalzlösung injiziert.
Ratten wurden 2 μl
(375 nMol) L-Glutamat injiziert.
-
Ausbringen
von stereotaktischer Färbung
vor der Verletzung bei Mäusen.
Der Schädel
wurde exponiert und unter Verwendung von 15% Wasserstoffperoxid trocken
und sauber gehalten. Das Bregma wurde identifiziert und markiert.
Ein Loch wurde oberhalb des oberen Colliculus jeder Hemisphäre (0,292
mm hinter und 0,05 mm seitlich zur Mittellinie) gebohrt. Unter Verwendung
eines stereotaktischen Messgeräts
und eines Hamilton-Injektors wurde den Mäusen an einem Punkt oberhalb
des oberen Colliculus jeder Hemisphäre, in einer Tierfe von 0,16
mm beziehungsweise 0,175 mm (abhängig
vom Mäusestamm)
von der knöchernen Oberfläche des
Gehirns Fluorogold (5% in Kochsalzlösung, Fluorochrome, Denver,
CO; 1 μl)
injiziert. Nach Abschluss der Injektion wurde die Wunde genäht. Rückläufige Aufnahme
der Färbung
stellt eine Markierung der lebenden Zellen dar.
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Beurteilung
des Überlebens
retinaler Ganglionzellen bei Mäusen.
Mäusen
wurde eine letale Dosis Pentobarbiton (170 mg/kg) gegeben. Ihre
Augen wurden enukliert und die Netzhäute wurden abgelöst und als flache
vollständige
Präparate
in Paraformaldehyd (4% in PBS) präpariert. Markierte Zellen von
4–6 ausgewählten Feldern
identischer Größe (0,7
mm2) wurden gezählt. Die ausgewählten Felder
befanden sich etwa in derselben Entfernung von der Sehnervpapille
(0,3 mm), um die Variation der RGC-Dichte als Funktion der Entfernung
von der Sehnervpapille zu überwinden.
Die Felder wurden von Beobachtern, die über die Behandlung, die die
Maus erhalten hatte, im Unklaren waren, unter dem Fluoreszenzmikroskop
(Vergrößerung × 800) gezählt. Die
durchschnittliche Anzahl an RGCs pro Feld in jeder Netzhaut wurde
berechnet.
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Beurteilung
des Überlebens
retinaler Ganglionzellen bei Ratten. Das Überleben von RGCs bei Ratten wurde
nach Aufbringen der lipophilen Fluoreszenzfärbung 4-(4-(Didecylamino)styryl)-N-methylpyridin-Iod (4-Di-10-Asp)
(Molecular Probes Europe BV, Niederlande) distal zum Sehnervenkopf
gemessen. Markierung und Messung wurden wie folgt durchgeführt: der
Sehnerv wurde exponiert, ohne die retinale Blutzufuhr zu beschädigen. Eine
vollständige
Axotomie wurde 1–2
mm vom Sehnervenkopf entfernt durchgeführt und feste Kristalle (0,2–0,4 mm
Durchmesser) von 4-Di-10-Asp wurden an der Stelle der gebildeten
Axotomie hinterlegt. Fünf
Tage nach Aufbringen der Färbung
wurden die Ratten getötet.
Die Netzhaut wurde vom Auge abgelöst, als abgeflachtes Gesamtpräparat in
4% Paraformaldehydlösung
präpariert
und durch Fluoreszenzmikroskopie auf markierte RGCs hin untersucht.
Bei den IOP-Versuchstieren wurden die Ganglionzellen durch rückläufiges Transport-Dextran-tetramethylrhodamin
(DTMR) (Molecular Probes, OR) markiert. Kristalle von 3000 MW-DTMR
wurden etwa 2 bis 3 mm vom Augapfel entfernt auf das Schnittende
des Sehnervs aufgebracht. 24 Stunden später wurden die Netzhäute im Ganzen
präpariert
und markierte Ganglionzellen in 8 Regionen, 2 pro Quadranten (0,66
bis 1,103 mm von der Kante der Sehnervpapille entfernt) wurden mit
einer 400-fachen Vergrößerung gezählt.
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Erzeugung
einer Mäuse-Cop-1-T-Zelllinie.
Eine Mäuse-T-Zelllinie
wurde durch Drainieren von Lymphknotenzellen, die von C57BL/6J-Mäusen erhalten
wurden, die mit Cop-1-Antigen immunisiert worden waren, erzeugt.
Das Antigen wurde in PBS (1 mg/ml) gelöst und mit einem gleichen Volumen
CFA, ergänzt
mit 5 mg/ml Myobacterium tuberculosis (Difco), emulgiert. Zehn Tage
nach der Immunisierung in die Hinterpfotenballen wurden die Mäuse getötet und
ihre drainierten Lymphknoten wurden chirurgisch entfernt und dissoziiert.
Die Zellen wurden gewaschen und in Stimulierungsmedium, das RPMI
ergänzt
mit L-Glutamin (2 mM), 2-Mercaptoethanol (5 × 10–5 M),
Penicillin (100 Einheiten/ml), Streptomycin (100 μg/ml) und
0,5% (Vol./Vol.) autologes Serum enthielt, mit dem Antigen (10 μg/ml) aktiviert.
Nach Inkubation über
72 h bei 37°C,
98% relativer Feuchtigkeit und 10% CO2,
wurden die Zellen in Vermehrungsmedium, bestehend aus RPMI, ergänzt mit
nicht-essenziellen Aminosäuren
(1 ml/100 ml), Natriumpyruvat (1 mM), L-Glutamin, β-Mercaptoethanol, Penicillin
und Streptomycin in denselben Konzentrationen wie vorstehend, mit
Zusetzen von 5% foetalem Kälberserum (Vol./Vol.)
und 10% T-Zell-Wachstumsfaktor, der von dem Überstand von mit Concanavalin
A stimulierten Milzzellen stammte, überführt. Die Zellen wurden 10–14 Tage
in Vermehrungsmedium gezüchtet,
bevor sie in Gegenwart von bestrahlten (2500 rad) Milzzellen (107 Zellen/ml) mit ihrem Antigen (10 μg/ml) in
Stimulierungsmedium erneut stimuliert wurden. Die T-Zelllinie wurde
durch wiederholte Stimulierung und Vermehrung vermehrt. Im Wesentlichen
hat die Linie einen ähnlichen
Phänotyp
zur zuvor beschriebenen (Aharoni et al., 1997).
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Erzeugung
einer Ratten-Cop-1-T-Zelllinie. T-Zelllinien wurden durch Drainieren
von Lymphknotenzellen, erhalten von Lewis Ratten, die mit den vorstehenden
Antigenen immunisiert worden waren, gebildet. Das Antigen wurde
in phosphatgepufferter Kochsalzlösung
(PBS) (1 mg/ml) gelöst
und mit einem gleichen Volumen an unvollständigem Freundschem Adjuvans
(IFA) (Difco Laboratories, Detroit, MI) ergänzt mit 4 mg/ml Myobacterium
tuberculosis (Difco) emulgiert. Zehn Tage nachdem das Antigen in
0,1 ml der Emulsion in die Hinterpfotenballen der Ratten injiziert
worden war, wurden die Ratten getötet und ihre drainierten Lymphknoten wurden
chirurgisch entfernt und dissoziiert. Die Zellen wurden gewaschen
und mit dem Antigen (10 μg/ml)
in Stimulierungsmedium, enthaltend Dulbeccos modifiziertes Eagles
Medium (DMEM), ergänzt
mit L-Glutamin (2 mM), 2-Mercaptoethanol
(5 × 105) Natriumpyruvat (1 mM), Penicillin (100
IU/ml), Streptomycin (100 μg/ml), nicht-essenziellen
Aminosäuren
(1 ml/100 ml) und autologem Serum 1 % (Vol./Vol.) stimuliert. Nach
Inkubation über
72 h bei 37°C,
98% relativer Luftfeuchtigkeit und 10% CO2 wurden
die Zellen in Vermehrungsmedium überführt, bestehend
aus DMEM, L-Glutamin, 2-Mercaptoethanol, Natriumpyruvat, nicht-essenziellen
Aminosäuren
und Antibiotika in denselben Konzentrationen wie vorstehend, mit
Zusetzen von 10% foetalem Kälberserum
(FCS) (Vol./Vol.) und 10% T-Zell-Wachstumsfaktor, der vom Überstand
von Concanavalin A (ConA)-stimulierten Milzzellen stammt. Die Zellen
wurden 4–10
Tage in Vermehrungsmedium gezüchtet,
bevor sie erneut mit ihrem Antigen (10 μg/ml) in Gegenwart von bestrahlten
(2000 rad) Thymuszellen (107 Zellen/ml)
in Stimulierungsmedium stimuliert wurden. Die T-Zelllinien wurden durch wiederholte
Stimulierung und Vermehrung vermehrt.
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Histologische
Analyse. Sieben Tage nach Glutamat- oder Kochsalzlösungsinjektion
wurden die Mäuse durch
eine letale Dosis Pentobarbiton (170 mg/kg) getötet und ihre Augen wurden entfernt
und 48h bei 4°C
in Formaldehyd (4% in PBS) fixiert. Schnitte (10μm dick) wurden in Paraffin eingebettet
und mit Hämatoxylin
und Eosin (H&E)
gefärbt.
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Erzeugung
von Augenhochdruck bei Ratten/Erhöhung des Augeninnendrucks bei
Ratten. Männliche Lewi-Ratten
wurden mit einem Gemisch aus Ketamin (15 mg/kg), Acepromazin (1,5
mg/kg) und Xylazin (0,3 mg/kg) anästhesiert. Eine Zunahme des
Augeninnendrucks (IOP) wurde durch Laser-Photokoagulation der limbalen
und episkleralen Venen erzielt. Ratten erhielten 2 Laserbehandlungen,
1 Woche auseinander, mit einem blaugrünen Argonlaser (1 Watt über 0,2
s, ergibt insgesamt 130–150
Punkte von 50 μm
in den beiden Behandlungen; Coherent, Palo Alto, CA). IOP wurde
einmal pro Woche unter Verwendung von TONO-PEN (Mentor, Norwell),
MA) gemessen, nachdem den Ratten intramuskulär das tierärztliche Beruhigungsmittel
Acepromazin zu 0,3 mg/kg injiziert worden war und Proparacain zu
0,5% topisch auf die Augen aufgetragen worden war, um die Hornhaut
zu anästhesieren.
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Ergebnisse
-
Myelin-assoziierte
Antigene schützen
nicht gegen Glutamat-Toxizität
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Das
Labor des vorliegenden Erfinders zeigte vor kurzem, dass passive
und aktive Immunisierung mit Myelin-assoziierten Antigenen die posttraumatische
Degeneration, die mit einer Quetschung des Sehnervs bei Mäusen und
Ratten (Beispiele 1 und 2; Moalem et al., 1999 und Fisher et al.,
2000) und mit Quetschverletzungen des Rückenmarks bei adulten Ratten
(Hauben et al., 2000a und Hauben et al., 2000b) einhergeht, reduzieren
kann. Um zu bestimmen, ob eine solche Neuroprotektion ebenfalls
nach einer nicht-mechanischen Verletzung ausgeübt wird, wurde zuerst untersucht,
ob eine aktive Immunisierung mit Myelinassoziierten Antigenen oder
ein passiver Transfer von T-Zellen, die auf diese Antigene reagieren,
eine Neuroprotektion gegen Toxizität bereitstellt, die durch intravitreale
Injektion von Glutamat induziert wurde. Die Sehnerven von Ratten
und Mäusen
wurden einer Quetschverletzung unterzogen. Unter Verwendung von
vom Labor der vorliegenden Erfinder etablierten Protokollen zur
Immunoneuroprotektion wurde eine aktive Immunisierung mit von MOG
abgeleiteten Peptiden (Fisher et al., 2000) an Mäusen und ein passiver Transfer
von Anti-MBP-T-Zellen bei Ratten (Moalem et al., 1999) durchgeführt. Ein
Glutamat-Eindringen wurde durch intravitreale Injektion von Glutamat
in einer Konzentration zugefügt,
von der zuvor gezeigt wurde, dass sie zu einem RGC-Tod führt, der
sowohl bei Mäusen
als auch bei Ratten nach einer Woche messbar ist (Yoles et al.,
2000).
-
Die
Mäuse wurden
vor der intravitrealen Injektion von Glutamat (200 nMol) mit pMOG
immunisiert. Wurde die RGC-Überlebensrate
1 Woche nach Glutamat-Injektion
bestimmt, konnte kein Hinweis auf eine heilsame Wirkung der Immunisierung
mit pMOG nachgewiesen werden (5A). In ähnlicher
Weise war keine vorteilhafte Wirkung nachweisbar, wenn der Glutamatinjektion
bei Ratten direkt ein passiver Transfer von Anti-MBP-T-Zellen folgte
(5B). Somit wurde, obwohl die Impfung mit pMOG
(1–22)
kürzlich
gezeigt hatte, dass sie bei Mäusen
nach Quetschverletzung des Sehnervs eine neuroprotektive Reaktion
induzierte (Fisher et al., 2000), in der vorliegenden Studie keine
solche Neuroprotektion gesehen, nachdem die mit pMOG geimpften Mäuse einem
Glutamin-Eindringen unterzogen wurden.
-
Diese
Ergebnisse ließen
die vorliegenden Erfinder zwei Möglichkeiten
annehmen: entweder ist der Verlust an RGCs nach Glutamat-Toxizität nicht
einer Immun-Neuroprotektion zuzuschreiben, was impliziert, dass
Glutamat-induzierter RGC-Zelltod das Immunsystem nicht beteiligt,
oder Myelin-assoziierte Antigene wie pMOG und MBP sind nicht die
richtigen Antigene für
eine Protektion gegen Glutamat-Toxizität. Kürzliche Ergebnisse aus dem
Labor der vorliegenden Erfinder (Kipnis et al., 2000), die zeigten,
dass die Rate an Zelltod, der durch Glutamat verursacht wird, bei
Ratten beziehungsweise Mäusen,
denen reife T-Zellen im Vergleich zu normalen Tieren fehlen, höher ist,
weisen stark darauf hin, dass die heilsame physiologische Reaktion
auf eine ZNS-Verletzung T-Zellen beteiligt. Dementsprechend hat
eine Verstärkung
dieser endogenen Glutamat-induzierten T-Zellreaktion wahrscheinlich eine vorteilhafte
Wirkung auf die verletzte Netzhaut.
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Cop-1-Immunisierung schützt gegen
Glutamat-Toxizität
-
Während die
Suche nach einem physiologischen Antigen, das eine heilsame Immunreaktion
auf Glutamat-induzierte Toxizität
hervorrufen könnte,
in diesem Stadium weiterhin ein primäres Ziel ist, waren die vorliegenden
Erfinder daran interessiert, ein Antigen zu finden, das für Zwecke
der exogenen Manipulation des Immunsystems auf die Immunreaktion
auf Glutamat verwendet werden könnte.
Zuerst wurde untersucht, ob eine Glutamat-Injektion verursacht,
dass die RGCs für
Lymphocyten zugänglich
werden. Es wurde herausgefunden, dass innerhalb von 24 h nach der
Glutamat-Injektion große
Mengen an Lymphocyten in das mit Glutamat injizierte Auge einwandern
(6A und 6B), was
annehmen lässt,
dass eine Immunmanipulation das Überleben
von RGCs nach ihrer lokalen Exposition zu Glutamat beeinflussen
könnte.
Zusammengenommen führten
diese beiden Beobachtungen die vorliegenden Erfinder dazu, anzunehmen,
dass die Glutamat-Toxizität eine T-Zell-vermittelte
Schutzwirkung aktiviert, und ermutigten die vorliegenden Erfinder,
nach einem Weg zu suchen, diese vorteilhafte Immunreaktion zu verstärken. Auf
der Suche nach einem geeigneten Antigen wurde das synthetische Polymer
Copolymer-1 (Cop-1), das ein Oligopeptid ist, das bei Patienten
mit Multipler Sklerose als Arzneistoff verwendet wird, und von dem
kürzlich
gezeigt wurde, dass es in einem Modell einer Quetschverletzung des
Sehnervs bei der Ratte (Kipnis et al., 2000a) die Neuroprotektion
verstärkt,
als geeigneter Kandidat angesehen.
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Zunächst wurde
untersucht, ob die Immunisierung mit Cop-1 eine vorteilhafte Wirkung
auf RGC-Überleben
nach optischer Quetschverletzung bei Mäusen und nicht nur Ratten hat.
Für diese
Untersuchung wurden Balb/c-Mäuse
verwendet. Die Immunisierung mit Cop-1 unter Verwendung eines Protokolls,
von dem gefunden wurde, dass es nach Quetschverletzung des Sehnervs
bei Ratten heilsam war, war auch nach Quetschverletzung des Sehnervs
bei Mäusen
heilsam (7).
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Als
nächstes
wurde untersucht, ob dasselbe Protokoll zu einer Neuroprotektion
gegen Glutamat-induzierte Toxizität führen kann. Für diese
Untersuchung wurden C57bl/6-Mäuse
verwendet, bei denen der Verlust an retinalen Ganglionzellen nach
Glutamat-Eindringen höher
ist als bei Balb/c (Kipnis et al., 2000b). Zehn Tage vor der intravitrealen
Injektion von Glutamat wurden die C57bl/6-Mäuse
mit Cop-1, das in Adjuvans emulgiert war, das 5 mg/ml Bakterien
enthielt, immunisiert. Dieser Stamm wurde in Hinblick auf die kürzlichen
Ergebnisse aus dem Labor der vorliegenden Erfinder, dass der Verlust
an RGCs, der durch Glutamat-Injektion
bei diesen Mäusen
induziert wird, auf Grund einer genetischen Verbindung zwischen
neuronalem Verlust und Resistenz gegen Autoimmunkrankheiten größer ist
als bei Balb/c-Mäusen
(Kipnis et al., 2000b), ausgewählt.
Die Immunisierung mit Cop-1 ergab eine signifikante Reduktion der
Glutamat-Toxizität
(8A). In einem Versuch, das therapeutische Fenster
für die
Immunisierung mit Cop-1 in diesem Modell einzurichten, wurde der
Versuch unter Verwendung von Cop-1, emulgiert in Adjuvans, das 2
verschiedene Konzentrationen an Bakterien (0,5 beziehungsweise 5
mg/ml) enthielt, wiederholt und die Mäuse wurden zu verschiedenen
Zeitpunkten bezogen auf das Glutamat-Eindringen immunisiert. Mäuse, die
am Tag der Glutamat-Injektion
immunisiert wurden, zeigten noch signifikant höhere Raten an RGC-Überleben als die, die bei Mäusen beobachtet
wurden, denen PBS emulgiert im entsprechenden Adjuvans injiziert
wurde (8B und 8C). Beide
Adjuvantien erzielten signifikante Wirkungen. Die Schutzwirkung
von Cop-1 verringerte sich mit der Zeit zwischen Immunisierung und Glutamat-Eindringen:
die mittlere prozentuale Überlebensrate
an RGCs war signifikant höher
als in den PBS-injizierten Netzhäuten,
wenn eine Cop-1-Immunisierung sofort oder 24 h nach der Glutamat-Injektion
gegeben wurde und war nicht signifikant, wenn Cop-1 48 h nach der
Glutamat-Injektion
gegeben wurde (8D). Interessanterweise schützte die
Immunisierung mit Cop-1 die Mäuse
nicht vor Toxizität,
die durch NMDA verursacht wurde (9), von
dem kürzlich
durch das Labor der vorliegenden Erfinder gezeigt wurde, dass es
in diesem Modell in vivo einen RGC-Tod mit anderen Merkmalen als
jenen, die für
apoptotischen Tod typisch sind, verursacht.
-
Adoptiver Transfer von
T-Zellen, die auf Cop-1 reagieren, schützt gegen Glutamat-Toxizität.
-
Um
festzustellen, ob die beobachtete Immunisierung mit Cop-1 zur T-Zell-vermittelten
Neuroprotektion gegen Glutamat-Toxizität führt, wurden 5 × 106 Cop-1-reaktive T-Zellen (250 μl intraperitoneal)
sofort nach der Injektion von Glutamat (200 nMol) passiv in Mäuse überführt. Eine
Woche später
hatten signifikant mehr RGCs in den Mäusen überlebt, denen Cop-1-reaktive
T-Zellen (1978 ± 86,
n = 6) injiziert wurden, als in den Kontrollmäusen (1238 ± 2, n = 3), denen PBS intraperitoneal
injiziert wurde (10).
-
Cop-1-Immunisierung schützt retinale
Ganglionzellen vor Tod, der durch Augenhochdruck bei Ratten induziert wird.
-
Lewis-Ratten
wurden mit einem Abstand von 1 Woche 2 Laserbehandlungen unterzogen,
um die IOP zu erhöhen.
Nachfolgende Messungen zu den angezeigten Zeitpunkten über einen
Zeitraum von 3 Wochen zeigten, dass der IOP 2 Wochen nach den Laserbehandlungen
auf 30 ± 0,4
mm HG (Mittelwert ± SEM)
angestiegen war und danach etwa auf diesem Wert blieb (11A). Die Überlebensrate
der retinalen Ganglionzellen, gemessen 3 Wochen nach der anfänglichen
Laserbehandlung, war bei diesen Ratten signifikant geringer (um
19,9% ± 0,51
%, Mittelwert ± SEM)
als bei nicht-gelaserten Kontrollratten (11B).
Um die Wirkung der Cop-1-Immunisierung auf das Überleben der retinalen Ganglionzellen
zu untersuchen, wurden Ratten mit Cop-1 emulgiert in CFA am Tag
der ersten Laserbehandlung immunisiert. Kontrollratten wurde PBS
im gleichen Adjuvans injiziert. Nach drei Wochen wurden die retinalen
Ganglionzellen rückläufig markiert
und 24 h später
wurden die Netzhäute
ausgeschnitten, im Ganzen präpariert
und die markierten retinalen Ganglionzellen wurden gezählt. Die
Anzahl der überlebenden
retinalen Ganglionzellen in den mit Cop-1 immunisierten Ratten war
signifikant höher
als in den PBS/CFA-injizierten Kontrollen (11C),
der IOP in beiden Gruppen von Ratten blieb so hoch wie in der Gruppe
der mit Laser behandelten Ratten, die keine Injektionen erhalten
hatten (11A). Eine ähnliche, jedoch leicht geringere
Wirkung wurde bei Ratten beobachtete, die mit Cop-1 immunisiert
wurden, wenn ihr IOP schon hoch war (11D).
-
(7) Diskussion der Ergebnisse
-
Bis
jetzt wurde für
Läsionen
des Rückenmarks,
eine der üblichsten,
jedoch zerstörerischen
traumatischen Verletzungen in Industriegesellschaften kein Heilmittel
gefunden. Seit mehr als 40 Jahren ist bekannt, dass ZNS-Neuronen,
anders als Neuronen des peripheren Nervensystems nur eine begrenzte
Fähigkeit
haben, sich nach einer Verletzung zu regenerieren. Während der
letzten 20 Jahre ergaben Versuche, die Regeneration zu fördern, Ansätze, die
zu einer teilweisen Erholung führten.
Während
der letzten Jahre wurde offensichtlich, dass obwohl die meisten
der traumatischen Verletzungen, die dem menschlichen Rückenmark
zugefügt
werden, partiell sind, der entstandene funktionelle Verlust trotzdem
schlimmer ist als der Schwere der anfänglichen Verletzung zugeschrieben
werden kann; der selbstverlängernde
Prozess der sekundären
Degeneration scheint entscheidend zu sein.
-
Kürzlich führte ein
wesentlicher Forschungsversuch zur Hemmung der durch Verletzung
induzierten sekundären
Degeneration. Alle Versuche hatten bis jetzt pharmakologische Grundlagen
und einige ergaben eine verbesserte Erholung von spinalem Schock.
Die vorliegenden Studien beschreiben im Gegensatz dazu eine Zelltherapie,
die das, was ein natürlicher
Mechanismus der Selbsterhaltung zu sein scheint, ausweitet und führt nach
einer einzigen Behandlung zu langanhaltender Genesung. Das Ausmaß dieser
Genesung scheint jenes zu übertreffen,
von dem bei Verwendung von pharmakologischen Verfahren berichtet
wird.
-
In
den meisten Geweben löst
ein durch Verletzung ausgelöster
Schaden eine zelluläre
Immunreaktion aus, die so wirkt, dass sie das Gewebe schützt und
seine Homöostase
erhält.
Diese Reaktion wurde Makrophagen und anderen Zellen zugeschrieben,
die die natürliche
Waffe des Immunsystems umfassen. Es wurde nicht angenommen, dass
Lymphocyten, die für
die adaptive Immunität
verantwortlich sind, bei der Erhaltung des Gewebes beteiligt sind.
Adaptive Immunität
wird, gemäß traditioneller
Lehrmeinung, gegen Gefahren von außen gerichtet. Die vorliegenden
Studien zeigen jedoch nun, dass die adaptive T-Zell-Immunantwort
sogar dann schützend
sein kann, wenn es keine Invasion durch Krankheitserreger von außen gibt.
Im Fall der Gewebeerhaltung liegt die Spezifität der T-Zellen bei Selbst-Antigenen des Gewebes.
-
Die
Ergebnisse der vorstehenden Beispiele zeigen die neuroprotektive
Wirkung von T-Zellen, die in einem quetschverletzten ZNS-Nerv sowie
in einem Sehnerv, der einer Glutamat-Toxizität ausgesetzt ist, auf Cop-1
reagieren. Im Ratten-Modell
einer partiellen Quetschung des Sehnervs hatte die adoptive Verabreichung
von Cop 1-reaktiven T-Zellen oder die Impfung mit Cop 1 am Tag der
ZNS-Verletzung eine
deutliche präventive
Wirkung auf die sekundäre
Degeneration von Nervenfasern. Dies ist das erste Mal, dass es sich zeigt,
dass eine Impfung ein mögliches
Verfahren ist, um die Ausbreitung des Schadens nach traumatischer Verletzung
des Sehnervs zu verhindern.
-
Nach
Quetschverletzung des Ratten-Sehnervs ergab eine Injektion von Cop
1-reaktiven T-Zellen
einen signifikanten Schutz gegen die zerstörerische Wirkung von sekundärer Degeneration.
T-Zellen reicherten sich wie erwartet an der Stelle der Verletzung
an, aber sie reicherten sich auch im unverletzten Nerv an. Die Anreicherung
von T-Zellen im unverletzten ZNS ist nur möglich, wenn es durch das präsentierte
Antigen eine Erkennung des T-Zellrezeptors gibt. Aktivierte T-Zellen
können
unabhängig
von ihrer Spezifität
durch die Blut-Hirn-Schranke wandern, jedoch nur die, die auf ZNS-Antigene
reagieren, können
sich im unverletzten Nerv anreichern (Hickey, 1991). Somit zeigen
die vorliegenden Ergebnisse zum ersten Mal eine Kreuzerkennung zwischen
Cop 1-reaktiven T-Zellen und Bestandteilen von ZNS-Myelin in vivo.
Diese Erkennung an der Verletzungsstelle dient wahrscheinlich als
Auslöser
für die
T-Zell-Aktivierung, die, möglicherweise über die
Sezernierung von geeigneten neurotrophen Faktoren oder anderen,
noch zu entdeckenden Faktoren durch die aktivierten T-Zellen zum
Umschalten der T-Zellen auf den protektiven Phänotyp führt. Diese Studie zeigt, dass Cop
1-reaktive T-Zellen, die durch ihr spezifisches Antigen aktiviert
werden, signifikante Mengen an BDNF sezernieren, ein Neurotrophin,
das beim Überleben
von Nervenzellen eine wichtige Rolle spielt (Yan et al., 1992; Sendtner
et al, 1992).
-
Cop-1
wurde ursprünglich
hergestellt, um die Aktivität
von basischem Myelin-Protein
(MBP) nachzuahmen und um die entzündliche demyelinisierende Krankheit
EAE bei Wiederkäuern
zu induzieren. Es wurde jedoch herausgefunden, dass es nicht-enzephalitogen
ist und sogar EAE, das durch MBP (Teitelbaum et al., 1971), Proteolipid-Protein
(PLP) (Teitelbaum et al., 1996), oder MOG (Ben-Nun et al., 1996)
induziert wird, unterdrückt.
Cop-1 verhindert die Entwicklung von EAE bei Wiederkäuern und
verbessert Multiple Sklerose beim Menschen. Studien haben eine partielle
Kreuzreaktivität
zwischen Antikörpern
und Cop-1 und MBP oder zwischen T-Zellen, die auf diese Antigene gerichtet
sind gezeigt (Webb et al., 1973 und Teitelbaum et al., 1988). Cop-1
kann als Antagonist des T-Zell-Antigenrezeptors für das immundominante
MBP-Epitop dienen (Aharoni et al., 1998). Es kann ebenfalls an verschiedene
Haupt-Histokompatibilitätskomplex
(MHC)-Klasse II-Moleküle binden
und sie daran hindern, an T-Zellen mit spezifischen Antigen-Erkennungseigenschaften
zu binden (Fridkis-Hareli et al., 1998). Bei Wiederkäuern induziert
Cop-1 die Expression regulatorischer Zellen, die die enzephalitogenen
T-Zellen supprimieren.
Es wurde herausgefunden, dass adoptiver Transfer solcher T- Zellen bei Wiederkäuern die
Entwicklung von EAE, das durch MBP (Aharoni et al., 1993), (PLP)
(Teitelbaum et al., 1996), oder Homogenat des gesamten Rückenmarks
(Aharoni et al., 1997) induziert wird, hemmt.
-
Somit
induziert die Immunisierung mit Cop-1, anders als die Immunisierung
mit MBP und anderen Myelin-assoziierten Proteinen EAE nicht, und
die T-Zellen, die in Abwesenheit von Adjuvantien durch Cop-1 hervorgerufen
werden, sind regulatorischer Natur. Die Immunsierung mit Cop-1 in
IFA direkt nach der Verletzung, gefolgt von einem Booster zwei Tage
später,
hatten eine starke neuroprotektive Wirkung. Eine solche Immunisierung
erreicht den Höhepunkt
ihrer zellulären
Reaktion wahrscheinlich innerhalb von einer Woche, es ist jedoch
berechtigt anzunehmen, dass die Anzahl an T-Zellen, die im ZNS vorliegen,
offensichtlich sogar vor diesem Zeitpunkt groß genug ist, um wenigstens
einige neuroprotektive Aktivität
auszuüben.
Es ist bekannt, dass nach der Immunisierung mit MBP Symptome von
EAE 10 Tage später
auftreten, was anzeigt, dass die Immunreaktion zu diesem Zeitpunkt
für enzephalitogene
T-Zellen stark genug ist, so dass sie sich an der Verletzungsstelle
anreichernn, ihren Schaden anrichten und EAE-Symptome hervorrufen.
Die vorliegenden Studie lässt annehmen,
dass die Immunreaktion am Sehnerv nach Immunisierung mit Cop-1 in
IFA, gefolgt von einem Booster nach zwei Tagen, ausreichend war,
die sekundäre
Degeneration zu verhindern. Es ist möglich, dass diese Reaktion
im Vergleich zu der Reaktion, die nach passivem Transfer von T-Zellen
erhalten wurde, etwas verspätet
auftrat, aber sie wurde nichtsdestotrotz noch innerhalb des Zeitfensters
erreicht, das zum Schutz der Nervenfasern, die der primären Läsion entkamen,
notwendig ist. Frühere
Studien am Sehnerv der Ratte zeigten, dass der Verlust an Neuronen,
der von der sekundären
Degeneration herrührt,
eine Woche nach leichter Quetschverletzung etwa 25% und zwei Wochen
nach der Verletzung etwa 55% beträgt (Yoles, 1998). Somit gäbe es, auch
wenn die Reaktion eine Woche benötigte,
um die benötigte
Stärke
zu erreichen, zu diesem Zeitpunkt immer noch Nervenfasern, die Schutz
brauchten. Ein Vergleich der Ergebnisse, die nach adoptivem Transfer
aktivierter Cop-1-reaktiver T-Zellen und nach aktiver Immunisierung
mit Cop-1 erzielt wurden, lässt annehmen,
dass es hinsichtlich der Zeit, die für eine maximale Wirksamkeit
benötigt
wird, zwischen beiden Behandlungen keinen signifikanten Unterschied
gibt, da das Ausmaß des
Schutzes vor sekundärer
Degeneration bei beiden in etwa gleich war. Es ist zu betonen, dass
Cop-1 hier eine Wirkung zeigt, die zu seiner bekannten Wirkung gegenteilig
ist; Cop-1 ist als Mittel bekannt, das hergestellt wurde, um T-Zell-Autoimmunität zu unterdrücken, wohingegen
es hier eine Wirkung hat, die die Aktivierung spezifischer Anti-Myelin-T-Zell-Autoimmunität benötigt.
-
Zusammengefasst
haben frühere
Studien gezeigt, dass die axonale Verletzung im ZNS von Ratten eine
autoimmune T-Zellreaktion hervorruft, die gegen Myelinproteine gerichtet
ist, die jedoch zu schwach ist, um die Nervenfasern vor sekundärer Degeneration
zu schützen.
Eine Verstärkung
dieser Immunantwort ohne das Risiko einer begleitenden Autoimmunkrankheit
wurde in dieser Studie unter Verwendung eines Copolymers erreicht,
der vom ZNS kreuz-erkannt wird, jedoch nicht enzephalitogen ist.
Die T-Zellimmunreaktion auf das Polymer, erhalten entweder durch
passiven Transfer oder durch Immunisierung zum Zeitpunkt der Verletzung,
stellt ein wirksames Mittel der post-traumatischen Erhaltung bereit.
Die hier gezeigte T-Zell-vermittelte Neuroprotektion ist sowohl
auf chronische als auch akute Verletzungen von Nerven des ZNS, bei
denen Neuronen für
Degeneration anfällig
und für
eine Neuroprotektion zugänglich
sind, anwendbar. Sie ist ebenfalls zum Schutz vor der primären und
sekundären
Degeneration, die durch Glutamat-Toxizität verursacht
wird, anwendbar. Hier in den Ergebnissen wird auch gezeigt, dass
T-Zell-abhängige
Immun-Neuroprotektion, erhalten durch passive oder aktive Immunisierung
mit Cop-1, eine wirksame Therapie für Glutamat-induzierte Toxizität bei Mäusen und
in einem Ratten-Modell mit chronisch hohem IOP ist.
-
Da
die Ergebnisse der Studien aus Beispiel 3 zeigen, dass sowohl die
passive als auch die aktive Immunisierung mit Cop-1 eine wirksame
Neuroprotektion vor Glutamat-Toxizität bereitstellen, kann eine
Impfung als Weg, die neuronale Toxizität, die mit Glutamat in Verbindung
steht, zu reduzieren, entwickelt werden. Diese Beobachtungen haben
eine Vielzahl interessanter Auswirkungen: (i) Cop-1, das als immunsuppressiver
Wirkstoff bei Patienten mit der Autoimmunkrankheit Multiple Sklerose
verwendet wird, ist als Impfung gegen Glutamat-induzierte Neurotoxizität wirksam;
(ii) der Verlust von ZNS-Neuronen auf Grund eines lokalen Stresssignals
kann von systemischer Immun-Manipulation profitieren; (iii) dieselben
Neuronen, in diesem Fall die RGCs, können von einer systemischen
Immunreaktion profitieren, unabhängig
von der Beschaffenheit und der Stelle der Verletzung, obwohl die
antigenische Spezifität
der Reaktion variieren kann; (iv) die vorteilhafte Aktivität von Cop-1,
scheint, obwohl sie offensichtlich nicht von der Art der Verletzung
(mechanisch oder biochemisch) abhängt, auf kritische Weise vom
Mechanismus des Todes, den die Verletzung aktiviert, abzuhängen. In
Beispiel 3 schützte
die induzierte Immunaktivität
die Zellen vor Tod, der durch Glutamat verursacht wurde, jedoch
nicht gegen Tod, verursacht durch NMDA; (v) Cop-1, das als Immunogen
wirkt, kann die Neuroprotektion durch einen Mechanismus induzieren,
der nicht notwendigerweise eine Kreuzerkennung von Myelin-Proteinen
benötigt.
-
Es
sollte betont werden, dass es einen wichtigen Unterschied zwischen
Immun-Neuroprotektion gegen sekundäre Degeneration und Immuntherapie
für Autoimmunkrankheiten
gibt. Während
ersteres eine aktive Beteiligung von heilsamen T-Zellen benötigt, kann
letzteres entweder von der Immunmodulation von enzephalitogenen
T-Zellen oder von ihrer Suppression profitieren. Cop-1, das als
Immunogen wirkt, kann beiden Zwecken, der Neuroprotektion vor neuronaler
Verletzung und der Therapie von Autoimmunkrankheiten, dienen. Wahrscheinlich
erreicht es dies durch Hervorrufen einer „sicheren" T-Zellreaktion, die auf der einen Seite die
zuträgliche
autoimmune T-Zellreaktion, die für
die Neuroprotektion benötigt
wird (Moalem et al., 1999a; Moalem et al., 1999b; Kipnis et al.,
2000a; Moalem et al., 2000c; und Schwartz et al., 1999) und auf
der anderen Seite die Immunmodulation bereitstellt, die für eine Vermeidung
von Autoimmunkrankheiten benötigt
wird (Neuhaus et al., 2000).
-
Es
wurde im Labor der vorliegenden Erfinder gezeigt, dass T-Zellen,
die auf MBP reaktiv sind, in Ratten-Modellen von teilweise gequetschten
Sehnerven (Moalem et al., 1999 und Schwartz et al., 1999) und Quetschverletzung
des Rückenmarks
(Hauben et al., 2000a) neuroprotektiv sind. Die vorherigen Ergebnisse im
Labor der vorliegenden Erfinder zeigten eine Kreuzerkennung zwischen
Cop 1-reaktiven
T-Zellen und Bestandteilen von ZNS-Myelin in vivo (Kipnis et al.,
2000a). Die vorliegenden Erfinder nahmen an, dass eine solche Erkennung
durch Auslösen
der T-Zellreaktivierung und somit durch Verursachen, dass die T-Zellen
auf einen protektiven Phänotyp
umschalten, einen möglichen
Mechanismus darstellen könnten,
dem die T-Zell-Neuroprotektion nach axonaler Verletzung unterliegt.
Weiterhin wurde durch die vorliegenden Erfinder gezeigt, dass Cop-1-reaktive
T-Zellen (Beispiele 1 und 2; Kipnis et al., 2000a) wie MBP-reaktive
T-Zellen (Moalem et al., 2000) signifikante Mengen an vom Gehirn
abgeleitetem neurotrophem Faktor, ein Neurotrophin, das bei neuronalem Überleben
eine große
Rolle spielt (Sendtner et al, 1992 und Yan et al., 1992) sezernieren,
wenn sie durch ihr spezifisches Antigen aktiviert werden. In Beispiel
1 untersuchte das Labor der vorliegenden Erfinder T- Zell-Immunität gegen
Cop-1 nach physischem Trauma der weißen Substanz, bei der Anti-Cop-1-T-Zellen mit
freigelegten Myelin-Epitopen kreuzreagieren können. Das aus Beispiel 3 vorliegende
Ergebnis, dass die Immunisierung mit Cop-1 gegen Glutamat-Toxizität aktiv
ist, was neuronale Zellkörper
unter Bedingungen, bei denen wahrscheinlich keine Myelin-Antigene
beteiligt sind, direkt beeinträchtigt,
lässt annehmen,
dass Anti-Cop-1-T-Zellen auf Grund ihrer Heterogenität auf verschiedene
Antigene, einschließlich
jener, die mit der Netzhaut in Verbindung stehen, reagieren. Die
Cop-1-reaktiven T-Zellen können
direkt mit Glutamat selbst interagieren. Eine solche Interaktion
könnte
die Cop-1-reaktiven T-Zellen, oder endogene T-Zellen in einen protektiven
Phänotyp
umzuwandeln.
-
Die
Möglichkeit,
dass Cop-1-reaktive T-Zellen innerhalb des Glaskörpers mit dem injizierten Glutamat oder
innerhalb der Netzhaut mit Microglia-aktivierten Zellen interagieren
könnten,
wird durch die großen
Zahlen an eindringenden Lymphocyten, die 24 h nach Glutamat-Injektion
im Glaskörper
beobachtet wurden, unterstützt.
Bei Mäusen,
denen Cop-1 injiziert wurde, umfassen die eindringenden Lymphocyten
wahrscheinlich einige, die für
Cop-1 spezifisch sind. Diese Beobachtung, zusammen mit dem Ergebnis,
dass der passive Transfer von Cop-1-reaktiven T-Zellen eine ähnliche
Wirkung hat wie die aktive Immunisierung mit Cop-1, lässt annehmen,
dass die Wirkung der Impfung in der Tat eher durch T-Zellen vermittelt
wird denn durch humorale Immunität
oder durch Cop-1 selbst. Da Glutamat, als Mediator der sekundären Degeneration,
in einiger zeitlicher Distanz von der primären Verletzung auftaucht (Yoles
et al., 1998), kann im Fall einer direkten Glutamat-Toxizität ein Behandlungsfenster
von 24 h annehmen lassen, dass das Behandlungsfenster bei Fällen von ZNS-Trauma
viel weiter ist. Es ist interessant zu bemerken, dass Cop-1 keine
Schutzwirkung hatte, wenn die toxische Verletzung durch NMDA induziert
wurde. Dies stimmt mit Studien aus dem Labor der vorliegenden Erfinder überein,
die zeigten, dass NMDA ein beinahe sofortiges Todessignal aussendet,
ohne klare Signale der Apoptose und anscheinend ohne andere Therapiemöglichkeit
als der durch NMDA-Rezeptor-Antagonisten. Es ist deshalb nicht überraschend,
dass die Immunisierung mit Cop-1 gegen NMDA-induzierte Toxizität unwirksam
war. Es bleibt noch festzustellen, ob die Aktivität von Cop-1
als eher neuroprotektives denn als suppressives Mittel von seinem
Verabreichungsweg abhängig
ist. Es muss ebenfalls noch bestimmt werden, wie die lokale Anreicherung
von für
ZNS-Antigen spezifischen T-Zellen oder von T-Zellen, die für kreuzreagierende Antigene
wie Cop-1 spezifisch
sind, die Neuroprotektion nach ZNS-Verletzungen vermitteln.
-
Die
T-Zell-vermittelte Neuroprotektion, die in den Studien von Beispiel
3 gezeigt wurde, könnte
sowohl für
chronische als auch für
akute Verletzungen von ZNS-Nerven anwendbar sein, bei denen Neuronen
für Degeneration
empfänglich
und für
die Neuroprotektion zugänglich
sind (Schwartz et al., 2000a; Schwartz et al., 2000b; Doble et al.,
1999; und Grunblatt et al., 2000). Ein chronischer Zustand, Glaukom,
wird oft mit IOP in Verbindung gebracht, und ist ein führender
Verursacher von Blindheit. Es ist jedoch eine allgemeine Erfahrung, dass
die Krankheit weiter fortschreiten kann, obwohl der IOP innerhalb
des normalen Bereichs bleibt, was annehmen lässt, dass eine mechanische
Kompression wahrscheinlich nicht der einzige Grund für einen
Schaden des Sehnervs ist, und dass eine Behandlung zusätzlich zur
Verringerung der IOP deshalb eine neuroprotektive Therapie umfassen
sollte (hinsichtlich einer Rezension vgl. Osborne et al., 1999;
Schwartz et al., 2000c; und Weinreb et al., 1999). Jüngste Studien
haben zum Beispiel gezeigt, dass eine Behandlung mit einem Glutamat-Antagonisten
(Chaudhary et al., 1998) oder einem Stickstoffoxid-Synthaseinhibitor
(Neufeld et al., 1999) in einem Ratten-Modell mit erhöhtem IOP
retinalen Ganglionzelltod abschwächt.
Es besteht jedoch die Gefahr, dass eine Interferenz durch diese
Mittel mit der physiologischen Reaktion, obwohl an der pathologischen
Stelle möglicherweise
zuträglich,
für normales
Gewebe schädlich
sein könnte,
was zu unerwünschten
Nebenwirkungen führt.
Ein stärker
bevorzugter Ansatz vom klinischen Gesichtspunkt her ist deshalb,
die eigene Verteidigungsmaschinerie des Gewebes zu nutzen und zu
verstärken.
-
Das
vorliegende Ergebnis der Neuroprotektion, das sogar dann erreicht
wird, wenn der Druck hoch bleibt, ist möglicherweise aus klinischer
Sicht sehr vorteilhaft. Und zwar deshalb, weil sogar ein Druck,
der auf einen normalen Wert reduziert ist, für Patienten mit Glaukom, bei
denen die übriggebliebenen
Neuronen verletzlicher sind als normale (Agies, 2000) nicht notwendigerweise
sicher ist. Darüber
hinaus könnte
eine Reduktion des IOP dahingehend, was bei solchen Patienten als
sicher betrachtet werden könnte,
nämlich
auf 12 mm Hg, nicht durchführbar
sein.
-
Nachdem
diese Erfindung nun vollständig
beschrieben ist, wird der Fachmann verstehen, dass diese innerhalb
eines weiten Bereichs äquivalenter
Parameter, Konzentrationen und Bedingungen ohne unzumutbares Experimentieren
durchgeführt
werden kann.
-
Während diese
Erfindung in Verbindung mit spezifischen Ausführungsformen davon beschrieben
worden ist, ist zu verstehen, dass weitere Modifikationen durchgeführt werden
können.
Diese Anmeldung soll alle Varianten, Verwendungsmöglichkeiten
oder Adaptationen der Erfindung abdecken, die im Allgemeinen den Prinzipien
der Erfindung folgen und solche Abweichungen von der vorliegenden
Offenbarung umfassen, wie sie mit bekannter oder gewohnheitsmäßiger Praxis
auf dem Fachgebiet einhergehen, zu dem die Erfindung gehört, und
wie zu den vorstehenden wichtigen Merkmalen, die im Folgenden im
Bereich der angehängten
Patentansprüche
gezeigt werden, angefügten
werden können.
-
Bezugnahmen
auf bekannte Verfahrensschritte, herkömmliche Verfahrensschritte,
bekannte Verfahren oder herkömmliche
Verfahren sind in keiner Weise ein Zugeständnis, dass irgendein Aspekt,
eine Beschreibung oder Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung auf dem jeweiligen Fachgebiet offenbart,
gelehrt oder vorgeschlagen wird.
-
Die
vorangehende Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen wird die allgemeine
Natur der Erfindung vollständig
zeigen, so dass andere, durch Anwendung von Wissen aus dem Fachgebiet
(einschließlich
der hierin zitierten Bezugnahmen), solche spezifischen Ausführungsformen
ohne unzumutbares Experimentieren, ohne Abweichen vom allgemeinen
Konzept der vorliegenden Erfindung leicht modifizieren und/oder für verschiedene
Anwendungsformen adaptieren können.
Deshalb sollen solche Adaptationen und Modifikationen, basierend
auf der hierin dargestellten Lehre und Anleitung, innerhalb der
Bedeutung und des Bereichs von Äquivalenten
der offenbarten Ausführungsformen
sein. Es ist zu verstehen, dass die Phraseologie oder Terminologie
hierin zum Zweck der Beschreibung und keine Beschränkung ist,
so dass die Terminologie oder Phraseologie der vorliegenden Spezifizierung
vom Fachmann hinsichtlich der hierin dargelegten Lehre und Anleitung
in Kombination mit dem Wissen des Durchschnittsfachmanns zu interpretieren
sind.
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