MXPA02007109A

MXPA02007109A - El uso del copolimero 1 y peptidos y polipeptidos relacionados y celulas t tratadas con estos para proteger a las celulas del sistema nervioso central de la toxicidad del glutamato.

Info

Publication number: MXPA02007109A
Application number: MXPA02007109A
Authority: MX
Inventors: Schwartz Michal Eisenbach
Original assignee: Yeda Res & Dev
Priority date: 2000-06-07
Filing date: 2001-01-22
Publication date: 2002-12-13
Also published as: IL150801A0; DK1294390T3; EP1294390A2; ATE314860T1; CY1105263T1; JP2004507460A; WO2001093893A2; JP4328090B2; US20020037848A1; AU3451801A; AU783031B2; CN1462190A; NZ520282A; WO2001093893A3; IL150801A; CA2398277C; KR20030007397A; CN100438906C; HK1058892A1; ES2256200T3

Abstract

Se proveen metodos para tratar lesion a o enfermedad del sistema nervioso central o periferico; en una modalidad, el tratamiento se efectua mediante la administracion de celulas T activadas que reconocen un antigeno de Cop 1 o un peptido o polipeptido relacionado con Cop 1 para promover la regeneracion nerviosa o para prevenir o inhibir la degeneracion neuronal dentro del sistema nervioso; en otra modalidad, el tratamiento implica la administracion de Cop 1 o un peptido o polipeptido relacionado con Cop 1 para promover la regeneracion nerviosa o para prevenir o inhibir la degeneracion neuronal en el sistema nervioso, ya sea el sistema nervioso central o el sistema nervioso periferico; las celulas T activadas, las cuales han sido activadas mediante la presencia de Cop 1 o un peptido o polipeptido relacionado con Cop 1, pueden administrarse solas o en combinacion con Cop 1 o un peptido o polipeptido relacionado con Cop 1.

Description

EL USO DEL COPQUMER01 Y PEPTIDO® Y POLP PTIDOS RELA€IOflADOS Y CÉLULAS T TRATADAS CON EStOS PARA PROTEGER A LAS CÉLULAS DEL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL DE LA TOXICIDAD DEL GLUTAMATO REFERENCIA RECIPROCA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reclama el beneficio de la prioridad a partir de las solicitudes de E.U.A. nos. 60/209, 799, presentada el 7 de junio del 2000, y 09/620, 216, presentada el 20 de julio del 2000. Los contenidos de cada una de las solicitudes nos. 60/209, 799 y 09/620, 216 se incorporan en la presente como referencias.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones y métodos para la promoción de la regulación nerviosa o prevención o inhibición de la degeneración neuronal para mejorar los efectos de lesiones o enfermedades del sistema nervioso (SN). En particular, la invención se refiere a composiciones que comprenden copolímero 1 (Cop 1) o un péptido o polipéptido relacionado con Cop-1 , y/o células T activadas tratadas con Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionado con Cop-1, para promover la regeneración nerviosa o para prevenir o inhibir la degeneración neuronal ocasionada por lesión o enfermedad de nervios dentro del sistema n central o sistema nervioso periférico de un sujeto humano. Las composiciones de la presente invención pueden administrarse solas o puecfen administrarse opcionalmente en cualquier combinación deseada.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El sistema nervioso comprende el sistema nervioso central y el sistema nervioso periférico. El sistema nervioso central (SNC) está compuesto del cerebro y la médula espinal; el sistema nervioso periférico (SNP) consiste de todos los otros elementos neurales, es decir los nervios y los ganglios fuera del cerebro y de la médula espinal. El daño a sistema nervioso puede resultar a partir de una lesión traumática, tal como un trauma penetrante o un trauma directo, una enfermedad o trastorno, incluyendo pero no limitado a la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), neuropatía diabética, demencia senil, e isquemia. El mantenimiento de la integridad del sistema nervioso central es un complejo "acto de balanceo" en el que los compromisos se apegan al sistema inmune. En la mayoría de los tejidos, el sistema inmune desempeña una parte esencial en la protección, reparación, y curación. En el sistema nervioso central, debido a este privilegio inmune único, las reacciones inmunológicas están relativamente limitadas (Streilein, 1993, 1995). Un cuerpo de evidencias en crecimiento indica que la falla en el sistema nervioso central de mamíferos para lograr la recuperación funcional después de la lesión es un reflejo de un diálogo no efectivo entre el tejido dañado y el sistema inmune. Por ejemplo, la comunicación restringida entre el sistema nervioso central y los macrófagos de origen sanguíneo afecta la capacidad de los axones axotomizados para crecer de nuevo; los transplantes de macrófagos activados pueden promover el crecimiento de nuevo del sistema nervioso central (Lazarov Spiegler et al, 1996; Rapalino et al, 1998). Las células T activadas se ha mostrado que entran al parénquima del sistema nervioso central, sin importar su especificidad antigénica, pero solamente las células T que son capaces de reaccionar con un antígeno del sistema nervioso central parecen persistir ahí (Hickey et al, 1991; Werkele, 1993; Kramer et al, 1995). Las células T reactivas a los antígenos de la materia blanca del sistema nervioso central, tal como la proteína básica de mielina (MBP), pueden inducir la encefalomielitis autoinmune experimental de enfermedad paralítica (EAE) varios días después de su inoculación dentro de ratas recipientes sin afección (Ben-Nun, 1981a). Las células T anti-MBP también pueden estar implicadas en la enfermedad humana de la esclerosis múltiple (Ota, K. et al, 1990; Martin, 1997). Sin embargo, a pesar de su potencial patogénico, las clonas de células T anti-MBP están presentes en el sistema inmune de sujetos saludables (Burns, 1983; Pette, M. et al, 1990; Schluesener et al, 1985). Las células T activadas, las cuales patrullan normalmente el sistema nervioso central intacto, se acumulan transitoriamente en sitios de lesiones de la materia blanca del sistema nervioso central (Hirschberg et al, 1998). Una consecuencia catastrófica de la lesión del sistema nervioso central es que el daño primario frecuentemente está compuesto por la pérdida secundaria gradual de neuronas adyacentes que aparentemente no habían sido dañadas, o solamente estaban marginalmente dañadas, por la lesión inicial (Faden et al, 1992; Faden 1993; Mclntosh, 1993). La lesión primaria ocasiona cambios en las concentraciones extracelulares de iones, elevación de las cantidades de radicales libres, liberación de neurotransmisores, agotamiento de factores de crecimiento, e inflamación local. Estos cambios disparan una cascada de eventos destructivos en las neuronas adyacentes que inicialmente escaparon a la lesión primaria (Lynch et al, 1994; Bazan et al, 1995; Wu et al, 1994). Este daño secundario está mediado por la activación de canales dependientes de voltaje o canales controlados por agonistas, fugas de iones, activación de enzimas dependientes de calcio tales como proteasas, lipasas y nucleasas, dísfunción mitocondrial y agotamiento de energía, culminando en la muerte de la célula neuronal (Yoshina et al, 1991; Hovda et al, 1991; Zivin et al, 1991; Yoles et al, 1992). La pérdida extendida de neuronas más allá de la pérdida ocasionada directamente por la lesión primaria se ha denominado "degeneración secundaria." Uno de los mediadores más comunes los cuales ocasionan auto- propagación del evento de enfermedad cuando el factor de riesgo primario se remueve o se atenúa es el glutamato. Un aminoácido excitador capaz de » exhibir una actividad dual: desempeñando un papel pivotal en el funcionamiento del sistema nervioso central normal (SNC) como un neurotransmteor esencial, pero volviéndose tóxico cuando sus niveles fisiológicos están excedidos. La elevación del glutamato se ha reportado en 5 muchos trastornos del SNC. En su papel como un compuesto excitotóxico, el glutamato es uno de los mediadores más comunes de toxicidad en trastornos degenerativos agudos y crónicos (incluyendo degeneración del nervio óptico en el glaucoma) (Pitt et al., 2000 y Schoepp et al., 1996). El glutamato endógeno se ha atribuido al daño cerebral que ocurre precisamente después 10 de la lesión cerebral por estado epiléptico, isquemia cerebral o lesión traumática cerebral. También puede contribuir a la neurodegeneración crónica en dichos trastornos como esclerosis lateral amiotrófica y corea de Huntington. La investigación intensiva se ha abocado a atenuar el efecto 15 citotóxico del glutamato por el uso de fármacos que actúan localmente, tales como los antagonistas del receptor NMDA (Brauner-Osborne et al., 2000). La terapia convencional de este tipo frecuentemente no es satisfactoria, puesto que, al neutralizar del efecto tóxico es probable que interfiera con el 48?-- funcionamiento fisiológico. En los humanos, dichos compuestos tienen efectos 20 psicotrópicos y otros efectos laterales que los hacen poco adecuados como agentes terapéuticos. Estos también tienen la desventaja de interferir con el funcionamiento fisiológico esencial del glutamato como un neurotransmisor ubicuo del SNC. Debido a que la actividad el glutamato es esencial para el -« . funcionamiento fisiológico normal, incluso es potencialmente devastador después de la lesión aguda o en los trastornos crónicos del SNC, cualquier intento para neutralizar su efecto perjudicial debe hacerlo sin eliminar su actividad esencial en otros sitios en el cuerpo. Otra consecuencia trágica de la lesión del sistema nervioso central es que las neuronas en el sistema nervioso central de mamíferos no llevan a cabo regeneración espontánea después de una lesión. Por lo tanto, la lesión del sistema nervioso central ocasiona deficiencia permanente de las funciones motoras y sensitivas. Las lesiones a la médula espinal, sin importar la severidad de la lesión, inicialmente resultan en una parálisis funcional completa conocida como choque de médula espinal. Alguna recuperación espontánea a partir del choque de médula espinal puede observarse, iniciando pocos días después de la lesión y disminuyendo en tres a cuatro semanas. Cuanto menos severa sea la lesión, mejor el resultado funcional. El grado de recuperación es una función de la cantídad de tejido sin daños menos el tejido perdido debido a la degeneración secundaria. La recuperación a partir de la lesión podría mejorarse por el tratamiento neuroprotector que podría reducir la degeneración secundaria. Por ejemplo, el alivio del efecto del glutamato es un blanco frecuente en el desarrollo de fármacos neuroprotectores. Entre los fármacos los cuales han sido desarrollados para este propósito están los antagonistas del receptor a N-metil-D-aspartato (NMDA) o antagonistas al ácido alfa- amino-3-hidroxi-5-met?l-D-aspartato (AMPA). Los fármacos " inevitablemente tendrán efectos laterales severos puesto que éstos interfi r » con el funcionamiento de los receptores NMDA y AMPA, los cuales son cruciales para la actividad del SNC. Uno de los antagonistas para el receptor NMDA más intensamente estudiados es MK801, el cual provee de una protección efectiva pero con severos efectos laterales. En los modelos animales distinguía cerebral y lesión cerebral traumática, los antagonistas del receptor NMDA y AMPA protegen en contra del daño agudo de cerebro y déficits conductuales reatrasados. Dichos compuestos se han puesto a evaluación en humanos, pero la eficiencia terapéutica aún debe de establecerse. Otras condiciones clínicas que pueden responder a los fármacos que actúan sobre la transmisión glutamatérgica incluyen la epilepsia, amnesia, ansiedad, hiperalgesia y psicosis (Meldrum, 2000). En el laboratorio de los inventores de la presente invención, ha sido descubierto recientemente que las células T activadas que reconocen un antígeno del sistema nervioso (SN) del paciente promueven la regeneración nerviosa o confieren neuroprotección. Se hace referencia la publicación PCT WO 99/60021, los contenidos completos de la cual se incorporan en la presente invención como referencia. Más específicamente, las células T reactivas a MBP se mostraron como neuroprotectoras en modelos de rata con lesiones de nervio óptico (Moaiem et al, 1999) y médula espinal (Hauben et al, 2000) parcialmente aplastados. No es sino hasta recientemente, que se ha pensado que el sistema inmune excluye a las células inmunes de participar en la reparación del sistema nervioso. Fue bastante sorprendente descubrir que las células T activadas específicas del SN podrían ser utilizadas para promover la regeneración nerviosa o para proteger al tejido del sistema nervioso de la degeneración secundaria lo cual puede seguir al daño ocasionado por la lesión o enfermedad del SNC o SNP. Las células T activadas específicas del SN como se describen en dicha publicación WO 99/60021 son células T activadas que tienen especificidad para un antígeno del SN de un paciente. El antígeno utilizado para conferir la especificidad a las células T puede ser un autoantígeno-SN del paciente, un péptido derivado del mismo, o un antígeno-SN de otro individuo o incluso de otra especie, o un péptido derivado del mismo, siempre y cuando la célula T activada reconozca un antígeno en el SN del paciente. Dichas células T activadas específicas del SN se utilizan para promover la regeneración nerviosa o para prevenir o inhibir los efectos de la enfermedad. Si la enfermedad a ser tratada es una enfermedad autoinmune, en la que el antígeno autoinmune es un antígeno SN, las células T las cuates se utilizan para el tratamiento del daño neural o la degeneración ocasionada por dicha enfermedad no se activan en contra del mismo antígeno autoinmune implicado en la enfermedad. La publicación PCT anteriormente referida WO 99/60021 describe que la terapia para mejorar los efectos de la lesión o enfermedad comprende la administración de células T activadas específicas del SN opcionalmente pueden estar en combinación con un antígeno o péptido específico del SN derivado a partir de éstas. Un antígeno específico del SN como se define en dicha WO 99/60021 se refiere a un antígeno que activa específicamente a las células T que sigue a la activación, las células T activadas se acumulan en un sitio de la lesión o enfermedad en el SN del paciente. Además, la administración oral del antígeno específico del SN o un péptido derivado del mismo puede combinarse con la inmunización activa para construir una respuesta de célula T crítica inmediatamente después de la lesión. En esta técnica precedente, el antígeno específico del SN utilizado para activar a las células T in vitro o in vivo o para inmunizar paciente, puede ser un antígeno obtenido a partir del tejido del SN, preferiblemente a partir de tejidos en un sitio de la lesión o enfermedad del SN. Los antígenos o epítopes naturales o sintéticos específico de SN se describieron para incluir MBP, MOG, MAG, S-100, BETA-a iloide, Thy-1, PO, P2 y un receptor de neurotransmisor. Los ejemplos ilustrativos específicos de dichos antígenos específicos de SN útiles descritos en WO 99/60021 son MBP, proteína de proteolípido humano (PLP), una oKgoproteína de oligodendrocito de humano. También descritos están los péptidos derivados a partir de antígenos específicos del SN, autoantígenos o derivados de antígenos específicos del SN que activan a las células T, pero que no inducen una enfermedad inmune, tal como un péptido que comprende los aminoácidos 51- 70 de la proteína básica de mielina (MBP). El mecanismo de acción de dichas células T específicas de SN aún no ha sido descubierto, pero la acumulación masiva de células T exógenamente administradas en el sitio de la lesión del SNC sugiere que la presencia de las células T en el sitio de la lesión juega un papel prominente en la neuroprotección. Parece, sin embargo, que la acumulación, a pesar de ser una condición necesaria, no es suficiente para el propósito, puesto que las células T específicas al no auto-antígeno de ovalbúmina también se acumulan en el sitio, pero no tienen efecto neuroprotector (Hirschberg et al, 1998). Un copolímero al azar básico sintético de alto peso molecular que consiste de los residuos L-Ala, L-Glu, L-Lys y L-Tyr en la relación molar aproximadamente seis partes de Ala a dos partes de Glu a 4.5 partes de Lys a 1 parte de Tyr, y que tiene un peso molecular de 15,000- 25,000, se describió inicialmente en la patente de E.U.A. No. 3, 849, 550 como un agente para tratamiento o prevención de encefalomielitis alérgiGa experimental (EAE), una enfermedad que se parece a la esclerosis múltiple (MS) que puede ser inducida en animales susceptibles. Los lotes de este copolímero de peso molecular promedio de 23,000, designado copolímero 1 o Cop 1 , se mostraron que son altamente efectivos para proteger y suprimir EAE en varias especies animales (Teitelbaum et al, 1971, 1974a, 1974b). Posteriormente, se encontró que Cop 1 reducía significativamente el número de recaídas en los pacientes con la forma que remite a la exacerbación de MS (Bornstein et al, 1990; Sela et al, 1990; Johnson et al, 1994). El copolímero 1, en la forma de sales de acetato de polipéptido sintéticos que contienen L-Glu, L-Ala, L-Tyr y L-Lys con una fracción molar promedio de 0.141 , 0.427, 0.095 y 0.338, es el ingrediente activo de COPRAXONE®, un medicamento para tratamiento de esclerosis múltiple. Por lo tanto es aparente el efecto del copolímero 1 en el tratamiento de MS está en el logro de la supresión o desactivación de la reactividad de la célula T autoinmune a los antígenos de mielina en los pacientes con esclerosis múltiple. Para este propósito, el copolímero 1 se administra sin adyuvantes mediante inyección subcutánea diariamente. Cop 1 se diseñó originalmente para limitar a MBP y para inducir EAE, pero se encontró que no era encef alitogénico e incluso para suprimir EAE inducida por MBP (Teitelbaum et al, 1971) (PLP) (Teitelbaum et al, 1996), o (MOG) (Ben-Nun et al, 1996). Los mecanismos precisos por medio de los cuales Cop 1 previene el desarrollo de EAE y mejora la esclerosis múltiple (MS) aún no se conocen. Sin embargo, algunas propiedades inmunológicas importantes de este copolímero han surgido. Los estudios han demostrado una reactividad cruzada parcial de Cop 1 con MBP tanto al nivel de la célula T (Webb et al, 1973) como al nivel del anticuerpo (Teitelbaum et al, 1988). Cop 1 puede servir como un antagonista del receptor del antígeno en la célula T para el epítope inmunodominante de MBP (Aharoni, 1998). Este también se puede unir a varias moléculas MHC clase II y prevenirlas de que se unan a las células T con propiedades específicas de reconocimiento del antígeno (Fridkis-Hareli et al, 1999a). En los roedores, Cop 1 induce a las células reguladoras que probablemente actúan como supresores de soporte (Aharoni, 1998) de las células T encefalitogénicas. La transferencia adoptiva de dtahas células T se encontró que previene el desarrollo de EAE inducida por MBP (Aharoni et al, 1993), PLP (Aharoni, 1998), o homogeneizado total de médula espinal (Aharoni et al, 1997). Además, la evidencia directa también ha sido reportada tanto para la interacción competitiva de Cop 1 como para copolímero relacionados y péptido de colágena II (Cll) con moléculas HLA-DR asociadas con artritis reumatoide (AR) y para la inhibición de respuestas por células T específicas para Cll, sugiriendo que estos compuestos pueden ser efectivos en contra de la artritis reumatoide (Fridkis-Hareli, 1998, 1999b). La administración oral de autoantígeno con el objeto de obtener "tolerancia oral" se ha descrito para el tratamiento de varias enfermedades autoinmunes. Por ejemplo, EP 359 783 describe la administración oral de MBP para el tratamiento de esclerosis múltiple. Las publicaciones internacionales PCT WO 91/12816, WO 91/08760 y WO 92/06704 todas describen el tratamiento de otras enfermedades autoinmunes utilizando el método de tolerancia oral con una variedad de autoantígenos. El tratamiento de la esclerosis múltiple mediante la ingestión o inhalación del copolímero 1 , para lograr la supresión de la respuesta de la célula T autoinmune a los antígenos de mielina, se ha descrito en la publicación PCT WO 98/30227. Los compuestos relacionados con el copolímero 1 también han sido estudiados y se ha encontrado que tienen propiedades similares al copolímero 1. Por ejemplo, los copolímeros compuestos de tres de los cuatro aminoácidos encontrados en el copolímero 1 se unen a moléculas MHC purificadas de clase II (Frldkis-Hareli et al, 1999a, WO 005250). Además» ttí^ motivos de unión del copolímero 1 a las moléculas HLA-DR asociadas con esclerosis múltiple y artritis reumatoide recientemente han sido elucidados (Fridkis-Hareli et al, 1999b). A partir de estos motivos de unión, tos polipéptidos de secuencias fijas pueden fácilmente ser propuestos y evaluados para la unión al asa de unión peptídica de las moléculas HLA-DR. Dichos péptidos podrían esperarse que actúen de manera similar al mismo Cop 1. Los ejemplos d dichos péptidos sintéticos se describen en WO 005249. La cita o identificación de cualquier referencia en esta sección o cualquier otra parte de esta solicitud no debe considerarse como una admisión de que dicha referencia está disponible como una técnica precedente a la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a métodos y composiciones para la promoción de la regeneración nerviosa o prevención o inhibición de degeneración neuronal para mejorar y tratar los efectos de lesión a, o enfermedad del sistema nervioso (SN). La presente invención se basa en parte en el descubrimiento inesperado de los solicitantes de que las células T activadas en contra de Cop 1 promueven la regeneración nerviosa o confieren neuroprotección. Además se basa en parte en el descubrimiento inesperado de los presentes inventores de que las células T activadas en contra de Cop 1 protegen las células nerviosas a partir de la toxicidad del glutamato. Como se utilizan la presente, "neuroprotección" se refiere la prevención o inhibición de efectos degenerativos o lesión o enfermedad en el SN, incluyendo protección a partir de efectos neurodegenerativos secundarios los cuales persisten incluso cuando el factor de riesgo primario se remueve o atenúa. Esto incluye la protección tanto de la materia blanca como de la materia gris. Hasta recientemente, se pensó que sistema inmune excluía a las células inmunes de participar en la reparación del sistema nervioso. Fue bastante sorprendente descubrir que las células T activadas por Cop 1 pueden ser utilizadas para promover la regeneración nerviosa o para proteger el tejido del sistema nervioso a partir de la degeneración secundaria la cual puede seguir ai daño ocasionado por lesión o enfermedad del SNC o SNP. "Célula T activada" como se utiliza en la presente invención ¡ncluye (i) células T que han sido activadas mediante la exposición a Cop 1 o a un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1 y (ii) progenie de dichas células T activadas. En una modalidad, la presente invención provee composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de células T activadas específicas a Cop 1 y métodos para utilizar dichas composiciones para promover la regeneración nerviosa o para prevenir o inhibir la degeneración neuronal en el SNC o SNP, en una cantidad es efectiva para mejorar los efectos de una lesión o enfermedad del SN. "Células T activadas específicas a Cop 1" como se utiliza eñ la presente invención se refiere a células T activadas que tienen especificidad por Cop i o un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1. Las células T activadas específicas a Cop 1 se utilizan para promover la regeneración nerviosa o para prevenir o inhibir los efectos degenerativos secundarios que pueden seguir a una lesión primaria del SN o los efectos de procesos neurodegenerativos ocasionados por un enfermedad o condición como se describe en la sección (3) a continuación, pero excluyendo a la esclerosis múltiple. Los ejemplos no limitantes incluyen glaucoma, evento cerebrovascular, isquémica, disparo por arma de fuego, y daño cerebral ocasionado por deportes peligrosos. Las células T activadas específicas a Cop 1 sirve no solamente para proveer neuroprotección en contra de factores de riesgo primarios y secundarios asociados con los cuerpos celulares neuronales mismos (materia gris) en vista de la protección descubierta en contra de la toxicidad al glutamato. Por lo tanto las células T activadas específicas a Cop 1 , se espera que sean útiles para el propósito de la presente ¡nvención y no han sido sugeridas por técnicas conocidas de inmunoterapia. Además, puesto que Cop 1 protege de la toxicidad del glutamato, su acción no solamente es mediante la reactividad cruzada con la mielina. También debe haber una actividad reguladora, tal como mediante la creación de células reguladoras o sustancias reguladoras. En vista de esta actividad reguladora, la vacuna de Cop 1 y las células T activadas específicas a Cop 1 se espera que también protegen la materia blanca y materia gris del daño ocasionado por el estrés oxidativo y otras fuentes de daño a las células neurales. Además, debido a esta actividad reguladora, la presente invención también puede ser utilizada para proteger células neurales no solamente a partir de esclerosis múltiple, como se ha sugerido en la técnica precedente, sino también a partir de enfermedades autoinmunes diferentes a la esclerosis múltiple. La presente ¡nvención también provee composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1 y métodos de uso de dichas composiciones para promover la regeneración nerviosa o para prevenir o inhibir la degeneración neural en el SNC o SNP, en el que la cantidad es efectiva para activar a las células T in vivo o ¡n vitro, en donde las células T activadas inhiben o mejoran los efectos de una lesión o enfermedad del SN. En la práctica de la invención, la terapia para la mejoría y el tratamiento de efectos de lesión o enfermedad que comprende la administración de células T activadas específicas a Cop 1 opcionalmente estará en combinación con Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1. Adicionalmente, la administración oral de Cop 1 o un antígeno de péptido o polipéptido relacionado con Cop 1 es efectiva para la neuroprotección después de cebar con Cop 1 administrado en un adyuvante. Por lo tanto, el Cop 1 oral puede ser utilizado para reforzar la actividad de las células T, subsecuentemente a la activación primaria de dicho Cop 1, preferiblemente en adyuvante, para construir una respuesta crítica de célula T inmediatamente después de la lesión. En otra modalidad, los bancos celulares pueden establecerse para almacenar células T sensibilizadas a Cop 1 para tratamiento neuroprotector de individuos en un tiempo posterior, como se necesite. En este caso, las células T autólogas pueden obtenerse a partir de un individuo. Alternativamente, las células T alogénicas o se ialogénicas pueden almacenarse de tal manera que estén presentes en un banco de células T de cada uno de los tipos más comunes de MHC clase II. En el caso de que un individuo sea tratado por una lesión, preferiblemente las células T autólogas almacenadas se utilizan, pero, si las células T autólogas no están disponibles, entonces deben utilizarse las células que compartan una molécula MHC tipo II con el paciente, y éstas podrían esperarse que sean operables en ese individuo. Las células preferiblemente se almacenen en un estado activado después de la exposición a Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1. Las líneas celulares del banco preferiblemente están criopreservadas. Las líneas celulares se preparan de cualquier forma la cual se conoce bien en la técnica. Una vez que las células se descongelan, éstas de cultivan preferiblemente antes de la inyección con el objeto de eliminar las células no viables. Durante este cultivo, las células pueden activarse o reactivarse utilizando el antígeno o péptido Cop 1 como se utilizó en la activación original. Alternativamente, la activación puede lograrse mediante el cultivo en la ^presencia de un mitógeno, tal como fitohemaglutinina (PHÁ|?o concavaMÉ (preferiblemente esta última). Esto colocará a las células dentro de un estado de activación incluso superior. Los pocos días que toma el cultivar a las células no deben ser detrimentales al paciente puesto que el tratamiento de conformidad con la presente invención puede ocurrir en cualquier tiempo de una semana a más después de la lesión con el objeto de que aún sea efectivo. Alternativamente, si el tiempo es esencial, las células almacenadas pueden administrar inmediatamente después de la descongelación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las figuras 1A y 1B son gráficas que muestran el número de RGC/mm2 marcadas (sobrevivientes) en retinas retiradas de ratas que habían sido inyectadas con PBS en adyuvante incompleto de Freund (IFA) (marcadas como PBS en las figuras) o con células T específicas a Cop 1 en IFA (marcadas como Tcopl) inmediatamente después de la lesión moderada (figura 1A) o severa (figura 1B) al nervio óptico. Las figuras 2A y 2B son gráficas que representan el ELISA de los factores neurotróficos secretados. Las células T de rata antí-MBP (barras blancas en la figura 2A) o anti-Cop 1 (barras negras en la figura 2A) se cultivaron por 48 horas con su antígeno específico en medio de estimulación. Los sobrenadantes de célula T se colectaron y se sometieron a ELISA intercalada. La gráfica muestra la concentración de NT3, BDNF, NGF y NT-4/5 secretados en cada muestra. La reli¡|§n de las cantidades de BDNF o NT-3 secretados mediante células T anti-Cop 1 a las cantidades secretados mediante células T anti-MBP se muestran en la figura 2B. Se muestra la relación media ± SD de cinco experimentos independientes con neurotrofina (NT) . La figura 3 es una gráfica que muestra como la inmunización con Cop 1 proteger a las fibras de nervio óptico a partir de la degeneración secundaria. Inmediatamente después de la lesión moderada al nervio óptico, las ratas se inmunizaron subcutáneamente con PBS en IFA o Cop 1 en IFA. Para la evaluación de la degeneración secundaria, el colorante de neurotrazado 4-Di-10-Asp se aplicó al nervio óptico distal al sitio de la lesión dos semanas después de la lesión por aplastamiento. Cinco días después las ratas de sacrificaron, y sus retinas se retiraron y se montaron en plano. Las RGC marcadas (sobrevivientes), a partir de cuatro campos localizados a aproximadamente la misma distancia del disco óptico en cada retina, se contaron bajo microscopía de fluorescencia. El efecto neuroprotector de la inmunización con Cop 1 en comparación con el de la inyección de PBS fue significativo (P<0.05, prueba t de Student). Los resultados son la suma de dos experimentos. Cada grupo contuvo de ocho a diez ratas. La figura 4 es una gráfica que muestra como la inmunización con Cop 1 proteger a las fibras del nervio óptico a partir de la toxicidad del glutamato. Los ratones se inmunizaron con Cop 1 emulsificada en adyuvante completo de Freund (CFA) y los ratones control se inyectaron con CFA sólo.

Un ojo de cada ratón se inyectó entonces con solución salina sola y el otro con solución salina que contenía 200 nmoles del glutamato. Siete días después del administración del glutamato, la retinas se retiraron y se montaron en plano. Las células del ganglio retinal (RGC) marcadas (sobrevivientes) se contaron. Las barras muestran las RGC remanentes como porcentaje del control para los ratones tratados con CFA que recibieron ya sea solución salina o solución salina con glutamato, y los ratones tratados con Cop 1 -CFA que recibieron ya sea solución salina o solución salina con Cop 1. Las figuras 5A y 5B muestra la inmunolocalización con pMOG (figura 5A) o la transferencia pasiva de las células T antí-MBP (figura 5B) |ue no protege a las RGC de ratón a partir de la toxicidad con glutamato. En la figura 5A, las RGC se expusieron directamente a la toxicidad del glutamato mediante inyección intravitral de L- glutamato (200 nmoles). Cuatro días después, las RGC se marcaron retrógradamente con FluoroOro, y esto se siguió después de tres días por escisión retinal y conteo (véase la sección de materiales y métodos del ejemplo 3, experimento 2). Las RGC supervivientes se expresaron como la media ± SEM por mm2. Las diferencias no significativas en la supervivencia de las RGC después de la inyección con glutamato se observaron entre el grupo tratado con pMOG en CFA (n=8) y el grupo control tratado con PBS en CFA (n =7). En la figura 5B, el glutamato se inyectó intravitralmente dentro de ratas Lewis. Cuatro días después, las RGC se marcaron mediante la aplicación del colorante 4-Di-10-Asp, y esto se siguió después de tres días por escisión retinal y conteo. Nótese que la supervivencia retinal en el grupo tratado con células T no 'difirió significativamente de la del grupo control (No. de RGC por mm2, media ± SEM (n =6 en cada grupo)). Las figuras 6A y 6B muestra la invasión de linfocitos siguiendo a la inyección intravitral de glutamato. El glutamato se inyectó intravitralmente dentro de ratones C57bl/6. Después de 24 horas, el ojo se removió y se procesó para histología. Se muestran las secciones de retina que se tiñeron con H&E (10 µm de grosor) de ambos ratones inyectados con glutamato (figura 6A) y ratones control (figura 6B). Barra= 200 µm. La figura 7 muestra la relación de supervivencia de las células ganglionares de la retina después de la lesión al nervio óptico. Las RGC de Balb/C adultos entrecruzados se marcaron retrógradamente con FluoroOro (véase la sección de materiales y métodos del ejemplo 3, experimento 2) diez días después de ser inmunizadas con 50 µg de Cop 1 emulsificado en CFA. Los ratones control se inyectaron con PBS en CFA (n = 8-12 en cada grupo). Tres días después del marcado de las RGC, los ratones se sometieron a una lesión severa por aplastamiento de la porción intraorbital del nervio óptico. Dos semanas después de la lesión, la retinas se retiraron y sus RGC marcadas se contaron (véase la sección de materiales y métodos del ejemplo 3, experimento 2). Con relación a los controles no inmunizados, las relaciones de supervivencia fueron significativamente mayores (p<0.001 , prueba t de Student) en los ratones inmunizados con Cop 1 en CFA.

Las figuras 8A-8D muestran la neuroprotección a partir de la toxicidad del glutamato mediante la inmunización activa con Cop 1. En la figura 8A, diez días antes de la inyección con glutamato, los ratones ee inmunizaron mediante inyección subcutánea con Cop 1 en CFA (5 mg/ml de bacteria) o se inyectaron con PBS en CFA. Los resultados de un experimento se muestran (n =5 en cada grupo). El número de RGC supervivientes por mm2 (media ± SEM) fue significativamente mayor en los ratones inmunizados con Cop 1 que en los ratones inyectados con PBS en CFA o en ratones que recibieron glutamato solamente (p<0.02, prueba t de dos colas). La inyección con PBS en CFA no tuvo efecto detectable sobre el número de RGC. El experimento se repitió tres veces, con resultados idénticos. Juntos los 13 animales en el grupo tratado con Cop 1 y los 15 animales en el grupo tratado con PBS se evaluaron. En la figura 8B, inmediatamente después de la inyección intravitral del glutamato, los ratones se inmunizaron con Cop 1 emulsiflcada en CFA (5 mg/ml de bacteria). El número de RGC supervivientes por mm2 (media ± SEM) se determinó una semana después. Los resultados de un experimento se muestran. El efecto de la inmunización con Cop 1 fue significativo (p<0.05 prueba t de dos colas; n = 12 para Cop 1 y n = 8 para el control). Este experimento se repitió utilizando 11 ratones para inmunización con Cop 1 y ocho ratones para inyección con PBS en CFA (5 mg/ml de bacteria). En la figura 8C, las RGC supervivientes siguiendo a la agresión con glutamato e inmunización inmediata con Cop 1 en adyuvante que contenía 0.5 mg/ml de bacteria. El número de RGC supervivientes por mm2 fue t?Significatl^nente mayor en los ratones inmunizados con Cop 1 (n = 15) que en los ratones inyectados con glutamato (n = 5) (p<0.04; prueba t de dos colas). En la figura 8D, la supervivencia de las RGC después de la inmunización llevada a cabo anteriormente, inmediatamente después, 48 horas después de la agresión con glutamato. Las barras muestran tos resultados agrupados obtenidos a partir de todos ratones examinados en bada tratamiento, colectados a partir de los experimentos repetidos. No se observó ningún efecto cuando la inmunización se llevó a cabo 48 horas después pe a agresión. La figura 9 muestra la inmunización por Cop 1 que fa la at proteger a los ratones a partir de la toxicidad del NMDA. Diez días antes dé la inyección de NMDA (75 nmoles), los ratones (n = 5-7) se inmunizaron mediante inyección subcutánea de Cop-1 en CFA o con PBS en CFA. El marcado de las RGC y el conteo de las RGC viables bajo microscopía de fluorescencia fueron como se describió para la supervivencia de las RGC en la figura 5A en los ratones inmunizados con Cop-1, expresados como un porcentaje de la supervivencia en un ojo normal, fueron similar al de tos ratones inyectados con PBS (p =0.55, prueba t de Student), indicando que no se obtuvo ninguna neuroprotección La figura 10 muestra que las células T reactivas a Cjo -1 protegen a las RGC a partir de la toxicidad del glutamato. Inmediatarrjente después de la inyección del glutamato (200 nmoles), los ratones se inyectaron con células T reactivas a Cop-1 o con PBS. La aplicación del colorante, - ?n lá •0 m preparación y conteo de las RGC, y cálculo de la supervivencia de las RGC fueron como se describió para la figura 5B. Significativamente se observaron más RGC marcadas en las retinas de los ratones inyectados con células T reactivas a Cop-1 que en las retinas de los ratones control inyectados con PBS (p<0.0007, prueba t de Student). Las figuras 11A-11D muestran el efecto de la IOP crónicamente incrementada y la inmunización con Cop-1 sobre la supervivencia de las células ganglionares de la retina en ratas Lewis. En la figura 11 A, la cauterización láser que ocasiona la oclusión de las venas episcleral y timbal resultan un incremento en la IOP y la muerte subsecuente de las células ganglionares de la retina. Tres semanas después del tratamiento con láser, la IOP media fue de 30.4 más menos 0.42 mm de Hg (media ± SEM, n = 5) en las ratas sometidas a oclusión venosa en comparación con 15.8 ± 0.2 mm de Hg (n = 7) en ratas sin afección. En la figura 11B, tres semanas después de la oclusión venosa, 19.9% más menos 0.51 % (media ± SEM) se contaron menos células ganglionares retinales en las ratas tratadas con láser que en las ratas sin afección. En la figura 11C, la inmunización con Cop-1 inmediatamente después de la oclusión venosa redujo la pérdida de células ganglionares de la retína. Las ratas se inmunizaron con Cop-1 (200 µg) en CFA (n = 15) o se inyectaron con PBS (n = 13) en CFA inmediatamente después del tratamiento con láser. La semana después, la retinas se retiraron y se montaron completas, y el número de células ganglionares de la retina premarcadas con amina de rodamina dextrán se contaron. Las barras representan la pérdida de * f tí? ganglionares de la retina en cada grupo de ratas, calculadas como un porcentaje del número de células ganglionares de la retina en las ratas sin afección (media ± SEM). La diferencia en los números de células ganglionaies de la retina en los dos grupos fue significativa (p<0.0001, prueba t de dos 5 colas). En la figura 11D, el efecto de la inmunización retrasada con Cop-1 sobre la pérdida de células ganglionares de la retina examinó mediante la inmunización de ratas diez días después de la oclusión venosa. Las barras representan la pérdida de células ganglionares de la retina en los grupos tratados con Cop-1 (n = 5) o PBS (n = 4), calculadas como un porcentaje del 0 número de células ganglionares de la retina (media ± SEM) en animales sin afección. Una tendencia hacia un efecto neuroprotector se observó después de la inmunización retrasada con Cop-1 ; la diferencia fue significativa solamente mediante una prueba t de una sola cola (p = 0.04). 5 DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Meramente para facilidad de la explicación, la descripción detallada de la presente invención se divide en las siguientes secciones: (1) células T activadas específicas a Cop 1 ; (2) Cop 1 y péptidos y polipéptidos 0 relacionados con Cop-1; (3) usos terapéuticos; (4) formulaciones y administración; (5) establecimiento de bancos de células autólogas para linfocitos T; (6) ejemplos; y (7) discusión de resultados. (1) Células T activadas específicas a COP 1 Las células T activadas específicas t >p-1 (ATC) son células T las cuales han sido activadas en la presencia de Cop 1 o un péptído o polipéptido relacionado con Cop 1 , como se define en la sección (2). Dichas ATC pueden ser utilizadas para tratar, es decir, mejorar o inhibir, los efectos de lesión o enfermedad del SNC o SNP que resulta en la degeneración del SN o para promover la regeneración en el SN, en particular en el SNC. Además, puesto que glutamato es un mediador en todas las enfermedades neurodegenerativos, ya sean crónicas o agudas, se pretende que dichas ATC puedan ser utilizadas para proteger a las células del SNC a partir de la toxicidad del glutamato y para tratar enfermedades o condiciones ocasionadas o exacerbadas por la toxicidad del glutamato, tales como presión intraocular anormal. Las células T activadas específicas a Cop 1 son preferiblemente autólogas, más preferiblemente de los fenotipos CD4 y/o CD8, pero éstas también pueden ser células T alogénicas a partir de donantes relacionados, por ejemplo, hermanos, parientes, niños, o donantes que coinciden con el HLA o que coinciden parcialmente, donantes semialogénicos o donantes completamente alogénicos. Además del uso de las células T autólogas aisladas a partir del sujeto, la presente invención también comprende el uso de células T semialogénicas para la neuroprotección. Estas células T pueden prepararse como líneas a corto o a largo plazo y almacenarse mediante métodos Gonvencforfeles de criopreservación para descongelamiento y administración, ya sea inmediatamente después de un cultivo durante 1-3 días, a un sujeto que padece de lesión del sistema nervioso central y que necesita la neuroprotección de las células T. El uso de las células T semialogénicas se basa en el hecho de que las células T puedan reconocer un epítope específico del antígeno presentado por las células presentadoras de antígenos externas (APC), con la condición de que APC exprese la molécula MHC, clase I o clase II, al cuaMa población específicas de células T de respuesta está restringida, junto con el epítope del antígeno reconocido por las células T. Por lo tanto, una población semialogénícas de células T que puedan reconocer al menos un producto alérgico de las moléculas MHC del sujeto, preferiblemente una molécula HLA-DR o una molécula HLA-DQ u otra molécula HLA, y que sea específica para un epítope Cop 1, será capaz de reconocer los antígenos con reacción entrecruzada con Cop 1 en el área de daño al SN del sujeto y producir el efecto neuroprotector necesitado. Hay poco o ningún polimorfismo en las moléculas de adhesión, moléculas de migración de leucocitos, y moléculas accesorias necesarias para que las células T migren al área del daño, se acumulen ahí, y lleven a cabo la activación. Por lo tanto, las células T semiatogénicas serán capaces de migrar y acumularse en el sitio del SNC que necesita de neuroprotección y serán activadas para producir el efecto deseado.

Se sabe que las células T semialogénicas serán rechazadas por el sistema inmune del sujeto, pero ese rechazo requiere aproximadamente dos semanas para desarrollarse. Por lo tanto, las células T semialogénicas tendrán la ventana de oportunidad de dos semanas necesaria para ejercer la neuroprotección. Después de dos semanas, las células T semialogénicas serán rechazadas a partir del cuerpo del sujeto, pero ése rechazo es ventajoso para el sujeto debido a que esto liberará al sujeto de las células T externas y prevendrá consecuencias posteriores de las células T activadas. Las células T semialogénicas proveen así un factor de seguridad importante y son una modalidad preferida. Se sabe que un número relativamente pequeño de moléculas HLA clase II se comparten por la mayoría de los individuos en una población. Por ejemplo, aproximadamente 50% de la población judía expresa el gen HLA-DR5. Por lo tanto, un banco de células T específicas reactivas a los epítopes Cop 1 que están restringidas a HLA-DR5 podría ser útil en 50% de esa población. La población total puede abarcarse esencialmente por un número pequeño de líneas celulares T adicionales restringidas a unas pocas moléculas HLA prevalentes diferentes, tales como DR1, DR4, DR2, etc. Porto tanto, un banco funcional de líneas celulares T uniformes puede prepararse y almacenarse para uso inmediato en casi cualquier individuo en una población dado. Dicho banco de células T podría superar cualquier problema técnico para obtener un número suficiente de células T específicas a partir del sujeto que necesite de neuroprotección durante la oportunidad abierta de la ventana úi¡» M& ¡& . ^..f f flffl j- ^.^j . |fo.frj de tratamiento. Las células T semialogénicas serán seguramente rechazadas después de lograr su papel de neuroprotección. Este aspecto de la invención no se contradice, y está en adición al uso de las células T autólogas como se describe la presente. Las células T activadas específicas a Cop-1 preferiblemente no están atenuadas, aunque las células T activadas específicas a Cop-1 atenuadas pueden ser utilizadas. Las células T pueden atenuarse utilizando métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo pero no limitados a, irradiación mediante rayos gamma, por ejemplo, 1.5-10.0 Rads (Ben-Nun et al, 1981b; Ben-Nun et al, 1982); y/o mediante tratamiento de presión, por ejemplo, se describe la patente de E.U.A. No. 4, 996, 194 (Cohén et al). En una modalidad preferida las células T activadas específicas a Cop 1 se aislan como se describe a continuación. Las células T pueden ser aisladas, purificadas de conformidad con los métodos conocidos en la técnica (Mor et al, 1 95). Para un ejemplo ilustrativo, véase la sección (6), ejemplo 1. Las células T circulantes de un sujeto las cuales reconocen a Cop 1 se aislan y se expanden utilizando procedimientos conocidos. Con el objetivo de obtener células T activadas específicas a Cop-1 , las células T se aislan y las ATC específicas a Cop 1 se expanden entonces mediante un procedimiento conocido (Burns et al, 1983; Pette et al, 1990; Martin et al, 1990; Schluesener et al, 1985; Suruhan-Dires Keneli et al, 1993, los cuales se incorporan en la presente invención como referencia en su totalidad).

Durante la activación ex vivo de las células T, las células T pueden activarse mediante el cultivo de las mismas en medio al cual se le ha añadido al menos un factor promotor del crecimieitto adecuado. Los factores promotores del crecimiento adecuados para este propósito incluyen, sin limitación, toxinas, por ejemplo factor a de necrosis tumoral (TNF-a), interleucina 2 (IL-2), e interleucina 4 (IL-4). En una modalidad, las células T activadas endógenamente producen una sustancia que mejora los efectos de la lesión o enfermedad én eI SN. En otra modalidad, las células T activadas endógenamente producen una sustancia que estimula a otras células, incluyendo, pero no limitadas a, factor de crecimiento transformante-ß (TGF-ß), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor neurotrófico 3 (NT-3), factor neurotrófico 4/5 (NT-4/5), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF); interferón-a (IFN-a), e interleucina-6 (IL-6), en donde las otras células, directamente o indirectamente, mejoran los efectos de la lesión o enfermedad. Siguiendo a su proliferación in vitro, las células T se administran a un sujeto mamífero. En una modalidad preferida, las células T se administran a un sujeto humano. La expansión de la célula T preferiblemente se lleva a cabo utilizando Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1. Las células T activadas con Cop 1 pueden ser utilizadas inmediatamente o pueden preservarse para uso posterior, por ejemplo, mediante criopreservación como sé llácribe a continuación. Las células T activadas específicas a Cop 1 también pueden obtenerse utilizando células T previamente criopreservadas, es decir, después de descongelar las células, las células T pueden ser incubadas con Cop 1 o con un péptido o polipéptído relacionado con Cop 1 , óptimamente junto con linfocitos de sangre periférica (PBL), para obtener una preparación de ATC específica a Cop 1. Como será evidente a los expertos en la técnica, las células T pueden presentarse, por ejemplo, mediante criopreservación, ya sea antes o después del cultivo. Los agentes de criopreservación que pueden ser utilizados incluyen pero no se limitan a dimetil sulfóxido (DMSO) (Lovelock et al, 1959; Ashwood-Smith, 1981), glicerol, polivinilpirrolidona (Rinfret, 1960), polietilénglicol (Sloviter et al, 1962), albúmina, dextrán, sucrosa, etilenglicol, i-eritritol, D-ribitol, D-manitol (Rowe et al, 1962), D-sorbitol, i-inositol, D-lactosa, cloruro de colina (Rowe et al, 1972), aminoácidos (Phan The Tran et al, 1960a), metanol, acetamida, monoacetato de glicerol (Lovelock, 1954), tales inorgánicas (Phan The Tran et al, 1960b, Phan The Tran et al), y DMSO combinado con almidón de hidroxietilo y albúmina de suero de humano (Zaroulis et al, 1980). Una relación de enfriamiento controlada es crítica. Diferentes agentes críoprotectores (Rapatz et al, 1968) y diferentes tipos celulares tienen diferentes relaciones de enfriamiento óptimas. Véase, por ejemplo, Rowe et al, (1962b); Rowe (1966); Lewis et al, (1967); y Mazur, (1970) para efectos de velocidad enfriamiento sobre la supervivencia de las células y su potencial de transplante. El calor de la fase de fusión cuando el agua se vuelve hielo debe ser mínimo. El procedimiento de enfriamiento puede llevarse a cabo mediante el uso de, por ejemplo, un dispositivo de congelamiento programable o un procedimiento de baño en metanol. Los aparatos de congelamiento programables permiten la determinación de las relaciones de congelamiento óptimas y facilitan el enfriamiento estándar reproducible. Los congeladores programables con una relación controlada tales como Cryomed y Planar permiten regresar del régimen de congelamiento a una curva deseada de relación de congelamiento. Después de un congelamiento extensivo, las células pueden transferirse rápidamente a una vasija de almacenamiento criogénico a largo plazo. En una modalidad, las muestras pueden almacenarse criogénicamente en congeladores mecánicos, tales como congeladores que mantienen una temperatura de aproximadamente -80°C o aproximadamente -20°C. En una modalidad preferida, las muestras pueden almacenarse criogénicamente en nitrógeno líquido (-196°C) o en su vapor. Dicho almacenamiento se facilita grandemente por la disponibilidad de refrigeradores de nitrógeno líquido altamente eficientes, los cuales se parecen a los contenedores Termos grandes con un vacío extremadamente bajo y un super aislamiento interno, de manera que las filtraciones de calor y las pérdidas de nitrógeno se mantienen en un mínimo absoluto.

Las consideraciones y los procedimientos para ta manipulación, criopreservación, y almacenamiento a largo plazo de tas células T pueden encontrarse, por ejemplo, en las siguientes referencias, incorporadas como referencias en la presente invención: Gorin (1986) y agencia internacional de energía atómica (1979). Otros métodos de criopreservación de células viables, o modificaciones de las mismas, están disponibles y se consideran para uso, por ejemplo, técnicas de espejo en metal frío. Véase Livesey et al (1987); Linner et al (1986), véase también patente de E.U.A. No. 4, 199, 022 por Senken et al, patente de E.U.A. No. 3, 753, 357 por Schwartz, y patente de E.U.A. No. 4, 559, 298 por Fahy. Las células congeladas preferiblemente se descongelan rápidamente (por ejemplo, en un baño con agua mantenido a 37-47°C) y se enfrían inmediatamente después de descongelarlas. Puede ser deseable tratar a las células con el objeto de prevenir aglomerados celulares después del descongelamiento. Para prevenir la formación de aglomerados, varios procedimientos pueden ser utilizados, incluyendo pero no limitados a la adición antes o después de congelamiento de DNAsa (Spitzer et al, 1980), dextrán y citrato de bajo peso molecular, citrato, almidón de hidroxietilo (Stlff et al, 1983), o dextrosa de citrato ácido (Zaroulis et al, 1980), etcétera. El agente crioprotectores, si es tóxico en tos humanos, debe removerse antes del uso terapéutico de las células T descongeladas. Una manera de remover el agente crioprotector es mediante la dilución a concentración insignificante. Una vez que las células T congeladas han sido descongeladas y recuperadas, éstas se utilizan para promover la regeneración neuronal como se describió en la presente invención con respecto a las células T no congeladas. Una vez descongeladas, las células T pueden ser utilizadas inmediatamente, asumiendo que éstas se activaron antes del congelamiento. Preferiblemente, sin embargo, las células descongeladas se cultivan antes de la inyección al paciente con el objeto de eliminar las células no viables. Además, en el transcurso de este cultivo durante ?n periodo de aproximadamente uno a tres días, un agente activador apropiado puede añadirse de manera que las células se activen, si las células congeladas fueron células T en reposo, o para ayudar a que las células logren una relación mayor reactivación si ésta se activaron antes del congelamiento. Usualmente, está disponible el tiempo para permitir dicho paso de cultivo antes de la administración de las células T que pueden ser administradas tanto como una semana después de la lesión, y posiblemente más, e incluso mantengan su efecto neurodegenerativo y neuroprotector. (2) COP 1 v péptido o polipéptido relacionados con COP 1 Las composiciones farmacéuticas que comprenden Cop 1 o un antígeno péptido o polipéptido relacionados con Cop 1 o derivado de los mismos pueden ser utilizado para prevenir o inhibir los efectos de lesión o t Í t enfermedad que resulta en la regeneración del SN, particularmente en el SNC, para proteger a las células del SNC a partir de la toxicidad del glutamato, o para tratar lesión o enfermedad ocasionada o exacerbada por la toxicidad del glutamato. Adicionalmente, Cop 1 o un antígeno péptido o polipéptido relacionados con Cop 1 o derivado de los mismos pueden ser utilizados para activación in vivo o in vitro de las células T. En una modalidad, tos métodos para promover la regeneración nerviosa o para prevenir o inhibir los efectos de lesión o enfermedad del SNC o SNP comprenden administrar Cop 1 o un antígeno péptido o polipéptido relacionados con Cop 1 o derivado de tos mismos a un mamífero en donde el Cop 1 o antígeno péptído o polipéptido relacionados con Cop 1 o derivado de los mismos activen a las células T in vivo para producir una población de células T que se acumulan en un sitio de lesión o enfermedad del SNC o SNP. En otra modalidad, Cop 1 o un antígeno péptido o polipéptido relacionados con Cop 1 o derivado de los mismos se administran en métodos para proteger a las células del SNC deia toxicidad del glutamato o para tratar lesión o enfermedad ocasionada o exacerbada por la toxicidad del glutamato. La composición para uso en la presente invención puede ser Cop 1 o un péptído o polipéptido relacionados con Cop 1. Para el propósito de la presente Invención, "Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionados con Cop 1" se pretende que incluya cualquier péptido o polipéptido, incluyendo un copolímero al azar, que funcionalmente reacciona de manera cruzada con una proteína básica de mielína (MBP) y sea capaz de competir con MBP en la MHC clase II en la presentación del antígeno. La composición puede comprender un copolímero al azar que comprenden una cantidad adecuada de un aminoácido de carga eléctrica positiva, tal como lisina o arginina, en combinación con un aminoácido con una carga eléctrica negativa (preferiblemente en una cantidad menor), tal como ácido glutámico ácido aspártico, ocasionalmente en combinación con un aminoácido eléctricamente neutral tal como alanina o lisina, que sirve como un llenador, y ocasionalmente con un aminoácido adaptado para conferir al copolímero de propiedades inmunogénicas, tales como aminoácidos aromáticos como tírosina o triptofano. Dichas composiciones pueden incluir cualesquiera de aquellas descritas en WO 005250, los contenidos completos de la cual se encuentran incorporados en la presente invención como referencia. Más específicamente, la composición para uso en la presente invención comprende al menos un copolímero seleccionado a partir del grupo consistente del copolímero al azar que comprenden un aminoácido seleccionado a partir de un grupo de al menos tres de los siguientes grupos: (a) lisina y arginina; (b) ácido glutámico y ácido aspártico; (c) alanina y glicina; (d) tirosina y triptofano. ,£3S_S Los copolímeros para uso en la presente invención pueden estar compuestos de L o D-aminoácidos o mezcla de los mismos. Como se sabe por los expertos en la técnica, los L- aminoácidos ocurren en la mayoría de las proteínas naturales. Sin embargo, los D- aminoácidos están comercialmente disponibles y pueden ser sustituidos por algunos o todos los aminoácidos utilizados para elaborar los terpolímeros y otros copolímero de la presente invención. La presente invención contempla copolímero que contienen tanto D como L-aminoácidos, así como copolímeros que consisten esencialmente ya sea de L o D- aminoácidos. En una modalidad de la invención, el copolímero contiene cuatro diferentes aminoácidos, cada uno a partir de un grupo diferente (a) a (d). Un copolímero preferido de conformidad con esta modalidad de la preseníe invención comprende en combinación alanina, ácido glutámico, lisina, y tirosina, con una carga eléctrica neta general positiva y de un peso molecular de aproximadamente 2,000 a aproximadamente 40,000 daltopes, preferiblemente de aproximadamente 2,000 a aproximadamente 13,000 daltones. El ejemplo más preferido es un copolímero 1 (Cop 1) con un peso molecular promedio aproximado de 4,700 a aproximadamente 13,000 daltones. Los intervalos de pesos moleculares preferidos y los procedimientos para elaborar una forma preferida de copolímero 1 se describen en la patente de E.U.A. No. 5, 800, 808, los contenidos completos de la cual se incorporan en la presente invención en su totalidad. Está claro que éstos se dan a manera de ejemplo solamente, y que la composición puede variar tanto con a sus constituyentes, las proporciones relativas de los constituyentes si el criterio general anteriormente mencionado se adhiere a los mismos. Por lo tanto, el copolímero puede ser un polipéptido de aproximadamente 15 a aproximadamente 100, preferiblemente de aproximadamente 40 a aproximadamente 80, aminoácidos en longitud. En otra modalidad, el copolímero contiene tres diferentes aminoácidos cada uno a partir de un grupo diferente de los tres grupos de tos grupos (a) a (d). Se hace referencia a estos copolímeros en la presente invención como terpolímeros. En una modalidad, los terpolímeros para uso en la presente invención contienen tírosina, alanina, y lisina, en adelante designados YAC. La fracción molar promedio de los aminoácidos en estos terpolímeros puede variar. Por ejemplo, la tirosina puede estar presente en una fracción molar de aproximadamente 0.005 a aproximadamente 0.250; la alanina puede estar presente en una fracción molar de aproximadamente 0.3 a aproximadamente 0.6; y la lisina puede estar presente en una fracción molar de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0.5. El peso molecular promedio es entre 2,000 a aproximadamente 40,000 daltones, y más preferiblemente entre aproximadamente 3,000 a aproximadamente 35,000 daltones. En una modalidad más preferida, el peso molecular promedio es de aproximadamente 5,000 a aproximadamente 25,000 daltones. Es posible sustituir la arginína por lisina, lisina por alanina, y/o triptofano por tirosina.

En otra modalidad, los terpolímeros para uso en la presente invención contienen tirosina, ácido glutámico, y lisiná, en adelante designados YEK. La fracción molar promedio de tos aminoácidos en estos terpolímeros puede variar: el ácido glutámico puede estar presente en una fracción molar de aproximadamente 0.005 a aproximadamente 0.300, tirosina puede estar presente en una fracción molar de aproximadamente 0.005 a aproximadamente 0.250, y lisina puede estar presente en una fracción molar de aproximadamente 0.3 a aproximadamente 0.7. El peso molecular promedio es entre 2,000 y aproximadamente 40,000 daltones, y preferiblemente entre aproximadamente 3,000 y aproximadamente 35,000 daltones. En una modalidad más preferida, el peso molecular promedio es de aproximadamente 5,000 a aproximadamente 25,000 daltones. Es posible sustituir el ácido aspártico por ácido glutámico, arginina por lisina, y/o triptofano por tirosina. En otra modalidad tos terpolímeros para uso en la presente invención contienen lisina, ácido glutámico, y alanina, en adelante designados KEA. La fracción molar promedio de los aminoácidos en estos polipéptidos también puede variar. Por ejemplo, ácido glutámico puede estar presente en una fracción molar de aproximadamente 0.005 a aproximadamente 0.300, alanina puede estar presente en una fracción molar de aproximadamente 0.005 a aproximadamente 0.600, lisina puede estar presente en una fracción molar de aproximadamente 0.2 a aproximadamente 0.7. El peso molecular promedio es entre 2,000 y 40,000 cartones, y preferiblemente entre aproximadamente 3,000 y 35,000 daltones. En una modalidad más preferida, l peso molecular promedio es de aproximadamente 5,000 a aproximadamente 25,000 daltones. Es posible sustituir ácido aspártico por ácido glutámico, glicina por alanina, y/o arginina por lisina. En otra modalidad, tos terpolímeros para uso en la presente invención contienen tirosina, ácido glutámico, y alanina, en adelante designados como YEA. La fracción molar promedio de los aminoácidos en estos polipéptidos puede variar. Por ejemplo, tirosina puede estar presente en una fracción molar de aproximadamente 0.005 a aproximadamente 0.250, ácido glutámico puede estar presente en una fracción molar de aproximadamente 0.005 a aproximadamente 0.300, y alanina puede estar presente en una fracción molar de aproximadamente 0.005 a aproximadamente 0.800. El peso molecular promedio es entre 2,000 y aproximadamente 40,000 daltones, y preferiblemente entre aproximadamente 3,000 y aproximadamente 25,000 daltones. En una modalidad más preferida, el peso molecular promedio es de aproximadamente 5,000 a aproximadamente 25,000 daltones. Es posible sustituir triptofano por tirosina, ácido aspártico por ácido glutámico, y/o lisina por alanina. En una modalidad más preferida, la fracción molar de aminoácidos de tos terpolímeros es aproximadamente Jo que se prefiere para el copolímero 1. La fracción molar de los aminoácidos en el copolímero 1 es ácido glutámico aproximadamente 0.14, alanina aproximadamente 0.43, tirosina aproximadamente 0.10, y lisina aproximadamente 0.34. El peso molecular promedio más preferido para el copolímero 1 está entre 5,000 y aproximadamente 9,000 daltones. La actividad el copolímero 1 para las utilidades descritas en la presente invención se espera que permanezca si una o más de las siguientes sustituciones se realiza: ácido aspártico por ácido glutámico, lisma por alanina, arginina por lisina, y triptofano por tirosina. Las relaciones molares de los monómeros de tos terpolímeros más preferidos de ácido glutámico, alanina, y tirosina, o YEA, es de aproximadamente 0.21 a aproximadamente 0.65 a aproximadamente 0.14. Las relaciones molares de los monómeros de los terpolímeros más preferidos de ácido glutámico, alanina y lisina, o KEA, es de aproximadamente 0.15 a aproximadamente 0.48 a aproximadamente 0.36. Las relaciones molares de los monómeros de tos terpolímeros más preferidos de ácido glutámico, tirosina, y lisina, o YEK, es de aproximadamente 0.26 a aproximadamente 0.16 a aproximadamente 0.58. Las relaciones molares de los monómeros de los terpolímeros más preferidos de tirosina, alanina y lisina, o YAK, es de aproximadamente 0.10 a aproximadamente 0.54 a aproximadamente 0.35. Los terpolímeros pueden elaborarse mediante cualquier procedimiento disponible por un experto en la técnica. Por ejemplo, los terpolímeros pueden elaborarse bajo condiciones de condensación utilizando la relación molar deseada de aminoácidos en solución, o mediante procedimientos sintéticos en fase sólida. Las condiciones de condensación incluye la temperatura adecuada, pH, y condiciones del solvente para condensar el grupo carboxilo de un aminoácido con el grupo amino de otro aminoácido para formar un enlace peptídico. Los agentes de condensación, por ejemplo diclorohexil-carbodiimida, pueden ser utilizados para facilitar la formación del enlace peptídico. Los grupos de bloqueo pueden ser utilizados para proteger los grupos funcionales, tales como las porciones de cadenas laterales y algunos de los grupos amino o carboxilo en contra de reacciones laterales no deseables. Por ejemplo, el procedimiento descrito en la patente de E.U.A. 3, 849, 650, puede ser utilizado en donde los N-carboxianhídridos de tirosina, alanina, glutamato de bencilo ? y N e-trifluoroacetil-lisina están polimerizados a temperatura ambiente en dioxano anhidro con dietilamina como un iniciador. El grupo ? carboxilo del ácido glutámico puede desbloquearse mediante bromuro ácido en ácido acético glacial. Los grupos trífluoroacetito se remueven a partir de lisina mediante píperidina 1 molar. Un experto en la técnica fácilmente entenderá que tos procedimientos pueden ajustarse para elaborar péptídos y polipéptidos que contengan los aminoácidos deseados, es decir, tres de los cuatro aminoácidos en el copolímero 1, mediante la eliminación selectiva de las reacciones que se relacionan con cualesquiera de ácido glutámico, alanina, tirosina, o lisina. Para propósitos de esta solicitud, los términos "temperatura ambiente" y "temperatura ambiental" significan una temperatura en un intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 26°C.

El peso molecular de los terpolímeros puede ajustarse durante la síntesis del polipéptidos o después de que los terpolímeros se han realizado. Para ajustar el peso molecular durante la síntesis del polipéptidos, las condiciones sintéticas o las cantidades de aminoácidos se ajustan de manera que la síntesis se detiene cuando el polipéptido alcanza la longitud aproximada la cual se desea. Después de la síntesis, los polipéptidos con el peso molecular deseado pueden obtenerse mediante cualquier procedimiento de selección de tamaño deseado, tal como cromatografía de tos polipépt?dos en una columna o gel para seleccionar tamaño y peso molecular, y la recolección de los intervalos de pesos moleculares deseados. Los polipéptidos presentes también pueden hidrolizarse parcialmente para remover especies de alto peso molecular, por ejemplo, mediante hidrólisis acida o enzimática, y luego purificar para remover el ácido o las enzimas. En una modalidad, los terpolímeros con un peso molecular deseado pueden prepararse mediante un procedimiento el cual incluye hacer reaccionar un polipéptido protegido con ácido bromhídrico para formar un trifluoroacetil-polipéptido que tiene el perfil de peso molecular deseado. La reacción se lleva a cabo por un tiempo y a una temperatura de la cual está predeterminada por una o más reacciones prueba. Durante ia reacción prueba, se determina el tiempo y temperatura variante y el intervalo de peso molecular de un lote dado de polipéptidos prueba. Las condiciones prueba que proveen el intervalo de peso molecular óptimo para ese lote de polipéptidos se utilizan para el lote. Por lo tanto, el trifluoroacetil- polipéptido que tiene el perfil de peso molecular deseado puede producirse mediante un procedimiento el cual incluye hacer reaccionar el polipéptido protegido con ácido bromhídrico por un tiempo y a una temperatura predeterminada por la reacción prueba. El trifluoroacetil- polipéptido con el perfil de peso molecular deseado se trata adicionalmente con una solución acuosa de piperidina para formar un polipéptido de baja toxicidad que tiene el peso molecular deseado. En una modalidad preferida, una muestra prueba del polipéptido protegido a partir de un lote dado se hace reaccionar con ácido bromhídrico por aproximadamente 10- 50 horas a una temperatura de aproximadamente 20- 28°C. Las mejores condiciones para ese lote se determinan mediante el corrimiento de varias reacciones prueba. Por ejemplo, en una modalidad, el polipéptido protegido se hace reaccionar con ácido bromhídrico por aproximadamente 17 horas a una temperatura de aproximadamente 26°C. Puesto que se conocen los motivos de unión de Cop 1 a moléculas HLA-DR asociadas a MS (Fridkis-Hareli et al, 1999b), los polipéptidos de secuencia fija pueden prepararse fácilmente y evaluarse para la unión al asa de unión peptídica de las moléculas HLA-DR como se describe en la publicación de Fridkis-Hareli et al (1999b). Los ejemplo de dichos péptidos son aquellos descritos en WO 005249, los contenidos totales de la cual se incorporan en la presente invención como referencia. Treinta y dos de los péptidos específicamente descritos en dicha solicitud se reproducen en el cuadro 1 , a continuación. Dichos péptidos, y otros péptidos similares podrían esperarse que tengan actividad similar a Cop 1. Sin embargo, esto puede -T"rtrrt-Ti ? t ~ determinarse fácilmente al evaluar su capacidad para activar las células T de conformidad corría presente invención. Todo esto puede hacerse sin llevar a cabo experimentación. Dichos péptidos, y otros péptidos similares, también son considerados para que estén dentro de la definición de péptídos o polipéptidos relacionados con Cop 1 y su uso se considera que es parte de la presente invención.

CUADRO 1 SEQ ID NO. Secuencia Peptídica 1 AAAYAAAAAAKAAAA 2 AEKYAAAAAAKAAAA 3 AKEYAAAAAAKAAAA 4 AKKYAAAAAAKAAAA 5 MAYAAAAAAKAAAA 6 KEAYAAAAMKAAAA 7 AEEYAAAAAAKAAAA 8 AAEYAAAAAAKAAAA 9 EKAYAAAAAAKAAAA 10 AAKYEAAAAAKAAAA 11 AAKYMAAAAKAAAA 12 EAMAAAAAAKAAAA 13 EKKYAAAAAAKAAAA 14 EAKYAAAAAMAAAA 15 AWYAAAAAAAAAAA 16 AKEYAAAAAAAAAAA 17 AKKYEAAAAAAAAAA 18 AKKYMAAAAAAAAA 19 AEAMAAAAAAAAAA 20 MAYAAAAAAAAAAA 21 AEEMAAAAAAAAAA 22 AMYKAAAAAAAAAA 23 EKAYAAAAAAAAAAA 24 AAKY AAA W AAAA 25 KYAIAAAAAAAAA 26 EKKYA AAAAAAA 27 EMYAÁáAAAAAAAA 28 AEYAKAAAAAAMAA 29 AMAYAAAAAAAAAA 30 EKYAAAAAAAAAAAA 31 AYKAFIAAAAAAAAAA 32 AKYMAAAAAAAAAA El copolímero preferido para uso en la presente invención es el copolímero 1, en adelante referido también como Cop 1. El copolímero 1 ha sido aprobado en varios países para el tratamiento de esclerosis múltiple (MS) bajo el nombre comercial, COPAXONE ®, acetato de Glatiramer. COPAXONE ® es una marca registrada de Teva Pharmaceuticals Ltd., Petah Tikva, Israel. Varios ensayos clínicos demostraron el copolímero 1 es bien tolerado solamente con reacciones laterales menores que principalmente fueron reacciones moderadas en el sitio de la inyección (Johnson et al, 1995). (3) Usos terapéuticos Las composiciones escritas en las secciones (1) hasta (2) pueden utilizarse para promover la regeneración nerviosa o para prevenir o inhibir la degeneración secundaria la cual puede seguir de otra manera a la lesión primaria del SN. Por ejemplo, lesiones de cabeza cerrada y trauma directo, tal como aquellas ocasionadas por la participación en deportes peligrosos, trauma penetrante, tal como heridas por disparo de arma de fuego, choque hemorrágico, choque isquémico, glaucoma, isquemia cerebral, o daños ocasionados por cirugía tal como remoción de tumor. Además, dichas composiciones pueden utilizarse para mejorar los efectos de enfermedad que resultan en un proceso degenerativo, por ejemplo, degeneración que ocuire ya sea en la materia gris o materia blanca (o ambas) como un resultado de varias enfermedades o trastornos, incluyendo, sin limitación: neuropatía diabética, demencia senil, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, parálisis del nervio facial (de Bell), glaucoma, corea de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica (ALS), estado epiléptico, neuropatía óptica no arterítica, hernia de disco intervertebral, deficiencia de vitaminas, enfermedades del prión tales como enfermedad de Cre?tzfeldt-Jakob, síndrome de túnel carpal, neuropatías periféricas asociadas con varias enfermedades, incluyendo pero no limitadas a, uremia, porfiria, hipoglucemia, síndrome de Sjorgren Larsson, neuropatía sensitiva aguda, neuropatías atáxiea crónica, cirrosis biliar, amiloidosis primaria, enfermedades pulmonares obstructivas, acromegalia, síndrome de malabsorción, policitemia vera, gammapatías IgA e IgG, complicaciones de varios fármacos (por ejemplo, metronidazol) y toxinas (por ejemplo, alcohol u organofosfatos), enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, ataxia, telangectasia, ataxia de Friedreich, polineuropatías amilodes, adrenomieloneuropatía, neuropatía axonal gigante, enfermedad de Refsum, enfermedad de Fabry, lipoproteinemia, etc. A la luz de los hallazgos con respecto al aspecto protector del glutamato de la presente invención, otras condiciones clínicas que pueden ser tratadas de conformidad con la presente invención incluyen epilepsia, amnesia, ansiedad, hiperalgesia, psicosis, accesos, presión intraocular anormalmente elevada, estrés oxidativo, y tolerancia y dependencia a opioides. Además, el aspecto protector del glutamato de la presente invención, es decir, tratamiento de la lesión o enfermedad ocasionado o exacerbado por la toxicidad del glutamato, puede incluir tratamientos postoperativos tales como remoción tumoral a partir del SNC y otras formas de cirugía en el SNC. En vista del hecho de que la inmunización con Cop 1 ha sido encontrada sorprendentemente útil para proteger en contra de la toxicidad del glutamato, se espera que tratamiento con Cop 1 o tratamiento de células T relacionadas con Cop 1 de conformidad con la presente invención será efectivo en el tratamiento de las condiciones anteriormente listadas no solamente en una fase tardía cuando la mielina ha sido afectada, sino también en las etapas tempranas en las que las neuronas han sido atacadas por factores los cuales ocasionan una elevación en los niveles de glutamato hacia niveles tóxicos. Por lo tanto, la presente invención es útil para cualquier indicación, es decir, neurodegeneración crónica o aguda, la cual se ocasiona o exacerbado por una elevación en los niveles de glutamato, incluyendo las etapas tempranas de choque isquémico, enfermedad de Alzheimer, etc. Además, esta protección de la toxicidad del glutamato establece que el papel del Cop 1 no se limita a su reactividad cruzada con la mielina También debe tener una actividad reguladora, tal como mediante la creación de células reguladoras o sustancias reguladoras. En vista de esta actividad reguiadora, la vacuna con Cop 1 y las callas T activadas específicas a Cop 1 se espera que protejan la materia blanca y la materia gris a partir del daño ocasionado por el estrés oxidativo y otras fuentes de daño a las célalas neurales. Además, debido a esta actividad reguladora, la presente invención también puede ser utilizada para proteger las células neurales no solamente a partir de la esclerosis múltiple, como se ha sugerido en la técnica precedente, sino también para otras enfermedades autoinmunes diferentes a la esclerosis múltiple. En una modalidad preferida, las células T activadas o la composición de inmunización que comprende Cop 1 o péptidos o polipéptidos relacionados con Cop 1 de la presente invención son útiles para tratar enfermedades o trastornos en donde la promoción de la regeneración nerviosa o prevención o inhibición de degeneración neural secundaria se indica, pero excluyendo a la esclerosis múltiple y a las neoplasias. En una modalidad preferida, las composiciones de la presente invención se administran a un sujeto humano. Como se describió anteriormente, Cop 1 ha sido utilizada como un agente para lograr la supresión o desactivación de la reactividad de las células T autoinmunes a los antígenos de mielina en pacientes con esclerosis múltiple. Para ese propósito, Cop 1 ha sido administrada sin adyuvantes mediante inyección subcutánea diariamente. La técnica precedente también describe la administración de Cop 1 a pacientes con esclerosis múltiple mediante la ruta oral, la cual también tiene como objetivo inducir la supresión 4- •- r*- de la respuesta de las células T autoinmunes a tos antígenos de mieMna. Nótese que estos usos de Cop 1 en la técnica precedente que tratamiento del esclerosis múltiple fundamentalmente son diferentes a partir del uso de Cop 1 para neuroprotección, el cual es el objetivo de la presente invención. Principalmente, como se muestra en WO 99/60021 a partir de laboratorio de los presentes inventores, la neuroprotección esta mediada por la activación de las células T autoinmunes específicamente dirigidas a los antígenos de mielina. Por lo tanto, es más sorprendente que Cop 1, un agente diseñado para suprimir la autoinmunidad de la célula T, deba tener un efecto que requiera la activación de la autoinmunidad de la célula T anti-mielina. En segundo lugar, el uso de Cop para la neuroprotección de conformidad con la presente invención se basa en la administración de células T anti-Cop 1 , el cual no es el modo en que Cop 1 se utiliza para tratar esclerosis múltiple. En tercer lugar, en una modalidad preferida, la presente invención contempla el uso de Cop 1 administrado en adyuvantes, tales como adyuvante incompleto de Freund o adyuvante completo de Freund, en cual es un tipo de preparación de Cop 1 que no ha sido utilizado previamente para el tratamiento de esclerosis múltiple o para cualquier otro propósito terapéutico. Mientras que la presente invención contempla la administración oral de Cop 1 para neuroprotección, ésta siempre es subsecuente a la activación primaria con Cop 1, preferiblemente en adyuvante. Por lo tanto, el Cop 1 puede ser utilizado para reforzar la actividad de las células T de manera subsecuente a la activación primaria con Cop 1. »9 i?!~ Por consiguiente, la composición y su modo de acción y neuroprotección son novedosos, tanto prácticamente como conceptualmente. Podría no ser obvio a un experto en la técnica, familiar con el uso de Cop 1 el suprimir o desactivar la reactividad de la célula T a los antígenos de mielina, para utilizar Cop 1 de manera específicamente diseñada para activar las células T específicamente dirigidas a antígenos de míelina por sus efectos benéficos en la neuroprotección, incluyendo mejoría de los proces©s degenerativos ocasionados por enfermedades autoinmunes. Las células T activadas por Cop 1 también pueden ser utilizadas para mejorar los procesos degenerativos ocasionados por neoplasmas, sin utilizar procedimientos de inmunoterapia. Las células T activadas con Cop 1 se acumularán en el sitio de la degeneración neural y facilitarán la inhibición de esta degeneración. (4) Formulaciones v administración Las composiciones farmacéuticas para uso de conformidad con la presente invención pueden formularse de manera convencional utilizando uno o más vehículos o excipientes fisiológicamente aceptables. El vehículo(s) debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la composición y no deletéreo al recipiente de la misma. La siguiente ejemplificación de vehículos, modos de administración, formas de dosis, etc., se lista como posibilidades conocidas a partir de las cuales los vehículos, modos de administración, formas de dosis, etc., pueden seleccionarse para uso con la presente invención. Aquéllos expertos en la técnica entenderán, sin embargo, que cualquier formulación dada y modo de administración seleccionado primero debe ser evaluado para determinar que éste alcanza los resultados deseados. Por lo tanto, por ejemplo, cuando el principio activo es Cop 1 o un péptído o polipéptido relacionados con Cop 1 , la formulación particular y modo de administración debe permitír que el principio activo actúe como una vacuna de manera que se generen células T activadas en contra de éste in vivo. Si dicha respuesta inmune no se obtiene, entonces esa formulación particular y modo de administración no debe utilizarse de conformidad con la presente invención. Similarmente, si el principio activo es células T activadas, entonces la formulación particular y modo de administración debe ser evaluado para asegurar que las células T activas que son administradas alcancen el torrente sanguíneo en un estado activo de manera que éstas puedan alojarse en el sitio de la lesión en el SNC de conformidad con la presente invención. El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehículo con el cual el terapéutico se administra. Los vehículos en la composición farmacéutica pueden comprender un agente de unión, tal como celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona (polividona o povidona), goma tragacanto, gelatina, almidón, lactosa o monohidrato de lactosa; un agente desintegrador, tal como ácido algínico, almidón de maíz y similares; un lubricante o agente tensioactivo, tal como estearato de magnesio, o lauril de sodio; un aglutinante, tal como dióxido de silicón coloidal; un agente edulcorante, tal como sucrosa o sacarina; y/o un agente saborizante, tal como menta, salicilato de metilo, o saborizante de naranja. Los métodos de administración incluyen, pero no se limitan a, parenteral, por ejemplo, intravenoso, intraperitoneal, intramuscular, subcutáneo, mucosal (por ejemplo, oral, intranasal, bucal, vaginal, rectal, intraocular), intratecal, ruta de administración tópicas e intradermales. La administración puede ser sistémica o local. Para la administración oral, la preparación farmacéutica puede estar en forma líquida, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones, o puede presentarse como un producto fármaco para reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Dichas preparaciones líquidas pueden prepararse mediante medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabes de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsificantes (por ejemplo, lecitina o acacia); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, éteres oleosos, o aceites vegetales fraccionados); y conservadores (por ejemplo, metil o propil-p-hidroxibenzoatos o ácido sórbico). Las composiciones farmacéuticas pueden tomar la forma de, por ejemplo, tabletas o cápsulas preparadas mediante modos convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes de unión (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); llenadores (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o fosfato ácido de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); desintegrantes (por ejemplo, almidón de patata o gluconato de almidón sódico); o agentes humectantes (por ejemplo, lauril sulfato de sodio). Las tabletas pueden estar revestidas mediante métodos bien conocidos en la técnica. Las preparaciones para administración oral pueden formularse adecuadamente para dar una liberación controlada del compuesto activo. Para administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de tabletas o pastillas formuladas de manera convencional. Las composiciones pueden formularse para administración parenteral mediante inyección, por ejemplo, mediante inyección de bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en formas de unidad de dosis, por ejemplo, en ampolletas o en contenedores de dosis múltiples, con un conservador añadido. Las composiciones pueden tomar tales formas como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o de dispersión. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógeno, antes de su uso. Las composiciones también pueden formularse en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, que contienen bases de supositorios convencionales tales come mantequilla de cocoa u otros glicéridos. Para administración mediante inhalación, las composiciones para uso de conformidad con la presente invención se administran convenientemente en la forma de una presentación en aerosol por aspersión a partir de paquetes presurizados o un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotefrafluoroetano, dióxido de carbono u otros gases adecuados. En el caso de un aerosol presurizado la unidad de dosis puede determinarse mediante la provisión de una válvula para administrar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina, para uso en un inhalador o insuflador pueden formularse de manera que contengan una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada tal co o lactosa o almidón. En una modalidad preferida, las composiciones que comprenden células T activadas por Cop 1, un Cop 1 o péptido o polipéptrdo relacionados con Cop 1 se formulan de conformidad con procedimientos rutinarios tales como composiciones farmacéuticas adaptadas para administración intravenosa a seres humanos. Típicamente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en amortiguadores acuosos isotónicos estériles. Cuando es necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local tal como lignocaina para eliminar el dolor en el sitio de la inyección. Generalmente, los ingredientes se abastecen ya sea separadamente o juntos en una mezcla. Cuando la composición se va a administrar mediante infusión, ésta se puede dispensarse con una botella de infusión que contienen agua o solución salina estéril grado farmacéutico. Cuando la composición se administra mediante inyección, una ampolleta de agua o solución salina estéril para la inyección puede proveerse de manera que los ingredientes puedan mezclarse antes de la administración. Las composiciones farmacéuticas que comprenden Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionados con Cop 1 opcionalmente pueden ser administradas con un adyuvante en la manera usual para inmunización. Los ejemplos no limitantes de dichos adyuvantes incluyen alumbre y adyuvante incompleto de Freund. Otras maneras de mejorar la inmunogenicidad del péptido o polipéptído administrado incluyen la administración en la forma de una agregación o un complejo con albúmina o con otros vehículos, todos en conocidos a los expertos en la técnica de la vacunación. Las emulsiones metabolizables de lípidos, tales como Intralipid o Lipofundin también pueden ser utilizadas como vehículos para la terapia con Cop 1 de la manera descrita en WO 97/02016, los contenidos totales de la cual se incorporan en la presente invención como referencia. Mientras estos materiales se sabe que ocasionan un cambio de citosina TH1 a TH2, no hay razón para creer que las toxinas TH2 no serán operables, y tal vez incluso preferibles, para el propósito de la presente invención. Cuando Cop 1 se introduce oralmente, éste se puede mezclar con otras formas alimenticias y consumirse en forma sólida, semisólida, en suspensión, o en emulsión; y puede mezclarse con vehículos farmacéuticamente aceptables, incluyendo agua, agentes de suspensión, agentes emulsificantes, mejoradores de sabor, y similares. En una modalidad, la composición oral esta entéricamente revestida. El uso de revestimientos entéricos se conoce bien en la técnica. Por ejemplo, Lehman (1971) ensefía los revestimientos entéricos tales como Eudragit S y Eudragit L. El Handbaok of Pharmaeeutical Excipients, 2a Ed., también enseña las aplicaciones de Eudragit S y Eudragit T. Un Eudragit que puede ser utilizado en la presente invención es L30D55. Cop 1 también puede ser administrado nasalmente en ciertas formas anteriormente mencionadas mediante inhalación o gotas en la nariz. Además, la inhalación oral puede emplearse para administrar Cop 1 a tos revestimientos mucosales de los pasajes de la tráquea y de los bronquios. La invención también provee un paquete o equipo farmacéutico que comprende uno o más contenedores llenados con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. En una modalidad preferida, las composiciones farmacéuticas de la invención se administran a un mamífero, preferiblemente un humano, poco después de la lesión o detección de una lesión degenerativa en el SN. Los métodos terapéuticos de la invención pueden comprender la administración de células T activadas por Cop 1 o péptido o polipéptido relacionados con Cop 1, o cualquier combinación de los mismos. Cuando se utiliza terapia de combinación, Cop 1 puede administrarse antes, concurrentemente o después de la administración de las células T activadas por Cop 1. * ocasionalmente también a lo largo del tiempo de vida del individuo, dependiendo de la condición o enfermedad la cual está siendo .tratada. En el caso de la lesión al SNC, el tratamiento puede tener un intervalo entre varios días a meses o incluso años, hasta que la condición se haya estabilizado y no haya o solamente haya un riesgo limitado de desarrollo de degeneración secundaria. En la enfermedad humana crónica o enfermedad de Parkinson, el tratamiento terapéutico de conformidad con la invención puede ser de por vida. Como ser evidente a los expertos en la técnica, el efecto terapéutico depende en algunas ocasiones de la condición o enfermedad a ser tratada, de la edad del individuo y de las condiciones de salud, de otros parámetros físicos (por ejemplo, género, peso, etc.) del individuo, así como de varios otros factores, por ejemplo, si individuo está tomando otros fármacos, etc. La dosis óptima de las composiciones terapéutica que comprenden células T activadas por Cop 1 de la invención es proporcional al número de fibras nerviosas afectadas por la lesión del SN o enfermedad en el sitio a ser tratado. En una modalidad preferida, los intervalos de dosis de aproximadamente 5 x 106 a aproximadamente 107 células para tratar una lesión que afecta aproximadamente 105 fibras nerviosas, tal como una transección completa de un nervio óptico de rata, e intervalos de aproximadamente 107 aproximadamente 108 células para tratar una lesión que afecta aproximadamente 106-107 fibras nerviosas, tal como una transección completa de un nervio óptico de humano. Como ser evidente para tos expertos en la técnica, la dosis de las células T pueden ser escaladas hacia arriba o hacia abajo en proporción al número de fibras nerviosas que se cree que han sido afectadas en la lesión o sitio de la herida a ser tratada. (b) Establecimiento de bancos de células autóloaas para linfocitos T Para minimizar el daño secundario después de una lesión nerviosa, los pacientes pueden ser tratados mediante la administración de linfocitos T autólogos o semialogénicos sensibilizados a Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionados con Cop 1. Como la ventana de oportunidad no ha sido definida precisamente, la terapia debe administrarse tan pronto como sea posible después de la lesión primaria para maximizar las oportunidades de éxito, preferiblemente dentro de aproximadamente una semana. Para acortar la distancia entre el tiempo requerido para la activación y el tiempo necesario para el tratamiento, puede establecerse un banco con una bóveda personal de linfocitos T autólogos preparados para uso futuro para terapia neuroprotectora en contra de degeneración secundaria en el caso de lesiones al SN. Los linfocitos T se aislan a partir de la sangre y luego se sensibilizan a Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionados con Cop 1. Las células entonces se congelan y se almacenan adecuadamente bajo el nombre de la persona, número de identidad, y grupo sanguíneo, en un banco de células hasta que se les necesite.

Adicíonalmente, las células madre autótogas del SNC pueden ser procesadas y almacenadas para uso potencial por un paciente individual en el evento de trastornos traumáticos del SN tal como isquemia o lesión mecánica, así como para tratar condiciones neurodegenerativos tales como enfermedad de Alzheimer o enfermedad de Parkinson. Alternativamente, las células T semialogénicas o alogénicas pueden ser almacenadas mediante congelamiento en bancos para uso por cualquier individuo el cual comparta una molécula MHC tipo II con la fuente de las células T. Los siguientes ejemplos ilustran ciertas características de la presente invención pero no se pretende que limiten el alcance de la presente invención. (6) Ejemplos Materiales v métodos para los ejemplos 1 v 2 Animales. Ratas Lewis entrecruzadas adultas (8-12 semanas de edad) se abastecieron por el centro de crianza animal (Animal Breeding Centre) del instituto Weizmann de Ciencia. Las ratas se alojaron en un cuarto con luz y temperatura controladas y se agruparon por edad para cada experimento. Los animales se manejaron de conformidad con las regulaciones formuladas por IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee- Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal). Antígenos. La proteína básica de mielina (MBP) a partir de las médulas espinales de conejillos de indias y la ovoalbúmina (OVA) se * í % * obtuvieron a partir de Sigma (St. Louis, MO). La Cop 1 utilizada en tos presentes ejemplos fue el producto COPAXONE® de Teva Pharmaceuticals (Israel), cuyo producto se obtuvo comercialmente. Anticuerpos. El anticuerpo monoclonal para el receptor de la célula T anti-rata (TCR) se proveyó amablemente por el doctor Boris Reizis. IgG de cabra anti-ratón conjugada con Cy-3 (con mínima reacción cruzada a proteína de suero de rata, humano, bovino, y caballo), se obtuvo a partir de Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA). Líneas de célula T. Las líneas de célula T se generaron a partir de células drenadas de nodulos linfáticos obtenidas de ratas Leviis inmunizadas con los antígenos anteriormente mencionados (Ben-Nun et al, 1981a). El antígeno se disolvió en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) (1 mg/ml) y se multiplicó con un volumen igual de adyuvante incompleto de Freund (IFA) (Difco Laboratories, Detroit, Ml) suplementado con 4 mg/ml de Mycobacterium tuberculosis (Difco). Diez días después de que el antígeno se inyectó dentro de las almohadillas de la pata trasera de las ratas en 0.1 ml de la emulsión, las ratas se sacrificaron y sus nodulos linfáticos drenados se removieron quirúrgicamente y se disociaron. Las células se lavaron y se activaron con el antígeno (10 µg/ml) en un medio de estimulación que contenía medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con L- glutamina (2 M), 2- mercaptoetanol (5 x 105 M), piruvato de sodio (1 mM), penicilina (100 Ul/ml), estreptomicina (100 µg/ml), aminoácidos esenciales (1 ml/100 ml), y suero autólogo al 1% (volumen/volumen). Después de la ?Ción por 72 horas a 37°C, 98% de humedad relativa y 10% de CO2, tes células se transfirieron a medio de propagación que consistía de DMEM, L- glutamina, 2- mercaptoetanol, piruvato de sodio, aminoácidos no esenciales, y antibióticos en las mismas concentraciones que anteriormente, con la adición de 10% de suero de ternera fetal (FCS) (volumen/volumen) y 10% de factor de crecimiento de célula T derivado a partir del sobrenadante de células esplénicas estimuladas con concavalina A (ConA) (Gillis et al, 1978). Las células se crecieron en medio de propagación por 4-10 días antes de ser re- estimuladas con su antígeno (10 µg/ml) en la presencia de células de timo (107 células/ml) irradiadas (2000 rad) en medio de estimulación. Las líneas de células T se expandieron mediante estimulación y propagación repetidas (Ben-Nun et al, 1982). Lesión por aplastamiento del nervio óptico. En nervio óptico se sometió a lesión por aplastamiento como se describió previamente (Duvdevani et al, 1990). Brevemente, las ratas se anestesiaron profundamente mediante inyección intraperitoneal (i.p.) de Rompun (xilazina, 10 mg/kgjVitamed, Israel) y Vetalar (cetamina, 50 mg/kg; Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, IA). Utilizando un microscopio con operación binocular, se llevó a cabo la cantotomía lateral en el ojo derecho, y la conjuntiva de incidió lateralmente a la córnea. Después de la separación de los músculos retractores de los bulbos, el nervio óptico se expuso intraorbitalmente mediante disección directa. Utilizando fórceps con reacción cruzada calibrada, el nervio óptico se sometí a una lesión por aplastamiento 1-2 mm a partir del ojo. Las lesiones por aplastamiento moderadas severas se inflingieron para ensayos a corto plazo (dos semanas), se mostró que este periodo de tiempo es óptimo para demostrar la degeneración secundaria y su respuesta al tratamiento (Yoles, 1998). El nervio contralateral no lesionado se dejó sin perturbación.

Medición de la degeneración secundaria por marcado retróaradp de las células qanqlionares de la retina La degeneración secundaria de los axones del nervio óptico y sus células ganglionares de la retina unidas (RGC) se midieron después de la aplicación post-lesíón del colorante lipófilo fluorescente, yoduro de 4-(4-(didecilamino)estiril)-N-metilpiridinio (4-Di-10-Asp) (Molecular Probes Europe BV, Países Bajos), distalmente al sitio de la lesión, dos semanas después de la lesión por aplastamiento. Debido que solamente los axones que están intactos pueden transportar el colorante de regreso a sus cuerpos celulares, la aplicación del colorante distalmente al sitio de la lesión después de dos semanas asegura que solamente los axones que sobrevivieron tanto al daño primario como la degeneración secundaria serán contados. Este método capacitada la diferenciación entre neuronas que aún están funcionalmente intactas y neuronas en las que los axones están lesionados pero los cuerpos celulares aún están viables, debido solamente a que aquellas neuronas cuyas fibras están morfológicamente intactas pueden tomar el colorante aplicado distalmente al sitio de la lesión y transportarlo a sus cuerpos celulares. Utilizando este método, el número de RGC marcadas refleja confiablemente el número de neuronas que aún están funcionando. El marcado y la medición se llevaron a cabo como sigue: el nervio óptico derecho se expuso por segunda vez, de nuevo sin dañar el abastecimiento sanguíneo a la retina. La axotomía completa se llevó a cabo 1-2 mm a partir del borde distal de sitio de la lesión y se depositaron cristales sólidos (0.2-0.4 mm de diámetro) de 4-Di-10-Asp en el sitio de la axotomía recientemente formada. Cinco días después de la aplicación del colorante las ratas se sacrificaron. La retina se separó del ojo, se preparó montándola completa en plano en una solución de paraformaldehído al 4%, y se examinó para marcado de RGC mediante microscopía de fluorescencia. Ensayo inmunoabsorbente asociado a la enzima. Las células T anti-MBP secreción por una semana en un medio de propagación, luego se lavaron con PBS y se resuspendieron en un medio de estimulación. Las células T (0.5 x 106 células/ml) se preincubaron, en la presencia de timocitos irradiados (107 células/ml), con ConA (1.25 µg/ml), o con antígeno MBP (10 µg/ml), o con antígeno Cop 1 (10 µg/ml) o con antígeno OVA (10 µg/ml), o sin antígeno, en medio de estimulación a 37°C, 98% de humedad relativa y 10% de C02. Además, los timocítos irradiados (107 células/ml) solos se incubaron en medio de estimulación. Después de 48 horas las células se centrifugaron y sus sobrenadantes se colectaron y se muestrearon. Las concentraciones de neurotrofina (NT)-3, factor de crecimiento nervioso (NGF), y NT-4/5 en las muestras se determinaron por el uso de equipos de ensayo intercalado inmunoabsorbente asociado a la enzima (ELISA) (Promega, Madison, Wl) y lo É? aración con un estándar NT (medición de absorbancias a 450 nm utilizando un lector de ELISA). Las concentraciones del factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) en las muestras se determinaron con un ELISA intercalado sensible. En breve, las placas de 96 pozos con fondo plano se revistieron con anticuerpo de pollo anti-BDNF de humano (Promega, Madison, Wl) en 0.025 M de NaHCO3 y 0.025 de Na2CO3 (pH 8.2). El BDNF recombinante de humano (utilizado como estándar; Research Diagnosfics, Flanders, NJ) se utilizó en diluciones seriales en solución de bloqueo que contenía 3% de albúmina de suero de bovino (BSA), 0.05% de monolaurato de polioxietileno- sorbitán (Tween 20), y 1% de FCS en PBS (pH 8.2). El BDNF unido se detectó mediante incubación de las cajas con un anticuerpo de ratón anti-BDNF de humano (Research Diagnostics) y luego con IgG de cabra anti- ratón conjugada con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) en solución de bloqueo. Las placas se desarrollaron utilizando un sistema de sustrato líquido de 3,3', 5, 5'-tetrametil-bencidina (Sigma, St. Louis, MO). La reacción se detuvo mediante la adición de 1M de H3P04, y la densidad óptica se determinó a 450 nm. Los resultados para cada experimento se calcularon como la cantidad de NT secretada por 1 ml de muestra, después de la sustracción de los niveles básales de los timocitos irradiados incubados con el medio de estimulación. Inmunohistoquímica. Las criosecciones longitudinales (10 µm de grosor) de los nervios se colectaron sobre portaobjetos de vidrio revestidos con gelatina y se congelaron hasta su preparación para tinción mediante fluorescencia. Las secciones se fljarcf? én etanoi por 10 minutos a temperatura ambiente, se lavaron dos veces con agua doblemente destilada, y se incubaron por tres minutos en PBS que contenía 0.05% de Tween 20 y se incubaron con IgG de cabra anti-ratón conjugada con Cy3 (con mínima reacción cruzada a proteínas de suero de rata, humano, bovino, y cabaBo; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) por una hora a temperatura ambiente. Las acciones se lavaron con PBS que contenía Tween 20 y se trataron con glicerol que contenía 1 , 4-diazabiciclo- (2,2,2) octano para inhibir el desvanecimiento de la fluorescencia. Las acciones se observaron con un 10 microscopio Zeiss universal de fluorescencia.

EJEMPLO 1 NEUROPROTECCION MEDIANTE CÉLULAS T ANTI-COP 1 15 La transferencia adoptiva de células T reactivas a Cop 1 es neuroprotectora del nervio óptico lesionado En un estudio previo, a partir de laboratorio de los presentes inventores, se mostró que después de un trauma agudo al SNC en la rata, la transferencia pasiva de células T encefalitogénicas específicas a antígenos 20 del propio SNC tal como MBP previenen la extensión del daño y por to tanto detienen la degeneración secundaria (véase WO 99/60021), Aquí, el efecto neuroprotector de las células T reactivas a Cop 1 se demuestra, cuyas células T, a diferencia de las células T reactivas a MBP, no son encefalitogénicas.

S- «Sí ? ? I ) Inmediatamente después de la lesión moderada (figura 1A) o severa (f ?il J : 1 B) del nervio óptico, las ratas se inyectaron con PBS o IFA o con células T específicas a Cop 1 en IFA. Para la evaluación de la degeneración secundaria, el colorante neurotrazador 4-Di-10-Asp se aplicó al nervio óptico dístal al sitio de la lesión, dos semanas después de la lesión. Después de cinco días, las ratas se sacrificaron y sus retinas se retiraron y se montaron en plano. Las RGC marcadas (supervivientes), a partir de cuatro campos localizados a aproximadamente la misma distancia a partir del disco óptico en cada retína, se contaron bajo un microscopio de fluorescencia. Los resultados demuestran las figuras 1A y 1B. El efecto neuroprotector de las células T reactivas a Cop 1 en comparación con el del PBS fue significativo tanto para la lesión de aplastamiento moderado (P<0.005, prueba t de Student) como para la lesión de aplastamiento severo (P< 0.05, prueba t de Student). Los resultados son las sumas de tres experimentos. Cada grupo contenía de seis a diez ratas.

Las células T reactivas a Cop 1 se acumulan tanto en los tejidos neuronales lesionados como no lesionados El laboratorio de los presentes inventores ha demostrado previamente que la transferencia pasiva de las células T anti-MBP dentro de ratas de lesionadas mediante aplastamiento es seguida por una acumulación masiva de las células T inyectadas en el sitio de la lesión. La transferencia pasiva de las células T reactivas a Cop 1 en el presente estudio también una acumulación significativa de las células T inyectadas en el sitio de la lesión en relación a la acumulación de las células T antpMBP endógenas en la rata lesionadas tratadas con PBS. La acumulación de la célula T en las ratas tratadas con Cop 1 fue mayor hacia el día 7 después de la inyección. Estos hallazgos estuvieron de acuerdo con lo resultados anteriores con líneas de células T inyectadas de diferentes especificidades. En ese estudio, la acumulación de la célula T en el sitio de la lesión en los nervios lesionados no fue selectiva, en contraste con los nervios no lesionados, en donde solamente las células T específicas a auto-antígenos del SNC se encontraron que se acumulaban. Por lo tanto, la acumulación de las células T a Cop 1 en el nervio lesionado no provee ninguna indicación para el reconocimiento cruzado con ninguna de las proteínas residentes en el SNC y por lo tanto por su actividad. Sin embargo, las células T a Cop 1, similarmente a las células T a MBP, se acumulan en el nervio no lesionado, a diferencia de las células T a OVA (resultados no mostrados). Aunque hubo una acumulación menor de tes células T reactivas a Cop 1 que de células T específicas a MBP, estos hallazgos apoyan adicionalmente la noción de reactividad cruzada entre Cop 1 y MBP in vivo.

Peritos de citosina v neurotrofina de líneas celulares T inyectadas específicas a MBP v a COP 1 Los sobrenadantes a partir de células T no estimuladas o a partir de células T estimuladas por 48 horas con mitógeno ConA, o antígeno MBP, o antígeno Cop 1 en medio de estimulación se sometieron a ELISA intercalado. En medio de cultivo que contenía productos decretados por estas células se recolectó y sus contenidos de citosina se cuantificaron mediante ELISA. Lo resultados se muestran en el cuadro 2. Las células T activadas secretaron mucha mayor cantidad de citosina que las células T sin estimulación. Las células T estimuladas con MBP preferiblemente expresaron la citosifia específica a Th1 INF mientras que las células T estimuladas con Cop 1 preferencialmente expresaron la citosina específica a Th2 IL-10. Las cantidades más grandes de citosinas secretadas se detectaron en los sobrenadantes de células T estimuladas con ConA (cuadro 2).

CUADRO 2 La sobrerregulación de la expresión neurotrófica y la secreción por las células T activadas con sus antígenos específicos se demostró ' H* recientemente en el laborado de loé presentes inventores. En un intento por lograr un entendimiento hacia el mecanismo subyacente de la neuroprotección mediada por la célula T, los sobrenadantes de células T en el presente estudio se sometieron a ELISA para determinar los perfiles de neurotrofina (NT) de las células T responsables de la neuroprotección. Las células T estimuladas con Cop 1 secretaron tanto NGF como NT-4/5, pero en cantidades menores de aquella secretadas por las células T anti-MBP. Con relación a la producción por las células T anti-MBP, la producción de NT-3 por las células T estimuladas con Cop 1 fue insignificante; la producción de BDNF, sin embargo, fue masiva (figura 2A). Por lo tanto, las células T estimuladas con Cop 1 producen cantidades menores de todos los actores neurotróficos examinados, con la notable excepción de BDNF (figura 2A). Cuatro determinaciones independientes de las cantidades de NT-3 y BDNF decretadas por las células T estimuladas diferencialmente produjeron resultados similares. En cada caso, las células T estimuladas con Cop 1 produjeron aproximadamente 2.5 veces más BDNF que las células T anti-MBP, y solamente 10% de las cantidades de NT-3 (figura 2B).

VACUNACIÓN CON COP 1 La vacunación con Cop 1 protege a las fibras del nervio óptico de la degeneración secundaria Este ejemplo se pretende que muestre que la vacunación con Cop 1 en IFA, con un refuerzo dado dos días después, resulta en una respuesta inmune lo suficientemente fuerte para la neuroprotección dentro de la ventana de tiempo crítico. Las ratas anestesiadas que se sometieron a lesión por aplastamiento moderado del nervio óptico, inmediatamente se vacunaron con Cop 1 en IFA, y un refuerzo se dio dos días después. Después de dos semanas las RGC se marcaron retrógradamente, y cinco días después las ratas se sacrificaron y sus retinas se retiraron. Las ratas vacunadas con Cop 1 en IFA mostraron evidencia de neuroprotección significativa en comparación con las ratas control inyectadas con PBS en IFA (figura 3).

PROf ECCION DE LA TOXICIDAD DEL GLUTAMATO Experimento 1 : la vacunación con COP 1 protege a las fibras nervio óptico de la toxicidad del glutamato Debido a la neuroprotección prometedora de los nervios lesionados obtenida mediante la inmunización con Cop 1, es importante encontrar si la protección podría restringirse al daño nervioso ocasionado por el trauma, o podría ser una neuroprotección más general a partir de condiciones ambientales hostiles ocasionadas por la toxicidad inducida por el glutamato por consiguiente, se condujo el siguiente experimento. Inmunización. Los ratones C57BI/6J (8-10 semanas de edad) se inyectaron cada uno con un total de 75 µg de Cop 1 emulsificado la con un volumen igual de adyuvantes completo de Freund (CFA) que contenía 5 mg/ml de micobacteria H37 RA (Difco). Los ratones en un segundo grupo se inyectaron con emulsión de solución salina amortiguada con fosfato (PBS) con CFA. La emulsión, en un volumen total de 0.1 ml, se inyectó intradermalmerrte diez días antes de que el glutamato se introdujera dentro de la retina. Toxicidad del glutamato. Diez días después de ta inmunización, los ratones se anestesiaron, y 1 µl de solución salina que contenía 200 nmoles del glutamato se inyectó dentro del cuerpo vitreo del ojo derecho. El ojo izquierdo no se inyectó y sirvió como un control.

Marcado de las células ganglionares de la retina. Tres días (72 horas) antes de la evaluación de la supervivencia de las RGC, cada ratón se anestesió y se colocó en un dispositivo estereotáctico. El cráneo se expuso y se mantuvo seco y limpio. El bregma se identificó y se marcó. El punto destinado de inyección estuvo una profundidad de 2 mm a partir de la superficie cerebral, 2.92. Por detrás del bregma en el eje anteroposterior, y 0.5 mm lateral a la línea medía. Una ventana se taladró en el cuero cabelludo por encima de las coordenadas designadas en los hemisferios derecho e izquierdo. El colorante neurotrazador FluoroOro (solución al 4% en solución salina; FluoroChrome, Dever, CO) se aplicó entonces (1 µl, a una relación de 0.5 µl/min) utilizando una jeringa Hamilton. Evaluación de la supervivencia de las RGC. Siete días después de la administración del glutamato los ojos se enuclearon y sus retinas se separaron y prepararon montándolas completas en plano en solución del 4% de páraformaldehído. Las células marcadas a partir de seis a ocho campos de tamaño idéntico (0.078 mm2), localizadas aproximadamente a 1 mm del disco óptico se contaron bajo el microscopio de fluorescencia y se promediaron. Los resultados se muestran en la figura 4. La toxicidad al glutamato se encontró que es aproximadamente cuatro veces mayor en los controles que en tos ratones inmunizados con Cop 1.

Experimento 2: vacunación para protección de neuronas en Gontra de toxicidad del glutamato e hipertensión ocular En este estudio, la inmunización activa o pasiva con un péptido derivado a partir de glucoproteína de mielina del oligodendrocito (MMOG) o con MBP, la cual provee neuroprotección efectiva después de la lesión axonal (Moaiem et al., 1999a; Moaiem et al., 1999b y Fisher et al., 2000), se muestra que no protege las neuronas de la toxicidad ocasionada por el glutamato. La protección de la toxicidad del glutamato se logró, sin embargo, mediante la vacunación con Cop 1. La inmunización con Cop 1 demostró adicionalmente que provee una protección altamente efectiva a la muerte de célutes ganglionares de la retina inducida por hipertensión ocular en el modelo de rata con glaucoma, bajo condiciones en donde la presión permanece elevada y no se ve afectada por la inmunización.

Materiales v métodos Animales. Todos los animales se manejaron de conformidad con las regulaciones formuladas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal. Los ratones de las cepas C57BL/6J, y Balb/c, de 8-13 semanas de edad, y la ratas Lewis entrecruzadas adultas de 8-12 semanas de edad se abastecieron por el Centro de Crianza Animal del Instituto Weizmann de Ciencia y alojaron en cuartos con luz y temperatura controlados. Las ratas se alojaron de manera que su edad y tamaño coincidiera en cada experimento. Antes de su uso en los experimentos, tos animales se anestesiaron mediante administración intraperítoneal de cetamina 80 mg/kg y xilazina 16 mg/kg. Antígenos. Cop-1 se obtuvo partir de Teva Pharmaceuticals (Petah Tikva, Israel). La glucoproteína de mielina de oligodendrocito (MOG) péptido (pMOG) 1-22 (GQFRVIGPGHPIRALVGDEAEL) (SEO ID NO: 33) se sintetizó en el laboratorio del Profesor M. Fridkin el Departamento de Química del Instituto Weizmann de Ciencia, utilizando la técnica Fmoc con un sintetizador automático de múltiples péptidos (AMS422, Abimed, Langenfeld, Alemania). MBP a partir de las médulas espinales de los conejillos de Indias se obtuvieron a partir de Sigma (Israel). Inmunización. Los ratones o ratas se inmunizaron con 75 µg o 100 µg de Cop 1, respectivamente, o 300 µg de pMOG emulsíficado con un volumen igual de adyuvante completo de Freund (CFA) que contenía 0.5 ó 5 mg/ml de Mycobacterium tuberculosis. La emulsión (volumen total de 0.15 ml) se inyectó subcutáneamente en un sitio en el flanco. Una semana después, a los ratones inmunizados con pMOG se les dio una inmunización idéntica en el otro flanco como un refuerzo. Los ratones controla que inyectaron con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) en CFA (Difco, Detroit, Michigan, EUA). Lesión mediante aplastamiento del nervio óptico. Lo ratones o ratas se anestesiaron y se sometieron a una lesión de aplastamiento severa en la porción intraorbital del nervio óptico, 1-2 mm a partir del globo ocular. Con la ayuda del microscopio de operación binocular, la conjuntiva se escindió ' y el nervio óptico se expuso. Utilizando fórceps calibrados con acción cruzaba y tomando cuidado especial para no interferir con el abastecimiento sanguíneo, el nervio se aplastó por 2s (ratones) a 30 s (ratas). Inyecciones de glutamato y de NMDA. El ojo derecho del ratón o rata anestesiada se pinchó con una aguja hipodérmica 27 en la parte superior de la esclera, y una jeringa Hamilton de 10 µl con una aguja hipodérmica 30 tanto como para que llegara al cuerpo vitreo. Los ratones inyectaron con un volumen total de 1 µl (200 nmoles) de L- glutamato o 1 MICROI de N-metB-D- aspartato (NMDA; 75 nmoles; RBI, Boston, MA) dísuelto en solución salina. Las ratas se inyectaron con 2 µl (375 nmoles) de L- glutamato. Aplicación pre-lesión del colorante estereotáctico en los ratones. El cráneo se expuso y se mantuvo seco y limpió utilizando 15% de peróxido de hidrógeno. El bregma se identificó y se marcó. Un orificio se perforó por arriba del coliculus superior de cada hemisferio (0.292 mm por detrás y 0.05 mm lateral a la línea media). Utilizando un dispositivo de medición estereotáctico y un inyector Hamilton, los ratones inyectaron con FluoroOro (5% en solución salina, Fluorocromo, Denver, CO; 1 µl) en un punto del csliculus superior de cada hemisferio, a una profundidad de 0.16 mm o 0.175 mm (dependiendo de la cepa del ratón) a partir de la superficie ósea del cerebro. Después de terminar la inyección, la herida se suturó. La toma retrógrada del colorante provee un marcado de las células vivas. Evaluación de la supervivencia de las células ganglionares retinales en los ratones. A los ratones se les dio una dosis letal de pentobarbitona (170 mg/kg). Sus ojos se enuclearon y las retinas se separaron y prepararon montándolas completas en plano en paraformaldehído (4% en PBS). Las células marcadas a partir de 4-6 campos seleccionados de tamaño idéntico (0.7 mm2) se contaron. Los campos seleccionadon se localizaron aproximadamente la misma distancia a partir del disco óptico (0.3 mm) para superar la variación en la densidad de RGC como una función de la distancia a partir del disco óptico. Los campos se contaron bajo microscopía de fluorescencia (amplificación x 800) por observadores ciegos al tratamiento recibido por el ratón. El número promedio de RGC por campo en cada retína se calculó. Evaluación de la supervivencia de células ganglionares retinales en las ratas. La supervivencia de las RGC en la ratas se midió después del aplicación post-lesión del colorante lipófilo fluorescente, yoduro de 4-(4-(didecilamino)estiril)-N-metilpiridinio (4-Di-10-Asp) (Molecular Probes Europe BV, Países Bajos), distalmente a la cabeza del nervio óptico. El marcado y la medición se llevaron a cabo como sigue: el nervio óptico se expuso sin daño del abastecimiento sanguíneo a la retina. La axotomía completa se llevó a cabo a 1-2 mm a partir de la cabeza del nervio óptico y se depositaron cristales sólidos (0.2-0.4 mm de diámetro) de 4-D¡-10-Aßp en el sitio de la axotomía formada. Cinco días después del aplicación del cotorante las ratas se sacrificaron. La retina se separó del ojo, se preparó como un montaje total en plano en una solución de paraformaldehído al 4%, y examinaron para RGC marcadas mediante microscopía de fluorescencia. En los animales -^Sisd", experimentales IOP, las célíia *l i|ltenares se marcaron mediante transporte retrógrado de tetrametilrodamina dextrán (DTMR) (Molecular Probes, OR). Los cristales de DTRM de PM 3000 se aplicaron al extremo cortado del nervio óptico aproximadamente de 2 a 3 mm a partir del globo 5 ocular. Veinticuatro horas después las retinas se montaron completas y las células ganglionares marcadas en ocho regiones, dos en cada cuadrarte, (0.66 a 1.103 mm a partir del extremo del disco óptico) se contaron con una amplificación de 400x. Generación de una línea de célula T Cop 1 de ratón. Una línea 10 de célula T de ratón se generó a partir de células de nodulos linfático drenado obtenidas a partir de ratones C57BL/6J inmunizados con antígeno Cop-1. El antígeno se disolvió en PBS (con mg/ml) y se emulsificó con un volumen igual de CFA suplementado con 5 mg/ml de Mycobacterium tuberculosis (Difco). Diez días después de la inmunización dentro de las almohadillas de la pate 15 trasera, los ratones se sacrificaron y sus nodulos linfáticos drenados se removieron quirúrgicamente y se disociaron. Las células se lavaron y se activaron con el antígeno (10 µg/ml) en medio de estimulación que contenía RPMI suplementado con L- glutamina (2 mM), 2- mercaptoetanol (5 x 105 M), penicilina (100 unidades/ml), estreptomicina (100 µg/ml), y suero autólogo al 20 0.5% (volumen/volumen). Después de la incubación por 72 horas a 37°C, 98% de humedad relativa y 10% de CO2, las células se transfirieron a medio de preparación que consistía de RPMI suplementado con aminoácidos no esenciales (1 ml/100 ml), piruvato de sodio (1 mM), L- glutamina, ß- •**-• i- mercaptoetanol, penicilina y estreptßrMcina, en las mismas concentraciones anteriormente mencionadas, con la adición de 5% de suero de ternera fetal (volumen/volumen) y 10% de factor de crecimiento de célula T derivado a partir del sobrenadante de células de paso estimuladas con concavalina A. Las células se crecieron en medio de propagación por 10-14 días antes de ser re-estimuladas con su antígeno (10 µg/ml) en la presencia de células de timo (107 cétulas/ml) irradiadas (2500 rad), en medio de estimulación. Las líneas de células T se expandieron mediante estimulación y propagación repetidas. Básicamente la línea tiene un fenotipo similar al previamente descrito (Aharoni et al, 1997). Generación de una línea de célula T Cop 1 de rata. Las líneas de célula T se generaron a partir de células de nodulos linfáticos drenados obtenidas a partir de ratas Lewis inmunizados con los antígenos anteriormente mencionados. El antígeno se disolvió en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) (1 mg/ml) y se emulsificó con un volumen igual de adyuvante incompleto de Freund (IFA) (Difco Laboratories, Detroit, Ml) y suplementado con 4 mg/ml de Mycobacterium tuberculosis (Difco). Diez días después de que el antígeno se inyectó dentro de las almohadillas de la pata trasera de las ratas en 0.1 ml de la emulsión, las ratas se sacrificaron y sus nodulos linfáticos drenados se removieron quirúrgicamente y se disociaron. Las células se lavaron y se activaron con el antígeno (10 µg/ml) en medio de estimulación que contenía medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con L- glutamina (2 mM), 2- mercaptoetanol (5 x 105 M), piruvato de sodio (1 mM), penicilina (100 Ul/ml), estreptomicina (100 µg/ml), aminoácidos esenciales (1 ml/100 ml), y suero autólogo al 1% (volumen/volumen). Después de la incubación por 72 horas a 37°C, 98% de humedad relativa y 10% de CO2, las células se transfirieron a medio de propagación que consistía de DMEM, L- glutamina, 2- mercaptoetanol, piruvato de sodio, aminoácidos no esenciales, y antibióticos en las mismas concentraciones que anteriormente, con la adición de 10% de suero de ternera fetal (FCS) (volumen/volumen) y 10% de factor de crecimiento de célula T derivado a partir del sobrenadante de células esplénicas estimuladas con concavalina A (ConA) (Gillis et al, 1978). Las células se crecieron en medio de propagación por 4-10 días antes de ser re-estimuladas con su antígeno (10 µg/ml) en la presencia de células de timo (107 células/ml) irradiadas (2000 rad) en medio de estimulación. Las líneas de células T se expandieron mediante estimulación y propagación repetidas. Análisis histológico. Siete días después de la inyección del glutamato o solución salina los ratones se sacrificaron mediante inyección de una dosis letal de pentobarbitona (170 mg/kg) y sus ojos se removieron y se fijaron en formadehído (4% en PBS) por 48 horas a 4°C. Las secciones (10 µm de grosor) se embebieron en parafina y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E). Generación de hipertensión ocular en ratas/elevación de presión intraocular en ratas. La ratas Lewis machos se anestesiaron con una mezcla de cetamina (15 mg/kg), acepromazina (1.5 mg/kg), y xilazina (0.3 mg/kg). Un ~ incremento en la presión intraoculaf 5 frf se logró mediante fotocoagulación por láser de tas venas timbal y episclerat. Las ratas recibieron dos tratamientos de láser, una semana aparte, con un láser de argón azul-verde (1 watt por 0.2 s, administrado un total de 130- 150 puntos de 50 µm en los dos tratamientos; Coherent Palo Alto, CA). La IOP se midió una vez a la semana utilizando TONO-PEN (Mentor, Norwell, MA), después de inyectaron las ratas - ¿ intramuscularmente con el tranquilizador de uso veterinario acepromazina 3.0 mg/kg y aplicando proparacaína 0.5% tópicamente en los ojos para anestesiar la córnea. 10 Resultados Los antígenos asociados con mielina no son protectores en contra de la toxicidad del glutamato. El laboratorio de la presente invención previamente ha demostrado que la inmunización pasiva y activa con 15 antígenos asociados con mielina puede reducir ta degeneración post- traumática asociada con la lesión por aplastamiento del nervio óptico en ratones y ratas (ejemplos 1 y 2; Moaiem et al., 1999 y Fisher et al., 2000) y con lesión contusiva a la médula espinal en ratas adultas (Hauben et al., 2000a y Hauben et al., 2000b). Para determinar si dicha neuroprotección 20 inmune se ejerce después de una lesión no mecánica también, primeramerrte se examinó si la inmunización activa con antígenos asociados a mielina o transferencia pasiva de células T reactivas a estos antígenos provee neuroprotección en contra de la toxicidad inducida por la inyección intravitral del glutamato. Los nervios ópticos d#tf f»#t«atas y los ratones se sometieron a lesión por aplastamiento. Utilizando protocolos establecidos para neuroprotección inmune a partir de laboratorio de los presentes inventores, la inmunización activa con péptidos derivados de MOG (Fisher et al., 2000) se llevó a cabo en ratones y la transferencia pasiva de células T anti-MBP en ratas (Moaiem et al., 1999). La agresión del glutamato se inflingió mediante inyección intravitral del glutamato a una concentración previamente mostrada que lleva a la muerte de RGC misma que se mide después de una semana tanto en ratones como en ratas (Yoles et al., 2000). Los ratones se inmunizaron con pMOG antes de la inyección intravitral del glutamato (200 nmoles). Cuando la relación de supervivencia de las RGC se evaluó una semana después de la inyección del glutamato, no hubo evidencia de un efecto benéfico de la inmunización con pMOG que pudiera ser detectable (figura 5A). Similarmente, no se detectó ningún efecto benéfico cuando la inyección del glutamato se siguió inmediatamente por la transferencia pasiva de células T anti-MBP en ratas (figura 5B). Por lo tanto, a pesar de que la vacunación con pMOG (1-22) recientemente demostró que induce una respuesta neuroprotectora en los ratones después de la lesión por aplastamiento del nervio óptico (Fisher et al., 2000), no se observó dicha neuroprotección en el presente estudio después de que los ratones vacunados con pMOG se sometieron a la agresión con glutamato. Estos hallazgos llevan a los presentes inventores a considerar dos posibilidades: ya sea la pérdida de RGC siguiendo a la toxicidad del glutamato no se somete a la neuroprotáÉfrón inmune, indicando que la muerte de las RGC inducida por glutamato no implica al sistema inmune, o que tos antígenos asociados con mielina tales como pMOG o MBP no son tos antígenos adecuados para la protección en contra de la toxicidad al glutamato. Los estudios recientes a partir de laboratorio de los presentes inventores (Kipnis et al., 2000), muestran que la relación de muerte celular ocasionada por el glutamato es mayor en las ratas o en los ratones que carecen «te células T maduras que en tos animales normales, 1o cual sugiere fuertemente que la respuesta fisiológica benéfica a la agresión al SNC implica a las células T. Por consiguiente, el refuerzo de esta respuesta endógena de célula T inducida por glutamato probablemente tiene un efecto benéfico sobre la retina lesionada. La inmunización con Cop 1 protege contra de la toxicidad del glutamato. Mientras que la búsqueda por un antígeno fisiológico que pueda evocar una respuesta inmune benéfica hacia la toxicidad inducida por glutamato aún es un objetivo primordial en esta etapa, los presentes inventores se interesaron en el hallazgo de un antígeno que pudiera ser utilizado para propósitos de manipulación exógena del sistema inmune en la respuesta inmune al glutamato. Primero se examinó si o no la inyección de glutamato ocasiona que las RGC se vuelvan accesibles a tos linfocitos. Se encontró que grandes números de linfocitos invaden al ojo inyectado con glutamato dentro de 24 horas después de la inyección con glutamato (figuras 6A y 6B), sugiriendo que la manipulación inmune podría influir la supervivencia de las RGC siguiendo a la exposición local al glutamato. Tomándolas juntas, estas dos observaciones llevan a tos presentes inventores a creer que la toxicidad del glutamato activa un efecto protector mediado por la célula T, y anima a los presentes inventores a buscar un modo de reforzar esta respuesta inmune. Buscando un antígeno apropiado, el polímero sintético copolímero 1 (Cop 1 ), el cual es un oligopéptido utilizado como un fármaco en pacientes con esclerosis múltiple, y que recientemente ha mostrado reforzar la neuroprotección en un modelo de lesión por aplastamiento del nervio óptico de la rata adulta (Kipnis et al., 2000a), se consideró como un candidato probable. Primero, se examinó si o no la inmunización con Cop 1 tiene un efecto benéfico sobre la supervivencia de las RGC después de la lesión por aplastamiento de nervio óptico en los ratones, y no solamente en las ratas. Para este estudio, se utilizaron ratones Balb/c. La inmunización con Cop 1, utilizando un protocolo que se encontró benéfico después de la lesión por aplastamiento del nervio óptico en las ratas, también fue benéfica después de la lesión del nervio óptico en los ratones (figura 7). A continuación, se investigó si o no el mismo protocolo puede llevar a neuroprotección en contra de toxicidad inducida por glutamato. Para este estudio, se utilizaron ratones C57bl/6, en los que la pérdida del ganglio retinal siguiendo a la agresión por glutamato es mayor que en Balb/c (Kipnis et al., 2000b). Diez días antes de la inyección intravitral del glutamato, los ratones C57bl/6 se inmunizaron con Cop 1 emulsificado en adyuvante que contenía 5 mg/ml de bacterias. Esta cepa se seleccionó en vista de los hallazgo recientes en el laboratorio de los presentes inventores de que la pérdida de RGC inducida por la inyección del glutamato en estos ratones es mayor que en los ratones Balb/c debido a una unión genética entre la pérdida neuronal y la resistencia a la enfermedad autoinmune (Kipnis et al., 2000b). La inmunización con Cop 1 resultó en una reducción significativa en la toxicidad del glutamato (figura 8A). En un intento para establecer la ventana terapéutica para la inmunización con Cop 1 en este modelo, el experimento utilizando Cop 1 emulsificado en adyuvante que contenía dos diferentes concentraciones de bacterias (0.5 o 5 mg/ml) se repitió y los ratones se inmunizaron a diferentes tiempos en relación con la agresión por glutamato. Lo ratones inmunizados al día de la inyección del glutamato incluso mostraron relaciones significativamente mayores de supervivencia de las RGC que aquélla observada en los ratones inyectados con PBS emulsificado en el adyuvante correspondiente (figura 8B y 8C). Ambos adyuvantes produjeron efectos significativos. La eficiencia protectora de Cop 1 disminuyó con el tiempo entre, la inmunización y la agresión del glutamato: el porcentaje medio de relación de supervivencia de las RGC cuando la inmunización con Cop 1 se dio inmediatamente o después de 24 horas después de la inyección con glutamato fue significativamente mayor que en las retinas inyectadas con PBS y no fue significativo cuando Cop 1 se dio 48 horas después de la inyección con glutamato (figura 8D). De manera interesante, la inmunización con Cop 1 no protegió a los ratones de la toxicidad ocasionada por NMDA (figura 9), recientemente mostrada por el laboratorio de los presentes inventores que ocasiona, en este modelo in vivo, muerte de RGC con diferentes caracterísficas a partir de aquella muerte típica de apoptosis. La transferencia adoptiva de las células T reactivas a Cop 1 protegen contra de la toxicidad al glutamato. Para determinar si inmunización observada con Cop 1 lleva a una neuroprotección mediada por la célula T en contra de la toxicidad del glutamato, 5 x 106 células T reactivas a Cop 1 (250 µl intraperitonealmente) se transfirieron pasivamente dentro de ratones inmediatamente después de la inyección del glutamato (200 nmoles). Una semana después, significativamente más RGC habían sobrevivido en los ratones inyectados con células T reactivas a Cop 1 (1978 ± 86, n =6) que en to ratones control (1238 ± 2, n =3) inyectados intraperitonealmente con PBS (figura 10). La inmunización con Cop 1 protegen a las células ganglionares de la retína de la muerte inducida por la hipertensión ocular en las ratas. A las ratas Lewis se les dieron dos tratamientos láser, una semana aparte, para incrementar la IOP. Las mediciones subsecuentes en los puntos de tíempo indicados durante un periodo de tres semanas mostraron que dos semanas después de los tratamientos láser la IOP se había incrementado a 30 ± 0.4 mm Hg (media ± SEM), y permaneció aproximadamente este nivel posteriormente (figura 11 A). La relación de supervivencia de células ganglionares de la retína en estas ratas, medidas tres semanas después del tratamiento inicial con láser, fue significativamente menor (por 19.9% ± 0.51%, media ± SEM) que en la ratas control no tratadas con láser (figura 11B). Para examinar el efecto de la inmunización con Cop 1 sobre la supervivencia de las células ganglionares de la retina, las ratas se inmunizaron con Cop 1 emulsífícado en CFA el primer día del tratamiento con láser. Las ratas control se inyectaron con PBS en el mismo adyuvante. Después de tres semanas, las células ganglionares de la retina se marcaron retrógradamente, y 24 horas después la retina se retiraron, se montaron completas, y las células ganglionares de la retina marcada se contaron. El número de células ganglionares de la retina supervivientes en las ratas inmunizadas con Cop 1 fue significativamente mayor que en los controles inyectados con PBS/CFA (figura 11C). La IOP en ambos grupos de ratas permaneció tan alta como en un grupo de ratas tratadas con láser que no había recibido inyecciones (figura 11A). Un efecto similar aunque ligeramente menor se observa en las ratas que se inmunizaron con Cop 1 cuando su IOP ya estaba alta (figura 11 D). (7) Discusión de resultados Aún no se ha encontrado la cura para las lesiones de la medida espinal, una de las lesiones traumáticas más comunes aún devastadora en las sociedades industriales. Se ha sabido por más de 40 años que las neuronas del SNC, a diferencia de las neuronas del sistema nervioso periférico, poseen solamente una capacidad limitada para regenerarse después de una lesión. Durante las últimas dos décadas, los intentos para promover la regeneración han producido métodos que llevan a una recuperación parcial. En los últimos dos años se ha vuelto aparente que, a pesar de que la mayoría de tes lesiones traumáticas soportadas por la médula espinal del humano son parciales, la pérdida funcional resultante es de alguna manera mucho peor de lo que podría considerarse por la severidad del daño inicial; el proceso de autopropagación de la degeneración secundaria parece ser decisivo. Un esfuerzo de investigación substancial recientemente se ha dirigido para detener la degeneración secundaria inducida por lesiones. Todos los intentos hasta ahora han estado basados farmacológicamente, y algunos han resultado en una recuperación mejorada a partir del choque espinal. Los presentes estudios, en contraste, describen una terapia celular que aumenta lo que parece ser un mecanismo natural de automantenimiento y lleva, después de un tratamiento único, a la recuperación a largo plazo. El grado de esta recuperación parece exceder el reportado utilizando métodos farmacológicos. En la mayoría de los tejidos, el daño inducido por una lesión dispara una respuesta inmune celular que actúa para proteger al tejido, y preservar su homeostasis. Esta respuesta se ha atribuido a los macrófagos y a otras células que comprenden las armas innatas del sistema inmune. Los linfocitos, los cuales son responsables de la inmunidad adaptativa, no han sido considerados como participantes en el mantenimiento tisular. La inmunidad adaptativa, de conformidad con las enseñanzas tradicionales, se dirige en contra de peligros externos. Los presentes estudios muestran ahora, sin embargo, que la respuesta inmune de la célula T adaptativas puede incluso proteger cuando no hay invasión por patógenos externos. En el caso del mantenimiento del tejido, la especificidad de las células T es hacia autoantígenos tisulares. Los resultados de los ejemplos anteriormente mencionados demuestran el efecto neuroprotector de las células T reactivas a Cop 1 en un nervio del SNC lesionado mediante aplastamiento, así como en un nervio óptico expuesto a la toxicidad del glutamato. En el modelo de ratas de aplastamiento parcial del nervio óptico, la administración adoptiva de células T reactivas a Cop 1 o la vacunación con Cop 1 en el día de la lesión del SNC tiene un efecto marcadamente preventivo sobre la degeneración secundaria de las fibras nerviosas. Esta es la primera ocasión que la vacuna se muestra como un método posible para prevenir el avance del daño después de la lesión traumática al nervio óptico. Después de la lesión por aplastamiento del nervio óptico de rata, la inyección de células T reactivas a Cop 1 resultó en una protección significativa en contra del efecto destructivo de la degeneración secundaria. Las células T se acumularon en el sitio de la lesión, como se esperaba, pero éstas también se acumularon en el nervio que no había sido lesionado. La acumulación de las células T en el SNC no lesionado es posible solamente si hay reconocimiento del receptor de la célula T por el antígeno presentado. Las células T activadas pueden pasar a través de la barrera hematoencefálica (BBB) sin importar su especificidad, pero solamente aquéllas que son reactivas a los antígenos del SNC pueden acumularse en los nervios no lesionados <Hickey, 1991). Por lo tanto, los presentes hallazgos demuestran, por primera vez, el reconocimiento cruzado in vivo entre las células T reactivas a Cop 1 y los componentes de la mielina del SNC. Este reconocimiento en el sitio de la lesión probablemente sirve como el disparo para la activación de la célula T, llevando al encendido de las células T hacia el fenotipo protector, posiblemente mediante la secreción de factores neurotróficos adecuados u otros factores, aún por ser descubiertos, producidos por las células T activadas. Este estudio demuestra que las células T reactivas a Cop 1 activadas por su antígeno específico secretan cantidades significativas de BDNF, una neurotrofina que desempeña un papel principal en la supervivencia neuronal (Yan et al., 1992; Sendtner et al., 1992). Cop 1 originalmente se diseñó para imitar la actividad de la proteína básica de mielina (MBP) y para inducir la enfermedad inflamatoria desmielinizante EAE en roedores. Se encontró, sin embargo, que no es encefalitogénico y que incluso suprime la EAE inducida por MBP (Teitelbaum et al., 1971), proteína proteolípido (PLP) (Teitelbaum et al., 1996), o MOG (Ben-Nun et al., 1996 ). Cop 1 previene el desarrollo de EAE en roedores y mejora la esclerosis múltiple en humanos. Los estudios han demostrado reactividad cruzada parcial entre anticuerpos a Cop 1 y MBP o entre las células T dirigidas a estos antígenos (Webb et al., 1973 y Teitelbaum et al., 1988). Cop 1 puede servir como un antagonista del receptor del antígeno de la célula T para el epítope MBP inmunodominante (Aharoni et al., 1998). Este también se puede unirse a varias moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase II y previene a éstas de unirse a las células T con propiedades específicas de reconocimiento del antígeno (Fridkis-Hareli et al., 1998). En los roedores, Cop 1 induce la expresión de células reguladoras que suprimen a las células T encefalitogénicas. La transferencia adoptiva de dicha células T en lo roedores puede encontrarse que previene desarrollo de EAE inducida por MBP (Aharoni et al., 1993), PLP (Teitelbaum et al., 1996), u homogeneizados de médula espinal completa (Aharoni et al., 1997). Por lo tanto, la inmunización con Cop 1, a pesar de la inmunización con MBP y otras proteínas asociadas a míelina, no induce EAE, y ias células T evocadas por Cop 1, en ausencia de adyuvantes, son de una naturaleza reguladora. La inmunización con Cop 1 en IFA inmediatamente después de la lesión, seguido por un refuerzo dos días después, tuvo un fuerte efecto neuroprotector. Dicha inmunización probablemente alcance el pico de su respuesta celular dentro de aproximadamente una semana, pero es razonable asumir que incluso después de este tiempo el número de células T presentes en el SNC aparentemente será to suficientemente grande para ejercer al menos alguna actividad neuroprotectora. Se sabe que después de la inmunización con MBP, los síntomas de EAE aparecen diez días después, indicando que a ése tiempo la respuesta inmune es lo suficientemente fuerte para que las células T encefalitogénicas se acumulen en el sitio de la lesión, inflingiendo su daño, y produciendo síntomas de EAE. El presente estudio sugiere que, después de la inmunización con Cop 1 en IFA seguido dos días después por un refuerzo, la respuesta inmune en el nervio óptico es suficiente para pre ienlr la degeneración secundaria. Es posible que esta respuesta e é de alguna manera retrasada con relación a la respuesta obtenida después de la transferencia pasiva de las células T, pero sin embargo aún se logró dentro de la ventana de tiempo necesaria para la protección de las fibras nerviosas que escaparon de la lesión primaria. Los estudios previos en el nervio ópWco de la rata han demostrado que la pérdida de neuronas resultante a partir de la degeneración secundaria es de aproximadamente 25% una semana después de la lesión por aplastamiento moderado y aproximadamente 55% dos semanas después de la lesión (Yoles, 1998). Por lo tanto, incluso si la respuesta toma una semana para alcanzar la fuerza requerida, habría aún fibras nerviosas que necesiten la protección en ese momento. Una comparación de los resultados obtenida después de la transferencia adoptiva de las células T activadas reactivas a Cop 1 y después de la inmunización activa con Cop 1 sugiere que no hay diferencia significativa entre los dos tratamientos durante el tiempo que se toma para ésta se vuelva máximamente efectiva, y el grado de protección a partir de la degeneración secundaria fue casi el mismo en ambos casos. Debe enfatizarse que Cop 1 está exhibiendo aquí un efecto que es opuesto al de su efecto conocido; Cop 1 se conoce como un agente diseñado para suprimir la autoinmunidad de la célula T, mientras que aquí tiene un efecto que requiere la activación de autoinmunídad específica de la célula T anti-mielina. En conclusión, los estudios iniciales han mostrado que la lesión axonal en el SNC de la rata despierta una respuesta de célula T autoinmune la cual se dirige en contra de las proteínas de mielina, pero es demasiado débil para proteger a las fibras nerviosas de la degeneración secundaria. El refuerzo de esta respuesta inmune sin riesgo de enfermedad autoinmune que la acompañe se logró en este estudio al utilizar un copolímero el cual se reconoce de manera cruzada por el SNC pero no es encefalitogénico. La respuesta inmune de la célula T al polímero, obtenida ya sea mediante transferencia pasiva o mediante inmunización durante tiempo de la lesión, provee un medio efectivo de mantenimiento post-traumático. La neuroprotección mediada por la célula T demostrada aquí se aplica tanto a lesiones crónicas, agudas de nervios del SNC, en los cuales las neuronas son vulnerables a la degeneración y son capaces de llevar a cabo neuroprotección. Esto también es aplicable a la protección a partir de la degeneración primaria y secundaria ocasionada por la toxicidad del glutamato. La neuroprotección inmuno dependiente de la célula T, lograda por la inmunización pasiva o activa con Cop 1, también se muestra aquí en tos resultados como una terapia efectiva para la toxicidad inducida por glutamato en tos ratones y en el modelo de rata con IOP crónicamente alta. Como los resultados de los estudios en el ejemplo 3 muestran tanto la inmunización pasiva como la inmunización activa con Cop 1 proveen neuroprotección efectiva a partir de la toxicidad del glutamato, la vacunación puede desarrollarse como una manera para reducir la toxicidad neurona! asociada con glutamato. Estas observaciones tienen varias implicaciones interesantes: (i) Cop 1 , el cual se utiliza como un fármaco inmunosupresor en -paci ntes con enfermedad de esclerosis múltiple autoinmune, es efectivo como una vacunación en contra de neurotoxicidad inducida por glutamato! (ii) la perdida de neuronas del SNC debido a una señal de estrés local puede beneficiarse a partir de la manipulación del sistema inmune; (iii) las mismas neuronas, en este caso las RGC, pueden beneficiarse a partir de la respuesta del sistema inmune sin importar la naturaleza y el sitio de la agresión, aunque la especificidad antigénica de la respuesta puede variar; (iv) la actividad benéfica de Cop 1 , aunque aparentemente no depende del tipo de agresión (mecánica o bioquímica), parece ser críticamente dependiente de los mecanismos de muerte que la agresión activa. En el ejempto 3, la actividad inmune inducida protege a las células en contra de la muerte ocasionada por glutamato pero no en contra de la muerte ocasionada por NMDA; (v) Cop 1 , actuando como un inmunógeno, puede inducir la neuroprotección mediante el mecanismo que no necesariamente requiere el reconocimiento cruzado de las proteínas de mielína. Debe recalcarse que hay una diferencia importante entre la neuroprotección inmune en contra de la degeneración secundaria y la terapia inmune para enfermedades autoinmunes. Mientras que la primera requiere la participación activa de las células T benéficas, la última puede beneficiarse ya sea a partir de la modulación inmune de las células T encefalítogénicas o a partir de su supresión. Cop 1 , actuando como un inmunógeno, puede servir tanto para propósitos de neuroprotección a partir de la agresión neuronal, para terapia para enfermedades autoinmunes. Presumiblemente éste logra esto al evocar una respuesta "segura" de célete T, te cuál por una parte provee te respuesta' benéfica de célula T autoinmune necesaria para la neuroprotecctón (Moaiem et al., 1999a; Moaiem et al., 1999b; Kipnis et al., 2000a; Moaiem et al., 2000c; y Schwartz et al., 1999), y por otra parte la modulación inmune requerida para evitar la enfermedad autoinmune (Neuhaus et al., 2000). Las células T reactivas a MBP mostraron en el laboratorio de los presentes inventores ser neuroprotectoras en los modelos de rata de nervios ópticos parcialmente aplastados (Móalem et al., 1999 y Schwartz et al., 1999) y en la lesión contusiva de la médula espinal (Hauben et al., 2000a). Los hallazgos previos en el laboratorio de los presentes inventores demostraron el reconocimiento cruzado in vivo entre las células T reactivas a Cop 1 y los componentes de la mielina del SNC (Kipnis et al., 2000a). Los presentes inventores sugirieron que dicho reconocimiento, al disparar la reactivación de la célula T y ocasionar así que las células T se comprometan hacia un fenotipo protector, puede representar un mecanismo posible que subyace a la neuroprotección de la célula T después de la lesión axonal. Se mostró adicionalmente por los presentes inventores que las células T reactivas a Cop 1 (ejemplos 1 y 2; Kipnis et al., 2000a), de manera similar a las células T reactivas a MBP (Moaiem et al., 2000), cuando se activan por sus antígenos específicos secretan cantidades significativas de factores neurotróficos derivado del cerebro, una neurotrofina que desempeña papel principal en la supervivencia neuronal (Sendtner et al., 1992 y Yan et al., 1992). En el ejemplo 1 , el laboratorio de los presentes inventores examinó la inmunidad de la célula T a Cop 1 después w trauma físico a te materia blanca, en donde las células T antí-Cop 1 reaccionan de manera cruzada cort los epítopes de mielina expuestos. Los presentes hallazgos en et ejemplo 3 con respecto a que la inmunización con Cop 1 es activa en contra de la toxicidad con glutamato, lo cual afecta directamente a los cuerpos celulares neuronales bajo condiciones en donde los antígenos diferentes a la mielina probablemente están implicados, puede sugerir que las células T anti-Cop 1, debido a su heterogeneidad, responden una variedad de antígenos incluyendo aquellos asociados con la retina. Las células T reactivas a Cop 1 pueden interaccionar directamente con el glutamato mismo. Dicha interacción podría convertir a las células T reactivas a Cop 1 , o células T endógenas, hacia un fenotipo protector. La posibilidad de que las células T reactivas a Cop 1 pueden interaccionar con el glutamato inyectado dentro del cuerpo vitreo o con las células microgliales activadas dentro de la retina se apoya por un gran número de linfocitos invasores observados en el cuerpo vitreo 24 horas después de la inyección con glutamato. En los ratones inyectados con Cop 1, los linfocítos invasores probablemente incluyen algunos que son específicos a Cop 1. Esta observación, junto con el hallazgo de que la transferencia pasiva de las células T reactivas a Cop 1 tienen un efecto similar al de la inmunización activa con Cop 1 , sugiere que el efecto de la vacunación es de hecho mediado por las células T, más que por la inmunidad humoral o por Cop 1 mismo. Debido a que el glutamato, siendo un mediador de la degeneración ' | t secundaria, aparece a cierta distancia en el tiempo a partir de la agresfón primaria (Yoles et al., 1998), una ventana de tratamiento de 24 horas en et caso de la toxicidad directa con glutamato puede implicar que en los casos de trauma al SNC la ventana para tratamiento con Cop 1 es mucho más amplia. Es interesante notar que Cop 1 no tiene efecto protector cuando la agresión tóxica se induce mediante NMDA. Esto está de acuerdo con los estudios a partir de laboratorio de los presentes inventores demuestran que NMDA impone una señal de muerte casi inmediata, sin signos claros de apoptosis y sin una oportunidad aparente para terapia diferente a los antagonistas del receptor de NMDA. Por lo tanto no es sorprendente que la inmunización con Cop 1 no fue efectiva en contra de la toxicidad inducida por NMDA. Permanece aún por establecerse si la actividad de Cop 1 como un neuroprotector más que como un agente supresor es dependiente de su ruta de administración. También permanece por determinarse cómo la acumulación local de las células T específicas a antígenos del SNC, o de células T específicas a antígenos con actividad cruzada tales como Cop 1, media la neuroprotección después de las agresiones al SNC. La neuroprotección mediada por célula T demostrada en los estudios en el ejemplo 3 puede ser aplicable tanto a agresiones crónicas como agudas de nervios del SNC en los cuales las neuronas son vulnerables a la degeneración y se someten a la neuroprotección (Schwartz et al., 2000a; Schwartz et al., 2000b; Doble et al., 1999; y Grunblatt et al., 2000). Una condición crónica, el glaucoma, frecuentemente se asocia con IOP, y es una as-*- causa que lleva a la ceguera. Es una experiencia común, sin^embargo, que te enfermedad pueda continuar progresando incluso cuando te IOP permanece dentro de un intervalo normal, sugiriendo que te compasión mecánica probablemente no es la única razón para el daño del nervio óptico y que el tratamiento, en adición a la disminución de la IOP, debe incluir por lo tanto una terapia de neuroprotección (para revisión véase Osborne et al., 1999; Schwartz et al., 2000c; y Weinreb et al., 1999). Los estudios recientes han mostrado, por ejemplo, que el tratamiento con un antagonista del glutamato (Chaudhary et al., 1998) o un inhibidor de la sintasa del óxido nítrico (Neufeld et al., 1999) atenúa la muerte de las células ganglionares de la retina en un modelo de rata de IOP incrementada. Hay un peligro, sin embargo, de interferencia con la respuesta fisiológica por estos agentes, aunque sea posiblemente benéfica en el sitio de te patología, puede ser dañino para el tejido normal, llevando a efectos laterales no deseables. Un método más favorable a partir del punto de vista clínico, por lo tanto, es endurecer y aumentar la maquinaria de defensa propia del tejido. El presente hallazgo de la neuroprotección lograda incluso cuando la presión permanece alta es potencialmente de gran ventaja a partir del punto de vista clínico. Esto es porque incluso una presión reducida a su valor normal no necesariamente es segura para pacientes con glaucoma, en los cuales tes neuronas remanentes son más vulnerables que las normales (Agis, 2000). Además, te reducción de la IOP a lo que puede considerarse como seguro en dichos pacientes, es decir, a 12 mm Hg, puede no ser factible. Habiendo ahora descrito completamente esta inversión, se apreciará por aquellos expertos en la técnica que la misma puede llevarse a cabo con un amplio intervalo de parámetros equivalentes, concentraciones» y condiciones sin apartarse del espíritu y alcance de la invención y sin llevar a cabo experimentación. Mientras que está invención se ha descrito en conexión con las modalidades específicas a la misma, se entenderá que pueden llevarse a cabo modificaciones. Esta solicitud se pretende que abarque cualesquiera variaciones, usos, o adaptaciones de las invenciones siguiendo, en general, los principios de las invenciones e incluyendo dichos punto de partida a partir de la presente descripción como dentro de la práctica conocida o habitual dentro de la técnica a la cual la ¡nvención pertenece y que puede ser aplicada a las características esenciales establecidas anteriormente como sigue en el alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las referencias citadas en la presente invención, incluyendo artículos de revistas o resúmenes, publicados o que corresponden a solicitudes de patentes de los E.U.A. o extranjeras, patentes emitidas en tos E.U.A. o en el extranjero, y cualesquiera otras referencias, se incorporan completamente como referencia en la presente, incluyendo todos los datos, tablas, figuras, y texto presentado en la citadas referencias. Adicionalmente, los contenidos totales de las referencias citadas dentro de las referencias cifaáafe én la presente invención también están completam nte incorporadas como referencias. La referencia a pasos de métodos conocidos, pasos de métodos convencionales, métodos conocidos o métodos convencionales no es de ninguna manera una admisión de que algún aspecto, descripción o modalidad de la presente invención está descrito, enseñado o sugerido en la técnica precedente. La descripción precedente de las modalidades específicas revelará completamente la naturaleza general de la invención y otros pueden, al aplicar el conocimiento dentro de la capacidad de la técnica (incluyendo tos contenidos de la referencia citadas en la presente), fácilmente modificar y/o adaptar varias aplicaciones tales como modalidades específicas, sin llevar a cabo experimentación, sin apartarse del concepto general de la presente invención. Por lo tanto, dichos adaptaciones y modificaciones se pretende que estén dentro del significado de intervalo de equivalentes de las modalidades descritas, basándose en la enseñanza y guía presentada en la presente invención. Debe entenderse que la fraseología o terminología en la presente invención es para el propósito de descripción y no de limitación, de manera que la terminología o fraseología de la presente especificación debe ser interpretada por los expertos en la técnica a largo de las enseñanzas y guías presentadas en la presente invención, en combinación con el conocimiento de un experto en la técnica.

* Referencias Agís, Am. J. Ophthalmol (2000) Aharoni et al, "T suppressor hybridomas and interleukin-2-dependent lines induced by copolymer 1 or by spinal cord homogenate down-regulate experimental allergic encephalomyelitis", Eur. J. mmunol. 23:17-25 (1993) Aharoni et al, "Copolymer 1 induces T cells of the T helper type 2 that crossreact with myelin basic protein and suppress experimental autoimmune encephalomyelitisll, Proc Nati Acad Sci (USA) 94(20):10821-10826 (1997) Ashwood-Smith, Nature 190:1204-1205 (1961) Bazan et al, "Mediators of injury in neurotrauma: intracellular signal transduction and gene expressionll, J. Neurotrauma 12(5):791-814 (1995) Ben-Nun et al, "The rapid isolation of clonable antigenspecific T lymphocyte lines capable of mediating autoimmune encephalomyelitis", Eur. J. Immunol. 11 (3): 195-199 (1981a) Ben-Nun et al, "Vaccination against autoimmune encephalomyelitis with T-1ymphocyte line cells reactive agaínst myelin basic protein", Nature 292(5818 ):60-61 (1981b) Ben-Nun et al, "Experimental autoimmune encephatomyelítis (EAE) mediated by T cell lines: process of selection of lines and characterization of the cells", J. Immunol. 129(1 ):303-308 (1982) Ben-Nun et al, "The autoimmune reacti ity to myelin olígodendrocyte glycoprotein (MOG) in múltiple sclerosis is potentially pathogenic: effect of copolymer 1 on MOGí-nduced disease", J. Neurol. 243(4Supl):S 14-22 (1996) Bornstein et al, "Clinical triáis of Cop 1 in múltiple sclerosis", Handbook of Múltiple Sclerosis. ed. Cook S.D. Marcel Deklcer, Inc., p. 460 (1990) Brauner-Osborne et al, " A new structural ctess of subtype-selective inhibitor of cloned excitatory amino acid transporter, EAAT211 Eur J Pharmacol.406:41-44 (2000) Burns et al, lllsolation of myelín basic protein-reactive T- cell lines from normal human blood", Cell Immunol. 81 (2) :435*440 (1983) Chaudhary et al, "MK801-a neuroprotectant in rat hypertensive eyes", Brain Res. 792(1): 154-8 (1998) Doble, "The role of excitotoxicity in neurodegeneratíve disease: ¡mplications for therapy", Pharmacol Ther. 81:163-221 Dreyer et al., "Elevated glutamate levéis in the vitreous body of humans and monkeys with glaucoma", Arch Ophthalmol, 114:299-305 (1996) Duvdevani et al, Restor. Neurol. Neurosci. 2:31-38, (1990) Faden et al, "Pharmacological strategies in CNS trauma", Trends Pharmacol. Sci. 13(1):29-35 (1992) Faden, A. I., "Experimental neurobiology of central nervous system trauma", Crit. Rev. Neurobiol. 7 (3-4):175-186 (1993) Fisher et al. , J**9 fetífi?science (2000) Fridkís-Hareli et al, "Direct binding of myelin basic protein and synthetic copolymer 1 to class II major histocompatibility complex molecules on living antigen presenting cells - specificity and promiscuity", Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 (11) :4872-76 (1994) Fridkis-Hareli et al, "Promiscuous binding of synthetic copolymer 1 to purified HLA-DR molecules", J. Immunol. 160 (9) :4386-4397 (1998) Fridkis-Hareli et al, "Binding of random copolymers of three amino acids to ctess II MHC molecules", Int. Immunol. 11 (5) :635-641 (1999a) Fridkis-Hareli et al, "Binding motifs of copolymer 1 to múltiple sclerosis- and rheumatoid arthritis-assocíated HLA-DR molecules", J.

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LISTADO DE SECUENCIAS <110> EISENBACH-SCHWARTZ, Mic al YOLES, Eti KIPNIS, Jonathan <120> Bl uso del copolímero 1 y péptidos y polip tidof relacionados y células T tratadas oon estos para terapia neuroprotectara <130> EIS-SCHWARTZ18 PCT <150> 06/209,799 <151> 2000-06-07 <150> 09/620,216 -<151> 2000-07-20 <160> 33 <170> Patente en versión 3.0 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial: Construcción sintética <400> 1 Ala Ala Ala Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala 1 5 10 15 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial: Construcción sintética <400> 2 Ala Glu Lys Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala 1 5 10 "" 15 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial: Construcción sintética <400> 3 Ala Lys Glu Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala 1 5 10 15 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial: Construcción sintética <400> 4 Ala Lys Lys Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala 1 5 10 15 <210> 5 <211> 15 • * ? <212> PRT <213> Artificial : Construcción sintética <400> 5 Ma Glu Ma Tyr Ma Ma Ma Ma a Ma Lys Ma Ma Ma Ma 1 5 10 15 <210> 6 <211> 15 <212> PRT c <213> Artificial : Construcción sintética <400> 6 Lys Glu Ma Tyr Ma Ma Ma Ma Ma Ma Lys Ma Ma Ma Ma 1 5 10 15 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial : Construcción sintética <400> 7 -JO Ma Glu Glu Tyr Ma Ma Ma Ma Ma Ma Lys Ma Ma Ma Ma 1 5 10 15 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial : Construcción sintética <400> 8 Ma Ma Glu Tyr Ma Ma Ma Ma Ma Ma Lys Ma Ma Ma Ma 1 5 10 15 <210> 9 15 <21-1> 15 <212> PRT <213> Artificial: Construcción -sintética <400> 9 Glu Lys Ma Tyr Ma Ma Ma Ma Ma Ma Lys Ma Ma Ma Ma 1 5 10 15 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial: Construcción sintética 0 <400> 10 Ma Ma Lys Tyr Glu Ma Ma Ma Ma Ma Lys Ma Ma Ma Ma 1 5 10 15 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial: Construcción sintética <400> 11 Ma Ma Lys Tys Ma Glu Ma Ma Ma Ma Lys Ma Ma Ma Ma 1 5 10 15 <210> 12 <211> 15 <212> PRT , <213> Artificial : Construcción sint tica <400> 12 Glu Ala Ma Tyr Ma Ma Ma Ma Ma Ma Lys Ma Ma Ma Ma 1 5 10 15 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial: Cbnstrucción sintética <400> 13 Glu Lys Lys Tyr Ma Ma Ma Ma Ma Ma Lys Ma Ma Ma Ma 1 5 10 15 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial: Construcción sintética <400> 14 Glu Ma Lys Tyr Ma Ma Ma Ma Ma Ma Lys Ma Ma Ma Ma 1 5 10 15 <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial: Construcción sintética <400> 15 Ma Glu Lys Tyr Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma 1 5 10 15 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial: Construcción sintética <400> 16 Ma Lys Glu Tyr Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma 1 5 10 15 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial: Construcción sintética <400> 17 Ma Lys Lys Tyr Glu Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma á v?*!*'"1 " --?SSSía 10 15 <210> 18 <211> 1S * 2Í2.> ??3RT <213> Artificial : Construcción sintética <400> 18 Ma Lys Lys Tyr Ma Glu Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma 1 5 10 15 <210> 19 <211> 15 ^ 3-2.^ PRT <213> Artificial : Construcción sintética <400> 19 Ma Glu Ma Tyr Lys Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma 1 5 10 15 <210> 20 <211> 15 <212> PRT 10 <213> Artificial: Construcción sintética <400> 20 Lys Glu Ma Tyr Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma 1 5 10 15 <210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial : Construcción sintética <400> 21 -l e Ma Glu Glu Tyr Lys Ala Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma 1 5 10 15 <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial: Construcción sintética <400> 22 Ma Ma Glu Tyr Lys Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma 1 5 10 15 <210> 23 20 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial: Construcción sintética <400> 23 Glu Lys Ma Tyr Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma 1 5 10 15 <210> 24 <211> 15 <212> ?$5$ <213> Artificial: Construcción sintética <400> 24 Ma Ma Lys Tyr Glu Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma 1 5 10 15 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial: Construcción sintética <400> 25 Ala Ma Lys Tyr Ma Glu Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma 1 5 10 15 <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial: Construcción sintética <400> 26 Glu Lys Lys Tyr Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma 1 5 10 15 <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial: Construcción sintética <400> 27 Glu Ma Lys Tyr Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma 1 5 10 15 <210> 28 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial: Construcción sintética <400> 28 Ma Glu Tyr Ma Lys Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma 1 5 10 15 <210> 29 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial: Construcción sintética <400> 29 Ma Glu Lys Ma Tyr Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma 1 5 10 15 <210> 30 <211> 15 <212> PRT _ , <213> Artificial: Construcción sintética 1 8 s - <400> 30 Glu Lys Tyr Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ala Ma Ma 1 5 10 15 <210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial: Construcción sintética <400> 31 Ma Tyr Lys Ma Glu Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma 1 5 10 15 <210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial: Construcción sintética <400> 32 Ma Lys Tyr Ma Glu Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma Ma 1 5 10 15 <210> 33 <211> 22 <212> PRT <213> Humano <400> 33 Gly Gln Phe Arg Val He Gly Pro Gly His Pro He Arg Ma Leu Val 1 5 10 15 Gly Asp Glu Ma Glu Leu 20

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- El uso de (a) células T activadas las cuales han sido activadas mediante Cop 1 o un péptído o polipéptído relacionado con Cop 1 ; o (b) Cop 1 o un péptido o pollpéptido relacionado con Cop 1 para preparar una composición farmacéutica para proteger las células del sistema nervioso central (SNC) de la toxicidad del glutamato en un individuo. 2.- El uso como se reclama en la reivindicación 1, en donde l individuo que necesita del mismo está siendo tratado post- operativamente después de la remoción tumoral o cirugía en el SNC para proteger a las células del SNC de la toxicidad del glutamato. 3.- El uso de (a) células T activadas las cuales han sido activadas mediante Cop 1 o un péptido o pollpéptido relacionado con Cop 1; o (b) Cop 1 o un péptído o polipéptido relacionado con Csp 1 para preparar un medicamento para tratar lesión o enfermedad ocasionada o exacerbada por la toxicidad del glutamato en un individuo. 4.- El uso como se reclama en la reivindicación 3, en donde dicha lesión o enfermedad comprende lesión de la médula espinal, trauma directo, trauma penetrante, choque hemorrágico, o choque isquémico. 5.- El uso como se reclama en la reivindicación 3, en donde dicha lesión o enfermedad es neuropatía diabética, demencia senil, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, parálisis del nervio facial (de Bell), gteucoma, corea de Huntmgton, esclerosis lateral amiotrófica, estado epiléptico, neuropatía óptica no arterítica, o deficiencia de vitamina 6.- El uso como se reclama en la reivindicación 3, en donde dicha lesión o enfermedades epilepsia, amnesia, ansiedad, hiperalgesfa, psicosis, accesos, estrés oxidativo, o tolerancia y dependencia a opioides. 7.- El uso como se reclama en la reivindicación 3, en donde dicha lesión o enfermedad está asociada con presión intraocular anormalmente elevada 8.- El uso como se reclama en la reivindicación 3, en donde dicha lesión o enfermedad es diferente a una enfermedad autoinmune. 9.- El uso como se reclama en la reivindicación 1 ó 3, en donde células T activadas tes cuales han sido activadas mediante Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1 son administrables a un individuo. 10.- El uso como se reclama en la reivindicación 9, en donde dichas células T activadas específicas del SN son células T autólogas, o células T alogénicas a partir de donantes relacionados, o donantes con coincidencia de HLA o coincidencia parcial, semialogénicos o completamente alogénicos. 11.- El uso como se reclama en la reivindicación 10, en donde dichas células T son células T autólogas las cuales han sido almacenadas o se derivan a partir de células autólogas del SNC. 12.- El uso como se reclama en la reivindtcacifn 10, en donde dichas células T son células T semialogénicas. 13.- El uso como se reclama en la reivindicación 1 ó 3, en donde Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1 son adminístrateles a un individuo. 14.- El uso como se reclama en ia reivindicación 13, en donde dicho Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1 es Cop 1. 15.- El uso como se reclama en la reivindicación 13, en donde dicho Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1 es un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1. 16.- El uso como se reclama en la reivindicación 13, en donde dicho Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1 es administrable de manera que promueve la inmunización activa del individuo de manera que se genera una respuesta crítica de célula T. 17.- El uso como se reclama en la reivindicación 1 ó 3, en donde dicho péptido o polipéptido relacionado con Cop 1 es un copolímero al azar que reacciona funcionalmente de manera cruzada con la proteína básica de mielina (MBP) y es capaz de competir con MBP sobre la molécula MHC clase II en la presentación del antígeno. 18.- El uso como se reclama en la reivindicación 17, en donde dicho copolímero al azar comprende un aminoácido seleccionado a partir de cada uno de al menos tres de los siguientes grupos: (a) lisina y arginina; (b) ácido glutámico y ácido üfpártico; (c) alanina y cSna; y (d) tirosina y triptofano. 19.- El uso como se reclama en la reivindcacíin 18, en donde dicho copolímero al azar contiene cuatro diferentes aminoácidos, cada unof a partir de un grupo diferente de los grupos (a) a (d). 20.- El uso como se reclama en la reivindicación 19, en donde dichos cuatro diferentes aminoácidos son alanina, ácido glutámico, lisina y tirosina. 21- El uso como se reclama en la reivindicación 20, en donde dicho copolímero al azar contiene tres diferentes aminoácidos, cada uno a partir de un grupo diferente de los tres grupos (a) a (d). 22.- El uso como se reclama en la reivindicación 21 , en donde dicho copolímero al azar contiene tirosina, alanina, y lisina. 23.- El uso como se reclama en la reivindicación 21, en donde dicho copolímero al azar contiene tirosina, ácido glutámico y lisina. 24.- El uso como se reclama en la reivindicación 21, en donde dicho copolímero al azar contiene lisina, ácido glutámico, y alanina. 25 - El uso como se reclama en la reivindicación 21, en donde dicho copolímero al azar contiene tirosina, ácido glutámico, y atanina. 26.- Una composición farmacéutica para protección de las células del sistema nervioso central (SNC) de la toxicidad del glutamato o para tratar lesión o enfermedad ocasionada o exacerbada por toxicidad del gitrtamato, que comprende una cantidad efectiva de Cop 1 o un péptido o polipéptido retecionado W o 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 27 - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada además porque comprende una cantidad-efectiva de Cop 1. gf. 28.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada además porque comprende una cantidad efectiva de un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1. 29.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque dicho péptido o polipéptído relacionado con Cop 1 es un copolímero al azar que funcionalmente reacciona de manera cruzada con la proteína básica de mielina (MBP) y es capaz de competir con MBP sobre la molécula MHC clase II en la presentación del antígeno. 30.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada además porque dicho copolímero al ai comprende un aminoácido seleccionado a partir de cada uno de al menos tres de los siguientes grupos: (a) lisina y arginina; (b) ácido glutámico y ácido aspártico; (c) alanína y glicina; y (d) tirosina y triptofano. 31.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada además porque dicho copolímero al azar contiene cuatro diferentes aminoácidos, cada uno a partir de un grupo diferente de los grupos (a) a (d). -*'& 32.- La co^fliión farmacéutica de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada además porque dichos cuatro diferentes aminoácidos son alanina, ácido glutámico, lisina y tirosina. 33.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada además porque dicho copolímero al azar contiene tres diferentes aminoácidos, cada uno a partir de un grupo diferente de los tres grupos (a) a (d). 34.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 31 o reivindicación 33, caracterizada además porque dicho copolímero al azar contiene tirosina, alanina, y lisina. 35.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 31 o reivindicación 33, caracterizada además porque dicho copolímero al azar contiene tirosina, ácido glutámico y lisina. 36.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 31 o reivindicación 33, caracterizada además porque dicho copolímero al azar contiene lisina, ácido glutámico, y alanina. 37.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 31 o reivindicación 33, caracterizada además porque dicho copolímero al azar contiene tirosina, ácido glutámico, y alanina. 38.- El uso de Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1 en la preparación de un medicamento para proteger a las células del sistema nervioso central de la toxicidad del glutamato. 39.- El uso d s ík>? 1 o un péptido o polipéptido* relacionado con Cop 1 para preparar una composición farmacéutica para proteger a las células del sistema nervioso central de la toxicidad del glutamato. 40.- El uso de Cop 1 o un péptido o polipépíido relacionado con Cop 1 para preparar una composición farmacéutica para tratar lesión o enfermedad ocasionada o exacerbada por la toxicidad del glutamato. Se proveen métodos para tratar lesión a o enfermedad del sistema nervioso central o periférico; en una modalidad, el tratamiento se efectúa mediante la administración de células T activadas qqe reconocen un antígeno de Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1 para promover la regeneración nerviosa o para prevenir o inhibir la degeneración neuronal dentro del sistema nervioso; en otra modalidad, el tratamiento implica la administración de Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1 para promover la regeneración nerviosa o para prevenir o inhibir la degeneración neuronal en el sistema nervioso, ya sea el sistema nervioso central o el sistema nervioso periférico; las células T activadas, las cuales han sido activadas mediante la presencia de Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1 , pueden administrarse solas o en combinación con Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1. 12B P02/1100F