ES2256200T3

ES2256200T3 - El uso de copolimero 1 y peptidos y polipeptidos relacionados, y de celulas t tratadas con los mismos, para neuroproteccion frente a la toxicidad del glutamato.

Info

Publication number: ES2256200T3
Application number: ES01906632T
Authority: ES
Inventors: Michal Eisenbach-Schwartz; Eti Yoles; Jonathan Kipnis
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 2000-06-07
Filing date: 2001-01-22
Publication date: 2006-07-16
Anticipated expiration: 2021-01-22
Also published as: CY1105263T1; CN100438906C; JP4328090B2; HK1058892A1; WO2001093893A3; WO2001093893A2; NZ520282A; KR20030007397A; CA2398277A1; JP2004507460A; DK1294390T3; DE60116467T2; MXPA02007109A; AU783031B2; EP1294390B1; AU3451801A; IL150801A; IL150801A0; CN1462190A; EP1294390A2

Abstract

El uso de Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1 para la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad causada o exacerbada por la toxicidad del glutamato, en el que dicha enfermedad no es la esclerosis múltiple.

Description

El uso de copolímero 1 y péptidos y polipéptidos relacionados, y de células T tratadas con los mismos, para neuroprotección frente a la toxicidad del glutamato.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones y usos para promover la regeneración de nervios o para la prevención o la inhibición de la degeneración neuronal, para mejorar los efectos de lesiones o enfermedades del sistema nervioso (SN). En particular, la invención se refiere a composiciones que comprenden Copolímero 1 (Cop 1) o un péptido o polipéptido relacionado con el Cop 1, y/o a células T activadas tratadas con Cop 1 o con un péptido o polipéptido relacionado con el Cop 1, para promover la regeneración de nervios o para prevenir o inhibir la degeneración neuronal causada por lesiones o enfermedades de los nervios dentro del sistema nervioso central o el sistema nervioso periférico de una persona. Las composiciones de la presente invención pueden ser administradas solas o pueden ser opcionalmente administradas en cualquier combinación que se desee.

Fundamento de la invención

El sistema nervioso comprende el sistema nervioso central y el periférico. El sistema nervioso central (SNC) está compuesto por el cerebro y la médula espinal; el sistema nervioso periférico (SNP) consiste en todos los demás elementos neurales, como son los nervios y los ganglios fuera del cerebro y la médula espinal.

Los daños del sistema nervioso pueden ser el resultado de una lesión traumática, tal como un traumatismo penetrante o un traumatismo contuso o cerrado, o una enfermedad o trastorno, incluyendo, pero sin limitarse a, la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica (ALS: Amyotrophic Lateral Sclerosis), neuropatía diabética, demencia senil e isquemia.

El mantenimiento de la integridad del sistema nervioso central en un complejo "acto de equilibrio" en el que se plantean compromisos con el sistema inmunitario. En la mayor parte de los tejidos, el sistema inmunitario desempeña un papel esencial en la protección, la reparación y la cicatrización. En el sistema nervioso central, a causa de su privilegio inmunitario único, las reacciones inmunológicas son relativamente limitadas (Streilein, 1993, 1995). Un conjunto de pruebas cada vez mayor indica que el fracaso del sistema nervioso central de un mamífero para lograr la recuperación funcional después de una lesión es un reflejo de un diálogo ineficaz entre el tejido dañado y el sistema inmunitario. Por ejemplo, la comunicación restringida entre el sistema nervioso central y los macrófagos transportados en la sangre afecta a la capacidad de los axones axotomizados para volver a crecer; los trasplantes de macrófagos activados pueden promover el nuevo crecimiento del sistema nervioso central (Lazarov Spiegler et al., 1996; Rapalino et al., 1998).

Se ha demostrado que las células T activadas entran en el parénquima del sistema nervioso central, al margen de su especificidad antigénica, pero solamente las células T capaces de reaccionar con un antígeno del sistema nervioso central parecen persistir allí (Hickey et al., 1991; Werkele, 1993; Kramer et al., 1995). Las células T reactivas contra antígenos de la sustancia blanca del sistema nervioso central, tal como la proteína básica de mielina (MBP: Myelin Basic Protein), pueden inducir la enfermedad paralítica encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE: Experimental Autoimmune Encephalomyelitis) algunos días después de su inoculación en ratas receptoras no sometidas a experimentación con anterioridad (Ben-Nun, 1981a). Las células T anti-MBP pueden también estar implicadas en la enfermedad humana esclerosis múltiple (Ota, K. et al., 1990; Martin, 1997). Sin embargo, a pesar de su potencial patógeno, hay presentes clones de células T anti-MBP en los sistemas inmunitarios de sujetos sanos (Burns, 1983; Pette, M. et al., 1990; Martin et al., 1990; Schluesener et al., 1985). Las células T activadas, que normalmente patrullan el sistema nervioso central intacto, se acumulan transitoriamente en los sitios de las lesiones de la sustancia blanca del sistema nervioso central (Hirschberg et al., 1998).

Una catastrófica consecuencia de una lesión del sistema nervioso central es que el daño primario está compuesto frecuentemente por la pérdida secundaria gradual de neuronas adyacentes que aparentemente estaban sin dañar o dañadas tan solo marginalmente por la lesión inicial (Faden et al., 1992; Faden 1993; McIntosh, 1993). La lesión primaria provoca cambios en las concentraciones iónicas extracelulares, elevación de la cantidad de radicales libres, liberación de neurotransmisores, depleción de factores de crecimiento e inflamación local. Estos cambios disparan una cascada de acontecimientos destructivos en las neuronas adyacentes que inicialmente escaparon a la lesión primaria (Lynch et al., 1994; Bazan et al., 1995; Wu et al., 1994). Este daño secundario está mediado por la activación de canales dependientes del voltaje o bloqueados por antagonista, fugas de iones, activación de enzimas dependientes del calcio tales como proteasas, lipasas y nucleasas, disfunción mitrocondrial y depleción de energía, culminando en la muerte de las células neuronales (Yoshina et al., 1992; Hovda et al., 1991; Zivin et al., 1991; Yoles et al., 1992). La amplia pérdida de neuronas más allá de la pérdida causada directamente por la lesión primaria ha sido llamada "degeneración secundaria".

Uno de los mediadores más comunes que producen autopropagación de las enfermedades, incluso cuando el factor de riesgo principal ha sido eliminado o atenuado, es el glutamato, un aminoácido excitador capaz de mostrar una doble actividad interpretando un papel fundamental en el sistema nervioso central (SNC) normal funcionando como un neurotransmisor esencial, pero haciéndose tóxico cuando se exceden sus niveles fisiológicos. Se ha publicado el aumento del glutamato en muchos trastornos del SNC. En su papel como compuesto excitotóxico, el glutamato es uno de los más comunes mediadores de la toxicidad en los trastornos degenerativos agudos y crónicos (incluyendo la degeneración del nervio óptico en el glaucoma) (Pitt et al., 2000 y Schoepp et al., 1996). El glutamato endógeno ha sido atribuido al daño cerebral que ocurre de forma aguda después del estado epiléptico, isquemia cerebral o lesión cerebral traumática. Puede contribuir también a la neurodegeneración crónica en trastornos tales como la esclerosis lateral amiotrófica y la corea de Huntington.

Se ha dedicado una intensa investigación a atenuar el efecto citotóxico del glutamato mediante el uso de fármacos de acción local, tales como los antagonistas del receptor de NMDA (Brauner-Osborne et al., 2000). Sin embargo, la terapia convencional de este tipo suele ser insatisfactoria ya que al neutralizar el efecto tóxico es probable que interfiera con el funcionamiento fisiológico. En las personas, tales compuestos tienen efectos secundarios psicotrópicos y de otro tipo, que pueden hacerlos inadecuados como agentes terapéuticos. También tienen el inconveniente de interferir con el funcionamiento fisiológico esencial del glutamato como neurotransmisor ubícuo del SNC. Como la actividad del glutamato es esencial para el funcionamiento fisiológico esencial, pero es potencialmente devastador después de una lesión aguda o en trastornos crónicos del SNC, cualquier intento de neutralizar su efecto nocivo ha de hacerse sin eliminar su actividad esencial en otros sitios del organismo.

Otra trágica consecuencia de una lesión del sistema nervioso central es que las neuronas del sistema nervioso central es que las neuronas del sistema nervioso central de los mamíferos no experimentan regeneración espontánea después de una lesión. Así, una lesión del sistema nervioso central produce el deterioro permanente de las funciones motrices y sensoriales.

Las lesiones de la médula espinal, al margen de la gravedad de la lesión, producen inicialmente una parálisis funcional completa conocida como choque espinal. Puede observarse cierta recuperación espontánea del choque espinal, a partir de unos días después de la lesión y que va disminuyendo a los tres o cuatro días. Cuanto menos grave es la lesión tanto mejor es el desenlace funcional. El alcance de la recuperación es función de la cantidad de tejido sin dañar menos la pérdida debida a la degeneración secundaria. La recuperación de la lesión mejoraría mediante un tratamiento neuroprotector que pudiese reducir la degeneración secundaria. Por ejemplo, el alivio del efecto del glutamato es un objetivo frecuente del desarrollo de fármacos neuroprotectores. Entre los fármacos que se están desarrollando con este fin están los antagonistas del receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA) o del receptor de ácido alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico (AMPA). Estos fármacos tendrán inevitablemente graves efectos secundarios ya que interfieren con el funcionamiento de los receptores de NMDA y AMPA, que son cruciales para la actividad del SNC. Uno de los antagonistas del receptor de NMDA más intensamente estudiado es el MK801, que proporciona una neuroprotección eficaz pero con graves efectos secundarios. En modelos animales de isquemia cerebral y lesión cerebral traumática, los antagonistas del receptor de NMDA y AMPA protegen contra la lesión cerebral aguda y los déficits de comportamiento retardados. Tales compuestos están sometidos a pruebas en seres humanos, pero aún ha de establecerse su eficacia terapéutica. Otras situaciones clínicas que pueden responder a fármacos que actúan sobre la transmisión glutamatérgica incluyen la epilepsia, amnesia, ansiedad, hiperalgesia y psicosis (Meldrum, 2000). En el laboratorio de los presentes inventores se ha descubierto recientemente que las células T activadas que reconocen un antígeno del sistema nervioso (SN) del paciente promueven la regeneración nerviosa o confieren neuroprotección. Se hace referencia a la publicación PCT WO 99/60021. Más específicamente, se demostró que las células T reactivas a MBP eran neuroprotectoras en modelos en ratas de nervio óptico parcialmente aplastado (Moalem et al., 1999), y en la lesión de la médula espinal (Hauben et al., 2000). Hasta hace poco se pensaba que el sistema inmunitario excluía a las células inmunitarias de participar en la reparación del sistema nervioso. Fue sorprendente descubrir que podían usarse células T activadas específicas del SN para promover la regeneración nerviosa o para proteger el tejido del sistema nervioso de la degeneración secundaria que puede seguir a los daños causados por una lesión o enfermedad del SNC o del SNP.

Las células T activadas específicas del SN, como se describen en dicha publicación WO 99/60021, son células T activadas que tienen especificidad por un antígeno del SN de un paciente. El antígeno usado para conferir la especificidad a las células T puede ser un autoantígeno-SN del paciente, un péptido derivado del mismo o un antígeno-SN de otro individuo o incluso de otra especie, o un péptido derivado del mismo, siempre y cuando la célula T activada reconozca un antígeno en el SN del paciente.

Dichas células T activadas específicas de SN pueden usarse para promover la regeneración nerviosa o para prevenir o inhibir los efectos de la enfermedad. Si la enfermedad que se está tratando es una enfermedad autoinmunitaria, en la que el antígeno autoinmunitario es un antígeno del SN, las células T que se usan para el tratamiento del daño neural o degeneración causada por dicha enfermedad no son activados contra el mismo antígeno autoinmunitario implicado en la enfermedad.

La publicación PCT anteriormente citada WO 99/60021 describe que la terapia para la mejora de los efectos de una lesión o enfermedad, que comprende la administración de células T activadas específicas para el SN, puede estar opcionalmente en combinación con un antígeno específico del SN o un péptido derivado del mismo. Un antígeno específico del SN, como se define en dicho documento WO 99/60021, se refiere a un antígeno que activa específicamente células T de forma que después de la activación las células T activadas se acumulan en el sitio de una lesión o enfermedad en el SN del paciente. Además, la administración oral de antígeno específico del SN o un péptido derivado del mismo puede combinarse con la inmunización activa para construir una respuesta crítica de las células T inmediatamente después de la lesión.

En esta invención anterior, el antígeno específico del SN usado para activar las células T in vitro o in vivo, o para inmunizar al paciente, puede ser un antígeno obtenido de tejido del SN, preferentemente de tejido de un sitio de la lesión o enfermedad del SNC. Se ha descrito que los antígenos o epítopos específicos del SN naturales o sintéticos incluyen MBP, MOG, PLP, MAG, S-100, \beta-amiloide, Thy-1, P0, P2 y un receptor neurotransmisor. Ejemplos ilustrativos específicos de tales antígenos específicos del SN útiles, descritos en el documento WO 99/60021, son MBP humana, proteína proteolipídica (PLP) humana y glicoproteína del oligodendrocito humana. También se describieron péptidos derivados de auto-antígenos específicos del SN o derivados de antígenos específicos del SN que activan células T pero no inducen una enfermedad autoinmunitaria, tales como un péptido que comprende los aminoácidos 51-70 de la proteína básica de mielina (MBP).

El mecanismo de acción de tales células T específicas del SN está aún por descubrir, pero la acumulación masiva de células T administradas exógenamente en el sitio de la lesión del SNC sugiere que la presencia de células T en el sitio de la lesión desempeña un importante papel en la neuroprotección. Sin embargo, parece que la acumulación, aun siendo una condición necesaria, no es suficiente para el fin, ya que las células T específicas para la ovoalbúmina no auto-antigénica se acumula también en el sitio pero no tiene efecto neuroprotector (Hirschberg et al., 1998).

Un copolímero al azar básico sintético, de alto peso molecular, consistente en restos L-Ala, L-Glu, L-Lys y L-Tyr en la relación molar aproximada de 6 partes de Ala por 2 partes de Glu por 4,5 partes de Lys y por 1 parte de Tyr, y que tiene un peso molecular de 15.000 a 25.000, fue descrito por primera vez en la patente de EE.UU. nº 3.849.550 como agente para el tratamiento o la prevención de la encefalomielitis alérgica experimental (EAE), una enfermedad que se parece a la esclerosis múltiple (MS) que puede ser inducida en animales susceptibles. Se demostró que tandas de este copolímero de peso molecular medio 23.000, designados Copolímero 1 o Cop 1, son altamente efectivas para proteger y suprimir la EAE en algunas especies animales (Teitelbaum et al., 1971, 1974a, 1974b).

Más tarde, se encontró que el Cop 1 reduce significativamente el número de recaídas en pacientes con la forma recurrente-remitente de MS (Bornstein et al., 1990; Sela et al., 1990; Jonson et al., 1994). El copolímero 1, en forma de las sales acetato de polipéptidos sintéticos que contienen L-Glu, L-Ala, L-Tyr y L-Lys con una fracción molar media de 0,141, 0,427, 0,095 y 0,338, es el ingrediente activo del COPAXONE®, un medicamento para el tratamiento de la esclerosis múltiple.

Es entonces evidente que el efecto del Copolímero 1 en el tratamiento de la MS está en el logro de la supresión o la desactivación de la reactividad autoinmunitaria de las células T frente a antígenos de mielina en pacientes con esclerosis múltiple. Con este propósito, el Copolímero 1 se administra sin coadyuvantes mediante una inyección subcutánea diaria.

El Cop 1 fue diseñado originalmente para imitar la MBP y para inducir la EAE, pero se encontró que era no encefalitogénica e incluso que suprimía la EAE inducida por MBP (Teitelbaum et al., 1971), (PLP) (Teitelbaum et al., 1996) o (MOG) (Ben-Nun et al., 1996). Los mecanismos precisos por los que el Cop 1 previene el desarrollo de EAE y mejora la esclerosis múltiple (MS) no son aún conocidos. No obstante, han aparecido algunas importantes propiedades inmunológicas de este copolímero. Hay estudios que han demostrado la reactividad cruzada parcial del Cop 1 con BMP tanto a nivel de la célula T (Webb et al., 1973) como del anticuerpo (Teitelbaum et al., 1988). El Cop 1 puede servir como antagonista del receptor del antígeno de la célula T para el epítopo inmunodominante de MBP (Aharoni, 1998). También puede unirse a varias moléculas de MHC clase II e impedir que se unan a células T con propiedades específicas de reconocimiento del antígeno (Fridkis-Hareli et al., 1999a). En roedores, el Cop 1 induce células reguladoras que probablemente actúan como supresores circunstantes (Aharoni, 1998) de células T encefalitogénicas. Se encontró que la transferencia adoptiva de tales células T previene el desarrollo de EAE inducida por MBP (Aharoni et al., 1993), PLP (Aharoni, 1998) o material homogeneizado de médula espinal completa (Aharoni et al., 1997).

Además, también se ha publicado una evidencia directa para la interacción competitiva tanto de Cop 1 y copolímeros relacionados como de péptido Colágeno II (CII) con moléculas HLA-DR asociadas a la artritis reumatoide (RA) y para la inhibición de respuestas de las células T específicas de CII, que sugieren que estos compuestos pueden ser efectivos contra la artritis reumatoide (Fridkis-Hareli, 1998, 1999b).

La administración oral de autoantígeno para obtener "tolerancia oral" ha sido descrita para el tratamiento de varias enfermedades autoinmunitarias. Por ejemplo, el documento EP 359 783 describe la administración oral de MBP para el tratamiento de la esclerosis múltiple. La publicaciones internacionales PCT WO 91/12816, WO 91/08760 y WO 92/06704 describen todas ellas el tratamiento de otras enfermedades autoinmunitarias usando el método de la tolerancia oral con una diversidad de autoantígenos. El tratamiento de la esclerosis múltiple por ingestión o inhalación de Copolímero 1, para conseguir la supresión de la respuesta autoinmunitaria de las células T contra antígenos de mielina, ha sido descrito en la publicación PCT WO 98/30227.

También se han estudiado compuestos relacionados con el Copolímero 1 y se ha encontrado que tienen propiedades similares a las del Copolímero 1. Por ejemplo, copolímeros compuestos por tres de los cuatro aminoácidos encontrados en el Copolímero 1 se unen a moléculas del MHC de Clase II purificadas (Fridkis-Hareli et al., 1999a, WO 005250). Además, se ha aclarado recientemente la unión de motivos del Copolímero 1 a moléculas HLA-DR asociadas a esclerosis múltiple y a artritis reumatoide (Fridkis-Hareli et al., 1999b). A partir de estos motivos de unión, pueden proponerse y ensayarse fácilmente polipéptidos para la unión al surco de unión de péptido de las moléculas de HLA-DR. Sería de esperar que tales péptidos actúen de una manera similar al propio Cop 1. Ejemplos de tales péptidos sintéticos se describen en el documento WO 005249. La cita o identificación de cualquier referencia en esta sección o en cualquier otra parte de esta solicitud no debe considerarse como admisión de que tal referencia es disponible como técnica anterior a la invención.

Sumario de la invención

La presente invención se dirige a usos y composiciones para promover la regeneración de nervios o para la prevención o inhibición de la degeneración neuronal para mejorar y tratar los efectos de una lesión o una enfermedad del sistema de nervioso (SN). La presente invención se basa en parte en el inesperado descubrimiento de los solicitantes de que células T activadas contra el Cop 1 favorecen la regeneración de los nervios o confieren neuroprotección. También se basa en parte en el inesperado descubrimiento de los presentes inventores de que células T activadas contra Cop 1 protegen a las células nerviosas frente a la toxicidad del glutamato. Como se usa en el presente texto, "neuroprotección" se refiere a la prevención o la inhibición de los efectos degenerativos de una lesión o una enfermedad en el SN, incluyendo la protección frente a los efectos neurodegenerativos secundarios, que persisten incluso cuando el factor de riesgo primario ha sido eliminado o atenuado. Esto incluye la protección tanto de la sustancia blanca como de la sustancia gris. Hasta hace poco, se creía que el sistema inmunitario excluía a los inmunocitos de la participación en la reparación del sistema nervioso. Fue sorprendente descubrir que las células T activadas con Cop 1 pueden usarse para promover la regeneración nerviosa o para proteger el tejido del sistema nervioso de la degeneración secundaria que puede seguir a los daños causados por una lesión o una enfermedad del SNC o del SNP. "Célula T activada", como se usa en el presente texto, incluye (i) células T que han sido activadas por exposición al Cop 1 o a un péptido o polipéptido relacionado con el Cop 1, y (ii) la progenie de tales células T activadas. En una realización, la presente invención describe composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de células T activadas específicas de Cop 1, y usos de tales composiciones para la preparación de un medicamento para promover la regeneración nerviosa o para prevenir o inhibir la degeneración neuronal en el SNC o el SNP, en una cantidad que es efectiva para mejorar los efectos de una lesión o de una enfermedad del SN. "Células T activadas específicas de Cop 1", como se usa en el presente texto, se refiere a células T activadas que tienen especificidad para el Cop 1 o para un péptido o polipéptido relacionado con el Cop 1.

Las células T activadas específicas para Cop 1 se usan para preparar un medicamento para promover la regeneración nerviosa o para prevenir o inhibir los efectos degenerativos secundarios que pueden seguir a una lesión primaria del NS o los efectos de procesos neurodegenerativos causados por una enfermedad o estado como se describe en la Sección (3), más adelante, pero excluyendo la esclerosis múltiple. Los ejemplos no limitantes incluyen el glaucoma, ictus, isquemia, heridas por arma de fuego, y daños cerebrales provocados por deportes peligrosos. Las células T activadas específicas de Cop 1 sirven no sólo para promover la neuroprotección contra factores de riesgo primarios y secundarios asociados con la mielina (sustancia blanca), sino también contra factores de riesgo primarios y secundarios asociados con los propios cuerpos celulares neuronales (sustancia gris), en vista de la protección, según se ha descubierto, contra la toxicidad del glutamato. Así, es de esperar que las células T activadas específicas de Cop 1 sean útiles para la finalidad de la presente invención, y no habrían sido sugeridas por las técnicas de inmunoterapia conocidas. Además, como el Cop 1 protege de la toxicidad del glutamato, su acción no es solamente a través de la reactividad cruzada con la mielina. Ha de tener también una actividad reguladora, por ejemplo creando células reguladoras o sustancias reguladoras. En vista de esta actividad reguladora, es de esperar que la vacunación con Cop 1 y las células T activadas específicas de Cop 1 protejan también la sustancia blanca y la sustancia gris del daño causado por la tensión oxidante y otras fuentes de daños para las células neurales. Además, debido a esta actividad reguladora, la presente invención puede también ser usada para proteger a las células neurales no solo contra la esclerosis múltiple, como ha sido sugerido en la técnica anterior, sino también contra enfermedades autoinmunitarias distintas de la esclerosis múltiple. La presente invención describe también composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1, y usos de tales composiciones para la preparación de un medicamento para promover la regeneración nerviosa o para prevenir o inhibir la degeneración neuronal en el SNC o el SNP, en el que la cantidad es efectiva para activar células T in vivo o in vitro, en donde las células T activadas inhiben o mejoran los efectos de una lesión o enfermedad del SN. En la práctica de la invención, el uso de células T activadas específicas de Cop 1 para la preparación de un medicamento para una terapia para la mejora y el tratamiento de efectos de una lesión o enfermedad puede estar opcionalmente en combinación con Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1. Adicionalmente, el uso de Cop 1 o un antígeno de péptido o polipéptido relacionado con Cop 1 para la preparación de un medicamento adecuado para administración oral, es efectivo para la neuroprotección después de sensibilizar con Cop 1 administrado en coadyuvante. Así, puede usarse Cop 1 oral para reforzar la actividad de las células T, después de la activación primaria de tal Cop 1, preferentemente en coadyuvante, para construir una respuesta de las células T crítica inmediatamente después de la lesión. Además, la solicitud describe que pueden establecerse bancos de células para almacenar células T sensibilizadas por Cop 1 para un posterior tratamiento neuroprotector de individuos, según se necesite. En este caso, pueden obtenerse células T autólogas de un individuo. Alternativamente, pueden almacenarse células T alogénicas o semialogénicas de manera que esté presente un banco de células T de cada uno de los tipos más comunes del MHC clase II. En caso de que haya que tratar a un individuo de una lesión, preferentemente se usan células T autólogas almacenadas para la preparación de un medicamento, pero, si no se dispone de células T autólogas, entonces se han de usar células T que compartan una molécula del MHC tipo II con el paciente, y sería de esperar que esto fuese operable en ese individuo. Las células se almacenan preferentemente en estado activado después de la exposición a Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1. Sin embargo, las células pueden también almacenarse en estado de reposo y activarse una vez han sido descongeladas y preparadas para ser usadas. Las líneas de células del banco son preferentemente crioconservadas. Las líneas de células se preparan de cualquier forma que sea bien conocida en la técnica. Una vez descongeladas las células, preferentemente se cultivan antes de su inyección con el fin de eliminar las células no viables. Durante este cultivo, las células pueden ser activadas o reactivadas usando el antígeno o péptido Cop 1 como se usa en la activación original. Alternativamente, puede conseguirse la activación cultivando en presencia de un mitógeno tal como fitohemaglutinina (PHA) o concanavalina A (preferentemente el primero de ellos). Esto pondrá las células en un estado de activación incluso más elevado. Los pocos días que lleva cultivar las células no han de ser perjudiciales para el paciente ya que el tratamiento de acuerdo con la presente invención puede tener lugar en cualquier momento hasta una semana o más después de la lesión para que sea efectivo. Alternativamente, si es esencial el tiempo, las células almacenadas pueden ser administradas inmediatamente después de la descongelación.

Breve descripción de los dibujos

Las Figura 1A y 1B son gráficas que muestran el número de RGCs marcados (supervivientes) por mm^{2} en retinas extirpadas de ratas a las que se había inyectado PBS en coadyuvante de Freund incompleto (IFA) (marcadas PBS en las figuras), o células T específicas de Cop 1 en IFA (marcadas Tcop1) inmediatamente después de una lesión leve (Fig. 1A) o grave (Fig. 1B) del nervio óptico.

Las Figuras 2A y 2B son gráficas que representan el análisis ELISA de factores neurotróficos segregados. Células T anti-MBP (con barras blancas en la Fig. 2A) o anti-Cop 1 (barras negras en la Fig. 2A) de rata fueron cultivadas durante 48 horas con su antígeno específico en medio de estimulación. Los sobrenadantes de las células T se recogieron y se sometieron a ELISA tipo sándwich. La gráfica muestra la concentración de NT3, BDNF, NGF y NT-4/5 segregados en cada muestra. Las relaciones de las cantidades de BDNF o NT-3 segregadas por células T anti-Cop 1 respecto de las cantidades segregadas por células T anti-MBP se muestran en la Fig. 2B. Se muestran la relaciones medias \pm sd de cinco experimentos independientes con neurotrofina (NT).

La Fig. 3 es una gráfica que muestra cómo la inmunización con Cop 1 protege las fibras del nervio óptico de la degeneración secundaria. Inmediatamente después de una lesión leve del nervio óptico, las ratas fueron inmunizadas por vía subcutánea con PBS en IFA o Cop 1 en IFA. Para evaluar la degeneración secundaria, se aplicó el colorante neurotrazador 4-Di-10-Asp al nervio óptico distalmente al sitio de la lesión, dos semanas después de la lesión por aplastamiento. Cinco días después, las ratas fueron sacrificadas y sus retinas se extirparon y se dispusieron en montaje plano. Los RGCs marcados (supervivientes), de cuatro campos situados a aproximadamente la misma distancia del disco óptico en cada retina, fueron contados bajo el microscopio de fluorescencia. El efecto neuroprotector de la inmunización con Cop 1 comparado con el de la inyección de PBS fue significativo (P < 0,05, prueba de la t de Student). Los resultados son el resumen de dos experimentos. Cada grupo contenía de ocho a diez ratas.

La Figura 4 es una gráfica que muestra cómo la inmunización con Cop 1 protege las fibras del nervio óptico frente a la toxicidad del glutamato. Se inmunizaron ratones con Cop 1 emulsionado en coadyuvante de Freund completo (CFA) y a los ratones testigo se les inyectó CFA solo. Después se inyectó en un ojo de cada ratón una solución salina sólo y en el otro una solución salina que contiene 200 nmoles de glutamato. Siete días después de la administración de glutamato, las retina se extirparon y se dispusieron en montaje plano. Se contaron las células ganglionares retinianas (RGCs) marcadas (supervivientes). Las barras muestran las RGCs que quedan como porcentaje del testigo para los ratones tratados con CFA que recibieron solución salina o bien solución salina con glutamato, y los ratones tratados con CFA-Cop 1 que recibieron solución salina o bien solución salina con Cop 1.

Las Figuras 5A y 5B muestran que la inmunización con pMOG (Fig. 5A) o la transferencia pasiva de células T anti-MBP (Fig. 5B) no protege las RGCs de ratón frente a la toxicidad del glutamato. En la Fig. 5A, ratones C57BL/6J fueron inmunizados con pMOG 14 días antes de que sus RGCs fueran expuestas directamente a la toxicidad del glutamato por inyección intravenosa de L-glutamato (200 nmoles). Cuatro días más tarde, las RGCs fueron marcadas de forma retrógrada con FluoroGold, y esto fue seguido a los tres días por la extirpación retiniana y conteo (véase la sección de Materiales y Métodos del Ejemplo 3, Experimento 2). La superviviencia de las RGC se expresa como la media \pm SEM por mm^{2}. No se observaron diferencias significativas en la superviviencia de RGC después de la inyección de glutamato entre el grupo tratado con pMOG en CFA (n = 8) y el grupo testigo tratado con PBS en CFA (n = 7). En la Fig. 5B, se inyectó glutamato intravítreamente en ratas Lewis. Cuatro días después, las RGCs fueron marcadas mediante la aplicación del colorante 4-Di-10-Asp, y esto fue seguido al cabo de 5 días por la extirpación de retina y el recuento. Se ha de observar que la superviviencia retiniana en el grupo tratado con células T no difería significativamente de la del grupo testigo (nº de RGCs por mm^{2}, media \pm SEM (n = 6 en cada grupo)).

Las Figuras 6A y 6B muestran la invasión de linfocitos después de la inyección intravítrea de glutamato. El glutamato fue inyectado intravítreamente en ratones C57bl/6. Después de 24 h, se extrajo el ojo y se procesó para histología. Se muestran secciones retinianas teñidas con H&E (10 \mum de espesor) tanto de ratones inyectados con glutamato (Fig. 6A) como testigos (Fig. 6B). Barra = 200 \mum.

La Figura 7 muestra la tasa de supervivencia de las células ganglionares retinianas después de la lesión del nervio ótico. Las RCGs de Balb/c adultos consanguíneos fueron marcadas de forma retrógrada con FluoroGold (véase la sección Métodos del Ejemplo 3, Experimento 2) 10 días después de ser inmunizados con 50 \mug de Cop 1 emulsionado en CFA. Los ratones testigo fueron inyectados con PBS en CFA (n = 8-12 en cada grupo). Tres días después del marcaje de las RGCs, los ratones fueron sometidos a una lesión grave por aplastamiento de la porción intraorbital del nervio óptico. Dos semanas después de la lesión, se extirparon las retinas y se contaron sus RGCs marcadas (véase la sección de Métodos en el Ejemplo 3, Experimento 2). En relación con los testigos no inmunizados, las tasas de supervivencia fueron significativamente más altas (p < 0,001, prueba de la t de Student) en ratones inmunizados con Cop-1 en CFA.

Las Figuras 8A-8D muestran la neuroprotección contra la neurotoxicidad del glutamato por inmunización activa con Cop-1. En la Fig. 8A, diez días antes de la inyección de glutamato, los ratones fueron inmunizados mediante inyección subcutánea con Cop-1 en CFA (5 mg/ml de bacterias) o inyectados con PBS en CFA. Se muestran los resultados de un experimento (n = 5 en cada grupo). El número de RGCs supervivientes por mm^{2} (media \pm SEM) fue significativamente más alto en los ratones inmunizados con COP 1 que en los ratones inyectados con PBS en CFA o en los ratones que recibieron solamente glutamato (p < 0,02, prueba de la t de dos colas). La inyección con PBS en CFA no tuvo efecto detectable sobre el número de RGCs. El experimento se repitió tres veces, con idénticos resultados. En conjunto se ensayaron 13 animales en el grupo tratado con Cop 1 y 15 animales en el grupo tratado con PBS. En la Fig. 8B, inmediatamente después de la inyección intravítrea de glutamato, los ratones fueron inmunizados con Cop 1 emulsionado en CFA (5 mg/ml de bacterias). El número de RGCs supervivientes por mm^{2} (media \pm SEM) se determinó una semana más tarde. Se muestran los resultados de un experimento. El efecto de la inmunización con COP 1 fue significativo (p < 0,05; prueba de la t de dos colas; n = 12 para Cop 1 y n = 8 para el testigo). Este experimento se repitió usando 11 ratones para la inmunización con COP 1 y 8 ratones para la inyección con PBS en CFA (5 mg/ml de bacterias). En la Fig. 8C, la supervivencia de las RGCs después de la agresión con glutamato e inmediata inmunización con Cop 1 en coadyuvante que contiene 0,5 mg/ml de bacterias. El número de RGCs supervivientes por mm^{2} fue significativamente más alto en los ratones inmunizados con Cop 1 (n = 15) que en los ratones inyectados con glutamato (n = 5) (p < 0,04; prueba de la t de dos colas). En la Fig. 8D, superviviencia de RGCs después de la inmunización realizada antes, inmediatamente después, o 48 horas después de la agresión con glutamato. Las barras muestran los resultados agrupados obtenidos para todos los ratones examinados en cada tratamiento, recogidos de experimentos repetidos. No se observó ningún efecto cuando la inmunización se realizó 48 h después de la agresión.

La Figura 9 muestra que la inmunización con Cop 1 falla en la protección de ratones frente a la toxicidad de NMDA. Diez días después de la inyección de NMDA (75 nmoles), se inmunizaron ratones (n = 5 a 7) mediante inyección subcutánea de Cop 1 en CFA o con PBS en CFA. El marcaje de las RGCs y el recuento de las RGCs viables bajo microscopio de fluorescencia fueron como se describe para la Fig. 5A. La supervivencia de RGCs en los ratones inmunizados con Cop 1, expresada como porcentaje de la supervivencia en un ojo normal, fue similar a la de los ratones a los que se ha inyectado PBS (p = 0,55, prueba de la t de Student), lo que indica que no se obtuvo neuroprotección.

La Fig. 10 muestra cómo las células T reactivas para Cop 1 protegen las RGCs frente a la toxicidad del glutamato. Inmediatamente después de la inyección de glutamato (200 nmoles), se inyectó a los ratones células T reactivas a Cop 1 o PBS. La aplicación del colorante, la preparación y el recuento de las RGCs, y el cálculo de la supervivencia de RGC fueron como se describe para la Fig. 5B. Se observan significativamente más RGCs marcadas en las retinas de los ratones a los que se ha inyectado células T reactivas a Cop 1 que en las retinas de los ratones testigo a los que se ha inyectado PBS (p < 0,0007, prueba de la t de Student).

Las Figuras 11A a 11D muestran el efecto de la IOP incrementada crónicamente y la inmunización con Cop 1 sobre la supervivencia de las células ganglionares retinianas en ratas Lewis. En la Fig. 11A, la cauterización con láser que provoca la oclusión de las venas epiescleral y limbar tiene por resultado un aumento en la IOP y la subsiguiente muerte de las células ganglionares retinianas. Tres semanas después del tratamiento con láser, la IOP media fue 30,4 \pm 0,42 mm de Hg (media \pm SEM, n = 5) en ratas sometidas a oclusión venosa, en comparación con 15,8 \pm 0,2 mm de Hg (n = 7) en ratas no manipuladas anteriormente. En la Fig. 11B, tres semanas después de la oclusión venosa, se contó un 19,9% \pm 0,51% (media \pm SEM) menos de células ganglionares retinianas en las ratas tratadas con láser que en las ratas no manipuladas anteriormente. En la Fig. 11C, la inmunización con Cop 1 inmediatamente después de la oclusión nerviosa reduce la pérdida de células ganglionares retinianas. Se inmunizaron ratas con Cop 1 (200 \mug) en CFA (n = 15) o se les inyectó PBS (n = 13) en CFA inmediatamente después del tratamiento con láser. Tres semanas más tarde, las retinas fueron extirpadas y montadas completas, y se contó el número de células ganglionares retinianas premarcadas con rodamina dextrano amina. Las barras representan la pérdida de células ganglionares retinianas en cada grupo de ratas, calculada como porcentaje del número de células ganglionares retinianas en ratas no sometidas previamente a ningún tratamiento (media \pm SEM). La diferencia en el número de células ganglionares retinianas en los dos grupos fue significativa (p < 0,0001, prueba de la t de dos colas). En la Fig. 11D, el efecto de la inmunización retardada con Cop 1 sobre la pérdida de células ganglionares retinianas fue examinado inmunizando ratas 10 días después de la oclusión venosa. Las barras representan la pérdida de células ganglionares retinianas en grupos tratados con Cop 1 (n = 5) o PBS (n = 4), calculada como porcentaje del número de células ganglionares retinianas (media \pm SEM) en animales no sometidos previamente a ningún tratamiento. Se observó una tendencia hacia un efecto neuroprotector después de la inmunización retardada con Cop 1; la diferencia fue significativa solamente en la prueba de la t de 1 cola (p = 0,04).

Descripción detallada de la invención

Con el solo fin de facilitar la exposición, la descripción detallada de la presente invención se divide en las siguientes subsecciones: (1) Células T activadas específicas de Cop 1; (2) Cop 1 y péptidos y polipéptidos relacionados con Cop 1; (3) Usos terapéuticos; (4) Formulaciones y administración; (5) Establecimiento de bancos de células autólogas para linfocitos T; (6) Ejemplos; y (7) Discusión de resultados.

(1) Células T activadas especificas de Cop 1

Las células T activadas específicas de Cop 1 (ATCs) son células T que han sido activadas en presencia de Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1, como se define en la Sección (2). Tales ATCs pueden usarse para preparar un medicamento para el tratamiento, es decir la mejora o la inhibición, de los efectos de una lesión o enfermedad del SNC o el SNP que tienen por resultado la degeneración del SN, o para favorecer la regeneración del SN, en particular del SNC. Además, como el glutamato es un mediador en todas las enfermedades neurodegenerativas, sean crónicas o agudas, se entiende que tales ATCs pueden usarse para proteger a las células del SNC frente a la toxicidad del glutamato y para tratar enfermedades o estados provocados o exacerbados por la toxicidad del glutamato, tales como la presión intraocular anómala. Las células T activadas específicas de Cop 1 son preferentemente autólogas, lo más preferentemente de los fenotipos CD4 y/o CD8, pero también pueden ser células T alogénicas de donantes relacionados, p. ej. hermanos, padres, hijos, o donantes HLA-compatibles o parcialmente compatibles, semialogénicos o totalmente alogénicos. Además del uso de células T autólogas aisladas del sujeto para preparar un medicamento, la presente invención comprende también el uso de células T semialogénicas para preparar un medicamento para neuroprotección. Estas células T pueden prepararse como líneas a corto y largo plazo y almacenarse por métodos de crioconservación convencionales para descongelación y administración, bien sea inmediatamente o después de cultivar durante 1 a 3 días, a un sujeto que padece una lesión en el sistema nervioso central y en necesidad de neuroprotección por células T.

El uso de células T semialogénicas se basa en el hecho de que las células T pueden reconocer un epítopo de un antígeno específico presentado por células de presentación del antígeno (APC: Antigen Presentation Cells) extrañas, con la condición de que las APC expresen la molécula del MHC, clase I o clase II, a la que está restringida la población de células T respondedoras específicas, junto con el epítopo del antígeno reconocido por las células T. Así, una población semi-alogénica de células T que puede reconocer al menos un producto alélico de las moléculas del MHC del sujeto, preferentemente una HLA-DR o una HLA-DQ u otra molécula de HLA, y que es específico para un epítopo de Cop 1, podrá reconocer los antígenos con reactividad cruzada con Cop 1 en el área del sujeto del daño del SN y producirá el efecto neuroprotector necesario. Hay poco o ningún polimorfismo en las moléculas de adhesión, moléculas de migración de leucocitos y moléculas accesorias necesarias para que las células T migren al área de los daños, se acumulen allí y experimenten la activación. Así, las células T semialogénicas podrán migrar y acumularse en el sitio del SNC en necesidad de neuroprotección, y se activarán para producir el efecto
deseado.

Se sabe que las células T semialogénicas serán rechazadas por el sistema inmunitario del paciente, pero que el rechazo requiere aproximadamente dos semanas para desarrollarse. Por ello, las células T semialogénicas tendrán el margen de oportunidad de dos semanas que se necesita para ejercer la neuroprotección. Al cabo de dos semanas, las células T semialogénicas serán rechazadas por el organismo del sujeto, pero ese rechazo es ventajoso para el sujeto porque de esta forma se desembarazará de las células T extrañas y evitará cualquier posible consecuencia adversa de las células T activadas. Las células T semialogénicas proporcionan entonces un importante factor de seguridad y son una realización preferida.

Se sabe que un número relativamente pequeño de moléculas del HLA clase II son compartidas por la mayor parte de individuos de una población. Por ejemplo, aproximadamente el 50% de la población judía expresa el gen HLA-DR5. Así, un banco de células T específicas reactivas frente a epítopos de Cop 1 que están restringidas a HLA-DR5 sería útil en un 50% de esa población. La población completa puede cubrirse esencialmente por un pequeño número de líneas de células T adicionales restringidas a unas cuantas de otras moléculas de HLA prevalentes, tales como DR1, DR4, DR2, etc. Así, puede prepararse un banco funcional de líneas de células T uniformes, y almacenarse para uso inmediato en casi cualquier individuo de una población dada. Tal banco de células T superaría cualquier problema técnico en la obtención de un número suficiente de células T específicas a partir del sujeto en necesidad de neuprotección durante el margen abierto de la oportunidad del tratamiento. Las células T semialogénicas serán rechazadas con seguridad después de cumplir su papel de neuroprotección. Este aspecto de la invención no está en contraposición, sino que se suma al mismo, con el uso de células T autólogas como se describe en el presente texto.

Las células T activadas específicas de Cop 1 son preferentemente no atenuadas, aunque pueden usarse células T activadas específicas de Cop 1 atenuadas. Las células T pueden atenuarse usando métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, radiaciones gamma, p. ej. 1,5-10,0 Rads (Ben-Nun et al., 1981b; Ben-Nun et al., 1982); y/o por tratamiento a presión, por ejemplo como se describe en la patente de EE.UU. nº 4.996.194 (Cohen et al.). En una realización preferida, las células T activadas específicas de Cop 1 se aíslan como se describe más adelante. Las células T pueden aislarse y purificarse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica (Mor et al., 1995). Para un ejemplo ilustrativo, véase la Sección (6), Ejemplo 1.

Las células T circulantes de un sujeto que reconocen Cop 1 se aíslan y se expanden de acuerdo con procedimientos conocidos. Para obtener células T activadas específicas de Cop 1, las células T se aíslan y las ATCs específicas de Cop 1 se expanden después por un procedimiento conocido (Burns et al., 1983; Pette et al., 1990; Martín et al., 1990; Schluesener et al., 1985; Suruhan-Dires Keneli et al., 1993).

Durante la activación ex vivo de las células T, las células T pueden ser activadas cultivándolas en un medio al que se ha añadido al menos un adecuado factor promotor del crecimiento. Los factores de promoción del crecimiento adecuados para este propósito incluyen, sin limitación, citocinas, por ejemplo factor \alpha de necrosis tumoral (TNF-\alpha), interleucina 2 (IL-2), e interleucina 4 (IL-4). En una realización, las células T activadas endógenamente producen una sustancia que mejora los efectos de una lesión o enfermedad en el SN.

En otra realización, las células T activadas endógenamente producen una sustancia que estimula a otras células, incluyendo, pero sin limitarse a ellas, factor \beta transformante del crecimiento (TGF-\beta), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor neurotrófico 3 (NT-3), factor neurotrófico 4/5 (NT-4/5), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF); interferón-\gamma (IFN-\gamma) e interleucina-6 (IL-6), en donde las otras células, directa o indirectamente, mejoran los efectos de la lesión o de la enfermedad.

Después de su proliferación in vitro, las células T se usan para la preparación de un medicamento adecuado para ser administrado a un mamífero. En una realización preferida, el medicamento es adecuado para ser administrado a un ser humano. La expansión de las células T se realiza preferentemente usando Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1 . Las células T activadas con Cop 1 pueden ser usadas inmediatamente o pueden ser preservadas para su uso posterior, p. ej. mediante crioconservación como se describe más adelante. Las células T activadas específicas de Cop 1 pueden obtenerse también usando células T crioconservadas previamente, es decir, después de descongelar las células, las células T pueden ser incubadas con Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1, óptimamente junto con linfocitos de sangre periférica (PBL), para obtener una preparación de ATCs específicas de Cop 1.

Como será evidente para los expertos en la técnica, las células T pueden ser preservadas, p. ej. mediante crioconservación, bien sea antes o después de su cultivo.

Los agentes de crioconservación que pueden usarse incluyen, pero sin limitarse a ellos, dimetilsulfóxido (DMSO) (Lovelock et al., 1959; Ashwood-Smith, 1961), glicerol, polivinilpirrolidona (Rinfret, 1960), polietilenglicol (Sloviter et al., 1962), albúmina, dextrano, sacarosa, etilenglicol, i-eritritol, D-ribitol, D-manitol (Rowe et al., 1962), D-sorbitol, i-inositol, D-lactosa, cloruro de colina (Rowe et al., 1962), aminoácidos (Phan The Tran et al., 1960a), metanol, acetamida, monoacetato de glicerol (Lovelock, 1954), sales inorgánicas (Phan The Tran et al., 1960b; Phan The Tran et al.), y DMSO combinado con hidroxietilalmidón y seroalbúmina humana (Zaroulis et al., 1980).

Es crítica una velocidad de enfriamiento controlada. Los distintos agentes crioprotectores (Rapatz et al., 1968) y distintos tipos de células tienen distintas velocidades de enfriamiento óptimas. Véanse, p. ej., Rowe et al. (1962b); Rowe (1966); Lewis et al. (1967); y Mazur (1970) para los efectos de la velocidad de enfriamiento sobre la superviviencia de las células y su potencial de trasplante. El calor de la fase de fusión en la que el agua se convierte en hielo debe ser mínimo. El procedimiento de enfriamiento debe llevarse a cabo usando, p. ej., un dispositivo de congelación programable o un procedimiento en baño de metanol.

Los aparatos de congelación programable permiten la determinación de velocidades de enfriamiento óptimas y facilitan un enfriamiento reproducible estándar. Los congeladores de velocidad controlada programables, tales como Cryomed o Planar, permiten sintonizar el régimen de congelación con la curva de velocidad de enfriamiento deseada.

Después de la congelación total, las células pueden ser rápidamente transferidas a un recipiente para almacenamiento criogénico prolongado. En una realización, las muestras pueden almacenarse criogénicamente en congeladores mecánicos, tales como los congeladores que mantienen una temperatura de aproximadamente -80ºC o aproximadamente -20ºC. En una realización preferida, las muestras pueden almacenarse criogénicamente en nitrógeno líquido (-196ºC) o en su vapor. Tal almacenamiento se facilita en gran medida por la disponibilidad de refrigeradores de nitrógeno líquido altamente eficientes, que se parecen a grandes recipientes termos con un vacío extraordinariamente elevado y un superaislamiento interno, de forma que las fugas térmicas y las pérdidas de nitrógeno se mantienen en un mínimo absoluto.

Pueden encontrarse consideraciones y procedimientos para la manipulación, la crioconservación y el almacenamiento prolongado de células T, por ejemplo, en las referencias Gorin (1986) e International Atomic Energy Agency (1969).

Se dispone y se prevén otros métodos de crioconservación de células viables, o modificaciones de los mismos, p. ej. las técnicas de espejo de metal frío. Véase Livesey et al. (1987); Linner et al. (1986); véanse también la patente de EE.UU. nº 4.199.022 de Senken et al., la patente de EE.UU. nº 3.753.357 de Schwartz, y la patente de EE.UU. nº 4.559.298 de Fahy.

Las células congeladas de descongelan preferentemente con rapidez (p. ej. en un baño de agua mantenido a 37-47ºC) y se enfrían inmediatamente de descongelarlas. Puede ser deseable tratar las células con el fin de prevenir la aglutinación al descongelarlas. Para evitar la aglutinación pueden usarse varios procedimientos, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, la adición, antes o después de la congelación, de DNAsa (Spitzer et al., 1980), dextrano de bajo peso molecular y citrato, citrato, hidroxietil almidón (Stiff et al., 1983), citrato de dextrosa ácido (Zaroulis et al., 1980),
etc.

El agente crioprotector, si es tóxico en las personas, ha de eliminarse antes del uso terapéutico de las células T descongeladas. Una forma de eliminar el agente crioprotector es mediante dilución hasta una concentración insignificante.

Una vez que las células T congeladas han sido descongeladas y recuperadas, se usan para promover la regeneración neuronal como se describe en el presente texto en relación con las células T no congeladas. Una vez descongeladas, las células T pueden usarse inmediatamente, suponiendo que habían sido activadas antes de la congelación. Sin embargo, preferentemente las células congeladas se cultivan antes de la inyección al paciente con el fin de eliminar las células no viables. Además, en el curso de este cultivo durante un período de aproximadamente uno a tres días, puede añadirse un agente de activación apropiado para activar las células, si las células congeladas eran células T en reposo, o para ayudar a las células a conseguir una tasa de activación más elevada si habían sido activadas antes de la congelación. Normalmente, se dispone de tiempo para permitir tal etapa de cultivo antes de la administración en forma de medicamento ya que las células T pueden administrarse tras un periodo de tiempo de hasta una semana, y posiblemente más de una semana, después de la lesión, y mantienen aún su efecto neurorregenerador y neuroprotector.

(2) Cop 1 y péptidos y polipeptidos relacionados con Cop 1

Las composiciones farmacéuticas que comprenden Cop 1 o un antígeno de un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1 o derivado del mismo pueden usarse para prevenir o inhibir los efectos de una lesión o enfermedad que tienen por resultado la degeneración del SN, para promover la regeneración nerviosa en el SN, en particular en el SNC, para proteger a las células del SNC frente a la toxicidad del glutamato, o para tratar una lesión o enfermedad causada o exacerbada por la toxicidad del glutamato. Adicionalmente, puede usarse Cop 1 o un antígeno de péptido o polipéptido relacionado con Cop 1 o un derivado del mismo para la activación in vivo o in vitro de las células T. En una realización, se proporciona el uso de Cop 1 o un antígeno de péptido o polipéptido relacionado con Cop 1 o un derivado del mismo para la preparación de un medicamento para promover la regeneración nerviosa o para prevenir o inhibir los efectos de una lesión o enfermedad del SNC o el SNP en un mamífero, en el que el Cop 1 o el antígeno de péptido o polipéptido relacionado con Cop 1 o un derivado del mismo activa las célula T in vivo para producir una población de células T que se acumula en el sitio de la lesión o la enfermedad del SNC o el SNP. En otra realización, el Cop 1 o el antígeno de péptido o polipéptido relacionado con Cop 1 o derivado del mismo se usa para la preparación de un medicamento adecuado para ser administrado para proteger a las células del SNC frente a la toxicidad del glutamato o para tratar una lesión o una enfermedad causada o exacerbada por la toxicidad del glutamato. La composición para ser usada en la presente invención puede ser Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1. Para los fines de la presente invención, se entiende que "Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1" incluye cualquier péptido, incluyendo un copolímero al azar, que tiene funcionalmente reacción cruzada con proteína básica de mielina (MBP) y puede competir con la MBP en el MHC de clase II en la presentación del antígeno.

La composición puede comprender copolímeros al azar que comprenden cualquier cantidad adecuada de un aminoácido de carga eléctrica positiva, tal como lisina o arginina, en combinación con un aminoácido con una carga eléctrica negativa (preferentemente en menor cantidad), tal como ácido glutámico o ácido aspártico, opcionalmente en combinación con un aminoácido eléctricamente neutro tal como alanina o glicina, que sirve como carga, y opcionalmente con un aminoácido adaptado para conferir al copolímero propiedades inmunogénicas, tal como un aminoácido aromático como la tirosina o el triptófano. Tales composiciones pueden incluir cualquiera de las descritas en el documento WO 005250.

Más específicamente, la composición para ser usada en la presente invención comprende al menos un copolímero elegido entre el grupo consistente en copolímeros al azar que comprenden un aminoácido entre cada uno de al menos tres de los siguientes grupos:

(a) lisina y arginina;

(b) ácido glutámico y ácido aspártico;

(c) alanina y glicina;

(d) tirosina y triptófano.

Los copolímeros para ser usados en la presente invención para preparar un medicamento pueden estar compuestos por L- ó D-aminoácidos o mezclas de los mismos. Como saben los expertos en la técnica, los L-aminoácidos están presentes en la mayor parte de las proteínas naturales. Sin embargo, los D-aminoácidos son disponibles comercialmente y pueden sustituir a algunos o a todos los aminoácidos usados para los terpolímeros y otros copolímeros de la presente invención. La presente invención contempla copolímeros que contienen tanto D- como L-aminoácidos, así como copolímeros que consisten esencialmente en uno u otro de los L- o D-aminoácidos.

En una realización de la presente invención, el copolímero contiene cuatro aminoácidos diferentes, cada uno de ellos de uno de los grupos (a) o (d). Un copolímero preferido de acuerdo con esta realización de la presente invención comprende en combinación alanina, ácido glutámico, lisina y tirosina, de carga eléctrica global neta positiva y de un peso molecular de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 40.000 Daltons, preferentemente de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 13.000 Daltons. El ejemplo más preferido es el Copolímero 1 (Cop 1) de peso molecular medio de aproximadamente 4.700 a aproximadamente 13.000 Daltons. Los márgenes de pesos moleculares y los procedimientos preferidos para hacer una forma preferida de Copolímero 1 se describen en la patente de EE.UU. nº 5.800.808. Está claro que esto viene dado solamente a título de ejemplo, y que la composición puede variarse con relación tanto a los constituyentes como a las proporciones relativas de los constituyentes si se cumplen los criterios generales anteriores. Así, el copolímero puede ser un polipéptido de aproximadamente 15 a aproximadamente 100, preferentemente de aproximadamente 40 a aproximadamente 80 aminoácidos de longitud.

En otra realización, el copolímero contiene tres aminoácidos diferentes, cada uno de ellos de uno diferente de tres de los grupos (a) a (d). Estos copolímeros se denominan en el presente texto terpolímeros.

En una realización, los terpolímeros para ser usados en la presente invención contienen tirosina, alanina y lisina, en adelante denominados YAK. La fracción molar media de los aminoácidos en estos terpolímeros puede variar. Por ejemplo, la tirosina puede estar presente en una fracción molar de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 0,250; la alanina puede estar presente en una fracción molar de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 0,6; y la lisina puede estar presente en una fracción molar de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,5. El peso molecular medio está entre 2.000 y aproximadamente 40.000 Daltons, y preferentemente entre aproximadamente 3.000 y aproximadamente 35.000 Daltons. En una realización más preferida, el peso molecular medio es de aproximadamente 5.000 a aproximadamente 25.000 Dlatons. Es posible sustituir lisina por arginina, alanina por glicina y/o tirosina por triptófano.

En otra realización, los terpolímeros para ser usados en la presente invención contienen tirosina, ácido glutámico y lisina, designados en adelante YEK. La fracción molar media de los aminoácidos en estos terpolímeros puede variar: el ácido glutámico puede estar presente en una fracción molar de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 0,300, la tirosina puede estar presente en una fracción molar de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 0,250 y la lisina puede estar presente en una fracción molar de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 0,7. El peso molecular medio está entre 2.000 y aproximadamente 40.000 Daltons, y preferentemente entre aproximadamente 3.000 y aproximadamente 35.000 Daltons. En una realización más preferida, el peso molecular medio es aproximadamente 5.000 a aproximadamente 25.000 Daltons. Es posible sustituir el ácido glutámico por ácido aspártico, la lisina por arginina y/o la tirosina por triptófano.

En otra realización, los terpolímeros para ser usados en la presente invención contienen lisina, ácido glutámico y alanina, designados en el presente texto en adelante KEA. La fracción molar media de los aminoácidos en estos terpolímeros también puede variar. Por ejemplo, el ácido glutámico puede estar presente en una fracción molar de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 0,300, la alanina puede estar presente en una fracción molar de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 0,600, la lisina puede estar presente en una fracción molar de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 0,7. El peso molecular medio está entre 2.000 y 40.000 Daltons, y preferentemente entre aproximadamente 3.000 y 35.000 Daltons. En una realización más preferida, el peso molecular medio es aproximadamente 5.000 a aproximadamente 25.000 Daltons. Es posible sustituir el ácido glutámico por ácido aspártico, la alanina por glicina y/o la lisina por arginina.

En otra realización, los terpolímeros para ser usados en la presente invención contienen tirosina, ácido glutámico y alanina, designados en adelante en el presente texto YEA. La fracción molar media de los aminoácidos en estos polipéptidos puede variar. Por ejemplo, la tirosina puede estar presente en una fracción molar de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 0,250, el ácido glutámico puede estar presente en una fracción molar de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 0,300, y la alanina puede estar presente en una fracción molar de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 0,800. El peso molecular medio está entre 2.000 y aproximadamente 40.000 Daltons, y preferentemente entre aproximadamente 3.000 y 35.000 Daltons. En una realización más preferida, el peso molecular medio es aproximadamente 5.000 a aproximadamente 25.000 Daltons. Es posible sustituir la tirosina por triptófano, el ácido glutámico por ácido aspártico, y/o la alanina por glicina.

En una realización más preferida, la fracción molar de los aminoácidos de los terpolímeros es aproximadamente la que se prefiere para el Copolímero 1. La fracción molar de aminoácidos en el Copolímero 1 es ácido glutámico aproximadamente 0,14, alanina aproximadamente 0,43, tirosina aproximadamente 0,10 y lisina aproximadamente 0,34. El peso molecular medio más preferido para el Copolímero 1 está entre aproximadamente 5.000 y aproximadamente 9.000 Daltons. Es de esperar que la actividad del Copolímero 1 para las utilidades descritas en el presente texto se mantenga si se hace una o más de las sustituciones siguientes: ácido aspártico por ácido glutámico, glicina por alanina, arginina por lisina y triptófano por tirosina.

Las relaciones molares de los monómeros del terpolímero más preferido de ácido glutámico, alanina y tirosina, o YEA, es aproximadamente 0,21 a aproximadamente 0,65 a aproximadamente 0,14.

Las relaciones molares de los monómeros del terpolímero más preferido de ácido glutámico, alanina y lisina, o KEA, es aproximadamente 0,15 a aproximadamente 0,48 a aproximadamente 0,36.

Las relaciones molares de los monómeros del terpolímero más preferido de ácido glutámico, tirosina y lisina, o YEK, es aproximadamente 0,26 a aproximadamente 0,16 a aproximadamente 0,58.

Las relaciones molares de los monómeros del terpolímero preferido de tirosina, alanina y lisina, o YAK, es aproximadamente 0,10 a aproximadamente 0,54 a aproximadamente 0,35.

Los terpolímeros pueden prepararse por cualquier procedimiento disponible para un experto en la técnica. Por ejemplo, los terpolímeros pueden prepararse bajo condiciones de condensación usando la relación molar deseada de aminoácidos en solución, o por procedimientos de síntesis en fase sólida. Las condiciones de condensación incluyen la temperatura y el pH apropiados, y condiciones de disolvente para condensar el grupo carboxilo de un aminoácido con el grupo amino de otro aminoácido, para formar un enlace peptídico. Pueden usarse agentes de condensación, por ejemplo diciclohexil-carbodiimida, para facilitar la formación del enlace peptídico. Pueden usarse grupos bloqueantes para proteger los grupos funcionales, tales como los restos de cadenas secundarias y algunos de los grupos amino o carboxilo, contra reacciones secundarias no deseadas.

Por ejemplo, puede usarse el procedimiento descrito en la patente de EE.UU. nº 3.849.650, en el que los N-carboxi-anhídridos de tirosina, alanina, glutamato de \gamma-bencilo y N-\varepsilon-trifluoroacetil-lisina se polimerizan a temperatura ambiente en dioxano anhidro con dietilamina como iniciador. El grupo \gamma-carboxilo del ácido glutámico puede desbloquearse mediante bromuro de hidrógeno en ácido acético glacial. Los grupos trifluoroacetilo se eliminan de la lisina mediante piperidina 1 molar. Un experto en la técnica entiende fácilmente que el procedimiento puede ser ajustado para preparar péptidos y polipéptidos que contengan los aminoácidos deseados, esto es, tres de los cuatro aminoácidos del Copolímero 1, eliminando selectivamente las reacciones que se refieren a uno cualquiera de los aminoácidos ácido glutámico, alanina, tirosina o lisina. Para los propósitos de esta solicitud, las expresiones "temperatura ambiente" y "temperatura del entorno" significan una temperatura que se encuentra en el intervalo entre aproximadamente 20 y aproximadamente 60ºC.

El peso molecular de los terpolímeros puede ajustarse durante la síntesis del polipéptido o después de que se hayan preparado los terpolímeros. Para ajustar el peso molecular durante la síntesis del polipéptido, las condiciones de síntesis o las cantidades de aminoácidos se ajustan de manera que la síntesis se detenga cuando el polipéptido alcanza la longitud aproximada que se desea. Después de la síntesis, pueden obtenerse los polipéptidos con el peso molecular deseado mediante cualquier procedimiento de selección de tamaños disponible, tal como cromatografía de los polipéptidos en una columna o gel de clasificación de pesos moleculares, y recogida de los intervalos de peso molecular deseados. Los presentes polipéptidos pueden también hidrolizarse parcialmente para eliminar las especies de alto peso molecular, por ejemplo mediante hidrólisis ácida o enzimática, y después purificarse para eliminar el ácido o las enzimas.

En una realización, pueden prepararse los terpolímeros con el peso molecular deseado mediante un procedimiento que incluye hacer reaccionar con ácido bromhídrico un polipéptido protegido para formar un trifluoroacetil-polipéptido que tiene el perfil de pesos moleculares deseado. La reacción se lleva a cabo durante un tiempo, y a una temperatura, que vienen predeterminados por una o más reacciones de prueba. Durante la reacción de prueba, se varían el tiempo y la temperatura y se determina el intervalo de pesos moleculares de una tanda dada de los polipéptidos de ensayo. Las condiciones de prueba que proporcionan el intervalo óptimo de pesos moleculares para esa tanda de polipéptidos se usan para la tanda. Así, puede producirse un trifluoroacetil-polipéptido que tiene el perfil de pesos moleculares deseado, mediante un procedimiento que incluye hacer reaccionar con ácido bromhídrico el polipéptido protegido, durante un tiempo y a una temperatura que vienen predeterminados por la reacción de prueba. El trifluoroacetilpolipéptido con el perfil de pesos moleculares deseado se sigue después tratando con una solución acuosa de piperidina para formar un polipéptido de baja toxicidad que tiene el peso molecular deseado.

En una realización preferida, una muestra de ensayo de polipéptido protegido de una tanda dada se hace reaccionar con ácido bromhídrico durante aproximadamente 10-50 horas a una temperatura de aproximadamente 20-28ºC. Las mejores condiciones para esa tanda se determinan realizando varias reacciones de prueba. Por ejemplo, en una realización, el polipéptido protegido se hace reaccionar con ácido bromhídrico durante aproximadamente 17 horas a una temperatura de aproximadamente 26ºC.

Como se conocen motivos de unión de Cop 1 a moléculas HLA-DR asociadas con MS (Fridkis-Hareli et al., 1999b), pueden prepararse fácilmente polipéptidos de secuencia fija y ensayarlos para la unión a la muesca de unión de péptido de las moléculas HLA-DR como se describe en la publicación de Fridkis-Hareli et al. (1999b). Ejemplos de tales péptidos son los que se describen en el documento WO 005249. Treinta y dos de los péptidos descritos específicamente en dicha solicitud se reproducen en la Tabla 1, más adelante. Sería de esperar que tales péptidos, y otros péptidos similares, tengan una actividad similar a la del Cop 1. Sin embargo, esto puede determinarse fácilmente ensayando su capacidad para activar a las células T de acuerdo con la presente invención. Todo esto puede hacerse sin una experimentación excesiva. Se considera que tales péptidos, y otros péptidos similares, caen dentro de la definición de péptidos o polipéptidos relacionados con Cop 1, y se considera que su uso forma parte de la presente
invención.

TABLA 1

1

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El copolímero preferido para ser usado en la presente invención es el Copolímero 1, denominado también en el presente texto Cop 1. El copolímero 1 ha sido aprobado en varios países para el tratamiento de la esclerosis múltiple (MS: Multiple Sclerosis) bajo el nombre comercial COPAXONE®, Glatiramer acetato. COPAXONE® es una marca comercial de Teva Pharmaceuticals Ltd., Petah Tikva, Israel. Varios experimentos clínicos demostraron que el Copolímero 1 es bien tolerado con solamente reacciones secundarias minoritarias, que en su mayoría eran reacciones leves en el sitio de la inyección (Johnson et al., 1995).

(3) Usos terapéuticos

Las composiciones descritas en las secciones (1) y (2) pueden usarse para la preparación de un medicamento para promover la regeneración nerviosa o para evitar o inhibir la degeneración secundaria que, de otra forma, podría seguir a una lesión primaria del SN, p. ej. lesiones cerradas en la cabeza y traumatismos contusos, tales como los causados por la participación en deportes peligrosos, traumatismo penetrante tal como las heridas por arma de fuego, ataque hemorrágico, ataque isquémico, glaucoma, isquemia cerebral, o daños causados por cirugía, tales como la extirpación de un tumor. Además, tales composiciones pueden usarse para la preparación de un medicamento para mejorar los efectos de una enfermedad que resultan de un proceso degenerativo, p. ej. la degeneración que tiene lugar en la sustancia gris o en la sustancia blanca (o en ambas) como consecuencia de varias enfermedades o trastornos entre los que se incluyen, sin limitación, neuropatía diabética, demencia senil, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, parálisis facial (de Bell), glaucoma, corea de Huntington, eslerosis lateral amiotrófica (ALS), estado epiléptico, neuropatía óptica no arterítica, hernia de disco intervertebral, déficit vitamínico, enfermedades priónicas tales como la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, síndrome del túnel carpiano, neuropatías periféricas asociadas con diversas enfermedades, entre las que se incluyen, pero sin limitarse a ellas, uremia, porfiria, hipoglucemia, hipoglucemia, síndrome de Sjorgren Larsson, neuropatía sensorial aguda, neuropatía atáxica crónica, cirrosis biliar, amiloidosis primaria, enfermedades pulmonares obstructivas, acromegalia, síndromes de malabsorción, policitemia verdadera, gammapatías de IgA e IgG, complicaciones por diversos fármacos (p. ej., metronidazol) y toxinas (p. ej. alcohol u organofosfatos), enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, ataxia telangiectasia, ataxia de Friedreich, polineuropatías amiloides, adrenomieloneuropatía, neuropatía axónica gigante, enfermedad de Refsum, enfermedad de Fabry, lipoproteinemia, etc. A la luz de los hallazgos con respecto al aspecto protector frente al glutamato de la presente invención, otras condiciones clínicas que pueden ser tratadas de acuerdo con la presente invención incluyen epilepsia, amnesia, ansiedad, hiperalgesia, psicosis, ataques, presión intraocular anormalmente elevada, agresión oxidativa, y tolerancia y dependencia de opiáceos. Además, el aspecto protector frente al glutamato de la presente invención, esto es, tratamiento de una lesión o enfermedad causados o exacerbados por la toxicidad del glutamato, puede incluir tratamientos post-operatorios tales como la eliminación de un tumor del SNC y otras formas de cirugía del SNC. En vista del hecho de que la inmunización con Cop 1 se ha encontrado sorprendentemente útil en la protección frente a la toxicidad del glutamato, se espera que el uso de Cop 1 para la preparación de un medicamento para el tratamiento con células T de acuerdo con la presente invención será efectivo en el tratamiento de las condiciones listadas anteriormente, no solo en la fase tardía cuando la mielina está siendo afectada sino también en las fases tempranas en las que las neuronas están siendo atacadas por factores que producen una elevación de los niveles de glutamato hasta niveles tóxicos. Así, la presente invención es útil para cualquier indicación, es decir, neurodegeneración crónica o aguda, que esté causada o exacerbada por una elevación de los niveles de glutamato, incluyendo las etapas tempranas del ataque isquémico, la enfermedad de Alzheimer, etc. Además, esta protección frente a la toxicidad del glutamato establece que el papel del Cop 1 no está limitado a su reactividad cruzada con la mielina. Debe tener también una actividad reguladora, como es creando células reguladoras o sustancias reguladoras. En vista de esta actividad reguladora, es de esperar que la vacunación con Cop 1 y células T activadas específicas de Cop 1 proteja también a la sustancia blanca y la sustancia gris frente a los daños causados por la tensión oxidativa y otras fuentes de daños para las células neurales. Además, a causa de esta actividad reguladora, la presente invención puede también usarse para proteger a las células neurales no sólo de la esclerosis múltiple, como se ha sugerido en la técnica anterior, sino también de enfermedades autoinmunitarias distintas de la esclerosis múltiple. En una realización preferida, las células T activadas, o composición de inmunización que comprende Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1 de la presente invención, se usan para tratar enfermedades o trastornos en los que está indicada la promoción de la regeneración nerviosa o la prevención o inhibición de la degeneración neural secundaria, pero excluyendo esclerosis múltiple y neoplasias. En una realización preferida, las composiciones de la presente invención son adecuadas para ser administradas a seres humanos. Como se discutió anteriormente en el presente texto, el Cop 1 ha sido usado como agente para conseguir la supresión o desactivación de la reactividad autoinmunitaria de las células T contra antígenos de mielina en pacientes de esclerosis múltiple. Con ese fin, se ha administrado Cop 1 sin coadyuvantes mediante inyección subcutánea diaria. La técnica anterior describe también la administración de Cop 1 a pacientes de esclerosis múltiple por vía oral, que se intenta también induciendo la supresión de la respuesta autoinmunitaria de las células T contra antígenos de mielina. Obsérvese que estos usos de Cop 1 en la técnica anterior del tratamiento para la esclerosis múltiple son fundamentalmente distintos del uso de Cop 1 para neuroprotección, que es el objeto de la presente invención. En primer lugar, como se muestra en el documento WO 99/60021 por el laboratorio de los presentes inventores, la neuroprotección está mediada por la activación de células T autoinmunitarias específicamente dirigidas contra antígenos de mielina. De aquí, es lo más sorprendente que el Cop 1, un agente destinado a suprimir la autoinmunidad de las células T, debe tener un efecto que requiere la activación de autoinmunidad de las células T anti-mielina específicas. En segundo lugar, el uso de Cop 1 para la neuroprotección de acuerdo con la presente invención se basa en la administración de células T anti-Cop 1, que no es la forma en la que se usa Cop 1 para tratar la esclerosis múltiple. En tercer lugar, en una realización preferida, la presente invención contempla el uso de Cop 1 para la preparación de un medicamento adecuado para ser administrado en coadyuvantes, tal como coadyuvante de Freund incompleto o coadyuvante de Freund completo, que es un tipo de preparado de Cop 1 que no ha sido usado anteriormente para el tratamiento de la esclerosis múltiple o para cualquier otro propósito terapéutico. Aunque la presente invención contempla la administración oral del medicamento descrito que comprende Cop 1 para neuroprotección, esta es siempre posterior a la activación primaria con Cop 1, preferentemente en coadyuvante. Así, puede usarse Cop 1 oral para reforzar la actividad de las células T después de la activación primaria con Cop 1. En consecuencia, la composición y su modo de acción y neuroprotección son nuevos, tanto desde el punto de vista práctico como conceptual. No sería evidente para un experto normal en la técnica, familiarizado con el uso de Cop 1 para suprimir o desactivar la reactividad de células T contra antígenos de mielina, usar Cop 1 de una manera destinada específicamente a activar células T dirigidas específicamente contra antígenos de mielina por su efecto beneficioso en neuroprotección, incluyendo mejorar el proceso degenerativo provocado por enfermedades autoinmunitarias. Las células T activadas con Cop 1 pueden usarse también para la preparación de un medicamento para mejorar el proceso degenerativo provocado por neoplasias, sin usar procedimientos de inmunoterapia. Las células T activadas con Cop 1 se acumularán en el sitio de la degeneración neural y facilitarán la inhibición de esta
degeneración.

(4) Formulaciones y administración

Las composiciones farmacéuticas para ser usadas de acuerdo con la presente invención pueden formularse de una manera convencional usando uno o más vehículos o excipientes aceptables fisiológicamente. El vehículo o los vehículos han de ser "aceptables" en el sentido de ser compatibles con los demás ingredientes de la composición y no nocivos para el receptor de la misma. Los siguientes ejemplos de vehículos, modos de administración, formas de dosificación, etc., se exponen como posibilidades conocidas a partir de las cuales los vehículos, modos de administración, formas de dosificación, etc., pueden ser seleccionados para ser usados con la presente invención. Los profesionales con una experiencia normal en la técnica entenderán, sin embargo, que cualquier formulación dada y modo de administración elegido debe ser primeramente ensayado para determinar que consigue los resultados deseados. Así, por ejemplo, cuando el principio activo es Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1, la formulación y modo de administración en particular han de permitir que el principio activo actúe como una vacuna aumentando las células T activadas contra el mismo in vivo. Si no se obtiene tal respuesta inmunitaria, entonces la formulación y modo de administración en particular no deben ser usados de acuerdo con la presente invención.

Del mismo modo, si el principio activo es células T activadas, entonces la formulación y el modo de administración en particular han ser ensayados para asegurarse de que las células T activas que se están administrando alcanzan el torrente circulatorio en un estado activo, de forma que puedan buscar el sitio de la lesión en el SNC de acuerdo con la presente invención.

El término "vehículo" se refiere a un diluyente, coadyuvante, excipiente o portador con el que se administra la composición farmacéutica. Los vehículos en la composición farmacéutica pueden comprender un aglutinante tal como celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona (polividona o povidona), goma tragacanto, gelatina, almidón, lactosa o lactosa monohidrato; un agente desintegrante tal como ácido algínico, almidón de maíz y similares; un agente lubricante o tensioactivo, tal como estearato de magnesio, o laurilsulfato sódico; un agente de deslizamiento tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; y/o un agente saborizante tal como menta, salicilato de metilo o sabor a naranja.

Los métodos de administración incluyen las vías parenteral, p. ej,. intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, mucosal (p. ej. oral, intranasal, bucal, vaginal, rectal, intraocular), intratecal, tópica e intradérmica. La administración puede ser sistémica o local.

Para administración oral, el preparado farmacéutico puede estar en forma líquida, por ejemplo soluciones, jarabes o suspensiones, o puede presentarse como producto con el fármaco para ser reconstituido con agua o con otro vehículo adecuado antes de ser usado. Tales preparados líquidos pueden obtenerse por medios convencionales con aditivos aceptables farmacéuticamente tales como agentes de suspensión (p. ej. jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (p. ej. lecitina o acacia); vehículos no acuosos (p. ej. aceite de almendras, ésteres oleosos o aceites vegetales fraccionados); y agentes de conservación (p. ej. metil o propil-p-hidroxibenzoatos o ácido sórbico). Las composiciones farmacéuticas pueden tomar la forma, por ejemplo, de comprimidos o cápsulas preparados por medios convencionales con excipientes aceptables farmacéuticamente tales como agentes aglutinantes (p. ej. almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropil metilcelulosa); cargas (p. ej. lactosa, celulosa microcristalina o hidrógeno fosfato cálcico); lubricantes (p. ej. estearato de magnesio, talco o sílice); agentes desintegrantes (p. ej. almidón de patata o glicolato de almidón sódico); o agentes humectantes (p. ej. laurilsulfato sódico). Los comprimidos pueden ser recubiertos por métodos conocidos en la técnica.

Los preparados para administración oral pueden ser formulados adecuadamente para dar la liberación controlada del compuesto activo.

Para administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas formuladas de manera convencional.

Las composiciones pueden formularse para administración parenteral mediante inyección, p. ej. por inyección en bolo o infusión continuada. Las formulaciones para inyección pueden ser presentadas en forma de dosificación unitaria, p. ej., en ampollas o en recipientes multidosis, con un agente conservante incorporado. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para la reconstitución con un vehículo adecuado, p. ej. agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso.

Las composiciones pueden también formularse en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, conteniendo p. ej. bases de supositorios convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.

Para la administración por inhalación, las composiciones para ser usadas de acuerdo con la presente invención se suministran convenientemente en forma de una presentación para pulverización en aerosol a partir de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado, p. ej. diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Pueden formularse cápsulas y cartuchos de, p. ej., gelatina, para ser usadas en un inhalador o insuflador, que contienen una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón.

En una realización preferida, las composiciones que comprenden células T activadas con Cop 1, un Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1, se formulan de acuerdo con procedimientos de rutina como composiciones farmacéuticas adaptadas para administración intravenosa a seres humanos. Típicamente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en un tampón acuoso isotónico estéril. En caso necesario, la composición puede incluir también un agente solubilizante y un anestésico local tal como lignocaína para aliviar el dolor en el sitio de la inyección. Generalmente, los ingredientes se suministran bien sea por separado o bien mezclados entre sí. Cuando la composición se va a administrar por infusión, puede ser dispensada con un frasco para infusión que contiene agua o solución salina estéril de calidad farmacéutica. Cuando la composición se va a administrar por inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua o solución salina estéril para inyección de forma que los ingredientes pueden mezclarse antes de la administración.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1 pueden opcionalmente ser administradas con un coadyuvante en la forma habitual para inmunización. Los ejemplos no limitantes de tales coadyuvantes incluyen alumbre y coadyuvante de Freund incompleto. Otras formas de mejorar la inmunogenicidad del péptido o polipéptido administrado incluyen la administración en forma de un agregado o complejo con albúmina o con otros vehículos, todos ellos bien conocidos por los profesionales con experiencia normal en la técnica de las vacunas. Las emulsiones lipídicas metabolizables, tales como Intralipid o Lipofundin, pueden usarse también como vehículos para la terapia con Cop 1 de la manera descrita en el documento WO 97/02016. Aunque se sabe que estos materiales provocan un desplazamiento de citocina TH1 a TH2, no hay razón alguna para creer que las citocinas TH2 no sean operables, y quizás incluso preferibles, para los propósitos de la presente inven-
ción.

Cuando el Cop 1 se introduce oralmente, puede mezclarse con otras formas de alimento y consumirse en suspensión sólida o semisólida, o en forma de emulsión; y puede mezclarse con vehículos aceptables farmacéuticamente, incluyendo agua, agentes de suspensión, agentes emulsionantes, potenciadores del sabor, y similares. En una realización, la composición oral está recubierta entéricamente. El uso de recubrimientos entéricos es bien conocido en la técnica. Por ejemplo, Lehman (1971) enseña recubrimientos entéricos tales como Eudragit S y Eudragit L. El texto Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2ª ed., enseña también aplicaciones del Eudragit S y del Eudragit L. Un Eudragit que puede ser usado en la presente invención es el L30D55.

El Cop 1 puede también ser administrado nasalmente en algunas de las formas antes mencionadas por inhalación o mediante gotas nasales. Además, la inhalación oral puede emplearse para suministrar Cop 1 a los revestimientos mucosales de la tráquea y los pasajes bronquiales.

La invención describe también un envase o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes rellenados con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención.

En una realización preferida, se prevé que las composiciones farmacéuticas de la invención se administren a un mamífero, preferentemente un ser humano, poco después de la lesión o de la detección de una lesión degenerativa en el SN. Los usos terapéuticos de la invención pueden comprender la administración de células T activadas con Cop 1, o de Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1, o cualquier combinación de los mismos. Cuando se usa una terapia de combinación, el Cop 1 puede ser administrado antes, al mismo tiempo o después de la administración de las células T activadas con Cop 1.

En una realización, las composiciones de la invención son adecuadas para ser administradas en combinación con uno o más de los siguientes: (a) fagocitos mononucleares, preferentemente monocitos cultivados (como se describe en la publicación PCT nº WO 97/09985, que se incorpora al presente texto como referencia en su totalidad), que han sido estimulados para mejorar su capacidad para promover la regeneración neuronal; (b) un factor neurotrófico tal como factor de crecimiento de fibroblastos ácido; y (c) una sustancia terapéutica anti-inflamatoria (esto es, un esteroide antiinflamatorio, tal como dexametasona o metilprednisolona, o un péptido anti-inflamatorio no esteroide, tal como Thr-Lys-Pro (TKP)).

En otra realización, células fagocito mononucleares de acuerdo con la publicación PCT nº WO 97/09985 y la solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 09/041.280, presentada el 11 de marzo de 1998, son inyectadas en el sitio de la lesión dentro del SNC, bien sea al mismo tiempo, antes de o después de la administración parenteral de células T activadas con Cop 1, Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1.

En otra realización, de células T activadas con Cop 1, Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1, pueden ser administrados como dosis individual o pueden repetirse, preferentemente en intervalos de 2 semanas y después en intervalos sucesivamente más largos una vez al mes, una vez al trimestre, una vez cada seis meses, etc. El curso del tratamiento puede durar varios meses, varios años, u ocasionalmente puede ser durante toda la vida del individuo, dependiendo de la condición que se esté tratando. En el caso de una lesión del SNC, el tratamiento puede oscilar entre varios días y unos meses o incluso años, hasta que la condición se haya estabilizado y no haya riesgo, o éste sea tan solo limitado, de desarrollo de degeneración secundaria. En la enfermedad humana crónica o la enfermedad de Parkinson el tratamiento terapéutico de acuerdo con la invención puede ser para toda la
vida.

Como será evidente para los expertos en la técnica, el efecto terapéutico depende a veces de la condición o enfermedad a tratar, de la edad y el estado de salud del individuo, de otros parámetros físicos (p. ej. sexo, peso, etc.) del individuo, así como de otros diversos factores, p. ej. si el individuo está tomando otros fármacos, etc.

La dosis óptima de las composiciones terapéuticas que comprenden células T activadas con Cop 1 de la presente invención es proporcional al número de fibras nerviosas afectadas por la lesión o la enfermedad del SN en el sitio que se está tratando. En una realización preferida, los intervalos de dosis de aproximadamente 5 x 10^{6} a aproximadamente 10^{7} células para tratar una lesión que afecta a aproximadamente 10^{5} fibras nerviosas, tal como una sección transversal completa del nervio óptico de la rata, e intervalos de aproximadamente 10^{7} a aproximadamente 10^{8} células para tratar una lesión que afecta a aproximadamente 10^{6}-10^{7} fibras nerviosas, tal como la sección transversal completa de un nervio óptico humano. Como será evidente para un experto en la técnica, la dosis de células T pueden escalarse hacia arriba o hacia abajo en proporción al número de fibras nerviosas que se suponen afectadas en el sitio de la lesión que se está tratando.

(5) Establecimiento de bancos de celulas autólogas para linfocitos T

Para minimizar los daños secundarios después de una lesión nerviosa, los pacientes pueden ser tratados administrando un medicamento que comprende linfocitos T autólogos o semialogénicos sensibilizados contra Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1. Como la ventana de oportunidad no ha sido aún definida con precisión, la terapia debe administrarse lo antes posible después de la lesión primaria para maximizar las probabilidades de éxito, preferentemente dentro del plazo de aproximadamente una semana.

Para salvar la diferencia entre el tiempo requerido para la activación y el tiempo necesario para el tratamiento, puede establecerse un banco con depósitos personales de linfocitos T autólogos preparados para uso futuro para una terapia neuroprotectora frente a la degeneración secundaria en caso de una lesión del SN. Los linfocitos T se aíslan de la sangre y después se sensibilizan contra Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1. Después se congelan las células y se almacenan adecuadamente bajo el nombre de la persona, su número de identidad y grupo sanguíneo, en un banco de células hasta que se necesiten.

Adicionalmente, células troncales autólogas del SNC pueden ser procesadas y almacenadas para su uso potencial por un paciente concreto en el caso de trastornos traumáticos del SN, tales como isquemia o lesión mecánica, así como para condiciones neurodegenerativas tratadas tales como la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson. Alternativamente, las células T semi-alogénicas o alogénicas pueden almacenarse congeladas en bancos para su uso por cualquier individuo que comparta una molécula del MHC tipo II con la fuente de células T.

Los ejemplos que siguen ilustran ciertas características de la presente invención.

(6) Ejemplos Materiales y métodos para los Ejemplos 1 y 2

Animales. Las ratas Lewis adultas hembras consanguíneas (8 a 12 semanas de edad) fueron suministradas por el Animal Breeding Center del Weizmann Institute of Science. Las ratas se albergaron en una sala con luz y temperatura controladas y se emparejaron por edad en cada experimento. Los animales fueron tratados de acuerdo con las regulaciones formuladas por el IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee: Comisión internacional para la atención y el uso de los animales).

Antígenos. La Proteína Básica de Mielina (MBP) de las médulas espinales de cobayas y la ovoalbúmina (OVA) fueron adquiridos de Sigma (St. Louis, Mo.) El Cop 1 usado en los presentes ejemplos fue el producto COPAXONE® de Teva Pharmaceuticals (Israel), producto que fue obtenido comercialmente.

Anticuerpos. El receptor de células T (TCR) monoclonal anti rata de ratón fue proporcionado gentilmente por el Dr. Boris Reizis. La IgG anti ratón de cabra, conjugada con Cy-3 (con mínima reacción cruzada contra proteínas de suero de rata, humano, bovino y equino), fue adquirida de Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA).

Líneas de células T. Las líneas de células T fueron generadas a partir de células de ganglios linfáticos drenantes obtenidas de ratas Lewis inmunizadas con los antígenos anteriores (Ben-Nun et al., 1981a). El antígeno se disolvió en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (1 mg/ml) y se emulsionó con igual volumen de coadyuvante de Freund incompleto (IFA) (Difco Laboratories, Detroit, MI) suplementado con 4 mg/ml de Mycobacterium tuberculosis (Difco). Diez días después se inyectó el antígeno en las pezuñas de las patas traseras de las ratas en 0,1 mL de la emulsión, se sacrificaron las ratas y sus ganglios linfáticos drenantes se extirparon quirúrgicamente y se disociaron. Las células se lavaron y se activaron con el antígeno (10 \mug/ml) en medio para estimulación que contiene medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con L-glutamina (2 mM), 2-mercaptoetanol (5 x 10^{-5}), piruvato sódico (1 mM), penicilina (100 UI/mL), estreptomicina (100 \mug/mL), aminoácidos no esenciales (1 mL/100 mL) y suero autólogo al 1% (volumen/volumen). Después de incubar durante 72 horas a 37ºC, 98% de humedad relativa y 10% de CO_{2}, las células se transfirieron a medio para propagación consistente en DMEM, L-glutamina, 2-mercaptoetanol, piruvato sódico, aminoácidos no esenciales y antibióticos en las mismas concentraciones que antes, con la adición de 10% de suero de ternera fetal (FCS) (v/v) y 10% de factor de crecimiento de las células T derivado del sobrenadante de células esplénicas estimuladas con concanavalina A (conA) (Gillis et al., 1978). Las células se desarrollaron en medio para propagación durante 4-10 días antes de ser re-estimuladas con su antígeno (10 \mug/mL) en presencia de células de timo (10^{7} células/mL) irradiadas (2000 rad) en medio para estimulación. Las líneas de células T fueron expandidas por estimulación y propagación repetidas (Ben-Nun et al.,
1982).

Lesión por aplastamiento del nervio óptico. El nervio óptico fue sometido a lesión por aplastamiento como se describió anteriormente (Duvdevani et al., 1990). Brevemente expuesto, las ratas fueron anestesiadas profundamente mediante inyección intraperitoneal (i.p.) de Rompun (xilazina, 10 mg/kg; Vitamed, Israel) y Vetalar (cetamina, 50 mg/kg; Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, IA). Usando un microscopio quirúrgico binocular, se llevó a cabo una cantotomía lateral en el ojo derecho, y la conjuntiva fue cortada lateralmente a la córnea. Después de la separación de los músculos retractores del globo, el nervio óptico fue expuesto extraorbitalmente mediante disección cerrada. Usando pinzas de acción cruzada calibradas, el nervio óptico se sometió a una lesión por aplastamiento a 1-2 mm del ojo. Se inflingieron lesiones por aplastamiento leves y graves para experimentos a corto plazo (dos semanas), ya que se observó que este periodo de tiempo era óptimo para demostrar la degeneración secundaria y su respuesta al tratamiento (Yoles, 1998). El nervio contralateral no lesionado se dejó inalterado.

Medida de la degeneración secundaria mediante marcaje retrógrado de células ganglionares retinianas. La degeneración secundaria de los axones del nervio óptico y sus células ganglionares retinianas (RGCs) unidas se midió después de la aplicación, posterior a la lesión, del colorante lipofílico fluorescente, yoduro de 4-(4-(didecilamino)estiril)-N-metilpiridinio (4-Di-10-Asp) (Molecular Probes Europe BV, Holanda), distalmente al sitio de la lesión, dos semanas después de la lesión por aplastamiento. Como solamente los axones que están intactos pueden transportar el colorante de nuevo a sus cuerpos celulares, la aplicación del colorante distalmente al sitio de la lesión después de dos semanas asegura que solamente se contarán los axones que han sobrevivido tanto al daño primario como a la degeneración secundaria. Este planteamiento permitió la diferenciación entre las neuronas que están aún funcionalmente intactas y las neuronas en las que los axones están lesionados pero los cuerpos celulares son todavía viables, porque solamente aquellas neuronas cuyas fibras están morfológicamente intactas puede absorber colorante aplicado distalmente al sitio de la lesión y transportarlo a sus cuerpos celulares. Usando este método, el número de RGCs marcadas refleja de un modo fiable el número de neuronas aún en funcionamiento. El marcaje y la medida se llevaron a cabo de la forma siguiente: el nervio óptico derecho fue expuesto por segunda vez, de nuevo sin dañar el suministro sanguíneo retiniano. Se llevó a cabo la axotomía completa a 1-2 mm del borde distal del sitio de la lesión y se depositaron cristales sólidos (de 0,2 a 0,4 mm de diámetro) de 4-Di-10-Asp en el sitio de la axotomía recién formada. Cinco días después de la aplicación del colorante, las ratas fueron sacrificadas. La retina se separó del ojo, se preparó en forma de montaje completo plano en solución de paraformaldehído al 4%, y se examinó para observar RGCs marcadas mediante microscopía de fluorescencia.

Ensayo inmunoabsorbente ligado a una enzima. Las células T anti MBP se desarrollaron durante una semana en un medio para propagación, después se lavaron con PBS y se resuspendieron en medio para estimulación. Las células T (0,5 x 10^{6} células/mL) se incubaron, en presencia de timocitos irradiados (10^{7} células/mL), con ConA (1,25 \mug/mL) o con antígeno MBP (10 \mug/mL), o con antígeno Cop 1 (10 \mug/mL), o con antígeno OVA (10 \mug/mL), o sin antígeno, en medio para estimulación a 37ºC, 98% de humedad relativa y 10% de CO_{2}. Además, se incubaron timocitos irradiados (10^{7} células/mL) solos, en medio para estimulación. Al cabo de 48 horas, las células se centrifugaron y sus sobrenadantes se recogieron y se muestrearon. Las concentraciones de neurotrofina (NT)-3, factor de crecimiento de los nervios (NGF) y NT-4/5 en las muestras se determinaron utilizando kits de ensayo inmunoabsorbente ligado a una enzima de tipo sándwich (ELISA) (Promega, Madison, WI) y por comparación con una NT patrón (medida de la absorbancia a 450 nm usando un lector de ELISA). Las concentraciones de factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) en las muestras se determinaron con un ELISA tipo sándwich sensible. De forma resumida, placas de fondo plano de 96 pocillos fueron recubiertas con un anticuerpo BDNF anti-humano de pollo (Promega, Madison, WI) en NaHCO_{3} 0,025 M y Na_{2}CO_{3} 0,025 M (pH 8,2). Se usó BDNF humano recombinante (utilizado como patrón; Research Diagnostics, Flanders, NJ) en diluciones en serie en solución bloqueante que contiene 3% de albúmina de suero bovino (BSA), 0,05% de monolaurato de polioxietilen-sorbitán (Tween 20) y 1% de FCS en PBS (pH 8,2). El BDNF no unido se detectó incubando las placas con un anticuerpo BDNF anti-humano de ratón (Research Diagnostics) y después con IgG anti-ratón de cabra, conjugada con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) en solución de bloqueo. Las placas se desarrollaron usando un sistema de sustrato líquido de 3,3',5,5'-tetrametil-bencidina (Sigma, St. Louis, MO). La reacción se detuvo añadiendo H_{3}PO_{4} 1M, y se determinó la densidad óptica a 450 nm. Los resultados para cada experimento se calcularon como la cantidad de NT segregada por mL de muestra, después de restar los niveles de fondo de los timocitos irradiados incubados con el medio para
estimulación.

Inmunohistoquímica. Criosecciones longitudinales (de 10 \mum de espesor) de los nervios fueron recogidas sobre portaobjetos de vidrio recubiertos con gelatina, y congelados hasta su preparación para tinción por fluorescencia. Las secciones se fijaron en etanol durante 10 minutos a temperatura ambiente, se lavaron dos veces con agua bidestilada y se incubaron durante tres minutos en PBS que contiene 0,05% de Tween-20. Las secciones se incubaron después durante una hora a temperatura ambiente con anticuerpos monoclonales anti-rata de ratón contra TCR (Hunig, 1989) diluidos en PBS que contiene 3% de FCS y 2% de BSA. Después se lavaron las secciones 3 veces con PBS que contiene 0,05% de Tween 20 y se incubaron con IgG anti-ratón de cabra, conjugada con Cy3 (con mínima reacción cruzada para proteínas de suero de rata, humano, bovino y equino; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) durante 1 h a temperatura ambiente. Las secciones se lavaron con PBS que contiene Tween 20 y se trataron con glicerol que contiene 1,4-diazobiciclo-(2,2,2)octano para inhibir el apagado de la fluorescencia. Las secciones se visualizaron con un microscopio de fluorescencia Zeiss Universal.

Ejemplo 1 Neuroproteccion por celulas T anti-Cop 1 La transferencia adoptiva de células T reactivas contra Cop 1 es neuroprotectora en el nervio óptico lesionado

En un estudio previo en el laboratorio de los presentes inventores, se demostró que, después de un traumatismo agudo del SNC de la rata, la transferencia pasiva de células T encefalitogénicas específicas para autoantígenos del SNC tales como MBP previene la diseminación de los daños y detiene así la degeneración secundaria (véase el documento WO 99/60021). Aquí, se demuestra el efecto neuroprotector de las células T reactivas a Cop 1, las cuales células T, a diferencia de las células T reactivas a MBP, no son encefalitogénicas. Inmediatamente después de una lesión del nervio óptico leve (Fig. 1A) o grave (Fig. 1B), se inyectó a las ratas PBS en IFA o células T específicas de Cop 1 en IFA. Para evaluar la degeneración secundaria, se aplicó el colorante neurotrazador 4-Di-10-Asp al nervio óptico distalmente al sitio de la lesión, dos semanas después de dicha lesión. Al cabo de cinco días, las ratas fueron sacrificadas y sus retinas se extirparon y se dispusieron en montaje plano. Las RGCs marcadas (supervivientes) de cuatro campos situados a aproximadamente la misma distancia del disco óptico en cada retina, se contaron bajo un microscopio de fluorescencia. Los resultados se muestran en las Figs. 1A y 1B. El efecto neuroprotector de las células T reactivas para Cop 1 comparado con el de la PBS fue significativo tanto para la lesión por aplastamiento leve (P < 0,005, prueba de la t de Student) como para la lesión por aplastamiento grave (P < 0,05, prueba de la t de Student). Los resultados son el resumen de tres experimentos. Cada grupo contenía de 6 a 10 ratas.

Las células T reactivas para Cop 1 se acumulan tanto en los tejidos neuronales lesionados como en los no lesionados

El laboratorio de los presentes inventores ha mostrado previamente que la transferencia pasiva de células T anti-MBP a ratas lesionadas por aplastamiento viene seguida por una acumulación masiva de las células T inyectadas en el sitio de la lesión. La transferencia pasiva de células T reactivas para Cop 1 en el presente estudio produjo también una significativa acumulación de las células T inyectadas en el sitio de la lesión en relación con la acumulación de células T anti-MBP endógenas en las ratas lesionadas tratadas con PBS. La acumulación de células T en las ratas tratadas con Cop 1 fue máxima el día 7 después de la inyección. Estos hallazgos estaban en línea con los resultados anteriores con líneas de células T inyectadas de especificidades diferentes. En ese estudio, la acumulación de células T en el sitio de la lesión en nervios lesionados fue no selectiva, al contrario que con nervios no lesionados, en los que se encontró que solamente se acumulaban células T específicas para autoantígenos del SNC. Por consiguiente, la acumulación de células T contra Cop 1 en el nervio dañado no proporciona ninguna indicación de reconocimiento cruzado con cualquiera de las proteínas del SNC residentes, y por tanto de actividad. Sin embargo, las células T contra Cop 1, al igual que las células T contra MBP, sí que se acumularon en el nervio no lesionado, a diferencia de las células T contra OVA (resultados no mostrados). Aunque había menos acumulación de células T reactivas contra Cop 1 que de células T específicas para MBP, estos hallazgos apoyan más la noción de reactividad cruzada entre Cop 1 y MBP in vivo.

Perfiles de citocina y neurotrofina de líneas de células T inyectadas, específicas contra MBP y contra Cop 1

Los sobrenadantes de células T no estimuladas o de células T estimuladas durante 48 horas con mitógeno ConA, o antígeno MBP, o antígeno Cop 1 en medio para estimulación, fueron sometidos a ELISA de tipo sándwich. Los medios cultivados que contienen los productos segregados por estas células fueron recogidos, y sus contenidos de citocina fueron determinados cuantitativamente mediante un ELISA. Los resultados se muestran en la Tabla 2. Las células T activadas segregaron cantidades mucho mayores de citocinas que las células T no estimuladas. Las células T estimuladas con MBP expresaron preferentemente la citocina INF específica de Th1, mientras que las células T estimuladas con Cop 1 expresaron preferentemente la citocina IL-10 específica de Th2. Las mayores cantidades de citocinas segregadas fueron detectadas en los sobrenadantes de células T estimuladas con ConA
(Tabla 2).

TABLA 2

	Estado de	Estimulación	Estimulación	Estimulación
	reposo	con MBP	con Cop 1	con ConA
	Tmbp	Tcop	Tmbp	Tcop	Tmbp	Tcop	Tmbp	Tcop
IFN-\gamma	725	6645	15692	925	7242	11825	22758	22525
(pgr/ml)
IL-10	41	382	1941	13	365	7244	3565	6503
(pgr/ml)

La regulación por incremento de la expresión neurotrófica y la secreción por células T activadas con sus antígenos específicos fue recientemente demostrada en el laboratorio de los presentes inventores. En un intento de obtener una idea acerca del mecanismo que subyace en la neuroprotección mediada por células T, los sobrenadantes de las células en el presente estudio fueron sometidos a ELISA para determinar los perfiles de neurotrofina (NT) de células T responsables de la neuroprotección. Las células T estimuladas con Cop 1 segregaron tanto NGF como NT-4/5, pero en menores cantidades que las segregadas por las células T anti MBP. En relación con la producción por células anti MBP, la producción de NT-3 por las células T estimuladas con Cop 1 fue insignificante; sin embargo, la producción de BDNF fue masiva (Fig. 2A). Así pues, las células T estimuladas con Cop 1 produjeron menores cantidades de todos los factores neurotróficos examinados, con la notable excepción de BDNF (Fig. 2A). Cuatro determinaciones independientes de las cantidades de NT-3 y BDNF segregados por las células T estimuladas diferencialmente dieron resultados similares. En cada caso, las células T estimuladas con Cop 1 produjeron aproximadamente 2,5 veces más BDNF que las células T anti MBP, y solamente un 10% de las cantidades de NT-3 (Fig. 2B).

Ejemplo 2 Vacunación con Cop 1 La vacunación con Cop 1 protege las fibras del nervio óptico de la degeneración secundaria

Se pretende que este ejemplo muestre que la vacunación con Cop 1 en IFA, con un refuerzo administrado dos días más tarde, tiene por resultado una respuesta inmunitaria suficientemente fuerte para la neuroprotección dentro del margen de tiempo crítico. Las ratas anestesiadas fueron sometidas a una lesión leve por aplastamiento del nervio óptico, inmediatamente se vacunaron con Cop 1 en IFA, y se les administró un refuerzo dos días más tarde. Después de dos semanas, las RGCs fueron objeto de marcaje retrógrado y, cinco días más tarde, las ratas fueron sacrificadas y sus retinas se extirparon. Las ratas vacunadas con Cop 1 en IFA mostraron evidencia de neuroprotección significativa en comparación con la de las ratas testigo a las que se inyectó PBS en IFA (Fig. 3).

Ejemplo 3 Protección contra la toxicidad del glutamato

Experimento 1

La vacunación con Cop 1 protege las fibras del nervio óptico frente a la toxicidad del glutamato

A causa de la prometedora neuroprotección de los nervios lesionados que se obtiene mediante la inmunización con Cop 1, es importante establecer si la protección podría restringirse a los daños nerviosos causados por un traumatismo, o si sería una neuroprotección más general frente a las condiciones de un entorno hostil causadas por la toxicidad inducida por el glutamato. En consecuencia, se llevó a cabo el experimento siguiente.

Inmunización. Ratones C57B1/6J OLA (de 8 a 10 semanas de edad) fueron inyectados cada uno de ellos con un total de 75 \mug de Cop 1 emulsionado con un volumen igual de coadyuvante de Freund completo (CFA) que contiene 5 mg/mL de micobacteria H37 RA (Difco). Los ratones de un segundo grupo fueron inyectados con una emulsión de solución salina tamponada con fosfato (PBS) con CFA. La emulsión, en un volumen total de 0,1 mL, fue inyectada intradérmicamente diez días antes de introducir el glutamato en la retina.

Toxicidad del glutamato. Diez días después de la inmunización, los ratones fueron anestesiados y se inyectó 1 \muL de solución salina que contiene 200 nmoles de glutamato en el humor vítreo del ojo derecho. El ojo izquierdo no fue inyectado y sirvió como testigo.

Marcaje de las células ganglionares retinianas. Tres días (72 horas) antes de la evaluación de la supervivencia de las RGC, cada ratón fue anestesiado y puesto en un dispositivo estereotáctico. El cráneo fue expuesto y mantenido seco y limpio. El bregma fue identificado y marcado. El punto de inyección designado fue a una profundidad de 2 mm desde la superficie del cerebro, 2,92 mm detrás del bregma en el eje anteroposterior, y 0,5 mm lateral a la línea media. Se taladró una ventana en el pericráneo por encima de las coordenadas designadas en los hemisferios derecho e izquierdo. Después se aplicó el colorante neurotrazador FluoroGold (solución al 4% en solución salina; Fluorochrome, Denver, CO) (1 \muL, a razón de 0,5 \muL/min) usando una jeringuilla Hamilton.

Evaluación de la supervivencia de las RGC. Siete días después de la administración del glutamato, los ojos fueron enucleados y sus retinas se separaron y se prepararon como montajes completos planos en solución de paraformaldehído al 4%. Las células marcadas de seis a ocho campos de idéntico tamaño (0,078 mm^{2}), situados aproximadamente a 1 mm del disco óptico, fueron contadas bajo el microscopio de fluorescencia, y promediadas. Los resultados se muestran en la Fig. 4. Se encontró que la toxicidad del glutamato era aproximadamente cuatro veces más alta en los testigos que en los ratones inmunizados con Cop 1.

Experimento 2

Vacunación para la protección de las neuronas contra la toxicidad del glutamato e hipertensión ocular

En este estudio, se muestra que la inmunización activa o pasiva con un péptido derivado de la glicoproteína del oligodendrocito mielina (MMOG) o con MBP, que proporciona una neuroprotección efectiva después de una lesión axónica (Moalem et al., 1999a; Moalem et al., 1999b y Fisher et al., 2000), no protege a las neuronas frente a la toxicidad causada por el glutamato. La protección frente a la toxicidad del glutamato se consiguió, sin embargo, mediante vacunación con Cop 1. Se demostró además que la inmunización con Cop 1 proporciona una protección altamente eficaz frente a la muerte de las células ganglionares retinianas inducida por la hipertensión ocular en el modelo de glaucoma en ratas, bajo condiciones en las que la presión se mantiene elevada y no es afectada por la inmunización.

Materiales y métodos

Animales. Todos los animales fueron tratados de acuerdo con las reglamentaciones formuladas por el Institutional Animal Care and Use Commitee. Los ratones de las cepas C57BL/6J y Balb/c, de 8 a 13 semanas de edad, y las ratas Lewis adultas consanguíneas, de 8 a 12 semanas de edad, fueron suministrados por el Animal Breeding Center del Weizmann Institute of Science, y se albergaron en salas con luz y temperatura controladas. Las ratas se emparejaron por edad y tamaño en cada experimento. Antes de su uso en los experimentos, los animales fueron anestesiados mediante administración intraperitoneal de 80 mg/kg de cetamina y 16 mg/kg de xilazina.

Antígenos. El Cop 1 fue adquirido de Teva Pharmaceuticals (Petah Tikva, Israel). El péptido (pMOG) de glicoproteína de la mielina de los oligodendrocitos (MOG) 1-22 (GQFRVIGPGHPIRALVGDEAEL) (SEC ID No: 33) fue sintetizado en el laboratorio del Prof. M. Fridkin en el Departamento de Química del Weizmann Institute of Science, usando la técnica Fmoc con un sintetizador de péptidos múltiple automático (AMS422, Abimed, Langenfeld, Alemania). La MBP de la médula espinal de cobayas fue adquirida de Sigma (Israel).

Inmunización. Los ratones o las ratas fueron inmunizados con 75 \mug o 100 \mug de Cop 1, respectivamente, o 300 \mug de pMOG emulsionado con igual volumen de coadyuvante de Freund completo (CFA) que contiene 0,5 o 5 mg/mL de Mycobacterium tuberculosis. La emulsión (volumen total 0,15 ml) fue inyectada subcutáneamente en el sitio 1 en el costado. Una semana más tarde, se administró a los ratones inmunizados con pMOG una inmunización idéntica en el otro costado como refuerzo. A los ratones testigo se les inyectó solución salina tamponada con fosfato (PBS) en CFA (Difco, Detrit, Michigan, USA).

Lesión por aplastamiento del nervio óptico. Los ratones o las ratas fueron anestesiados y sometidos a una lesión grave en la porción intraorbital del nervio óptico, a 1-2 mm del globo ocular. Con ayuda de un microscopio quirúrgico binocular, se cortó la conjuntiva y se expuso el nervio óptico. Usando pinzas calibradas de acción cruzada y poniendo un cuidado especial para no interferir con el aporte sanguíneo, el nervio fue aplastado durante 2 s (ratones) o 30 s (ratas).

Inyecciones de glutamato y NMDA. El ojo derecho del ratón o la rata anestesiados fue punzado con una aguja de calibre 27 en la parte superior de la esclerótica, y se introdujo una jeringuilla Hamilton de 10 \muL con una aguja de calibre 30 hasta el cuerpo vítreo. Se inyectó a los ratones un volumen total de 1 \muL (200 nmoles) de L-glutamato o 1 \muL de N-metil-D-aspartato (NMDA; 75 nmoles; RBI, Boston, MA) disueltos en solución salina. Se inyectó a las ratas 2 \muL (375 nmoles) de L-glutamato.

Aplicación previa a la lesión de colorante estereotáctico en ratones. El cráneo fue expuesto y se mantuvo seco y limpio usando peróxido de hidrógeno al 15%. El bregma fue identificado y marcado. Se perforó un orificio por encima del colículo superior de cada hemisferio (0,292 mm por detrás y 0,05 mm lateralmente al hemisferio). Usando un dispositivo de medida estereotáctico y un inyector Hamilton, se inyectó a los ratones FluoroGold (al 5% en solución salina, Fluorochrome, Denver, CO; 1 \muL) en el punto 1 en el colículo superior de cada hemisferio, a una profundidad de 0,16 mm o 0,175 mm (dependiendo de la cepa del ratón) desde la superficie ósea del cerebro. Después de completar la inyección, la herida fue suturada. La absorción retrógrada del colorante proporciona un marcador de las células vivas.

Evaluación de la superviviencia de las células ganglionares retinianas en ratones. Se administró a los ratones un dosis letal de pentobarbitona (170 mg/kg). Los ojos fueron enucleados y las retinas se separaron y se prepararon como montajes completos planos en paraformaldehído (al 4% en PBS). Se contaron las células marcadas de 4-6 campos seleccionados de idéntico tamaño (0,7 mm^{2}). Los campos seleccionados estaban situados a aproximadamente la misma distancia del disco óptico (0,3 mm) para salvar la variación de la densidad de RGC en función de la distancia desde el disco óptico. Los campos se contaron bajo el microscopio de fluorescencia (800 aumentos) por observadores desconocedores del tratamiento recibido por el ratón. Se calculó el número medio de RGCs por campo en cada retina.

Evaluación de la supervivencia de las células ganglionares retinianas en ratas. La supervivencia de las RGCs en ratas se midió después de la aplicación, posterior a la lesión, del colorante lipofílico fluorescente yoduro de 4-(4-didecilamino)estiril)-N-metilpiridinio (4-Di-10-Asp) (Molecular Probes Europe BV, Holanda), distalmente a la papila óptica. El marcaje y la medida se llevaron a cabo como sigue: el nervio óptico se expuso sin dañar el aporte sanguíneo retiniano. Se realizó la axotomía completa 1-2 mm de la papila óptica y se depositaron cristales sólidos (0,2 a 0,4 mm de diámetro) de 4-Di-10-Asp en el sitio de la axotomía formada. Cinco días después de la aplicación del colorante, las ratas fueron sacrificadas. La retina se separó del ojo, se preparó como montaje completo plano en solución de paraformaldehído al 4%, y se examinaron para observar RGCs marcadas mediante microscopía de fluorescencia. En los animales de experimentación IOP, las células ganglionares fueron marcadas con dextrano tetrametilrodamina (DTMR) por transporte retrógrado (Molecular Probes, OR). Los cristales de DMTR de 3000 MW fueron aplicados al extremo cortado del nervio óptico aproximadamente a 2 ó 3 mm del globo. Veinticuatro horas más tarde, las retinas se montaron completas y las células ganglionares marcadas de 8 regiones, 2 en cada cuadrante (0,66 a 1,103 mm del borde del disco óptico), fueron contadas con 400 aumentos.

Generación de una línea de células T-Cop 1 de ratón. Se generó una línea de células T de ratón a partir de células de ganglios linfáticos drenantes obtenidos de ratones C57BL/6J inmunizados con antígeno Cop 1. El antígeno se disolvió en PBS (1 mg/mL) y se emulsionó en un volumen igual de CFA suplementado con 5 mg/mL de Mycobacterium tuberculosis (Difco). Diez días después de la inmunización en las pezuñas posteriores, los ratones fueron sacrificados y sus ganglios linfáticos drenantes fueron retirados quirúrgicamente y disociados. Las células se lavaron y se activaron con el antígeno (10 \mug/mL) en medio para estimulación que contiene RPMI suplementado con L-glutamina (2 mM), 2-mercaptoetanol (5 x 10^{-5} M), penicilina (100 unidades/mL), estreptomicina (100 \mug/mL) y suero autólogo al 5% (vol/vol). Después de la incubación durante 72 horas a 37ºC, 98% de humedad relativa y 10% de CO_{2}, las células fueron transferidas a medio para propagación consistente en RPMI suplementado con aminoácidos no esenciales (1 mL/100 mL), piruvato sódico (1 mM), L-glutamina, \beta-mercaptoetanol, penicilina y estreptomicina, en las mismas concentraciones que antes, con la adición de 5% de suero de ternera fetal (vol/vol) y 10% de factor de crecimiento de células T derivado del sobrenadante de células esplénicas estimuladas con concanavalina A. Las células se desarrollaron en medio para propagación durante 10 a 14 días antes de ser reestimuladas con su antígeno (10 \mug/mL) en presencia de células esplénicas (10^{7} células/mL) irradiadas (2500 rad), en medio para estimulación. La línea de células T fue expandida por estimulación y propagación repetidas. Básicamente la línea tiene un fenotipo similar al descrito anteriormente (Aharoni et al., 1997).

Generación de una línea de células T Cop 1 de rata. Se generaron líneas de células T a partir de células de ganglios linfáticos drenantes obtenidas de ratas Lewis inmunizadas con los antígenos anteriores. El antígeno se disolvió en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (1 mg/mL) y se emulsionó con un volumen igual de coadyuvante de Freund incompleto (IFA) (Difco Laboratories, Detroit, MI) suplementado con 4 mg/mL de Mycbacterium tuberculosis (Difco). Diez días después el antígeno se inyectó en las pezuñas posteriores de las ratas en 0,1 mL de la emulsión, las ratas fueron sacrificadas y sus ganglios linfáticos drenantes fueron extirpados quirúrgicamente y disociados. Las células se lavaron y se activaron con el antígeno (10 \mug/mL) en medio para estimulación que contiene medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con L-glutamina (2 mM), 2-mercaptoetanol (5 x 10^{-5}), piruvato sódico (1 mM), penicilina (100 UI/mL), estreptomicina (100 \mug/mL), aminoácidos no esenciales (1 mL/100 mL) y suero autólogo al 1% (volumen/volumen). Después de incubar durante 72 horas a 37ºC, 98% de humedad relativa y 10% de CO_{2}, las células se transfirieron a medio para propagación consistente en DMEM, L-glutamina, 2-mercaptoetanol, piruvato sódico, aminoácidos no esenciales y antibióticos en las mismas concentraciones que antes, con la adición de 10% de suero de ternera fetal (FCS) (v/v) y 10% de factor de crecimiento de las células T derivado del sobrenadante de células esplénicas estimuladas con concanavalina A (conA). Las células se desarrollaron en medio para propagación durante 4-10 días antes de ser re-estimuladas con su antígeno (10 \mug/mL) en presencia de células de timo (10^{7} células/mL) irradiadas (2000 rad) en medio para estimulación. Las líneas de células T fueron expandidas por estimulación y propagación repetidas.

Análisis histológico. Siete días después de la inyección de glutamato o de solución salina, los ratones fueron sacrificados mediante la inyección de una dosis letal de pentobarbitona (170 mg/kg) y sus ojos fueron extraídos y fijados en formaldehído (al 4% en PBS) durante 48 h a 4ºC. Las secciones (10 \mum de espesor) fueron incluidas en parafina y teñidas con hematoxilina y eosina (H&E).

Generación de hipertensión ocular en ratas/Elevación de la presión intraocular en ratas. Ratas Lewis macho fueron anestesiadas con una mezcla de cetamina (15 mg/kg), acepromazina (1,5 mg/kg) y xilazina (0,3 mg/kg). Se consiguió un aumento de la presión intraocular (IOP) mediante fotocoagulación con láser de las venas limbar y episcleral. Las ratas recibieron 2 tratamientos de láser, separados 1 semana, con un láser de argón azul-verde (1 watio durante 0,2 s, suministrando un total de 130-150 puntos de 50 \mum en los dos tratamientos; Coherent, Palo Alto, CA). La IOP se midió una vez por semana usando TONO-PEN (Mentor, Norwell, MA), después de inyectar a las ratas intramuscularmente el tranquilizante veterinario acepromazina 3,0 mg/kg y aplicar proparacaína al 0,5% tópicamente en los ojos para anestesiar la córnea.

Resultados

Los antígenos asociados con la mielina no son protectores contra la toxicidad del glutamato. El laboratorio del presente inventor ha demostrado anteriormente que la inmunización pasiva y activa con antígenos asociados a la mielina puede reducir la degeneración post-traumática asociada con la lesión por aplastamiento del nervio óptico en ratones y ratas (Ejemplos 1 y 2; Moalem et al., 1999, y Fischer et al., 2000) y con la lesión contusa de la médula espinal en ratas adultas (Hauben et al., 2000 a, y Hauben et al., 2000b). Para determinar si tal neuroprotección inmunitaria se ejerce también después de una lesión no mecánica, se examinó primero si la inmunización activa con antígenos asociados con la mielina o la transferencia pasiva de células T reactivas para estos antígenos proporciona neuroprotección contra la toxicidad inducida por la inyección intravítrea de glutamato. Los nervios ópticos de ratas y ratones fueron sometidos a lesión por aplastamiento. Usando protocolos establecidos para la protección inmunitaria por el laboratorio de los presentes inventores, se realizó la inmunización activa con péptidos derivados de MOG (Fischer et al., 2000) en ratones, y transferencia pasiva de células T anti-MBP en ratas (Moalem et al., 1999). La agresión del glutamato fue infligida mediante inyección intravítrea de glutamato a una concentración que, como se demostró con anterioridad, conduce a la muerte de las RGC, que puede medirse después de 1 semana tanto en los ratones como en las ratas (Yoles et al., 2000).

Los ratones fueron inmunizados con pMOG antes de la inyección intravítrea de glutamato (200 nmoles). Cuando se evaluó la tasa de superviviencia de las RGC 1 semana después de la inyección de glutamato, no pudo detectarse ninguna evidencia del efecto beneficioso de la inmunización con pMOG (Fig. 5A). Del mismo modo, no era detectable ningún efecto beneficioso cuando la inyección de glutamato fue seguida inmediatamente por la transferencia pasiva de células T anti-MBP en ratas (Fig. 5B). Así, aunque se demostró recientemente que la vacunación con pMOG(1-22) induce una respuesta neuroprotectora en los ratones después de la lesión por aplastamiento del nervio óptico (Fischer et al., 2000), no se observó tal neuroprotección en el presente estudio después de que los ratones vacunados con pMOG fueran sometidos a la agresión del glutamato.

Estos hallazgos conducen a los presentes inventores a considerar 2 posibilidades: o la pérdida de RGCs después de la toxicidad del glutamato no es susceptible para neuroprotección inmunitaria, lo que supone que la muerte de RGC inducida por glutamato no implica al sistema inmunitario, o bien los antígenos asociados a la mielina tales como pMOG y MBP no son los antígenos correctos para la protección frente a la toxicidad del glutamato. Resultados recientes del laboratorio de los presentes inventores (Kipnis et al., 2000), demostrando que la tasa de muerte celular causada por el glutamato es más alta en ratas o ratones que carecen de células T maduras que en animales normales, sugieren con fuerza que la respuesta fisiológica beneficiosa a la agresión del SNC implica a las células T. En consecuencia, es probable que el refuerzo de esta respuesta de las células T inducida por el glutamato endógeno tenga un efecto beneficioso sobre la retina lesionada.

La inmunización con Cop 1 protege frente a la toxicidad del glutamato. Aunque la búsqueda de un antígeno fisiológico que pueda provocar una respuesta inmunitaria beneficiosa a la toxicidad inducida por el glutamato es aún un objetivo prioritario en esta etapa, los presentes inventores se han interesado en encontrar un antígeno que pueda ser usado con el propósito de la manipulación exógena del sistema inmunitario de la respuesta inmunitaria al glutamato. Primeramente se examinó si la inyección de glutamato hace o no que las RGCs se hagan accesibles a los linfocitos. Se encontró que gran número de linfocitos invaden el ojo inyectado con glutamato dentro de las 24 h de la inyección de glutamato (Figs. 6A y 6B), lo que sugiere que la manipulación inmunitaria podría influir sobre la supervivencia de las RGCs después de su exposición local al glutamato. Juntas, estas dos observaciones llevaron a los presentes inventores a pensar que la toxicidad del glutamato activa un efecto protector mediado por las células T, y animaron a los presente inventores a buscar una forma de reforzar esta respuesta inmunitaria beneficiosa. En la búsqueda de un antígeno apropiado, el polímero sintético Copolímero 1 (Cop 1), que es un oligopéptido usado como fármaco en pacientes con esclerosis múltiple, y que recientemente demostró reforzar la neuroprotección en un modelo de lesión por aplastamiento del nervio óptico de la rata adulta (Kipnis et al., 2000a), fue considerado un probable candidato.

Primero se examinó si la inmunización con Cop 1 tiene o no un efecto beneficioso sobre la superviviencia de las RGC después de la lesión por aplastamiento del nervio óptico en ratones, y no solo en ratas. Para este estudio se usaron ratones Balb/c. La inmunización con Cop 1, usando un protocolo que se encontró que era beneficioso después de la lesión por aplastamiento del nervio óptico en ratas, era también beneficiosa después de la lesión por aplastamiento del nervio óptico en ratones (Fig. 7).

A continuación se investigó si el mismo protocolo puede dar lugar o no a neuroprotección contra la toxicidad inducida por el glutamato. Para este estudio se usaron ratones C57bl/6, en los que la pérdida de ganglios retinianos después de una agresión por glutamato es más alta que en Balb/c (Kipnis et al., 2000b). Diez días antes de la inyección intravítrea de glutamato, los ratones C57bl/6 fueron inmunizados con Cop 1 emulsionado en coadyuvante que contiene 5 mg/ml de bacterias. Esta cepa se seleccionó en vista del reciente hallazgo en el laboratorio de los presentes inventores, de que la pérdida de RGCs inducida por la inyección de glutamato en estos ratones es más alta que en los ratones Balb/c debido a una unión genética entre la pérdida neuronal y la resistencia a la enfermedad autoinmunitaria (Kipnis et al., 2000b). La inmunización con Cop 1 tuvo por resultado una reducción significativa de la toxicidad del glutamato (Fig. 8A). En un intento de establecer la ventana terapéutica para la inmunización con Cop 1 en este modelo, se repitió el experimento usando Cop 1 emulsionado en coadyuvante que contiene dos concentraciones diferentes de bacterias (0,5 ó 5 mg/ml) y los ratones fueron inmunizados en tiempos diferentes en relación con la agresión con glutamato. Los ratones inmunizados el día de la inyección de glutamato mostraron aún tasas de superviviencia de RGC significativamente más altas que las observadas en los ratones inyectados con PBS emulsionado en el correspondiente coadyuvante (Fig. 8B y 8C). Ambos coadyuvantes proporcionaron efectos significativos. La eficacia protectora del Cop 1 disminuyó con el tiempo entre la inmunización y la agresión con glutamato: el porcentaje medio de la tasa de supervivencia de RGCs cuando la inmunización con Cop 1 se administró inmediatamente o 24 h después de la inyección de glutamato fue significativamente más alta que en las retinas inyectadas con PBS y no fue significativa cuando el Cop 1 fue administrado 48 h después de la inyección de glutamato (Fig. 8D). Es interesante el hecho de que la inmunización con Cop 1 no logró proteger a los ratones frente a la toxicidad causada por NMDA (Fig. 9), que recientemente el laboratorio de los presentes inventores ha demostrado que causa, en este modelo in vivo, la muerte de RGC con características distintas que las típicas de la muerte apoptótica.

La transferencia adoptiva de células T reactivas contra Cop 1 protege contra la toxicidad del glutamato. Para determinar si la inmunización observada con Cop 1 conduce a la neuroprotección mediada por las célula T contra la toxicidad del glutamato, 5 x 10^{6} células T reactivas para Cop 1 (250 \muL intraperitonealmente) fueron transferidas pasivamente a ratones inmediatamente después de la inyección de glutamato (200 nmoles). Una semana más tarde, habían sobrevivido significativamente más RGCs en los ratones inyectados con células T reactivas para Cop 1 (1978 \pm 86, n = 6) que en los ratones testigo (1238 \pm 2, n = 3) a los que se había inyectado intraperitonealmente PBS (Fig. 10).

La inmunización con Cop 1 protege las células ganglionares retinianas frente a la muerte inducida por la hipertensión ocular en ratas. Ratas Lewis recibieron 2 tratamientos con láser, con una semana de separación, para aumentar la IOP. Medidas subsiguientes en los tiempos indicados, a lo largo de un periodo de 3 semanas, indicaron que a las dos semanas después de los tratamientos con láser la IOP había aumentado a 30 \pm 0,4 mm de Hg (media \pm SEM), y quedaba después en aproximadamente ese nivel (Fig. 11A). La tasa de supervivencia de las células ganglionares retinianas en estas ratas, medida 3 semanas después del tratamiento inicial con láser, era significativamente más baja (en 19,9% \pm 0,51%, media \pm SEM) que en las ratas testigo no tratadas con láser (Fig. 11B). Para examinar el efecto de la inmunización con Cop 1 sobre la supervivencia de las células ganglionares retinianas, las ratas fueron inmunizadas con Cop 1 emulsionado en CFA el día del primer tratamiento con láser. A las ratas testigo se les inyectó PBS en el mismo coadyuvante. Al cabo de 3 semanas, las células ganglionares retinianas fueron marcadas de forma retrógrada, y 24 horas más tarde las retinas fueron extirpadas y puestas en montaje completo, y se contaron las células ganglionares retinianas marcadas. El número de células ganglionares retinianas en las ratas inmunizadas con Cop 1 fue significativamente más elevado que en los testigos inyectados con PBS/CFA (Fig. 11C) la IOP en ambos grupos de ratas quedó tan alta como en un grupo de ratas tratadas con láser que no había recibido inyecciones (Fig. 11A). Un efecto similar, aunque ligeramente menor, se observó en ratas que fueron inmunizadas con Cop 1 cuando su IOP era ya elevada (Fig. 11D).

(7) Discusión de los resultados

Hasta ahora no se ha encontrado curación para las lesiones de la médula espinal, una de las lesiones traumáticas más comunes pero más devastadoras en la actualidad en las sociedades industriales. Se sabe desde hace más de 40 años que las neuronas del SNC, a diferencia de las neuronas del sistema nervioso periférico, no posee más que una capacidad limitada para regenerarse después de una lesión. Durante las últimas dos décadas, los intentos de promover la regeneración han proporcionado soluciones que llevan a una recuperación parcial. En los últimos años se ha hecho evidente que, aunque la mayor parte de las lesiones traumáticas sufridas por la médula espinal humana son parciales, la pérdida funcional resultante es sin embargo mucho peor de lo que cabría esperar de la gravedad de la lesión inicial; el proceso auto-propagado de degeneración secundaria parece ser decisivo.

Recientemente se ha dirigido un esfuerzo investigador sustancial a la detención de la degeneración secundaria inducida por la lesión. Todos los intentos hasta ahora han tenido una base farmacológica, y algunos han tenido por resultado una recuperación mejorada del choque espinal. Los presentes estudios, en cambio, describen una terapia celular que aumenta lo que parece ser un mecanismo natural de auto-mantenimiento y conduce, después de un tratamiento individual, a una recuperación duradera. El alcance de esta recuperación parece ser superior al publicado usando métodos farmacológicos.

En la mayor parte de los tejidos, el daño inducido por una lesión dispara una respuesta inmunitaria celular que actúa protegiendo el tejido y preservando su homeostasis. esta respuesta ha sido atribuida a macrófagos y otras células que comprenden el brazo innato del sistema inmunitario. No se cree que los linfocitos, que son responsables de la inmunidad adaptativa, participen en el mantenimiento de los tejidos. La inmunidad adaptativa, de acuerdo con la enseñanza tradicional, se dirige contra peligros extraños. Los presentes estudios no muestran, sin embargo, que la respuesta inmunitaria adaptativa de las células T pueda ser protectora incluso cuando no hay invasión por patógenos extraños. En el caso del mantenimiento del tejido, la especificidad de las células T es para auto-antígenos del tejido.

Los resultados de los ejemplos anteriores demuestran el efecto neuroprotector de las células T reactivas contra Cop 1 en un nervio del SNC lesionado por aplastamiento, así como en un nervio óptico expuesto a la toxicidad del glutamato. En el modelo con ratas de aplastamiento parcial del nervio óptico, la administración adoptiva de células T reactivas para Cop 1 o vacunación con Cop 1 el día de la lesión del SNC, tenía un acusado efecto preventivo sobre la degeneración secundaria de las fibras nerviosas. Esta es la primera vez que se indica que la vacunación es un posible método para prevenir la dispersión del daño tras una lesión traumática del nervio óptico.

Después de la lesión por aplastamiento del nervio óptico de la rata, la inyección de células T reactivas para Cop 1 tuvo por resultado una protección significativa frente al efecto destructor de la degeneración secundaria. Las células T se acumularon en el sitio de la lesión, como es de esperar, pero también se acumularon en el nervio no lesionado. La acumulación de células T en el SNC no lesionado es posible solamente si hay reconocimiento del receptor de células T por al antígeno presentado. Las células T activadas pueden pasar a través de la barrera hematoencefálica (BBB: Blood-Brain Barrier) al margen de su especificidad, pero solamente aquellas que son reactivas frente a antígenos del SNC pueden acumularse en el nervio no dañado (Hickey, 1991). Así, los presentes hallazgos demuestran, por primera vez, el reconocimiento cruzado in vivo entre células T reactivas para Cop 1 y componentes de mielina del SNC. Este reconocimiento en el sitio de la lesión probablemente sirve de disparador para la activación de las células T que conduce a la conexión de las células T hacia el fenotipo protector, posiblemente a través de la secreción de factores neurotróficos adecuados u otros factores, aún por descubrir, por las células T activadas. Este estudio demuestra que las células T reactivas para Cop 1 activadas por su antígeno específico segregan cantidades significativas de BDNF, una neurotrofina que juega un papel principal en la supervivencia neuronal (Yan et al., 1992; Sendtner et al., 1992).

El Cop 1 fue diseñado originalmente para imitar la actividad de la proteína básica de mielina (MBP) y para inducir la enfermedad desmielinizante inflamatoria EAE en roedores. Sin embargo, se encontró que era no encefalitogénico y que incluso suprimía la EAE inducida por MBP (Teitelbaum et al., 1971), proteína proteolipídica (PLP) (Teitelbaum et al., 1996), o MOG (Ben-Nun et al., 1996). El Cop 1 previene el desarrollo de EAE en roedores y mejora la esclerosis múltiple en las personas. Hay estudios que han demostrado reactividad cruzada parcial entre el anticuerpo contra Cop 1 y la MBP o entre las células T dirigidas a estos antígenos (Webb et al., 1973 y Teitelbaum et al., 1988). El Cop 1 puede servir como antagonista del receptor del antígeno de las células T para el epítopo de MBP inmunodominante (Aharoni et al., 1998). También puede unirse a varias moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase II e impedir que se unan a células T con propiedades de reconocimiento del antígeno especificas (Fridkis-Hareli et al., 1998). En los roedores, el Cop 1 induce la expresión de células reguladoras que suprimen las células T encefalitogénicas. Se ha encontrado que la transferencia adoptiva de tales células T en roedores previene el desarrollo de EAE inducida por la MBP (Aharoni et al., 1993), PLP (Teitelbaum et al., 1996) u homogeneizado de médula espinal completo (Aharoni et al., 1997).

Así, la inmunización con Cop 1, a diferencia de la inmunización con MBP y otras proteínas asociadas a la mielina, no induce EAE, y las células T provocadas por Cop 1, en ausencia de coadyuvantes, son de una naturaleza reguladora. La inmunización con Cop 1 en IFA inmediatamente después de la lesión, seguida por un refuerzo 2 días más tarde, tuvo un intenso efecto neuroprotector. Es probable que tal inmunización alcance el pico de su respuesta celular en aproximadamente una semana, pero es razonable suponer que, incluso antes de ese tiempo, el número de células T presentes en el SNC será suficientemente grande como para ejercer al menos una cierta actividad neuroprotectora. Se sabe que, después de la inmunización con MBP, los síntomas de EAE aparecen 10 días más tarde lo que indica que en ese tiempo la respuesta inmunitaria es suficientemente intensa para que las células T encefalitogénicas se acumulen en el sitio de la lesión, inflinjan sus daños y produzcan síntomas de EAE. El presente estudio sugiere que, después de la inmunización con Cop 1 en IFA, seguida dos días más tarde por un refuerzo, la respuesta inmunitaria en el nervio óptico fue suficiente para prevenir la degeneración secundaria. Es posible que esta respuesta fuese algo retardada en relación con la respuesta obtenida después de la transferencia pasiva de células T, pero de todas formas se consiguió aún dentro del margen de tiempo necesario para la protección de las fibras nerviosas que escaparon de la lesión primaria. Estudios previos en el nervio óptico de la rata han demostrado que la pérdida de neuronas que resulta de la degeneración secundaria es aproximadamente el 25% una semana después de la lesión leve por aplastamiento y aproximadamente el 55% dos semanas después de la lesión (Yoles, 1998). Así, incluso si la respuesta precisó una semana para alcanzar la intensidad requerida, habría aún fibras nerviosas en necesidad de protección en ese tiempo. Una comparación de los resultados obtenidos después de la transferencia adoptiva de células T reactivas para Cop 1 activadas y después de la inmunización activa con Cop 1, sugiere que no hay diferencias significativas entre los dos tratamientos en el tiempo que lleva hacerse efectivo al máximo, ya que la cuantía de la protección de la degeneración secundaria fue casi la misma en ambos. Debe hacerse énfasis en que el Cop 1 está mostrando aquí un efecto que es opuesto a su efecto conocido; se sabe que el Cop 1 es un agente diseñado para suprimir la autoinmunidad de las células T, mientras que aquí tiene un efecto que requiere activación de autoinmunidad de las células T anti-mielina específica.

En conclusión, estudios anteriores han demostrado que la lesión axónica en el SNC de la rata despierta una respuesta autoinmunitaria de las células T que se dirige contra las proteínas de mielina, pero es demasiado débil para proteger a las fibras nerviosas frente a la degeneración secundaria. El refuerzo de esta respuesta inmunitaria sin riesgo de acompañar una enfermedad autoinmunitaria se consiguió en este estudio usando un copolímero que es reconocido de forma cruzada por el SNC pero que no es encefalitogénico. La respuesta inmunitaria de las células T al polímero, obtenida bien sea por transferencia pasiva o bien por inmunización en el momento de la lesión, proporciona un medio eficaz de mantenimiento post-traumático. La neuroprotección mediada por las células T demostrada aquí es aplicable tanto a las lesiones crónicas como a las agudas de los nervios del SNC, en los que las neuronas son vulnerables a la degeneración y susceptibles de neuroprotección. También es aplicable a la protección de la degeneración primaria y secundaria causada por la toxicidad del glutamato. También se demuestra aquí en los resultados que la neuroprotección inmunitaria dependiente de las células T, conseguida por inmunización pasiva o activa con Cop 1, es una terapia efectiva para la toxicidad inducida por glutamato en ratones y en un modelo con ratas de IOP (presión intraocular) crónicamente alta.

Como los resultados de los estudios en el Ejemplo 3 indican que la inmunización tanto pasiva como activa con Cop 1 proporciona una neuroprotección efectiva frente a la toxicidad del glutamato, puede desarrollarse la vacunación como forma de reducir la toxicidad neuronal asociada con el glutamato. Estas observaciones tienen varias implicaciones interesantes: (i) el Cop 1, que se usa como fármaco inmunosupresor en pacientes con la enfermedad autoinmuntaria de la esclerosis múltiple, es efectivo como vacunación contra la neurotoxicidad inducida por el glutamato; (ii) la pérdida de neuronas del SNC debida a una señal de estrés local, puede beneficiarse de la manipulación autoinmunitaria sistémica; (iii) las mismas neuronas, en este caso las RGCs, pueden beneficiarse de una respuesta inmunitaria sistémica al margen de la naturaleza y el sitio de la lesión, aunque la especificidad antigénica de la respuesta puede variar; (iv) la actividad beneficiosa del Cop 1, aunque aparentemente no dependiente del tipo de lesión (mecánica o bioquímica), parece ser críticamente dependiente del mecanismo de muerte que activa la agresión. En el Ejemplo 3, la actividad inmunitaria inducida protegió a las células frente a la muerte causada por el glutamato, pero no frente a la muerte causada por el NMDA; (v) el Cop 1, actuando como inmunógeno, puede inducir la neuroprotección por un mecanismo que no requiere necesariamente reconocimiento cruzado de proteínas de mielina.

Debe insistirse en que hay una importante diferencia entre la neuroprotección inmunitaria contra la degeneración secundaria y la terapia inmunitaria para enfermedades autoinmunitarias. Mientras la primera requiere implicación activa de células T beneficiosas, la última puede beneficiarse de la modulación inmunitaria de células T encefalitogénicas, o bien de su supresión. El Cop 1, que actúa como un inmunógeno, puede servir para ambos fines de neuroprotección de la agresión neuronal y terapia para enfermedades autoinmunitarias. Presumiblemente consigue esto provocando una respuesta "segura" de las células T, que por una parte proporciona la beneficiosa respuesta autoinmunitaria de las células T necesaria para la neuroprotección (Moalem et al., 1999a; Moalem et al., 1999b; Kipnis et al., 2000a; Moalem et al., 2000c; y Schwartz et al., 1999), y por otra parte la modulación inmunitaria requerida para evitar una enfermedad autoinmunitaria (Neuhaus et al., 2000).

En el laboratorio de los presentes inventores se mostró que las células T reactivas para MBP son neuroprotectoras en modelos en ratas de nervios ópticos parcialmente aplastados (Moalem et al., 1999 y Schwartz et al., 1999) y lesión contusa de la médula espinal (Hauben et al., 2000a). Los hallazgos previos en el laboratorio de los presentes inventores demostraron reconocimiento cruzado in vivo entre células T reactivas para Cop 1 y componentes de mielina del SNC (Kipnis et al., 2000a). Los presentes inventores sugirieron que tal reconocimiento, disparando la reactivación de las células T y haciendo así que las células T se conecten hacia un fenotipo protector, podría representar un posible mecanismo que es la base de la neuroprotección de las células T después de una lesión axónica. Se demostró también por los presentes inventores que las células T reactivas para Cop 1 (Ejemplos 1 y 2; Kipnis et al., 2000a), al igual que las células T reactivas para MBP (Moalem et al., 2000), cuando son activadas por su antígeno específico, segregan cantidades significativas de factor neurotrófico derivado del cerebro, una neurotrofina que desempeña un papel principal en la superviviencia neuronal (Sendtner et al., 1992 y Yan et al., 1992). En el Ejemplo 1, el laboratorio de los presentes inventores examinó la inmunidad de células T contra Cop 1 después de un traumatismo físico de la sustancia blanca, en donde las células T anti-Cop 1 pueden tener reacción cruzada con epítopos de mielina expuestos. El presente hallazgo en el Ejemplo 3, de que la inmunización con Cop 1 es activa contra la toxicidad del glutamato, que afecta directamente a los cuerpos celulares neuronales bajo condiciones en las que no es probable que intervengan antígenos de mielina, puede sugerir que las células T anti-Cop 1, a causa de su heterogeneidad, responden a una diversidad de antígenos incluyendo los asociados con la retina. Las células T reactivas para Cop 1 pueden interaccionar directamente con el propio glutamato. Tal interacción podría convertir las células T reactivas para Cop 1, o células T endógenas, en un fenotipo protector.

La posibilidad de que las células T reactivas para Cop 1 puedan interaccionar con el glutamato inyectado dentro del humor vítreo o con células activadas de microglía dentro de la retina, viene apoyado por el gran número de linfocitos invasores observados en el humor vítreo 24 horas después de la inyección de glutamato. En ratones a los que se ha inyectado Cop 1, es probable que los linfocitos invasores incluyan algunos que sean específicos para Cop 1. Esta observación, junto con el hallazgo de que la transferencia pasiva de células T reactivas para Cop 1 tiene un efecto similar al de la inmunización activa con Cop 1, sugiere que el efecto de la vacunación está realmente mediado por células T, en vez de por la inmunidad humoral o por el propio Cop 1. Como el glutamato, siendo un mediador de degeneración secundaria, aparece a cierta distancia en el tiempo de la agresión primaria (Yoles et al., 1998), un margen de tratamiento de 24 h en el caso de la toxicidad directa del glutamato puede implicar que en casos de traumatismo del SNC el margen para el tratamiento con Cop 1 sea mucho más amplio. Es interesante observar que el Cop 1 no tenía efecto protector cuando la agresión tóxica fue inducida por NMDA. Esto está en la línea de estudios realizados en el laboratorio de las presentes inventores, que indican que el NMDA impone una señal de muerte casi inmediata, sin signos claros de apoptosis y sin oportunidad aparente para otra terapia que no sea con antagonistas del receptor de NMDA. Por tanto no resulta sorprendente que la inmunización con Cop 1 fuese ineficaz contra la toxicidad inducida por el NMDA. Queda por establecer si la actividad del Cop 1 como neuroprotector en vez de como agente supresor depende de su vía de administración. También queda por determinar cómo la acumulación local de células T específicas para antígenos del SNC, o de las células T específicas para antígenos con reactividad cruzada tales como Cop 1, median en la neuroprotección después de las agresiones al SNC.

La neuroprotección mediada por células T demostrada en los estudios del Ejemplo 3 podría ser aplicable a las lesiones, tanto crónicas como agudas, de nervios del SNC en los que las neuronas son vulnerables a la degeneración y susceptibles de neuroprotección (Schwartz et al., 2000a; Schwartz et al., 2000b; Doble et al., 1999; y Grunblatt et al., 2000). Una condición crónica, el glaucoma, se asocia frecuentemente con la IOP y es una de las causas importantes de ceguera. Sin embargo, es experiencia común que la enfermedad puede continuar progresando incluso aunque la IOP se mantenga dentro del intervalo normal, lo que sugiere que la compresión mecánica no es probablemente la única razón para que se dañe el nervio óptico, y ese tratamiento, además de reducir la IOP, debería por tanto incluir una terapia neuroprotectora (para una revisión, véanse Osborne et al., 1999; Schwartz et al., 2000c; y Weinrab et al., 1999). Estudios recientes han señalado, por ejemplo, que el tratamiento con un antagonista del glutamato (Chaudhary et al., 1998) o un inhibidor de la óxido nítrico sintasa (Neufeld et al., 1999) atenúa la muerte de células ganglionares retinianas en un modelo con ratas de aumento de la IOP. Sin embargo, existe el peligro de que la interferencia con la respuesta fisiológica por estos agentes, aunque posiblemente beneficiosa en el sitio de la patología, podría ser perjudicial para el tejido normal, dando lugar a efectos secundarios indeseables. Una solución más favorable desde el punto de vista clínico, por tanto, es aprovechar y aumentar la propia maquinaria de defensa del tejido.

El presente hallazgo de neuroprotección conseguida incluso cuando la presión sigue siendo alta es potencialmente de gran ventaja desde el punto de vista clínico. Esto es porque incluso una presión reducida hasta la normal no es necesariamente segura para pacientes con glaucoma, en los que las neuronas restantes son más vulnerables que las normales (Agis, 2000). Además, la reducción de la IOP que podría considerarse segura en tales pacientes, es decir hasta 12 mm de Hg, podría no ser factible.

Habiendo descrito ahora completamente esta invención, los expertos en la técnica apreciarán que la misma puede realizarse dentro de un amplio margen de parámetros, concentraciones y condiciones equivalentes sin necesidad de una experimentación excesiva.

Aunque esta invención ha sido descrita en relación con realizaciones específicas de la misma, se entenderá que es capaz de más modificaciones. Se entiende que esta solicitud cubre cualquier variación, uso o adaptación de las invenciones que siguen, en general, los principios de la invención, y que incluyen derivaciones de la presente descripción que caen dentro de la práctica conocida o habitual en la técnica a la que pertenece la invención, y como puede aplicarse a las características esenciales expuestas anteriormente en el presente texto como sigue en el alcance de las reivindicaciones anexas.

La referencia a etapas de métodos conocidos, etapas de métodos convencionales, métodos conocidos o métodos convencionales no supone en modo alguno admitir que ningún aspecto, descripción o realización de la presente invención sea descrito, enseñado o sugerido en la técnica relacionada.

La descripción precedente de las realizaciones específicas revelará así totalmente la naturaleza general de la invención que otros, aplicando conocimientos dentro de la experiencia en la técnica (incluyendo el contenido de las referencias citadas en el presente texto), pueden modificar y/o adaptar fácilmente para varias aplicaciones tales realizaciones específicas, sin una excesiva experimentación, sin apartarse del concepto general de la presente invención. Por consiguiente, se entiende que tales adaptaciones y modificaciones están dentro del significado y margen de equivalentes de las realizaciones descritas, basándose en la enseñanza y las directrices presentadas en el presente texto. Ha de entenderse que la terminología del presente texto tiene una finalidad de descripción y no de limitación, por lo que la terminología de la presente memoria descriptiva ha de ser interpretada por el profesional experto a la luz de las enseñanzas y directrices presentadas en el presente texto, en combinación con los conocimientos de una persona con una experiencia normal en la técnica.

Referencias

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<110> EISENBACH-SCHWARTZ, Michal

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YOLES, Eti

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KIPNIS, Jonathan

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<120> EL USO DE COPOLÍMERO 1 Y PÉPTIDOS Y POLIPÉPTIDOS RELACIONADOS, Y DE CÉLULAS T TRATADAS CON LOS MISMOS, PARA TERAPIA NEUROPROTECTORA.

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<130> EIS-SCHWARTZ18 PCT

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<170> PatentIn version 3.0

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<213> Artificial: Construcción sintética

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<400> 18

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\sa{Ala Lys Lys Tyr Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala}

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<210> 19

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Artificial: Construcción sintética

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<400> 19

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\sa{Ala Glu Ala Tyr Lys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala}

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<210> 20

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Artificial: Construcción sintética

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<400> 20

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\sa{Lys Glu Ala Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala}

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<210> 21

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Artificial: Construcción sintética

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<400> 21

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\sa{Ala Glu Glu Tyr Lys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala}

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<210> 22

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Artificial: Construcción sintética

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<400> 22

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\sa{Ala Ala Glu Tyr Lys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala}

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<210> 23

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Artificial: Construcción sintética

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<400> 23

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\sa{Glu Lys Ala Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala}

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<210> 24

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Artificial: Construcción sintética

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<400> 24

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<210> 25

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Artificial: Construcción sintética

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<400> 25

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<210> 26

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Artificial: Construcción sintética

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<400> 26

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\sa{Glu Lys Lys Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala}

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<210> 27

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Artificial: Construcción sintética

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<400> 27

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\sa{Glu Ala Lys Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala}

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<210> 28

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Artificial: Construcción sintética

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<400> 28

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\sa{Ala Glu Tyr Ala Lys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala}

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<210> 29

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Artificial: Construcción sintética

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<400> 29

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\sa{Ala Glu Lys Ala Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala}

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<210> 30

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Artificial: Construcción sintética

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<400> 30

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<210> 31

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Artificial: Construcción sintética

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<400> 31

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\sa{Ala Tyr Lys Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala}

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<210> 32

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Artificial: Construcción sintética

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<400> 32

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\sa{Ala Lys Tyr Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala}

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<210> 33

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<211> 22

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<212> PRT

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<213> HUMANA

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<400> 33

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\sa{Gly Gln Phe Arg Val Ile Gly Pro Gly His Pro Ile Arg Ala Leu}

\sac{Val Gly Asp Glu Ala Glu Leu}

Claims

1. El uso de Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1 para la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad causada o exacerbada por la toxicidad del glutamato, en el que dicha enfermedad no es la esclerosis múltiple.

2. El uso según la reivindicación 1ª, de Cop 1.

3. El uso según la reivindicación 1ª o 2ª, en el que dicho péptido o polipéptido relacionado con Cop-1 es un copolímero al azar que presenta reacción cruzada funcional con la proteína básica de mielina (MBP) y es capaz de competir con la MBP sobre la molécula del MHC de clase II en la presentación del antígeno.

4. El uso según la reivindicación 3ª, en el que dicho copolímero al azar comprende un aminoácido seleccionado de cada uno de al menos tres de los grupos siguientes:

(a) lisina y arginina;

(b) ácido glutámico y ácido aspártico;

(c) alanina y glicina; y

(d) tirosina y triptófano.

5. El uso según la reivindicación 4ª, en el que dicho copolímero al azar contiene cuatro aminoácidos diferentes, cada uno de ellos de un grupo diferente de los grupos (a) a (d).

6. El uso según la reivindicación 5ª, en el que dichos cuatro aminoácidos diferentes son alanina, ácido glutámico, lisina y tirosina.

7. El uso según la reivindicación 5ª, en el que dicho copolímero al azar contiene tres aminoácidos diferentes, cada uno de ellos de un grupo diferente de tres de los grupos (a) a (d).

8. El uso según la reivindicación 7ª, en el que dichos tres aminoácidos diferentes son tirosina, alanina y lisina; tirosina, ácido glutámico y lisina; lisina, ácido glutámico y alanina; o tirosina, ácido glutámico y alanina.

9. Uso de células T que han sido activadas por Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1, para la preparación de un medicamento para proteger células del sistema nervioso central de la toxicidad del glutamato.

10. Uso de células T que han sido activadas por Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1, para la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad causada o exacerbada por la toxicidad del glutama-
to.

11. El uso según la reivindicación 9ª o 10ª, en el que las células T han sido activadas por Cop 1.

12. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 9ª a 11ª, en el que dichas células T activadas son células T autólogas.

13. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 9ª a 11ª, en el que dichas células T activadas son células T alogénicas procedentes de donantes relacionados, o donantes HLA-compatibles o parcialmente compatibles, semialogénicos o totalmente alogénicos.

14. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 13ª, en el que dicho medicamento es para el tratamiento de una enfermedad asociada con presión intraocular anormalmente elevada.

15. El uso según la reivindicación 14ª, en el que dicha enfermedad es el glaucoma.

16. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 13ª, en el que dicho medicamento es para el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre neuropatía diabética, demencia senil, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, parálisis del nervio facial (de Bell), corea de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, estado epiléptico, neuropatía óptica no arterítica, o deficiencia vitamínica, glaucoma, hernia del disco intervertebral, enfermedades priónicas tales como la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, síndrome del túnel carpiano, neuropatías periféricas asociadas con diversas enfermedades, incluyendo uremia, porfiria, hipoglucemia, síndrome de Sjorgren Larsson, neuropatía sensorial aguda, neuropatía atáxica crónica, cirrosis biliar, amiloidosis primaria, enfermedades pulmonares obstructivas, acromegalia, síndromes de malabsorción, policitemia verdadera, gammapatías de IgA e IgG, complicaciones por diversos fármacos (por ejemplo, metronidazol) y toxinas (por ejemplo, alcohol u organofosfatos), enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, ataxia-telangiectasia, ataxia de Friedreich, polineuropatías amiloides, adrenomieloneuropatía, neuropatía axonal gigante, enfermedad de Refsum, enfermedad de Fabry, lipoproteinemia, epilepsia, amnesia, ansiedad, hiperalgesia, psicosis, convulsiones, presión intraocular anormalmente elevada, agresiones oxidativas, y tolerancia y dependencia de opiáceos.

17. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 13ª, en el que dicho medicamento es para el tratamiento del sistema nervioso central tras la extirpación de tumores del mismo o la intervención quirúrgica en el mismo.

18. Uso de Cop 1 o un péptido o polipéptido relacionado con Cop 1 para la preparación de un medicamento para el tratamiento del glaucoma.