KR20030007397A - 코폴리머 1 및 관련된 펩티드들 및 폴리펩티드 및 이들로처치된 티세포들의 신경보호 요법을 위한 사용 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 중추신경계 또는 말초신경계의 손상 또는 질병을 처치하기 위한 방법들이 제공된다. 하나의 구체예에서, Cop 1 또는 Cop 1-관련 펩티드 또는 폴리펩티드의 항원을 인식하는 활성화된 T-세포들의 투여에 의해 신경계 내에서의 신경 재생을 촉진시키거나 또는 신경 퇴화를 방지하거나 억제시킨다. 다른 구체예에서, 처치는 중추신경계 또는 말초신경계 두 가지 모두의 신경계에서 신경 재생을 촉진시키거나 또는 신경 퇴화를 방지하거나 또는 억제시키기 위한 Cop 1 또는Cop 1-관련 펩티드 또는 폴리펩티드의 투여를 포함한다. Cop 1 또는 Cop 1-관련 펩티드 또는 폴리펩티드의 존재에 의해 활성화된 T-세포들을 단독으로 또는 Cop 1 또는 Cop 1-관련 펩티드 또는 폴리펩티드와 함께 투여될 수 있다.

Description

코폴리머 1 및 관련된 펩티드들 및 폴리펩티드 및 이들로 처치된 티세포들의 신경 보호 요법을 위한 사용{The use of copolymer 1 and related peptides and polypeptides and T cells treated therewith for neuroprotective therapy}

발명의 배경

신경계는 중추신경계와 말초신경계를 포함한다. 중추신경계(CNS)는 두뇌 및 척수(spinal cord)를 포함하여 이루어지며; 말초신경계(PNS)는 다른 신경요소들 모두 즉, 두뇌와 척수의 외부에 있는 신경절(ganglia)들로 이루어진다.

신경계에 대한 손상(damage)은 관통 외상(penetrating trauma) 또는 무딘 외상(blunt trauma) 등과 같은 외상성 손상(traumatic injury) 또는 알쯔하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 근위축성 축삭 경화증(ALS ; amyotrophic lateral sclerosis), 당뇨성 신경장애(diabetic neuropathy), 노인성 치매(senile dementia) 및 빈혈(ischemia) 등을 포함하나, 이들에 제한되지 않는 질병 또는 장애(disorder)들에 기인한다.

중추신경계의 온전함(central nervous system integrity)의 유지는 중간상태(compromise)들이 면역 체계에 충격을 주는 "균형 작용(balancing act)"의 복합(complex)이다. 대부분의 조직들에서, 면역 체계는 보호, 회복(repair) 및 치료(healing)에서 중요한 역할을 한다. 그 독특한 면역 우선성(immune privilege)으로 인하여, 중추신경계에서는 면역학적 반응(immunological reaction)들이 비교적 제한된다(Streilein, 1993, 1995).

미성체(a growing body)의 증거는 부상후의 기능적 회복(functional recovery)을 이루기 위한 포유동물의 중추신경계의 실패가 손상된 조직과 면역 체계 간의 유효하지 않은 소통(dialog)의 반영(reflection)이라는 것임을 나타낸다. 예를 들면, 중추신경계와 혈액 유래 대식세포(blood-borne macrophage)들 간의 제한된 의사소통(communication)은 축색절단된 신경돌기가 재생(regrow)하는 능력(capacity)에 영향을 주며; 활성화된 대식세포들의 이식(transplant)은 중추신경계 재생성(regrowth)을 촉진시킬 수 있다(Lazarov Spiegler et al, 1996; Paplino et al, 1998).

활성화된 T-세포들이 그들의 항원 특이성(antigen specificity)에 무관하게 중추신경계 유조직(parenchyma)으로 들어간다는 것이 밝혀졌으나, 단지 중추신경계 항원과 반응할 수 있는 T-세포들만이 그곳에 존속하는 것으로 보여진다(Hickey et al, 1991; Werkele, 1993; Kramer et al, 1995).

수초 염기성 단백질(MBP ; myelin basic protein)과 같은 중추신경계 백질(white matter)의 항원에 대해 반응성인 T-세포들은 무처리의 감수성 생쥐들 내로의 접종 수일 이내에 마비성 질병(paralytic disease)인 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE ; experimental autoimmune encephalomyelitis)을 유발시킬 수 있다(Ben-Nun, 1981a).

항-수초 염기성 단백질 T-세포들은 또한 인간 질병 다발성 경화증(human disease multiple sclerosis)에 포함될 수 있다(Ota, K. et al, 1990; Martin, 1997). 그러나, 그들의 병원잠재성(pathogenic potential)에도 불구하고, 항-수초염기성 단백질 T-세포 클론(clone)들은 건강한 대상체들의 면역 체계들 내에 존재한다(Burns, 1983; Pette, M. et al, 1990; Martin et al, 1990; Schluesener et al, 1985).

통상적으로 온전한 중추신경계를 순회하는 활성화된 T-세포들은 중추신경계 백질 손상부위(white matter lesion)의 위치들에 일시적으로 축적된다(Hirschberg et al, 1998).

중추신경계 손상의 파멸적 영향은 1차 손상이 종종 초기 손상에 의해 명백하게 손상되지 않은, 또는 단지 주변적으로만 손상된 인접한 신경들의 점진적인 2차 손상으로 복합화 된다는 것이다(Faden et al, 1992; Faden 1993; McIntosh, 1993). 1차 손상부는 세포외 이온농도(extracellular ion concentration), 유리기(free radical)들의 양의 증가, 신경전달자(neurotransmitter)들의 방출, 성장 인자(growth factor)들의 소모(depletion) 및 국부 염증(local inflammation)들의 원인이 된다.

이들 변화들은 원래 1차 손상에서 빠져나온 인접한 신경들에의 파괴적 사건들의 종속을 촉발시킨다(Lynch et al, 1994; Bazen et al, 1995; Wu et al, 1994). 이러한 2차 손상은 전압-의존성(voltage-dependent) 또는 작용물질-동작 채널(agonist-gated channel)들의 활성화, 이온 누설, 프로테아제(protease)들, 리파아제(lipase)들 및 뉴클레아제(nuclease)들과 같은 칼슘-의존성 효소들의 활성화, 미토콘드리아성 부전(mitochondrial dysfunction) 및 에너지 소모(energy depletion)에 의해 매개되어(mediated) 신경 세포의 사멸에 이르게 된다(Yoshinaet al, 1991; Hovada et al, 1991; Zivin et al, 1991; Yoles et al, 1992). 1차 손상에 의해 직접적으로 원인이 된 손실 이후의 신경들의 광범위한 손실(loss)을 "2차 퇴화"라고 불러왔다.

1차 위험인자(primary risk factor)가 제거되거나 또는 약화된 경우에서도 질병들의 자가-증식(self-propagation)의 원인이 되는 가장 일반적인 매개자(mediator)들 중의 하나는 글루타메이트(glutamate)이며, 이는 정상의 중추신경계(CNS)에서 필수적인 신경전달자(neurotransmitter)로서 기능하는 중추적인 역할을 하나, 그 생리학적인 농도가 과다한 경우에는 독성으로 되는 이중 활성(dual activity)을 나타내는 자극성 아미노산이다.

글루타메이트의 상승은 많은 중추신경계 장애(disorder)들에서 보고되었다. 여기독성 화합물(excitotoxic compound)로서의 그의 역할에서, 글루타메이트는 녹내장(glaucoma)에서의 시신경(optic nerve) 퇴화를 포함하여 급성 또는 만성의 퇴화장애에서 가장 일반적인 독성의 매개자들 중의 하나이다(Pitt et al, 2000; Schoepp et al., 1996).

내인성 글루타메이트(endogenous glutamate)는 간질발작 상태(status epilepticus), 뇌빈혈(cerebral ischemia) 또는 외상성 뇌손상(traumatic brain injury) 후 급속하게 일어나는 뇌손상에 기여한다. 이는 또한 근위축성 축삭 경화증 및 헌팅턴 무도병(Huntington's chorea) 등과 같은 장애들에서의 만성적 신경 퇴화에 기여한다.

NMDA-수용기(receptor) 길항제(antagonist) 들과 같이 국부적으로 작용하는약물들의 사용에 의해 글루타메이트의 세포장애성 영향(cytotoxic effect)을 감소시키기 위한 집중적인 연구가 이루어졌다(Brauner-Osborne et al., 2000). 이러한 형태의 상용 요법(therapy)은 종종 만족스럽지 못하나, 독성 영향의 중화에서는 생리적 기능에 간섭하는 것으로 여겨진다.

인간의 경우, 이러한 화합물들은 향정신성(psychotropic) 및 다른 부작용들을 가지며, 치료제들로서 부적절하게 만든다. 이들은 또한 편재적 중추신경계 신경전달자로서의 글루타메이트의 필수적 생리적 기능과 간섭하는 단점을 갖는다. 정상적인 생리적 기능에서 글루타메이트 활성이 필수적이고, 게다가 급성 손상 후 또는 만성적인 중추신경계 장애들에서 잠재적으로 파괴적이기 때문에, 체내 다른 부위들에서 그 필수적 활성을 제거하지 않으면서 그 유해한 영향을 중화시키기 위한 어떠한 임의의 시도도 반드시 행해져야 한다.

중추신경계 손상의 다른 비극적 결과는 포유동물의 중추신경계 내의 신경들은 손상에 따른 동시적 재생을 수행하지 않는다는 것이다. 따라서, 중추신경계 손상은 운동 근육(motor)과 감각기능(sensory function)들의 영구장애(permanent impairment)의 원인이 된다.

손상의 심각함(severity)과는 무관하게, 척수 부위(spinal cord resion)들은 초기에 척수 쇼크(spinal shock)로 알려진 완전 기능 마비의 결과로 된다. 척수 쇼크로부터의 일부 동시적 회복이 관찰될 수 있으며, 이는 손상 후 수일 내에 시작하여 3 내지 4주 내에 차차 줄어든다.

외상(insult)이 덜 심할수록, 기능상의 결과(outcome)는 더 좋아진다. 회복의 정도는 손상되지 않은 조직에서 2차 퇴화로 인한 손실을 공제한 양의 함수이다. 손상으로부터의 회복은 2차 퇴화를 감소시킬 수 있는 신경보호적 처치(neuroprotective treatment)에 의해 개선될 수 있다.

예를 들면, 글루타메이트의 영향의 완화는 신경보호적 약물 개발의 빈번한 목표(target)이다. 이러한 목적을 위해 개발된 약물들 중에는 N-메틸-D-아스파르테이트-수용기 길항제(NMDA-receptor antagonist ; N-methyl-D-aspartate-receptor antagonist) 또는 알파-아미노-3-히드록시-5-메틸-4-이속사졸프로피온산(AMPA)-수용기 길항제(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazoleproprionic acid-receptor antagonist) 들이 있다.

이들 약물들이 NMDA 및 AMPA 수용기들의 기능화(funtioning)에 간섭하기 때문에, 이들 약물들은 필수적으로 심각한 부작용들을 가지며, 이는 중추신경계 활성에 대해서는 결정적이다. 가장 집중적으로 연구된 NMDA-수용기 길항제들 중의 하나는 MK801이며, 이는 유효한 신경 보호(neuroprotection)을 제공하기는 하나, 심각한 부작용들을 갖는다.

뇌빈혈(cerebral ischemia) 및 외상성 뇌손상(traumatic brain injury)의 동물 모델에서, NMDA 및 AMPA 수용기 길항제들은 급성 뇌손상 및 지연된 행동장애(behavioral deficits)들에 대해 보호한다. 이러한 화합물들이 인간에게 시험되는 경우에서, 치료 효능(therapeutic efficacy)이 입증되지는 않았다. 글루타메이트성 전달(glutamatergic transmission)에 작용하는 약물들에 대응할 수 있는 다른 임상조건(clinical condition)들에는 간질(epilepsy),기억상실증(amnesia), 불안증(anxiety), 지각과민증(hyperalgesia) 및 정신병(psychosis)들이 포함된다(Meldrum, 2000).

환자의 신경계의 항원을 인식하는 활성화된 T-세포들이 신경 재생을 촉진하거나 또는 신경보호를 부여한다는 것이 본 발명자들의 실험실에서 최근 발견되었다. PCT 공개 WO 99/60021 호를 참고로 하였으며, 그 내용을 본 명세서에 참고로 인용하였다.

특히, MBP에 반응성인 T-세포들이 부분적으로 파괴된 시신경의 쥐의 모델 및 척수 손상의 쥐의 모델에서 신경보호가 이루어진다는 것이 밝혀졌다(부분적으로 파괴된 시신경의 쥐의 모델은 Moalem et al, 1999; 척수 손상의 쥐의 모델은 Hauben et al, 2000을 참조).

최근까지도, 면역체계는 면역세포(immune cell)들이 신경계 회복에 참여하는 것을 배척한다고 여겨졌다. 중추신경계 또는 말초신경계의 손상 또는 질병에 기인한 손상에 따른 2차 퇴화로부터의 신경 재생 또는 신경계 조직 보호에 신경계-특이성(NS-specific)의 활성화된 T-세포들이 사용될 수 있다는 발견은 놀라운 것이다.

상기 WO 99/60021 호에 기술된 바와 같은 신경계-특이성의 활성화된 T-세포들은 환자의 신경계의 항원에 대해 특이성을 갖는 활성화된 T-세포들이다. T-세포들에 특이성을 부여하는데 사용된 항원은 그 활성화된 T-세포가 그 환자의 신경계 내의 항원을 인식할 수 있는 한 그 환자의 자가신경계-항원, 그들로부터 유도된 펩티드 또는 다른 개체 혹은 다른 종의 신경계-항원, 또는 그들로부터 유도된 펩티드가 될 수 있다.

상기 신경계-특이성의 활성화된 T-세포들은 신경 재생을 촉진시키거나 또는 질병의 영향들을 방지하거나 또는 억제하는데 사용된다. 처치되는 질병이 자가면역 질병(autoimmune disease)이고, 그 자가면역 항원(autoimmune antigen)이 신경계 항원인 경우, 이러한 질병에 의해 야기된 신경 손상 또는 퇴화의 처치에 사용된 T-세포들은 질병 중에 포함된 동일한 자가면역 항원에 대해서는 활성화되지 않는다.

신경계-특이성의 활성화된 T-세포들의 투여(administration)를 포함하는 손상 또는 질병의 영향들의 완화를 위한 치료법은 신경계-특이성의 항원 또는 그로부터 유도된 펩티드들과 선택적으로 조합될 수 있음이 상기 언급된 PCT 공개 WO99/60021 호에 기술되어 있다.

상기 WO 99/60021 호에서 규정된 신경계-특이성 항원은 활성화에 이어 활성화된 T-세포들이 환자의 신경계 내의 손상 또는 질병 부위에서 축적되는 것과 같이 T-세포들을 특이적으로 활성화하는 항원들을 의미한다. 더욱이, 신경계-특이성 항원 또는 그들로부터 유도된 펩티드의 경구 투여는 손상 후 즉시적 임계 T-세포 응답(critical T cell response)을 구축하기 위한 적극적 면역화(active immunization)에 수반될 수 있다.

이러한 선 발명에서, 시험관 내 또는 생체 내에서 T-세포들을 활성화하거나 또는 환자를 면역화 하는데 사용된 신경계-특이성 항원은 신경계 조직으로부터, 바람직하게는 중추신경계 손상 또는 질병 부위의 조직으로부터 수득된 항원이 될 수 있다. 천연 또는 합성의 신경계-특이성 항원들 또는 항원결정기(epitope)들에는 MBP, MOG, PLP, MAG, S-100, β-아밀로이드, Thy-1, P0, P2 및 신경전달자수용기(neurotransmitter receptor)들이 포함된다.

WO 99/60021 호에 기술된 이러한 유용한 신경계-특이성 항원들의 특정의 구체적인 예들로는 인간 MBP, 인간 단백지질 단백질(PLP ; proteolipid protein) 및 인간 희소돌기아교세포 당단백(oligodendrocyte glycoprotein) 들이 있다. 또한 수초 염기성 단백질(MBP ; myelin basic protein)의 아미노산 51 - 70들을 포함하는 펩티드와 같이 T-세포들을 활성화시키기는 하나, 자가면역 질병을 일으키지 않는 신경계-특이성의 자가-항원들 또는 신경계-특이성 항원들의 유도체들로부터 유도된 펩티드들이 기술되어 있다.

이러한 신경계-특이성의 T-세포들의 작용 메카니즘은 아직 밝혀지지 않았으나, 중추신경계 손상 부위에 외인성으로 투여된 T-세포들의 막대한 축적이 손상부위에서의 T-세포들의 존재가 신경 보호에 있어서 중요한 역할(prominent role)을 한다는 것으로 제시한다. 비-자가항원 난백알부민(ovalbumin)에 특이적인 T-세포들 또한 상기 부위에 축적되나, 신경 보호 효과가 없기 때문에, 필요조건(necessary condition)을 통한 축적은 이러한 목적을 위해서는 충분치 않다는 것이 밝혀졌다(Hirschberg et al, 1998).

감수성의 동물(susceptible animal)들에 유도될 수 있는 실험적 알레르기성 뇌척수막염(EAE ; experimental allegic encephalomyelitis), 다발성 경화증(MS ; multiple sclerosis)과 유사한 질병들의 치료용 또는 방지용 약물(agent)로서, 6부의 Ala, 2부의 Glu, 4.5부의 Lys, 1부의 Tyr의 비율로 L-Ala, L-Glu, L-Lys 및 L-Tyr 잔기들로 이루어지며, 15,000 내지 25,000의 분자량을 갖는, 고분자량 합성 염기성 랜덤 코폴리머(synthetic basic random copolymer)가 미합중국 특허 제 3,849,550 호에 처음으로 기술되었다.

코폴리머 1 또는 Cop 1으로 나타내어지는, 평균분자량 23,000의 이 코폴리머의 배치(batch)들은 여러 동물 종들에서 실험적 알레르기성 뇌척수막염의 보호 및 억제에 매우 효과적임이 나타났다(Teitelbaum et al, 1971, 1974a, 1974b).

후에, Cop 1이 다발성 경화증의 악화-완화(exacerbating-remitting) 형태에 대한 환자들의 재발(relapses)의 수를 명백하게 감소시킴이 밝혀졌다(Bornstein et al, 1990; Sela et al, 1990; Johnson et al, 1994). 0.141, 0.427, 0.095 및 0.338의 평균 몰분율을 갖는 L-Glu, L-Ala, L-Tyr 및 L-Lys를 포함하는 합성 폴리펩티드들의 아세테이트 염들의 형태의 코폴리머 1이 다발성 경화증 치료용 약물인 '코팍손(COPAXONE)(등록상표)'의 활성성분이다.

따라서, 다발성 경화증의 치료에 있어서의 코폴리머 1의 영향은 다발성 경화증 환자들의 수초 항원에 대한 자가면역 T-세포 반응성의 억제 또는 비활성화의 달성이라는 것이 명백하다. 이러한 목적을 위하여, 코폴리머 1은 부형제(adjuvant)들 없이 매일의 피하주사에 의해 투여된다.

Cop 1은 원래 MBP를 모방(mimic)하도록 그리고 실험적 알레르기성 뇌척수막염을 유발하도록 설계되었으나, 비-뇌척수막성(non-encephalitogenic)이고, 심지어 MBP에 의해 유발된 실험적 알레르기성 뇌척수막염을 억제하는 것으로 밝혀졌다(Teitelbaum et al, 1971)(PLP의 경우, Teitelbaum et al, 1996을 참조; 또는 MOG의 경우, Ben-Nun et al, 1996을 참조하시오). Cop 1이 어떻게 실험적 알레르기성 뇌척수막염의 발달을 억제하고, 그리고 다발성 경화증을 완화시키는 지의 정확한 메카니즘들은 아직 알려지지 않았다. 게다가, 이 코폴리머의 몇몇 중요한 면역학적 특성들은 나타났다. T-세포 수준과 항체 수준 두 가지 모두에서 MBP에 대한 Cop 1의 부분적 교차-반응성이 몇몇 연구들에서 입증되었다(T-세포의 경우 Webb et al, 1973을 참조, 항체의 경우 Teitelbaum et al, 1988을 참조).

Cop 1은 MBP 면역우성 항원결정기(MBP immunodominant epitope)에 대한 T-세포 항원 수용기의 길항제로서 작용할 수 있다(Aharoni, 1998). 이들은 또한 여러 MHC 클래스 2 분자(MHC class Ⅱ molecule)들을 결합할 수 있으며, 또한 특이성 항원-인식 특성(specific antigen-recognition properties)을 갖는 T-세포들에의 결합을 방지할 수 있다(Fridkis-Hareli et al, 1999a). 설치류(rodents)에 있어서, 뇌척수막성 T-세포들의 방관 억제자(bystander suppressor)들로서 동작하는 제어 세포(regulatory cell)들을 유발한다(Aharoni, 1998).

이러한 T-세포들의 입양 전달(adoptive transfer)은 MBP, PLP 또는 전체 척수파쇄액(spinal cord homogenate)에 의해 유발된 실험적 알레르기성 뇌척수막염의 발달을 억제하는 것으로 밝혀졌다(MBP의 경우 Aharoni et al, 1993; PLP의 경우 Aharoni, 1998을 참조; 척수파쇄액의 경우 Aharoni et al, 1997을 참조하시오).

더우기, Cop 1 및 관련된 코폴리머들 및 콜라겐 Ⅱ(CⅡ ; collagen Ⅱ) 펩티드와 류머티스성의 관절염-관련 HLA-DR 분자들(rheumatoid arthritis(RA)-associated HLA-DR molecule) 간의 경쟁적 상호작용(competitive interaction) 및 CⅡ-특이성 T-세포 응답에 대한 두 가지 모두에서 이들 화합물들이 류머티스성 관절염에 대해 유효할 수있음을 예측케 하는 직접적인 증거가 또한 보고되었다(Fridkis-Hareli, 1998, 1999b).

"경구 내성(oral tolerance)"을 얻기 위한 자가항원의 경구 투여가 여러 자가면역 질병들의 처치용으로 기술되었다. 예를 들면, EP 359 783 호에는 다발성 경화증의 처치를 위한 MBP의 경구 투여를 기술하고 있다. PCT 국제공개 WO 91/12816 호, WO 91/08760 호 및 WO 92/06704 호들 모두는 다양한 자가항원들로의 경구내성법(oral tolerance method)을 사용하여 다른 자가면역 질병들을 처치하는 것을 기술하고 있다. PCT 국제공개 WO 98/30227 호에는 수초 항원들에 대한 자가면역 T-세포 응답을 억제하기 위한 코폴리머 1의 섭취(ingestion) 또는 흡입(inhalation)에 의한 다발성 경화증의 처치를 기술하고 있다.

코폴리머 1에 관련된 화합물들 역시 연구되었으며, 코폴리머 1에 유사한 특성들을 갖는다는 것이 밝혀졌다. 예를 들면, 코폴리머 1에서 발견된 4개의 아미노산들 중 3개로 이루어진 코폴리머는 정제된 클래스 2 MHC 분자들에 결합한다(Fridkis-Hareli et al, 1999a, WO 005250 호).

게다가, 다발성 경화증 및 류머티스성 관절염-관련 HLA-DR 분자들에의 코폴리머 1의 결합 모티프(binding motif)들이 최근 밝혀졌다(Fridkis-Hareli et al, 1999b). 이들 결합 모티프들로부터, 고정된 서열의 폴리펩티드를 상기 HLA-DR 분자들의 펩티드 결합 홈(peptide binding groove)에 결합시키는 것을 용이하게 제안하고 그리고 시험할 수 있다. 이러한 펩티드들은 Cop 1 자체와 유사한 방법으로 행동할 것으로 기대된다. 이러한 합성 펩티드들의 예들이 WO 005249 호에 기술되어 있다.

본 명세서의 본 장 또는 다른 부분들에서의 어떠한 참고문헌의 인용 또는 확인들도 이러한 참고문헌이 본 발명에 대한 선행기술로서 언급된 것임을 인정하는 것으로 해석되어서는 안될 것이다.

관련된 출원들에 대한 교차-참조

본 출원은 2000년 1월 20일자로 출원된 미합중국 특허출원 제 09/487,793 호, 2000년 6월 7일자로 출원된 동 제 60/209,799 호 및 2000년 7월 20일자로 출원된 동 제 09/620,216 호들의 우선권을 주장한다. 제 09/487,793 호, 제 60/209,799 호 및 제 09/620,216 호의 각 출원들의 내용들은 본 명세서에 참고로 인용하였다.

발명의 분야

본 발명은 신경 재생(nerve regeneration)의 촉진(promotion) 또는 신경성 퇴화(neuronal degeneration)의 방지(prevention) 또는 억제(inhibition)하여 신경계(NS ; nervous system)의 손상(injury) 또는 질병(disease)을 개선(ameliorate)시키기 위한 조성물들 및 방법들에 관한 것이다.

특히, 본 발명은 코폴리머 1(Cop-1) 또는 Cop 1-관련 펩티드 또는 폴리펩티드 및/또는 Cop-1이나 Cop 1-관련 펩티드나 폴리펩티드로 처리되어 활성화된 T-세포들을 포함하여 인간의 중추신경계 또는 말초신경계 내의 신경 재생을 촉진하거나 또는 신경들의 손상 또는 질병에 기인한 신경성 퇴화를 방지 또는 억제하는 조성물들에 관한 것이다. 본 발명에 따른 상기 조성물들은 단독으로 또는 어떠한 다른 소정의 조합으로 선택적으로 투여될 수 있다.

발명의 요약

본 발명은 신경계의 손상 또는 질병의 영향들을 완화시키고 치료하기 위한 신경 재생의 촉진 또는 신경 퇴화의 방지 또는 억제를 위한 방법들 및 조성물들에 관한 것이다.

본 발명은 부분적으로는 Cop 1에 대한 활성화된 T-세포들이 신경 재생을 촉진하거나 또는 신경 보호를 부여한다는 본 발명자들의 예기치 못한 발견에 기초하고 있다. 본 발명은 또한 부분적으로는 Cop 1에 대한 활성화된 T-세포들이 글루타메이트 독성으로부터 신경세포들을 보호한다는 본 발명자들의 예기치 못한 발견에 기초하고 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "신경 보호"는 1차적인 위험인자(primary risk factor)가 제거되거나 또는 약화(attenuate)된 후에도 지속되는 2차 신경 퇴화 영향들로부터의 보호를 포함하여, 신경계의 손상 또는 질병의 퇴화성 영향들의 방지 또는 억제를 의미한다. 이는 백질(white matter) 및 회백질(gray matter) 두 가지 모두의 보호를 포함한다. 최근까지도, 면역체계는 면역세포들이 신경계 회복에 참여하는 것을 배척한다고 여겨졌다.

Cop 1 활성화된 T-세포들이 신경 재생을 촉진시키거나 중추신경계 또는 말초신경계의 손상 또는 질병에 기인하는 손상에 후속될 수 있는 2차 퇴화로부터 신경계 조직들을 보호하는 데 사용될 수 있다는 발견은 매우 놀랄 만한 것이다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "활성화된 T-세포"는 (ⅰ) Cop 1 또는 Cop 1-관련 펩티드 또는 폴리펩티드에의 노출에 의해 활성화된 T-세포들 (ⅱ) 이러한 활성화된 T-세포들의 소산(progeny)들을 포함한다.

하나의 구체적인 실시예에서, 본 발명은 치료상으로 유효한 양의 Cop 1-특이성의 활성화된 T-세포들을 포함하는 약학 조성물(pharmaceutical composition)들 및 중추신경계 또는 말초신경계 내의 신경 재생을 촉진시키거나 또는 신경 퇴화를 방지하거나 또는 억제하기 위하여 상기한 조성물들을 신경계의 손상 또는 질병의 영향들을 개선시키는데 유효한 양으로 사용하는 방법들을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "Cop 1-특이성인 활성화된 T-세포"들은 Cop 1 또는 Cop 1-관련 펩티드 또는 폴리펩티드에 대해 특이성을 갖는 활성화된 T-세포들을 의미한다.

Cop 1-특이성인 활성화된 T-세포들은 신경재생을 촉진하거나 또는 다발성 경화증을 제외하지 않은, 이하의 섹션(3)에서 기술된 바와 같은 조건 또는 질병에 기인하는 신경 퇴화 진행의 영향에 후속될 수 있는 2차적 퇴화 영향들을 방지하거나 또는 억제하는 데 사용된다.

그 예들에는 녹내장, 뇌졸증(stroke), 빈형, 총격(gunshot) 및 위험한 운동들에 의해 야기된 뇌손상들을 포함하나, 이들에 제한되지는 않는다. 상기 Cop 1-특이성의 활성화된 T-세포들은 수초(백질)와 관련된 1차 및 2차 위험인자들 뿐만 아니라 글루타메이트 독성에 대하여 발견된 보호의 면에서 신경세포 본체들(neuronal cell bodies) 자체들(회백질)과 관련된 1차 및 2차 위험인자들에 대한 신경 보호를 제공하도록 기능한다.

따라서, Cop 1-특이성의 활성화된 T-세포들은 본 발명의 목적들에 유용할 것으로 기대되며, 공지의 면역요법 기술들에 의해 암시되지는 않는 것이다. 더욱이, Cop 1이 글루타메이트 독성으로부터 보호하기 때문에, 그 작용은 전적으로 수초와의 교차-반응성을 경유하는 것만은 아니다. 또한, 이는 조절세포 또는 조절물질들에 의하는 것과 같은 조절활성을 갖는다.

이러한 조절활성의 관점에서, Cop 1 백신화 및 Cop 1-특이성의 활성화된 T-세포들은 또한 신경세포들에의 산화성 스트레스(oxidative stress) 및 다른 손상원(source of damage) 들에 의해 야기된 손상으로부터 백질 및 회백질을 보호할 것이 기대된다. 게다가, 이러한 조절활성 때문에, 본 발명은 또한 선행기술에서 제안되었던 것과 같이 다발성 경화증 뿐만 아니라 다발성 경화증 이외의 다른 자가면역 질병들로부터 신경세포들을 보호하는 데 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 치료상으로 유효한 양의 Cop 1 또는 Cop 1-관련 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물 및 중추신경계 또는 말초신경계 내의 신경 재생을 촉진시키거나 또는 신경 퇴화를 방지하거나 또는 억제하기 위하여 상기한 조성물들을 시험관 내 또는 생체 내에서 T-세포들을 활성화시키기에 유효한 양으로 사용하며, 상기 활성화된 T-세포들이 신경계의 손상 또는 질병의 영향들을 억제 또는 개선시키는 방법들을 제공한다.

본 발명의 실시에 있어서, Cop 1-특이성의 활성화된 T-세포들의 투여를 포함하는, 손상 또는 질병의 영향들의 개선 및 처치를 위한 요법은 선택적으로 Cop 1 또는 Cop 1-관련 펩티드 또는 폴리펩티드들로 조합될 수 있다. 게다가, Cop 1 또는 Cop 1-관련 펩티드 또는 폴리펩티드 항원의 경구 투여는 부형제 중에서 투여된 Cop 1으로 개시(priming)된 후의 신경 보호에 유효하다.

따라서, 손상 직후 임계 T-세포 응답을 구축하기 위하여 바람직하게는 부형제 내의 이러한 Cop 1의 1차 활성화에 후속하여 T-세포들의 활성화를 촉진(boost)시키기 위하여 경구용 Cop 1이 사용될 수 있다.

다른 구체적인 실시예에 있어서, 필요에 따라 차후의 개인들의 신경 보호 처치를 위한 Cop 1으로 민감화된 T-세포(Cop 1 sensitized T cell)들을 저장하기 위한 세포 은행(cell bank)들이 구축될 수 있다. 이러한 경우에 있어서, 자기유래(autologous) T-세포들이 개인으로부터 수득될 수 있다. 달리, 가장 통상적인 MHC-클래스 2 타입들의 개개의 T-세포들의 은행이 제공되는 것과 같이, 동종간(allogenic) 또는 부분-동종간(semi-allogenic) T-세포들이 저장될 수 있다.

어느 개인을 손상에 대해 처치하고자 하는 경우, 자기유래의 저장된 T-세포들이 바람직하게 사용될 수 있으나, 자기유래의 T-세포들을 얻을 수 없는 경우에는, 환자와 MHC 타입 2 분자를 공유하는 세포들이 사용될 수 있으며, 이는 그러한 개인에게 작용할 것으로 기대된다. 상기 세포들은 바람직하게는 Cop 1 또는 Cop 1-관련 펩티드 또는 폴리펩티드에 노출된 후, 활성화된 상태로 저장된다.

그러나, 상기 세포들은 또한 일단 사용을 위해 해동(thawed)되고, 준비되고, 활성화되어, 휴지상태(resting state)로 저장될 수 있다. 상기 세포 은행의 세포주(cell line)들은 바람직하게는 저온저장(cryopreserve)될 수 있다. 상기 세포주들은 당해 기술분야에서 공지된 어떠한 방법으로도 준비될 수 있다.

일단 상기 세포들이 해동된 후에는, 바람직하게는 생존불가능한 세포들을 제거하기 위하여 주사에 앞서 배양된다. 배양 동안에는, 상기 세포들은 원래의 활성화에서 사용되었던 Cop 1 항원 또는 펩티드를 사용하여 활성화 또는 재활성화 될 수 있다. 달리, 피토헤마그글루티닌(PHA ; phytohemagglutinin) 또는 콘카나발린 에이(concanavalin A)(바람직하게는 전자)와 같은 미토겐(mitogen)의 존재 중에서의 배양에 의하여 활성화가 이루어질 수 있다. 이는 상기 세포들을 보다 높은 상태의 활성화에 위치시킬 수 있다.

본 발명에 따른 처치가 여전히 유효하게 되도록 하기 위하여 손상 후, 1주일 또는 그 이상에서 언제든지 일어날 수 있기 때문에, 상기 세포들을 배양하는 데 소용되는 며칠은 환자에게는 손해가 되는 것은 아니다. 달리, 시간이 절대적이라면, 상기 저장된 세포들은 해동 후 즉시 투여될 수 있다.

도면의 간단한 설명

도 1A 및 도 1B는 경미한 시신경 손상(도 1A) 또는 심각한 시신경 손상(도 1B) 직후, 불완전 프룬드 부형제(IFA ; incomplete Freund's adjuvant) 중의 PBS(도면들에서는 PBS로 표시) 또는 불완전 프룬드 부형제 중의 Cop 1-특이성의 T-세포들로 주사된 생쥐들로부터 절개해 낸 망막(retina)들 중 표지된(생존하는) 망막 신경절 세포들/㎟의 수를 나타내는 그래프이다.

도 2A 및 도 2B는 분비된 신경영양인자(neurotrophic factor)들의 ELISA 분석을 나타내는 그래프이다. 생쥐의 항-MBP T-세포들(도 2A의 흰색 막대들) 또는 항-Cop 1 T-세포들(도 2A의 흑색 막대들)은 자극 배지(stimulation medium) 중에서 그들의 특이성 항원들로 48시간 동안 배양시켰다. 상기 T-세포 상등액(supernatant)들은 수집되어 샌드위치 ELISA 분석에 적용시켰다.

상기 도면은 각 샘플 중에 분비된 NT3, BDNF, NGF 및 NT-4/5의 농도를 나타낸다. 항-MBP T-세포들에 의해 분비된 양에 대한 항-Cop 1 T-세포들에 의해 분비된 BDNF 또는 NT-3의 양의 비율을 도 2B에 나타내었다. 영양물질들(NT ; neurotrophine)에 대한 5개의 독립된 실험들의 평균 비율 ±표준편차(SD)로 나타내었다.

도 3은 Cop 1으로의 면역화가 어떻게 2차 퇴화로부터 시신경섬유(optic nerve fiber)들을 보호하는 가를 나타내는 도면이다. 경미한 시신경 손상 직후, 생쥐들을 불완전 프룬드 부형제 중의 PBS 또는 불완전 프룬드 부형제 중의 Cop 1으로 피하경로로 면역화 시켰다. 2차 퇴화의 평가(assessment)를 위하여, 충돌 손상 2주 후에 손상의 부위에 대한 시신경의 말단(distal)에 신경추적자(neurotracer) 염료 4-Di-10-Asp를 적용시켰다. 5일 후, 그 생쥐들을 살처분시키고, 그 망막들을 절개해내어 평판-탑재(flat-mount)시켰다.

각 망막 중의 광디스크(optic disk)로부터 대략 동일한 거리에 위치하는 4개의 영역들로부터 표지된(생존하는) 망막 신경절 세포들을 형광현미경 하에서 계수하였다. PBS 주사의 신경보호 효과와 비교하여 Cop 1 면역의 신경보호 효과는 명백하였다(P<0.05, 스튜던트 티-테스트(Student's t-test)). 상기 결과들은 두 실험들의 요약이다. 각 그룹은 생쥐들의 8/10을 포함하였다.

도 4는 Cop 1으로의 면역화가 어떻게 글루타메이트 독성으로부터 시신경섬유들을 보호하는 가를 나타내는 도면이다. 생쥐들을 완전 프룬드 부형제(CFA ; complete Freund's adjuvant) 내에 에멀젼화 시킨 Cop 1으로 면역화 시켰으며, 대조군 생쥐들은 완전 프룬드 부형제 만으로 주사하였다.

계속해서, 각 생쥐의 한쪽 안구에는 생리식염수(saline) 만을, 다른 한쪽 안구에는 200nmole의 글루타메이트를 포함하는 생리식염수를 주사하였다. 글루타메이트 투여 7일 후, 망막들을 절개해내어 평판-탑재시켰다. 표지된(생존하는) 망막 신경절 세포들을 계수하였다. 막대들은 생리식염수 또는 글루타메이트를 포함하는 생리식염수 두 가지 모두를 수용하는, 완전 프룬드 부형제로 처치된 생쥐들 및 생리식염수 또는 Cop 1을 포함하는 생리식염수 두 가지 모두를 수용하는 완전 프룬드 부형제-Cop 1으로 처치된 생쥐들에 대한 잔존하는 망막 신경절 세포들을 대조군의 백분율로 나타낸 것이다.

도 5A 및 도 5B는 pMOG로의 면역화(도 5A) 또는 항-MBP T-세포들의 수동적 전달(passive transfer)이 생쥐의 망막 신경절 세포들을 글루타메이트 독성으로부터 보호하지 못한다는 것을 나타내는 도면이다.

도 5A에서, C57BL/6J 쥐들은 그 망막 신경절 세포들이 L-글루타메이트(200nmole)의 안구 유리체내로의 주사(intravitreous injection)에의한 글루타메이트 독성에 직접적으로 노출되기 14일 전에 pMOG로 면역화 되었다. 4일 후, 상기 망막 신경절 세포들은 플루오로골드(FluoroGold)로 역행적으로(retrogradely) 표지되었으며, 그 3일 후에 망막 절개 및 계수가 수행되었다(실험 2의 실시예 3의 재료 및 방법들을 참조하시오).

망막 신경절 세포 생존은 ㎟ 당 평균 ±SEM으로 표현되었다. 완전 프룬드 부형제 중의 pMOG로 처치한 그룹(n=8)과 완전 프룬드 부형제 중의 PBS로 처치한 대조군(n=7) 사이에서 글루타메이트 주사 후 망막 신경절 세포 생존에 있어서 명백한 차이들은 없었다.

도 5B에서, 루이스 생쥐(Lewis rats)들은 그 안구 유리체내로 글루타메이트가 주사되었다. 4일 후, 망막 신경절 세포들은 염료 4-Di-10-Asp의 적용에 의해 표지되었으며, 그 5일 후에 망막 절개 및 계수가 수행되었다. T-세포로 처치된 그룹에서의 망막 상의 생존은 대조군에서의 망막 상의 생존과 명백하게 다르지 않았다는 것을 주목하여야 한다(㎟ 당 망막 신경절 세포들의 수, 평균 ±SEM(각 그룹에서의 n=6)).

도 6A 및 도 6B는 글루타메이트의 안구 유리체 내로의 주사에 따른 임파구(lymphocyte)들의 침입(invation)을 나타낸다. C57bl/6 쥐들의 안구 유리체 내로 글루타메이트를 주사하였다. 24시간 후, 안구를 제거하고, 조직검사(histology)를 수행하였다. 글루타메이트-주사된 그룹의 생쥐들(도 6A)과 대조군 생쥐들(도 6B) 두 가지 모두의 H&E-염색 망막부(H&E-stained retinal section)들을 나타냈다. 막대=200㎛.

도 7은 시신경 손상 후, 망막 신경절 세포들의 생존율을 나타낸다. 완전 프룬드 부형제 중에 에멀젼화 시킨 Cop 1 50㎍으로 면역화 시킨 10일 후, 동계의(inbred), 성체 Balb/c 쥐들의 망막 신경절 세포들을 플루오로골드로 역행적으로 표지시켰다(실험 2의 실시예 3의 실험부를 참조하시오). 대조군 생쥐들은 완전 프룬드 부형제 중의 PBS로 주사하였다(각 그룹에서 n=8 내지 12).

망막 신경절 세포들의 표지 3일 후, 생쥐들의 시신경의 인트라오비탈부(intraorbital portion)에 심각한 충격 손상을 가하였다. 손상 2주 후, 망막들을 절개해내어, 표지된 망막 신경절 세포들을 계수하였다(실험 2의 실시예 3의 실험부를 참조하시오.). 면역화 되지 않은 대조군에 비하여, 완전 프룬드 부형제 중의 Cop-1으로 면역화된 생쥐들에서 생존율은 명백하게 높게 나타났다(P<0.001, 스튜던트 티-테스트).

도 8A 내지 도 8D는 Cop-1으로의 적극적 면역화에 의한 글루타메이트 독성으로부터의 신경 보호를 나타낸다. 도 8A에서, 글루타메이트 주사 10일 전, 생쥐들은 완전 프룬드 부형제 중의 Cop-1(5㎎/㎖)로의 피하주사에 의하여 면역화 되었거나 또는 완전 프룬드 부형제 중의 PBS로 주사되었다. 하나의 실험의 결과들을 나타내었다(각 그룹에서 n=5). ㎟ 당 생존하는 망막 신경절 세포들의 수(평균 ±SEM)는 완전 프룬드 부형제 중의 PBS로 주사된 생쥐들 또는 글루타메이트 만 수용된 생쥐들 보다 Cop-1-면역화 된 생쥐들에서 명백하게 더 높았다(P<0.02, 2-테일드(2-tailed) 티-테스트). 완전 프룬드 부형제 중의 PBS로의 주사는 망막 신경절 세포들의 수에 대해 감지할 만한 영향이 없었다. 실험은 3회 반복되었으며, 결과들은 동일하였다. Cop-1으로 처치된 그룹에서의 13마리 및 PBS로 처치된 그룹에서의 15마리들이 전부 실험되었다.

도 8B에서, 글루타메이트의 안구 유리체내로의 주사 직후, 생쥐들을 완전 프룬드 부형제 중에 에멀젼화 된 Cop-1(5㎎/㎖ 박테리아)으로 면역화 시켰다. 1주 후, ㎟ 당 생존하는 망막 신경절 세포들의 수를 결정하였다. 하나의 실험의 결과들을 나타내었다. Cop-1으로의 면역화의 영향은 명백하였다(P<0.05, 2-테일드 티-테스트; Cop-1에 대해서는 n=12 그리고 대조군에 대해서는 n=8). 이 실험은 Cop-1 면역화에 대해서는 11마리의 생쥐들 그리고 완전 프룬드 부형제 중의 PBS(5㎎/㎖ 박테리아)로의 주사에 대해서는 8마리의 생쥐들을 사용하여 반복하였다.

도 8C에서, 글루타메이트 상해(glutamate insult) 및 부형제 중의 Cop-1(0.5㎎/㎖ 박테리아)로의 즉각적 면역화 후의 망막 신경절 세포들의 생존을 나타내었다. ㎟ 당 생존하는 망막 신경절 세포들의 수는 글루타메이트로 주사된 생쥐들(n=5)에서 보다 Cop-1-면역화된 생쥐들(n=15)에서 명백하게 높았다((P<0.04; 2-테일드 티-테스트).

도 8D에서, 글루타메이트 공격 이전, 직후 또는 48시간 후, 수행된 면역화 후의 망막 신경절 세포들의 생존을 나타내었다. 막대들은 반복된 실험들에서 수집된, 각 처치에서 검사된 모든 생쥐들에 대해 모아진 결과들을 나타낸다. 상기 글루타메이트 공격 후 48시간에서 면역화가 수행된 경우에서 효과는 없었다.

도 9는 Cop-1 면역이 NMDA 독성으로부터 생쥐들을 보호하는 데 실패한 것을 보여준다. NMDA의 주사(75nmole) 10일 전에, 생쥐들을 완전 프룬드 부형제 중의Cop-1(n=5 내지 7) 또는 완전 프룬드 부형제 중의 PBS로의 피하 주사에 의해 면역화 시켰다. 망막 신경절 세포들의 표지화 및 형광 현미경 하에서의 생존하는 망막 신경절 세포들의 계수를 도 5A에 대해 기술된 바대로 수행하였다.

정상 안구 중의 생존의 백분율로 표시된, Cop-1-면역화된 생쥐들에서의 망막 신경절 세포 생존은 PBS-주사된 생쥐들에서의 망막 신경절 세포 생존과 유사하였으며(p=0.55, 스튜던트 티-테스트), 신경 보호가 없었다는 것을 나타낸다.

도 10은 Cop-1-반응성 T-세포들이 글루타메이트 독성으로부터 망막 신경절 세포들을 보호한다는 것을 나타낸다. 글루타메이트(200nmole)의 주사 직후, 생쥐들에 Cop-1-반응성 T-세포들 및 PBS를 주사하였다. 염료의 적용, 망막 신경절 세포들의 준비 및 계수 그리고 생존하는 망막 신경절 세포의 계산을 도 5B에 대해 기술된 바대로 수행하였다. PBS-주사된 대조군 생쥐들의 망막들에서 보다 Cop-1-반응성 T-세포들로 주사된 생쥐들의 망막들에서 분명하게 보다 많은 표지된 망막 신경절 세포들이 나타났다(p<0.0007, 스튜던트 티-테스트).

도 11A 내지 도 11D들은 루이스 생쥐들에서 생존하는 망막 신경절 세포들에 대하여 만성적으로 증가된 IOP 및 Cop-1 면역화의 영향을 나타낸다. 도 11A에서, 상공막(episcleral)의 정맥 및 연정맥(limbal vein)들을 폐색 시키는 레이저 소작(laser cauterization)이 IOP의 증가 및 후속의 망막 신경절 세포들의 사멸의 결과가 되는 것을 나타낸다. 레이저 조사 3주 후, 평균 IOP는 무처리 생쥐들에서의 15.8 ±0.2㎜Hg(n=7)에 비해 정맥 폐색의 적용을 받은 생쥐들에서는 30.4 ±0.42㎜Hg(평균 ±SEM의 보다 적은 망막 신경절 세포들이 계수되었다.

도 11C에서, 정맥 폐색 직후 Cop-1으로의 면역화가 망막 신경절 세포 손상을 감소시킨다. 생쥐들은 레이저 조사 후 즉시 완전 프룬드 부형제 중의 Cop-1(200㎍)으로 면역화 되거나(n=15), 또는 완전 프룬드 부형제 중의 PBS로 주사되었다(n=13). 3주 후, 망막들은 절개되어지고, 전체적으로 평판-탑재되고, 그리고 로다민 덱스트란 아민(rhodamine dextran amine)으로 사전-표지된 망막 신경절 세포들의 수가 계수 되었다.

막대들은 무처리 생쥐들에서의 망막 신경절 세포들의 수의 백분율로 계산된, 각 그룹의 생쥐들에서의 망막 신경절 세포 손실을 나타낸다(평균 ±SEM). 2 그룹들에서의 망막 신경절 세포들의 수치들에서의 차이는 명백하였다(p<0.0001, 2-tailed t-test).

도 11D에서, 망막 신경절 세포에 대한 지연된 면역화의 효과는 정맥 폐색 10일 후 생쥐들을 면역화 시키는 것에 의해 검사되었다. 막대들은 무처리 동물들에서의 망막 신경절 세포들의 수의 백분율로 계산된, Cop-1으로 처치된 그룹(n=5) 또는 PBS로 처치된 그룹(n=4)들에서의 망막 신경절 세포 손실을 나타낸다(평균 ±SEM). 신경 보호 영향에 대한 경향은 Cop-1으로의 지연된 면역화 후에 관측되었으며, 그 차이는 단지 1-tailed t-test에서 명백하였다(p=0.04).

발명의 상세한 설명

단지 설명을 용이하게 하기 위하여, 본 발명의 상세한 설명을 (1) Cop 1 특이성의 활성화된 T-세포들; (2) Cop 1 및 Cop 1-관련 펩티드 및 폴리펩티드; (3) 치료의 용도; (4) 조성 및 투여; (5) T-임파구들에 대한 자기유래의 세포 은행 구축; (6) 실시예들; 및 (7) 결과들의 토론; 의 섹션들로 나누었다.

(1) Cop 1 특이성의 활성화된 T-세포들

Cop 1-특이성의 활성화된 T-세포(ATC)들은 섹션 (2)에서 규정된 바와 같이 Cop 1 또는 Cop 1-관련 펩티드 또는 폴리펩티드의 존재 중에서 활성화된 T-세포들이다. 이러한 ATC들은 신경계 퇴화 또는 신경계 중에서의 재생을 촉진시키는 중추신경계 또는 말초신경계의 손상 또는 질병의 영향들을 처치, 즉 개선 또는 억제시키는 데 사용될 수 있다.

게다가, 글루타메이트가 만성 또는 급성의 모든 신경퇴화성 질병들에서의 매개자이기 때문에, 이러한 ATC들이 글루타메이트 독성으로부터 중추신경계 세포들을 보호하거나 또는 비정상적 안내압(intraocular pressure)과 같이 글루타메이트 독성에 의해 야기되거나 또는 악화된 질병들 또는 상태들을 처치하기 위하여 사용될 수 있다.

상기 Cop 1-특이성의 활성화된 T-세포들은 바람직하게는 자기유래성, 특히 바람직하게는 CD4 및/또는 CD8 표현형(phenotype)이나, 이들은 또한 관련된 공여자(donor)들, 예를 들면 형제자매(sibling)들, 부모들, 자녀들, 또는 HLA-일치된 또는 부분적으로 일치된, 부분-동종간 또는 완전 동종간 공여자들로부터의 동종간 T-세포들이 될 수 있다.

대상체(subject)로부터 단리된 자기유래의 T-세포들의 사용에 더해, 본 발명은 또한 신경 보호를 위하여 부분-동종간 T-세포들의 사용을 제공한다. 이들 T-세포들은 단기간 및 장기간용 세포주들로 제조되고, 중추신경계의 손상으로 고통을받으며, T-세포 신경 보호가 필요한 대상체에 해동 및 즉시 또는 1 내지 3일간의 배양 후, 적용시키기 위하여 통상의 저온저장에 의해 저장된다.

부분-동종간 T-세포들의 사용은 항원 주요 세포(APC ; antigen presenting cell)들이 MHC 분자, 클래스 1 또는 클래스 2들을 발현한다는 가정 하에, T-세포들이 외부 항원 주요 세포들에 의해 제공되는 특이성 항원 에피토프(specific antigen epitope)를 인식하며, 특이성 대응 T-세포 개체군(population)들이 그에 제한된다는 사실에 기초한다.

따라서, 대상체의 MHC 분자들, 바람직하게는 HLA-DR 또는 HLA-DQ 또는 다른 HLA 분자들의 대립형질의(allelic) 산물을 인식할 수 있고, 또한 Cop 1 에피토프에 대해 특이성인, T-세포들의 부분-동종간 개체군은 대상체의 신경계 손상의 영역내의 Cop 1과 교차-반응성인 항원들을 인식하고, 요구된 신경 보호 효과를 생산할 수 있게 된다. T-세포들이 손상의 영역으로 이동되고, 그곳에 축적되고, 그리고 활성화를 수행하기 위하여 요구되는 접착 분자들(adhesion molecules), 백혈구 이동 분자들(leukocyte migration molecules) 및 보조 분자들(accessory molecules)에서 다형성(polymorphism)은 거의 없거나 또는 전혀 없다.

따라서, 상기 부분-동종간 T-세포들은 신경 보호가 필요한 중추신경계 자리에로 이동시키고, 축적시킬 수 있으며, 또한 활성화되어 소정의 효과를 낼 수 있을 것이다.

부분-동종간 T-세포들이 대상체의 면역 체계에 의해 거부(reject)될 수 있다는 것은 알려진 바이나, 그러한 거부(rejection)가 발달하기에는 대략 2주가 소요된다. 따라서, 상기 부분-동종간 T-세포들은 신경 보호를 발휘하는데 필요한 2주간의 기회를 갖게 된다. 2주 후에는, 상기 부분-동종간 T-세포들은 대상체의 몸체로부터 거부될 수 있으나, 이러한 거부가 대상체의 외부 T-세포들을 제거할 수 있고, 또한 활성화된 T-세포들의 어떠한 바람직하지 않은 결과들을 방지할 수 있기 때문에, 이러한 거부는 대상체에 유리하다. 따라서, 상기 부분-동종간 T-세포들은 중요한 안전 인자를 제공하며, 바람직한 실례가 된다.

HLA 클래스 2 분자들의 상대적으로 적은 수(일부)는 인구의 대부분의 개체들에서 공유된다는 것은 알려진 바이다. 예를 들면 유대인(Jewish population)들의 대략 50%는 HLA-DR5 유전자를 발현한다. 따라서, HLA-DR로 제한된 Cop 1 에피토프들에 반응성인 특이성 T-세포들의 은행은 유대인의 50%에는 유용하게 된다. 전체 인구는 DR1, DR4, DR2 등과 같은 몇몇 다른 주요한(prevalent) HLA 분자들로 제한된, 필수적인 소수의 부가 T-세포주들에 의해 커버될 수 있다.

따라서, 기능상 균일한 T-세포주들의 은행이 주어진 인구에서 거의 모든 임의의 개인들에 즉각적으로 사용될 수 있도록 준비되고, 또한 저장된다. 이러한 T-세포들의 은행은 처치 기회의 가능한 시기상 범위 동안에 신경 보호가 필요한 대상체로부터 충분한 수의 특이성 T-세포들을 얻기 위한 임의의 기술적 문제들을 극복할 수 있도록 한다.

상기 부분-동종간 T-세포들은 그들의 신경 보호 역할을 완수한 후 만족스럽게 거부되게 된다. 본 발명의 이러한 관점은 모순된 것은 아니며, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 자기유래의 T-세포들의 사용에 부가되는 것이다.

비록 약화시킨 Cop 1-특이성의 활성화된 T-세포들이 사용될 수 있기는 하나, Cop 1-특이성의 활성화된 T-세포들은 바람직하게는 약화시키지 않는다. T-세포들은 예를 들면, 1.5 내지 10.0Rads의 감마선-조사(Ben-Nun et al, 1981b; Ben-Nun et al, 1982)들에 의하거나 및/또는 예를 들면, 미합중국 특허 제 4,996,194 호(Cohen et al)에서 기술된 바와 같은 가압 처치(pressure treatment)에 의한 방법들을 포함하나, 이들에 제한되지 않는 당해 기술분야에서 공지된 방법들을 사용하여 약화시킬 수 있다.

바람직한 구체예에서 상기 Cop 1-특이성의 활성화된 T-세포들은 다음과 같이 단리될 수 있다. T-세포들은 당해 기술분야에서 공지된 방법들에 따라 단리되고, 정제될 수 있다(Mor et al, 1995). 구체적인 실시예는 섹션(6)의 실시예 1을 참조하시오.

Cop 1을 인식하는, 대상체의 순환 T-세포들은 공지의 절차들을 사용하여 단리되고, 확장될 수 있다. Cop 1-특이성의 활성화된 T-세포들을 얻기 위해서는, T-세포들은 공지의 절차들을 사용하여 단리되고, 계속해서 Cop 1-특이성의 ATC들은 확장된다(Burns et al, 1983; Pette et al, 1990; Martin et al, 1990; Schluesener et al, 1985; Suruhan-Dires Keneli et al, 1993, 이들은 그 전체로서 본 명세서에 참고로 인용되었음).

T-세포들의 생체 외 활성화 동안에, 상기 T-세포들은 적어도 하나의 적절한 성장 촉진 인자가 첨가된 배지 내에서 이들을 배양하는 것에 의해 활성화될 수 있다. 이러한 목적을 위해 적절한 성장 촉진 인자들에는 예를 들면 종양 괴사 인자알파(TNF-α; tumor necrosis factor α), 인터류킨 2(IL-2) 및 인터류킨 4(IL-4)들을 포함하나, 이들에 제한되는 것은 아니다.

하나의 구체예에서, 상기 활성화된 T-세포들은 신경계 내의 손상 또는 질병의 영향들을 완화시키는 물질을 내인성적으로 생산한다.

다른 하나의 구체예에서, 상기 활성화된 T-세포들은 다른 세포들을 자극하는 물질을 내인성적으로 생산하며, 이러한 다른 세포들을 자극하는 물질들에는 변환 성장 인자-베타(TGF-β ; transforming growth factor-β), 신경 성장 인자(NGF), 향신경성 인자 3(NT-3 ; neurotrophic factor-3), 향신경성 인자 4/5(NT-4/5 ; neurotrophic factor-4/5), 뇌 유래의 향정신성 인자(BDNF ; brain derived neurotrophic factor), 인터페론-감마(interferon-γ) 및 인터류킨-6(IL-6) 들을 포함하나, 이들에 제한되지 않으며, 여기에서 상기 다른 세포들은 직접적으로 또는 간접적으로 손상 또는 질병의 영향들을 완화시킨다.

시험관 내 증식(proliferation) 후, 상기 T-세포들은 포유동물 대상체에 투여된다. 바람직한 구체예에서, 상기 T-세포들은 인간 대상체에 투여된다. T-세포 확장은 바람직하게는 Cop 1 또는 Cop 1-관련 펩티드 또는 폴리펩티드를 사용하여 수행된다.

Cop 1-활성화된 T-세포들은 즉각적으로 사용되거나 또는 이하에서 기술된 바와 같이 예를 들면 저온저장에 의해 추후에 사용될 수 있도록 보존될 수 있다. Cop 1-특이성의 활성화된 T-세포들은 또한 앞서 저온저장된 T-세포들을 사용하여, 예를 들면 상기 세포들을 해동시키고, 상기 T-세포들을 Cop 1 또는 Cop 1-관련 펩티드또는 폴리펩티드와 함께, 또한 적절하게는 말초의 혈액 임파구(PBL ; peripheral blood lymphocyte)들과 함께 배양시켜 Cop 1-특이성 ATC들을 수득할 수 있다.

당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 명백하게 이해될 수 있는 바와 같이, 상기 T-세포들은 배양 전 또는 후 모두에서 예를 들면 저온저장에 의해 보존될 수 있다.

사용될 수 있는 저온저장제(cryopreservation agent)들에는 디메틸술폭사이드(DMSO)(Lovelock et al, 1959; Ashwood-Smith, 1961), 글리세롤, 폴리비닐피롤리돈(Rinfret, 1960), 폴리에틸렌글리콜(Sloviter et al, 1962), 알부민, 덱스트란, 자당(sucrose), 에틸렌글리콜, I-에리쓰리톨, D-리비톨, D-만니톨(Rowe et al, 1962), D-솔비톨, I-이노시톨, D-락토오스, 콜린 클로라이드(Rowe et al, 1962), 아미노산류(Phan The Tran et al, 1960a), 메탄올, 아세트아미드, 글리세롤 모노아세테이트(Lovelock, 1954), 무기염류(Phan The Tran et al, 1960b; Phan The Tran et al) 및 히드록시에틸 전분 및 인간 혈청 알부민과 결합된 디메틸술폭사이드(Zaroulis et al, 1980)들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다.

조절된 냉각속도는 절대적이다. 서로 다른 저온저장제들(Rapatz et al, 1968) 및 서로 다른 세포형들은 서로 다른 최적의 냉각속도들을 갖는다. 예를 들면, 세포들의 생존 및 그들의 이식 잠재성에 대한 냉각속도의 영향들에 대해서는 로우에 등(Rowe et al)(1962b); 로우에(Rowe)(1966); Lewis et al(루이스 등)(1967); 및 마주르(Mazur)(1970)들을 참조하기 바란다.

물이 얼음으로 변하는 혼재 상태(fusion phase)의 열은 최소화되어야 한다. 냉각절차는 예를 들면 프로그래밍이 가능한 냉각기구 또는 메탄올-조(methanol-bath) 절차의 사용에 의해 수행될 수 있다.

프로그래밍이 가능한 냉각기구들은 최적의 냉각속도의 결정을 가능하며, 표준의 재현가능한 냉각을 용이하게 한다. 크라이오메드(Cryomed) 또는 플래나(Planar)와 같은 프로그래밍-속도조절 냉동기(freezer)들이 소정의 냉각속도 곡선에 따른 냉각 계획의 조율(tuning)을 가능하게 한다.

냉각 후, 세포들은 신속하게 장기간 저온 저장 용기에로 이전될 수 있다. 하나의 구체예에서, 샘플들은 -80 내지 -20℃의 온도로 유지되는 냉동기와 같은 기계적 냉동기들 내에 저온 저장될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 샘플들은 액체 질소(-196℃) 또는 그 증기 중에서 저온 저장될 수 있다.

이러한 저장은 열손실 및 질소 손실들을 최소한으로 유지할 수 있도록 극히 낮은 진공 및 내부의 초절연 등을 갖는 대형 보온용기들과 유사한, 고효율의 액체 질소 냉장고(refrigerator)들의 획득에 의해 크게 편리하게 될 수 있다.

T-세포들의 가공, 저온 저장 및 장기간 저장에 대한 고찰들 및 절차들은 예를 들면, 본 명세서에서 참고로 포함하는 참고문헌들 즉, 고를린(Gorin)(1986) 및 국제 원자력 기구(International Atomic Energy Agency)(1969)에서 찾을 수 있다.

생존하는 세포들의 저온 저장의 다른 방법들 또는 그들의 변형들은 예를 들면 냉각금속-유리기술(cold-metal mirror technique)의 사용으로부터 얻을 수 있으며, 또한 구체화될 수 있다. 리비세이 등(Livesey et al)(1987); 린너 등(Linneret al)(1986); 센켄(Senken)과 그의 동료들에게 허여된 미합중국 특허 제 4,199,022 호; 및 Fahy에게 허여된 미합중국 특허 제 4,559,298 호 등을 참조하시오.

냉동된 세포들은 바람직하게는 신속하게 해동되며(예를 들면 37 내지 47℃로 유지되는 수조 내에서), 해동 후 즉시 냉각된다. 해동에 대한 세포상 응집을 예방하기 위하여 세포들을 처치하는 것이 바람직하다. 응집을 방지하기 위해서는, 냉동 전, 후의 DNA 분해효소(DBAse)(Spitzer et al, 1980), 저분자량 덱스트란, 저분자량 시트르산염, 시트르산염, 히드록시에틸 전분(Stiff et al, 1983) 또는 시트르산 덱스트로스(acid citrate dextrose)(Zaroulis et al, 1980)의 첨가를 포함하는(이에 제한되는 것은 아님) 여러 절차들이 사용될 수 있다.

만일 인간에 유해하다면, 상기 저온저장제는 해동된 T-세포들의 치료적 사용에 앞서 제거되어야 한다.상기 저온저장제를 제거하는 하나의 방법은 임의의 불분명한 농도로의 희석에 의한 것이 될 수 있다.

냉동된 T-세포들이 일단 해동되고, 회복되면, 이들은 냉동되지 않은 T-세포들에 대하여 본 명세서에서 기술된 바와 같이 신경 재생을 촉진시키는 데 사용된다. 일단 해동되면, T-세포들은 냉동에 앞서 활성화되었다고 가정하고, 즉각적으로 사용될 수 있다.

그러나, 바람직하게는 해동된 세포들은 생존하지 않는 세포들을 제거하기 위하여 환자에게 주사하기 전에 배양된다. 더욱이, 1 내지 3일의 가간에 걸친 이러한 배양의 과정에서, 냉동 T-세포들이 휴면 T-세포들인 경우, 세포들을 활성화시키기위하여, 또는 냉동에 앞서 활성화된 경우, 세포들이 보다 높은 활성화의 수준을 달성할 수 있도록 돕기 위하여 적절한 활성화제(activating agent)들이 첨가될 수 있다.

대개, T-세포들이 손상 후 1주일 및 그 이상에서 투여될 수 있으며, 또한 그들의 신경 재생 및 신경 보호 효과를 유지할 수 있도록 투여에 앞서 배양 단계를 허용하도록 시간을 사용할 수 있다.

(2) Cop 1 및 Cop 1-관련 펩티드 및 폴리펩티드

신경계 퇴화의 결과를 낳는 손상 또는 질병의 영향을 방지 또는 억제하기 위하여, 신경계 특히, 중추신경계에서의 신경 재생을 촉진하기 위하여, 글루타메이트 독성으로부터 중추신경계 세포들을 보호하기 위하여, 또는 글루타메이트 독성에 기인하거나 또는 악화된 손상 또는 질병을 처치하기 위하여 Cop 1 또는 Cop 1-관련 펩티드 또는 폴리펩티드 항원 또는 그들의 유도체를 포함하는 약학 조성물이 사용될 수 있다.

게다가, Cop 1 또는 Cop 1-관련 펩티드 또는 폴리펩티드 항원 또는 그들의 유도체는 생체 내 또는 시험관 내 T-세포들의 활성화에 사용될 수 있다. 하나의 구체예에서, 신경 재생을 촉진하거나 또는 중추신경계 또는 말초신경계 손상 또는 질병의 영향들을 방지하거나 또는 억제하는 방법은 Cop 1 또는 Cop 1-관련 펩티드 또는 폴리펩티드 항원 또는 그들의 유도체를 포유동물에 투여하여, Cop 1 또는 Cop 1-관련 펩티드 또는 폴리펩티드 항원 또는 그들의 유도체가 생체네 T-세포들을 활성화시켜 중추신경계 또는 말초신경계의 손상 또는 질병의 위치에서 축적되는 T-세포들의 개체군을 생산하도록 하는 것을 포함한다.

다른 구체예에서, Cop 1 또는 Cop 1-관련 펩티드 또는 폴리펩티드 항원 또는 그들의 유도체는 글루타메이트 독성으로부터 중추신경계 세포들을 보호하거나, 또는 글루타메이트 독성에 의해 야기되거나 또는 악화된 손상 또는 질병을 처치하기 위한 방법들에서 투여된다.

본 발명에서 사용되는 조성물은 Cop 1 또는 Cop 1-관련 펩티드 또는 폴리펩티드가 될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, "Cop 1 또는 Cop 1-관련 펩티드 또는 폴리펩티드"는 수초 염기성 단백질(MBP)과 기능적으로 교차-반응하고, 항원 존재 중에서 MHC 클래스 2에 대해 MBP와 경쟁할 수 있는 랜덤 코폴리머를 포함하여 어떠한 펩티드 또는 폴리펩티드도 포함하도록 한다.

상기 조성물은 글루탐산 또는 아스파르트산과 같은 음전하의 아미노산과 함께, 리신 또는 아르기닌과 같은 양전하의 아미노산 적당량을 포함하는 랜덤 코폴리머를 포함할 수 있으며, 충진제(filler)로 작용하는, 알라닌 또는 글리신과 같은 전기적으로 중성인 아미노산을 선택적으로 포함하며, 또한 티로신 또는 트립토판 등의 방향족 아미노산과 같이 코폴리머에 면역특성들을 부여하기 위하여 적용되는 아미노산들을 포함한다. 이러한 조성물들은 본 명세서에서 참고로 인용한 WO 005250호에 기술된 어느 임의의 것들도 포함할 수 있다.

특히, 본 발명에서의 사용을 위한 조성물은 하기 그룹들 즉, (a) 리신 및 아르기닌; (b) 글루탐산 및 아스파르트산; (c) 알라닌 및 글리신; (d) 티로신 및 트립토판 중의 적어도 3개의 그룹의 각각으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 랜덤 코폴리머로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 코폴리머를 포함한다.

본 발명에서의 사용을 위한 코폴리머들은 L-아미노산, D-아미노산 또는 이들의 혼합물로 이루어질 수 있다. 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 공지된 바와 같이, L-아미노산들은 대부분 천연의 단백질로부터 발생한다. 그러나, D-아미노산들은 상용적으로 구입할 수 있는 것이며, 본 발명의 3원공중합체(terpolymer) 및 다른 코폴리머들을 제조하는 데 사용된 아미노산들의 일부 또는 전부를 대체할 수 있다.

본 발명은 L-아미노산들 또는 D-아미노산들만으로 이루어진 코폴리머들과 마찬가지로, D-아미노산 및 L-아미노산들 둘 다를 포함하여 이루어지는 코폴리머들을 만들 수 있다.

본 발명의 하나의 구체예에서, 상기 코폴리머는 각각이 서로 다른 상기 그룹 (a) 내지 (d)들 중의 하나인 서로 다른 4개의 아미노산들을 포함한다. 본 발명의 본 구체예에 따른 바람직한 코폴리머는 전체적으로 양의 전기적 전하와 2,000 내지 40,000달톤(dalton), 바람직하게는 2,000 내지 13,000달톤의 분자량을 갖는 글루탐산, 리신 및 티로신의 조합을 포함한다.

가장 바람직한 실시예는 4,700 내지 13,000달톤의 평균분자량의 코폴리머 1(Cop 1)이다. 바람직한 형태의 코폴리머 1을 만들기 위한 바람직한 분자량 범위 및 공정들이 미합중국 특허 제 5,800,080호에 기술되어 있으며, 그 내용을 본 명세서에 완전히 참고로 포함시켰다. 이는 단지 실시예의 하나로서 주어진 것이며, 상기한 일반적인 기준들을 고수하는 한, 상기 조성은 성분 및 성분의 상대적인 비율들 두 가지 모두에 대해 변화될 수 있음은 명백한 것이다. 따라서, 상기 코폴리머는 15 내지 100, 바람직하게는 40 내지 80의 아미노산 길이의 폴리펩티드가 될 수 있다.

다른 구체예에 있어서, 상기 코폴리머는 각각이 서로 다른 상기 그룹 (a) 내지 (d)들 중의 3개의 그룹 중의 하나인 서로 다른 3개의 아미노산들을 포함한다. 이들 공중합체들을 본 명세서에서는 3원공중합체라고 칭한다.

하나의 구체예에서, 본 발명에서의 사용을 위한 상기 3원공중합체는 티로신, 알라닌 및 리신을 포함하여, 본 명세서에서는 야크(YAK)라고 칭한다. 이들 3원공중합체들에서의 아미노산들의 평균 몰분율은 변할 수 있다. 예를 들면, 티로신은 0.005 내지 0.250의 몰분율로 존재할 수 있고, 알라닌은 0.3 내지 0.6의 몰분율로 존재할 수 있고, 그리고 리신은 0.1 내지 0.5의 몰분율로 존재할 수 있다. 평균 분자량은 2,000 내지 40,000달톤, 바람직하게는 3,000 내지 35,000달톤 사이이다.

보다 바람직한 구체예에서, 상기 평균 분자량은 5,000 내지 25,000달톤이다. 리신 대신 아르기닌, 알라닌 대신 글리신 및/또는 티로신 대신 트립토판이 치환되는 것이 가능하다.

다른 구체예에서, 본 발명에서의 사용을 위한 상기 3원공중합체들은 티로신, 글루탐산 및 리신을 포함하며, 본 명세서에서는 예크(YEK)라고 칭한다. 이들 3원공중합체들에서의 아미노산들의 평균 몰분율은 변할 수 있으며: 글루탐산은 0.005 내지 0.300의 몰분율로 존재할 수 있고, 티로신은 0.005 내지 0.250의 몰분율로 존재할 수 있고, 그리고 리신은 0.3 내지 0.7의 몰분율로 존재할 수 있다.

평균 분자량은 2,000 내지 40,000달톤, 바람직하게는 3,000 내지 35,000달톤 사이이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 평균 분자량은 5,000 내지 25,000달톤이다. 글루탐산 대신 아스파르탐산, 리신 대신 아르기닌 및/또는 티로신 대신 트립토판이 치환되는 것이 가능하다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서의 사용을 위한 상기 3원공중합체들은 리신, 글루탐산 및 알라닌을 포함하며, 본 명세서에서는 케아(KEA)라고 칭한다. 이들 3원공중합체들에서의 아미노산들의 평균 몰분율 또한 변할 수 있다. 예를 들면, 글루탐산은 0.005 내지 0.300의 몰분율로 존재할 수 있고, 알라닌은 0.005 내지 0.600의 몰분율로 존재할 수 있고, 리신은 0.2 내지 0.7의 몰분율로 존재할 수 있다.

평균 분자량은 2,000 내지 40,000달톤, 바람직하게는 3,000 내지 35,000달톤 사이이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 평균 분자량은 5,000 내지 25,000달톤이다. 글루탐산 대신 아스파르트산, 알라닌 대신 글리신 및/또는 리신 대신 아르기닌이 치환되는 것이 가능하다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서의 사용을 위한 상기 3원공중합체들은 티로신, 글루탐산 및 알라닌을 포함하며, 본 명세서에서는 예아(YEA)라고 칭한다. 이들 3원공중합체들에서의 아미노산들의 평균 몰분율 또한 변할 수 있다. 예를 들면, 티로신은 0.005 내지 0.250의 몰분율로 존재할 수 있고, 글루탐산은 0.005 내지 0.300의 몰분율로 존재할 수 있고, 알라닌은 0.005 내지 0.800의 몰분율로 존재할수 있다.

평균 분자량은 2,000 내지 40,000달톤, 바람직하게는 3,000 내지 35,000달톤 사이이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 평균 분자량은 5,000 내지 25,000달톤이다. 티로신 대신 트립토판, 글루탐산 대신 아스파르트산 및/또는 알라닌 대신 글리신이 치환되는 것이 가능하다.

보다 바람직한 구체예에서, 상기 3원공중합체의 아미노산들의 몰분율은 코폴리머 1에 대하여 바람직한 것이 어떤 것인가에 따른다. 코폴리머 1에서의 아미노산들의 몰분율은 글루탐산이 대략 0.14, 알라닌이 대략 0.43, 티로신이 대략 0.10 그리고 리신이 대략 0.34이다. 코폴리머 1에 대한 가장 바람직한 평균 분자량은 5,000 내지 9,000달톤 사이이다.

하나 또는 그 이상의 하기의 치환들, 즉 글루탐산 대신 아스파르트산, 알라닌 대신 글리신, 리신 대신 아르기닌 및 티로신 대신 트립토판의 치환이 이루어진다면, 본 명세서에서 기술된 활용들을 위한 코폴리머 1의 활성은 잔류할 것으로 기대된다.

예아(YEA)의 글루탐산, 알라닌 및 티로신의 보다 바람직한 3원공중합체의 단량체들의 몰비들은 약 0.21 : 0.65 : 0.14이다.

케아(KEA)의 글루탐산, 알라닌 및 리신의 보다 바람직한 3원공중합체의 단량체들의 몰비는 약 0.15 : 0.48 : 0.36이다.

예크(YEK)의 글루탐산, 티로신 및 리신의 보다 바람직한 3원공중합체의 단량체들의 몰비는 약 0.26 : 0.16 : 0.58이다.

야크(YAK)의 티로신, 알라닌 및 리신의 보다 바람직한 3원공중합체의 단량체들의 몰비는 약 0.10 : 0.54 : 0.35이다.

상기 3원공중합체는 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 획득 가능한 어떠한 임의의 절차들에 의해서도 제조될 수 있다. 예를 들면, 용액 중의 소정의 몰비의 아미노산들을 사용하여 축합 조건들 하에서 또는 고상 합성 절차들(solid phase synthetic procedure)에 의해 만들어질 수 있다. 축합 조건들은 하나의 아미노산의 카르복실기를 다른 아미노산의 아미노기와 축합시켜 펩티드 결합을 형성시키기 위한 적절한 온도, pH 및 용매 조건들을 포함한다.

예를 들면 디시클로헥실-카르보디이미드와 같은 축합제(condensing agent)들이 펩티드 결합의 형성을 용이하게 하도록 하기 위하여 사용될 수 있다. 측쇄 부분(side chain moieties)들과 같은 관능기들 및 원하지 않는 부반응들에 대하여 아미노기 또는 카르복실기들의 일부를 보호하기 위하여 블로킹기(blocking group)들이 사용될 수 있다.

예를 들면, 미합중국 특허 제 3,849,650 호에 기술된 절차가 사용될 수 있으며, 여기에서, 티로신, 알라닌, 감마-벤질 글루타메이트 및 N ε-트리플루오로아세틸 리신의 N-카르복시무수물들이 개시제로서의 디에틸아민과 함께 무수 디옥산 중에서 주변온도에서 중합된다.

상기 글루탐산의 감마-카르복실기는 빙초산 중에서 브롬화수소에 의해 탈블록(deblock)될 수 있다. 상기 트리플루오로아세틸기들은 1몰 피페리딘에 의해 리신으로부터 제거된다. 상기 공정이 소정의 아미노산들, 즉 글루탐산, 알라닌, 티로신또는 리신들 중의 어느 하나에 관련된 반응들을 선택적으로 제거하는 것에 의하여 코폴리머 1 내의 4개의 아미노산들 중 소정의 3개의 아미노산들을 포함하는 펩티드들 또는 폴리펩티드들을 제조하도록 조절될 수 있다는 것은 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 용이하게 이해될 수 있다. 이러한 적용의 목적들을 위하여, 상기 용어들 "주변온도" 및 "실온"은 20 내지 26℃의 범위의 온도를 의미한다.

상기 3원공중합체의 분자량은 폴리펩티드 합성 동안 또는 상기 3원공중합체가 만들어진 후에 조절될 수 있다. 폴리펩티드 합성 동안에 분자량을 조절하기 위해서는, 합성조건들 또는 아미노산들의 양을 조절하여 폴리펩티드가 소정의 길이에 다다랐을 때 합성을 중지시키도록 한다. 합성 후에는, 분자량 정립 컬럼(molecular weight sizing column) 또는 겔(gel)에 의한 폴리펩티드들의 크로마토그래피 및 소정의 범위의 분자량을 수집하는 것과 같은 임의의 획득가능한 크기 선택 절차들에 의해 소정의 분자량의 폴리펩티드를 얻을 수 있다.

또한, 상기 폴리펩티드들은 예를 들면 산 또는 효소 가수분해에 의해 부분적으로 가수분해되어 고분자량의 종들을 제거할 수 있으며, 계속해서 정제시켜 산 또는 효소들을 제거할 수 있다.

하나의 구체예에서, 소정의 분자량을 갖는 3원공중합체들은 보호된 폴리펩티드를 브롬화수소산(hydrobromic acid)과 반응시켜 소정의 분자량 프로파일(profile)을 갖는 트리플루오로아세틸-폴리펩티드(trifluoroacetyl-polypeptide)를 형성하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조될 수 있다.

상기 반응은 하나 또는 그 이상의 시험반응들에 의해 사전 결정된 시간 동안사전 결정된 온도에서 수행된다. 시험반응 동안, 시간과 온도를 변화시키고, 시험 폴리펩티드들의 주어진 배치에서의 분자량 분포를 결정한다. 폴리펩티드들의 배치에 대해 최적의 분자량 분포를 제공하는 시험조건들이 배치에 대해 사용된다.

따라서, 시험반응에 의해 사전 결정된 시간 동안 사전 결정된 온도에서 보호된 폴리펩티드를 브롬화수소산과 반응시키는 것을 포함하는 공정에 의해 소정의 분자량 프로파일을 갖는 트리플루오로아세틸-폴리펩티드가 생산될 수 있다. 계속해서, 소정의 분자량 프로파일을 갖는 상기 트리플루오로아세틸-폴리펩티드는 피페리딘 수용액으로 처리되어 소정의 분자량을 갖는 저독성의 폴리펩티드를 형성한다.

바람직한 구체예에서, 주어진 배치로부터의 보호된 폴리펩티드의 시험샘플은 10 내지 50시간 동안 20 내지 28℃의 온도에서 브롬화수소산과 반응된다. 상기 배치에 대한 가장 좋은 조건은 다수의 시험반응들을 수행하는 것에 의해서 결정된다. 예를 들면, 하나의 구체예에서, 상기 보호된 폴리펩티드는 대략 17시간 동안 대략 26℃의 온도에서 브롬화수소산과 반응된다.

MS-관련 HLA-DR 분자들에의 Cop 1의 결합 모티프들이 공지이기 때문에(Fridkis-Hareli et al, 1999b), 고정된 서열의 폴리펩티드들이 용이하게 제조되고, 그리고 Fridkis-Hareli et al(1999b) 공개에서 기술된 바와 같이 상기 HLA-DR 분자들의 펩티드 결합 홈에의 결합이 시험될 수 있다. 이러한 펩티드들의 예들은 WO 005249 호에 기술된 것들이며, 그 내용을 본 명세서에 참고로 인용하였다.

상기 출원에 특별히 기술된 32개의 펩티드들을 이하의 표 1에 다시 나타내었다. 이러한 펩티드들 및 다른 유사한 펩티드들은 Cop 1과 유사한 반응성을 갖는 것으로 기대될 수 있다. 그러나, 이는 본 발명에 따른 활성화 T-세포들에의 이들의 능력을 시험하는 것에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 이들 전부는 과도한 실험 없이 수행될 수 있다.

이러한 펩티드들 및 다른 유사한 펩티드들은 또한 Cop 1-관련 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 규정 내에 들 것으로 고려되며, 그들의 사용은 본 발명의 일부가 될 것으로 고려된다.

서열번호	펩티드 서열	서열번호	펩티드 서열
1	AAAYAAAAAAKAAAA	17	AKKYEAAAAAAAAAA
2	AEKYAAAAAAKAAAA	18	AKKYAEAAAAAAAAA
3	AKEYAAAAAAKAAAA	19	AEAYKAAAAAAAAAA
4	AKKYAAAAAAKAAAA	20	KEAYAAAAAAAAAAA
5	AEAYAAAAAAKAAAA	21	AEEYKAAAAAAAAAA
6	KEAYAAAAAAKAAAA	22	AAEYKAAAAAAAAAA
7	AEEYAAAAAAKAAAA	23	EKAYAAAAAAAAAAA
8	AAEYAAAAAAKAAAA	24	AAKYEAAAAAAAAAA
9	EKAYAAAAAAKAAAA	25	AAKYAEAAAAAAAAA
10	AAKYEAAAAAKAAAA	26	EKKYAAAAAAAAAAA
11	AAKYAEAAAAKAAAA	27	EAKYAAAAAAAAAAA
12	EAAYAAAAAAKAAAA	28	AEYAKAAAAAAAAAA
13	EKKYAAAAAAKAAAA	29	AEKAYAAAAAAAAAA
14	EAKYAAAAAAKAAAA	30	EKYAAAAAAAAAAAA
15	AEKYAAAAAAAAAAA	31	AYKAEAAAAAAAAAA
16	AKEYAAAAAAAAAAA	32	AKYAEAAAAAAAAAA

본 발명에서의 사용을 위한 바람직한 코폴리머는 코폴리머 1이며, 본 명세서에서는 또한 Cop 1이라고 칭한다. 코폴리머 1은 코팍손(COPAXONE)(등록상표)(글라티라머 아세테이트(Glatiramer acetate))이라는 상품명 하에 여러 나라들에서 다발성 경화증의 처치용으로 승인되었다.

코팍손(COPAXONE)(등록상표)은 이스라엘 페타 틱바(Petah Tikva) 소재 테바파마슈티칼스 리미티드(Teva Pharmaceuticals Ltd.)의 상품명이다. 코폴리머 1이 주사 부위에서 극히 완만한 반응들인 단지 부차적인 부작용들만을 가지며, 충분히 허용된다는 것이 여러 임상시도들에서 증명되었다(Johnson et al, 1995).

(3) 치료의 용도

섹션 (1) 내지 (2)들에서 기술된 조성물들은 신경 재생을 촉진시키거나, 또는 밀폐된 두부 손상들 및 위험한 운동들에의 참여에 의해 야기된 것과 같은 무딘 외상, 총격 손상과 같은 관통 외상, 출혈 충격(hemorrhagic stroke), 빈혈성 충격(ischemic stroke), 녹내장, 뇌졸증 또는 종양절개와 같은 외과적 수술에 기인하는 손상들과 같은 1차적인 신경계 손상에 후속하는 2차 신경 퇴화를 방지하거나 또는 억제하기 위하여 사용될 수 있다.

게다가, 예를 들면, 당뇨성 신경장애, 노인성 치매, 알쯔하이머병, 파킨슨병, 안면신경마비, 녹내장, 헌팅턴 무도병, 근위축성 축삭 경화증, 간질발작 상태, 무동맥성 시신경장애(non-arteritic optic neuropathy), 추간원판탈출증(intervertebral disc herniation), 비타민 결핍, 크로이펠트-야곱병과 같은 프리온 질병들, 수근관 압박 증후군(carpal tunnel syndrome) 또는 말초신경장애와 관련된 질병들(요독증, 포르피린증(porphyria), 저혈당증, 쇼그렌 라르손 증후군(Sjorgren Larsson syndrome), 급성 지각신경장애(acute sensory neuropathy), 만성 운동실조신경장애(chronic ataxic neuropathy), 담즙성간경변증, 원발성 유전분증, 허파폐색질병(obstructive lung diseases), 선단거대증, 흡수불량 증후군, 진성 다혈구혈증, IgA 및 IgG 감마질병들(gammapathies), 여러 약물(예를 들면, 메트로니다졸)들과 독소(예를 들면 알코올 또는 유기인들)의 합병증, 샤르코-마리형 질병(Charcot-Marie-Tooth disease), 모세관확장성 운동실조증(ataxia telangectasia), 프리드리히 유전성 척수성 운동실조증, 아밀로이드 다발신경증, 아드레노마이엘로 신경장애(adrenomyeloneuropathy), 거대 축색성 신경장애(giant axonal neuropathy), 레프섬병(가족성실조성다발신경염), 파브리병(Fabry's disease), 리포프로테이네미아(lipoproteinemia) 등과 같은(이에 제한되지는 않음)) 등과 같은 여러 질병들이나 장애(disorder)들(이에 제한되지는 않음)의 결과로서의 백질 또는 회백질(또는 둘다)에서 일어나는 퇴화와 같은 퇴화성 진행의 결과를 낳는 질병의 영향들을 개선시키는데 이러한 조성물들이 사용될 수 있다.

본 발명의 글루타메이트 보호의 면에 대한 발견들의 관점에서, 본 발명에 따라 처치될 수 있는 다른 임상적 조건들에는 간질, 기억상실증, 불안증, 지각과민증 및 정신병, 급발작, 비정상적으로 상승한 안내압, 산화성 스트레스 및 아편내성과 아편의존성 들이 포함된다. 게다가, 본 발명의 글루타메이트 보호의 관점 즉, 글루타메이트 독성에 기인하거나 또는 악화된 손상 또는 질병의 처치에는 중추신경계로부터의 종양 제거 및 중추신경계에 대한 다른 형태의 수술들과 같은 수술 후 처치들이 포함된다.

놀랍게도 Cop 1 면역화가 글루타메이트 독성에 대해 유용하다는 것이 발견되었다는 관점에서, 수초가 영향을 받은 늦은 경우에서 뿐 만 아니라 글루타메이트 수준을 독성 수준까지 상승시키는 원인이 되는 인자들에 의해 신경들이 공격을 받는 초기 상태에서도 본 발명에 따른 Cop 1 처치 또는 Cop 1-관련 T-세포 처치가 상기 언급한 조건들의 처치에 유용할 수 있음은 예기할 수 있는 것이다.

따라서, 본 발명은 빈혈성 충격, 알쯔하이머병 등의 초기 단계들을 포함하여 글루타메이트 독성에서의 상승에 의해 야기되거나 또는 악화된, 급성 또는 만성의 신경 퇴화와 같은 임의의 전조에 대해서도 사용될 수 있다.

더욱이, 이러한 글루타메이트 독성 보호는 Cop 1의 역할이 그의 수초와의 교차-반응성에만 한정되지는 않는다는 것을 입증한다. 조절 세포들 또는 조절 물질들의 생성에 의한 것과 같이 조절 활성을 갖는다. 이러한 조절 활성의 관점에서, Cop 1 백신화 및 Cop 1-특이성의 활성화된 T-세포들이 또한 신경세포들에의 산화성 스트레스 및 다른 손상원들에 의해 야기된 손상으로부터 백질 및 회백질을 보호한다는 것이 기대된다.

게다가, 이러한 조절 활성 때문에, 본 발명은 또한 선행기술에서 제시된 바와 같이 다발성 경화증으로부터 뿐만 아니라 다발성 경화증 이외의 다른 자가면역 질병들로부터 신경세포들을 보호하는데 사용될 수 있다.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 Cop 1 또는 Cop 1-관련 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 활성화된 T-세포들 또는 면역화 조성물은 다발성 경화증 및 신형성(neoplasias)들을 제외하고, 신경 재생의 촉진 또는 2차 신경퇴화의 예방 또는 억제가 나타나는 곳에서의 질병들 또는 장애들을 처치하는데 사용된다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 상기 조성물들은 인간 대상체에 투여된다.

이제까지 기술된 바와 같이, Cop 1은 다발성 경화증 환자들에서 수초 항원들에의 자가면역 T-세포들의 억제 또는 탈활성화를 이루기 위한 약제로서 사용되어 왔다. 이러한 목적을 위하여, Cop 1은 부형제 없이 매일의 피하주사에 의해 투여되어 왔다. 선행기술은 또한 경구 투여에 의한 Cop 1의 다발성 경화증 환자들에의 투여를 기술하고 있으며, 이는 또한 수초 항원에의 자가면역 T-세포 응답의 억제를 포함하는 것을 목표로 하고 있다.

선행기술에서의 이들 다발성 경화증에 대한 처치의 Cop 1의 사용은 신경 보호를 위한 Cop 1의 사용과는 근본적으로 다르며, 이것이 본 발명의 과제이다.

첫째, 본 발명자들의 실험실로부터 나온 WO 99/60021 호에 나타난 바와 같이, 특별히 항-수초 T-세포 자가면역의 활성화를 요구하는 효과를 가져야 한다는 것은 매우 놀랄만한 것이다.

둘째, 본 발명에 따른 신경보호를 위한 Cop 1의 사용은 항-Cop 1 T-세포들의 투여에 기초하고 있으며, 이는 다발성 경화증을 처치하기 위하여 Cop 1이 사용된 방법은 아니다.

셋째, 바람직한 구체예에서, 본 발명은 불완전 프룬드 부형제 또는 완전 프룬드 부형제 등과 같은 부형제들에 적용된 Cop 1의 사용을 꾀하며, 이는 앞서 다발성 경화증의 처치를 위하여 또는 어떠한 다른 치료적 목적을 위하여 사용되지 않았던 Cop 1 제제의 일 형태이다.

비록 본 발명이 신경 보호를 위한 Cop 1의 경구 투여, 바람직하게는 부형제 중에서의 경구 투여를 꾀하기는 하나, 이는 항상 Cop 1으로의 1차 활성화에 따르는 것이다. 따라서, 경구용 Cop 1은 Cop 1으로의 1차 활성화에 후속하여 T-세포들의활성을 촉진시키는 데 사용될 수 있다.

따라서, 상기 조성물 및 그 작용 모드 및 신경 보호는 이론적으로나 실제적으로나 모두 신규한 것이다. 수초 항원들에의 T-세포 반응성을 억제하거나 탈활성화하기 위한 Cop 1의 사용에 익숙한, 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 자가면역 질병들에 의해 야기된 퇴화 진행을 개선시키는 것을 포함하여 신경 보호에서 이로운 영향을 주기 위하여 특히 수초 항원들에 대한 T-세포들의 활성화를 위하여 특별히 설계되는 방법으로 Cop 1을 사용하는 것은 자명한 것이 아니다.

Cop 1-활성화된 T-세포들은 또한 면역요법 공정들을 사용치 않고, 신생물들에 의해 야기된 퇴화성 진행을 완화시키는 데 사용될 수 있다. Cop 1으로 활성화된 T-세포들은 신경 퇴화의 위치에 축적될 수 있으며, 이러한 퇴화의 억제를 가능하게 한다.

(4) 조성 및 투여

본 발명에 따라 사용하기 위한 약학 조성물들은 하나 또는 그 이상의 생리학적으로 수용가능한 운반체들 또는 보형제(excipient)들을 사용하여 통상의 방법으로 제형화될 수 있다. 상기 운송체들은 조성물의 다른 성분들과 조화될 수 있는 것이고, 그들의 수용체(recipient)에 대해 해롭지 않아야 한다는 점에서 "수용가능한" 것이어야 한다.

운송체들, 투여의 형태, 투여량 형태 등의 이하의 실례들은 본 발명에 대한 사용을 위해 선택될 수 있는 운송체들, 투여의 형태, 투여량의 형태 등으로부터의 공지된 가능성들에 따라 기재된 것이다. 그러나, 어떠한 주어진 조성 및 선택된 투여의 형태가 그것이 소정의 결과들을 달성하는 지를 결정하기 위하여 먼저 시험되어야 한다는 것은 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 이해될 수 있는 것이다.

따라서, 예를 들면 활성요소가 Cop 1 또는 Cop 1-관련 펩티드 또는 폴리펩티드인 경우, 상기 특정 조성 및 투여의 형태는 활성요소가 백신으로서 작용하여 생체 내에서 반대로 활성화된 T-세포들을 증가시키도록 하는 것을 허용하여야 한다. 만일 이러한 면역 응답이 얻어지지 않는다면, 그 특정 조성 및 투여의 형태는 본 발명에 따라 사용되어서는 안된다.

유사하게, 만일 상기 활성요소가 T-세포들을 활성화시키는 경우, 상기 특정 조성 및 투여의 형태는 투여된 활성 T-세포들이 활성상태에서 혈류에 도달하여 본 발명에 따라 중추신경계 중의 손상 부위에 도달하도록 하는 가를 확인하기 위하여 시험되어야 한다.

"운송체"라는 용어는 그에 의해 치료제가 투여되는 희석제, 부형제, 보형제 또는 비히클(vehicle)을 의미한다. 상기 약학 조성물에서 상기 운송체들은 미세결정 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈(폴리비돈 또는 포비돈), 트라가칸 검, 젤라틴, 전분, 락토오스 또는 락토오스 일수화물 등과 같은 결합제; 알긴산, 옥수수 전분 등과 같은 응집방지제들; 스테아린산마그네슘 또는 소듐 라우릴 설페이트 등과 같은 윤활제 또는 계면활성제들; 콜로이드상 이산화규소와 같은 활주제(glidant); 자당 또는 사카린 등과 같은 감미제; 및/또는 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향 등과 같은 방향제; 들을 포함할 수 있다.

투여의 방법에는 예를 들면 정맥 내의, 복강 내의, 근육내의, 피하의, 점질내의(예를 들면, 구강의, 비강내의, 볼의(buccal), 질의(vaginal), 직장의, 안내의(intraocular) 등과 같은), 포막 내의, 국소의 및 피부내의 등과 같은 비경구적 경로들을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 투여는 전체적 또는 국부적이 될 수 있다.

경구 투여를 위해서는, 상기 약학 제제는 예를 들면 용액, 시럽 또는 현탁액과 같은 액상이 되거나, 또는 사용 전에 물 또는 다른 적절한 비히클에 복구되는 약품으로 제공될 수 있다. 이러한 약학 제제들은 현탁제들(예를 들면, 솔비톨 시럽, 셀룰로오스 유도체 또는 수소화된 식용가능한 지방); 에멀젼화제들(예를 들면, 레시틴 또는 아카시아); 비수성 비히클들(예를 들면, 알몬드 오일, 오일상 에스테르 또는 분별화된 식물성 오일들); 및 보존제들(예를 들면, 메틸-p-히드록시 벤조에이트 또는 프로필-p-히드록시 벤조에이트 또는 소르빈산) 등과 같은 약학적으로 수용가능한 첨가제들로 통상의 방법들에 의해 제조될 수 있다.

상기 약학 조성물들은 결합제들(예를 들면, 사전-젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로오스); 충전제들(예를 들면, 락토오스, 미세결정 셀룰로오스 또는 인산수소칼슘); 윤활제들(예를 들면, 스테아린산마그네슘, 활석 또는 실리카); 응집방지제들(예를 들면, 감자 전분 또는 소듐 스타치 글리콜레이트(sodium starch glycolate); 또는 적심제들(예를 들면, 소듐 라우릴 설페이트) 등과 같은 약학적으로 수용가능한 보형제들로 통상의 방법들에 의해 정제 또는 캡슐의 형태를 가질 수 있다. 상기 정제들은 당해 기술분야에서 공지된 방법들에 의해 피복될 수 있다.

경구 투여용 제제들은 활성 화합물의 조절된 방출을 가능하게 하도록 적절히 제형화될 수 있다. 볼을 통한 투여를 위해서는, 상기 조성물들은 통상의 방법으로 조성된정제 또는 함당정제(lozenge)의 형태를 가질 수 있다.

상기 조성물들은 예를 들면 거환 주사(bolus injection) 또는 지속 주입(continuous infusion) 등과 같은 주사에 의한 비경구적 투여를 위해 제형화 될 수 있다. 주사용 제형들은 첨가된 보존제들과 함께 예를 들면 앰플과 같은 단위 투여량 형태 또는 수회분 투여량 용기(multidose container)로 제공될 수 있다.

상기 조성물들은 유성 또는 수성 비히클 내의 현탁액, 용액 또는 에멀젼과 같은 형태를 가질 수 있으며, 또한 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제 등과 같은 조성화제(formulatory agent)들을 포함할 수 있다. 달리, 상기 활성성분은 사용 전에 예를 들면 멸균, 무독소 수(sterile pyrogen free water)로 복구되는 분말형태가 될 수 있다.

상기 조성물들은 또한 예를 들어 코코아 버터 또는 다른 글리세리드 들과 같은 통상의 좌약기제들을 포함하는 좌약(suppository) 또는 지연 관장제(retention enemas) 등과 같은 직장용의 조성물(rectal composition)로 제형화 될 수 있다.

흡입에 의한 투여를 위해서는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 조성물들은 예를 들면 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적절한 기체들과 같은 적절한 추진제의 사용으로 가압된 용기들 또는 분무기(nebulizer)로부터 공급되는 에어로졸 스프레이의 형태로 통상적으로 공급될 수 있다. 가압된 에어로졸의 경우에서는, 계량된 양을 공급하는 밸브의 제공에 의해 투여량을 결정할 수 있다. 흡입기(inhaler) 또는 취분기(insufflator)로의 사용을 위한 젤라틴으로 된 캡슐 또는 카트리지들은 상기 조성물과 락토오스나 전분과 같은 적절한 분말상 기재들의 혼합 분말을 포함하도록 조성될 수 있다.

바람직한 구체예에서, Cop 1-활성화된 T-세포들, Cop 1 또는 Cop 1-관련 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 조성물들은 인간에의 정맥 내 투여를 위해 적용된 약학적 조성물들과 같은 통상의 절차들에 따라 제형화 된다. 전형적으로, 정맥 내 투여를 위한 조성물들은 멸균의, 등장의 수성 완충제 중의 용액들이다. 필요에 따라, 상기 조성물은 또한 용해제 및 주사 부위에서의 고통을 완화시키기 위하여 리그노카인(lignocaine)과 같은 국부마취제를 포함할 수 있다.

일반적으로, 상기 성분들은 별도로 또는 함께 혼합되어 공급된다. 상기 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우에서, 상기 조성물은 멸균의, 약학적 등급의 물 또는 생리식염수를 포함하는 주입병(infusion bottle)에 분산될 수 있다. 상기 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 주사용 멸균수 또는 생리식염수의 앰플이 제공되어, 상기 성분들이 투여에 앞서 혼합될 수 있다.

Cop 1 또는 Cop 1-관련 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물들은 선택적으로 면역화를 위한 통상의 방법에서의 부형제들과 함께 투여될 수 있다. 이러한 부형제들의 실례들에는 명반(alum) 및 불완전 프룬드 부형제들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 투여된 펩티드 또는 폴리펩티드의 면역성을 향상시키기 위한 다른 방법들에는 백신 분야에서 숙련된 자에게는 모두 공지된 바와 같은알부민 또는 다른 담체(carrier)들과의 응집제 또는 복합제의 형태로의 투여를 포함한다. 대사가능한 지질 에멀젼 또한 WO 97/02016 호에서 기술된 방법으로의 Cop 1 요법을 위한 비히클로서 사용될 수 있으며, 그 내용을 본 명세서에 참고로 인용하였다. 비록 이들 물질들이 TH1 내지 TH2 시토킨 이동의 원인으로 알려져 있기는 하나, 본 발명의 목적에 대해 TH2가 동작하지 않는다거나 심지어 바람직하지 않을 수 있다는 것을 믿을 만한 이유는 없다.

Cop 1이 경구적으로 투여되는 경우, 이는 다른 음식물 형태들과 혼합될 수 있으며, 고체, 반-고체, 현탁제 또는 에멀젼화제 형태로 소모될 수 있으며, 또한 이는 물, 현탁제들, 에멀젼화제들, 방향강화제들 등을 포함하여 약학적으로 수용가능한 담체들과 혼합될 수 있다.

하나의 구체예에서, 상기 경구 조성물은 장용피(장에서 용해되는 피복)의 형태가 될 수 있다. 장용 피복은 당해 기술분야에서는 공지된 것이다. 예를 들면, Lehman(1971)은 유드라짓 에스(Eudragit S) 및 유드라짓 엘(Eudragit L) 등과 같은 장용 피복제를 교시하고 있다. 약학적 보형제들의 핸드북(Handbook of Pharmaceutical Excipients) 2판 또한 유드라짓 에스 및 유드라짓 엘 적용들을 교시하고 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 하나의 유드라짓으로는 엘30디55(L30D55)가 될 수 있다.

Cop 1은 또한 흡입 또는 점비액에 의한 앞서 기술한 형태들 중의 특정의 형태로 코에 투여될 수 있다. 더욱이, Cop 1을 기관의(trachea) 및 기관지의(bronchial) 통로들의 점질의 내막(mucosal lining)들에의 공급을 위하여경구 흡입이 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 약학 조성물들의 하나 또는 그 이상의 성분들로 충진된 하나 또는 그 이상의 용기들을 포함하는 팩 또는 키트를 제공한다.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 약학 조성물들은 신경계 내의 퇴화 영역의 손상 또는 검출 직후, 포유동물, 특히 인간에게 투여된다. 본 발명의 치료요법들에는 Cop 1-활성화된 T-세포들 또는 Cop 1 또는 Cop 1-관련 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 이들의 어떠한 임의의 조합들의 투여가 포함된다. 복합 요법(combination therapy)이 사용되는 경우, Cop 1은 Cop 1-활성화된 T-세포들의 투여 전, 투여와 동시 및 투여 후에 투여될 수 있다.

하나의 구체예에서, 본 발명의 조성물들은 (a) (본 명세서에서 참고로 인용한 PCT 공개 제 WO 97/09985 호에서 기술된 바와 같이) 신경 재생을 촉진하기 위하여 그들의 용량을 증가시키기 위하여 자극된 단핵 식균소(mononuclear phagocyte)들, 바람직하게는 배양된 단핵세포들; (b) 산성의 섬유아세포 성장 인자와 같은 영양 인자; 및 (c) 항-염증 치료제(즉, 덱사메타손 또는 메틸프레드니솔론 등과 같은 항-염증용의 스테로이드 또는 Thr-Lys-Pro(TKP)와 같은 비-스테로이드성의 항-염증 펩티드); 들 중의 어느 하나 또는 그 이상의 조합으로 투여된다.

다른 구체예에서, PCT 공개 제 WO 97/09985 호 및 1998년 3월 11일자 출원된 미합중국 특허출원 제 09/041,280 호들에 따른 단핵 식균소들은 Cop 1-활성화된 T-세포들, Cop 1 또는 Cop 1-관련 펩티드 또는 폴리펩티드의 비경구적 투여와 동시에, 투여 전, 또는 투여 후에 중추신경계 내의 손상부 또는 국부 내로 주사된다.

다른 구체예에서, Cop 1-활성화된 T-세포들, Cop 1 또는 Cop 1-관련 펩티드 또는 폴리펩티드의 투여는 단일 투여량으로 투여되거나, 또는 바람직하게는 2주의 간격 마다 반복하여, 그리고 계속해서 한달에 한번, 4/4분기의 분기당 한번, 매 6개월 마다 한번 등 보다 장기화된 간격으로 투여될 수 있다. 처치의 과정은 처치되어야 하는 상태 또는 질병에 따라 수개월, 수년 또는 종종 환자의 평생 동안 진행될 수 있다.

중추신경계 손상의 경우에는, 상기 처치는 상태가 안정화되고, 그리고2차 퇴화의 전개가 없거나 또는 제한된 위험만이 있을 때까지, 수일 내지 수개월 또는 수년간의 사이에서 변화될 수 있다. 만성 인간 질병 또는 파킨슨병의 경우, 본 발명에 따른 상기 치료적 처치는 일생 동안이 될 수 있다.

당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 명백하게 되는 것으로서, 예를 들면 환자가 다른 약물 등을 복용하는 지의 여부 등 여러 다른 인자들과 마찬가지로, 환자의 연령 및 건강상태 및 다른 신체적 인자들(예를 들면, 성별, 체중 등)에 따라, 처치되어야 할 상태 또는 질병에 따라 시간이 의존된다.

본 발명의 Cop 1-활성화된 T-세포들을 포함하는 치료 조성물들의 최적의 투여량은 처치되어야 할 위치에서의 신경계 손상 또는 질병에 영향을 받은 신경섬유들의 수에 비례한다. 바람직한 구체예에서, 생쥐의 시신경의 완전한 횡단과 같이 대략 10⁵의 신경섬유들이 영향을 받은 영역의 처치를 위해서는 5*10⁶내지 10⁷의 세포들의 영역이내가 되고, 인간 시신경의 완전한 횡단과 같이 10⁶내지 10⁷의 신경섬유들이 영향을 받은 영역의 처치를 위해서는 10⁷내지 10⁸의 세포들의 영역이내가 된다.

당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 명백하게 될 수 있는 바와 같이, T-세포들의 투여량은 처치되어야 할 영역 또는 위치에서 영향을 받았을 것이라고 여겨지는 신경섬유들의 수에 비례하여 상하로 조절될 수 있다.

(5) T-임파구들에 대한 자기유래의 세포 은행 구축

신경 손상 후 2차 손상을 최소화하기 위하여, 환자들은 Cop 1 또는 Cop 1-관련 펩티드 또는 폴리펩티드에 의해 민감화된, 자기유래의 또는 부분-동종간의 T-임파구들의 투여에 의해 처치될 수 있다. 기회의 순간으로서 정밀하게 한정되지는 않았으나, 성공의 기회를 극대화하기 위하여 1차 손상 후 가능한 한 빨리, 바람직하게는 대략 1주일 이내에 요법제가 투여되어야 한다.

활성화를 위해 요구되는 시간과 처치를 위해 요구되는 시간 사이의 간격을 연결하기 위하여, 신경계 손상의 경우에서 2차 퇴화에 대한 신경 보호 치료의 장래 사용을 위하여 준비된 자기유래의 T-임파구들의 개인별 저장실들로 은행이 구축될 수 있다. T-임파구들은 혈액으로부터 분리되고, 계속해서 Cop 1 또는 Cop 1-관련 펩티드 또는 폴리펩티드로 민감화된다. 계속해서, 상기 세포들은 냉동되고, 소요될 때까지, 개인의 성명, 식별번호 및 혈액형 하에 적절하게 저장된다.

게다가, 개개 환자에 대해 알쯔하이머병 또는 파킨슨병 등과 같은 신경 퇴화 조건들을 처치하기 위한 것과 마찬가지로 빈혈 또는 기계적 손상 등과 같은 신경계의 외상성 장애들의 경우에서의 잠재적 사용을 위하여 중추신경계의 자기유래의 줄기세포들이 가공되고 저장될 수 있다. 달리, T-세포들의 근원에 대해 하나의 MHC 타입 2 분자를 공유하는 임의의 개인들에 의한 사용을 위하여 부분-동종간 또는 동종간의 T-세포들이 은행 내에 냉동 저장될 수 있다.

이하의 실시예들은 본 발명의 특정의 장점들을 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 관점을 제한하는 것으로 의도된 것은 아니다.

(6) 실시예들

실시예 1 및 2의 재료들 및 방법들

동물들: 동계의 암컷 성체 루이스 생쥐들(8 내지 12주령)을 와이즈만 인스티튜트 오브 사이언스(Weizmann Institute of Science)의 동물급여센터(animal breeding center)로부터 공급받았다. 상기 생쥐들은 광- 및 온도-조절된 방에 각 실험에 맞는 연령에 맞게 보관하였다. 동물들은 동물 보호 및 사용 위원회(IACUC ; Institutional Animal Care and Use Committee)에서 제정된 규정들에 따라 취급되었다.

항원들: 기니아 피그 및 난백알부민의 척수들로부터의 수초 염기성 단백질은 미합중국 미주리주 세인트루이스 소재 시그마로부터 구입하였다. 본 실시예들에서 사용된 Cop 1은 이스라엘 페타 틱바(Petah Tikva) 소재 테바 파마슈티칼스 리미티드(Teva Pharmaceuticals Ltd.)의 상품인 코팍손(COPAXONE)(등록상표)이며, 이 제품은 상용적으로 구입하였다.

항체들: 생쥐 모노클로날 항 생쥐 T-세포 수용기(TCR)는 보리스레이지스(Boris Reizis) 박사에 의해 제공되었다. 염소 항 생쥐 IgG에 결합된 Cy-3(생쥐, 인간, 소 및 말의 혈청 단백질에 대한 최소의 교차-반응을 갖는)는 미합중국 펜실바니아주 웨스트 그로브에 소재하는 잭슨 임뮤노리서치로부터 구입하였다.

T-세포주들: 상기 항원들로 면역화된 루이스 생쥐들로부터 수득된 유출 임파선 세포들로부터 생성된 것이다(Ben-Nun et al, 1981a). 상기 항원은 인산염-완충 생리식염수(PBS)(1㎎/㎖)에 용해시켰으며, 4㎎/㎖의 미코박테리움 튜베르쿨로시스(디프코)로 보충된, 등량의 불완전 프룬드 부형제(IFA)(미합중국 미시간주 디트로이트 소재 디프코 라보레이토리즈(Difco Laboratories))에 에멀젼화시켰다.

상기 항원을 생쥐의 뒷다리 패드에 상기 에멀젼 0.1㎖를 주사한 10일 후, 상기 생쥐들을 살처분시키고, 그들의 유출 임파선들을 외과적으로 제거하여 분리시켰다. 상기 세포들을 세척하고, L-글루타민(2mM), 2-머캅토에탄올(5*10^-5M), 피루브산나트륨(1mM), 페니실린(100IU/㎖), 스트렙토마이신(100㎍/㎖), 비-필수아미노산들(1㎖/100㎖) 및 자기유래의 혈청 1%(용적/용적)들로 보충된, 둘베코의 변형 이글 매질(DMEM ; Dulbecco's modified Eagle's medium)을 포함하는 자극 매질 중에서 상기 항원(10㎍/㎖)으로 활성화시켰다.

37℃, 98% 상대습도 및 10% 이산화탄소에서 72시간 동안 배양 후, 상기 세포들을 10% 태아소혈청(FCS ; fetal calf serum)(용적/용적) 및 콘카나발린 에이(ConA)-자극된 비장세포들의 상등액으로부터 나온 10% T-세포 성장 인자들이 부가된, DMEM, L-글루타민, 2-머캅토에탄올, 피루브산나트륨, 비-필수아미노산들및 항생제들을 상기한 바와 동일한 농도로 포함하는 전개 매질로 이전시켰다(Gillis et al, 1978).

세포들을 전개 매질 내에서 4 내지 10일간 성장시킨 후, 전개 매질 중에서 조사된(2000rad) 흉선세포들(10⁷세포들/㎖)의 존재 중에서 그들의 항원(10㎍/㎖)으로 재자극시켰다. 상기 T-세포주들을 반복된 자극 및 전개에 의해 확장시켰다(Ben-Nun et al, 1982).

시신경의 파괴 손상: 시신경을 앞서 설명한바와 같이 파괴 손상에 적용시켰다(Duvdevani et al, 1990). 간단하게, 생쥐들을 롬푼(Rompun)(xylazine, 10㎎/㎏, 이스라엘 소재 비타메드(Vitamed)) 및 베타랄(Vetalar)(ketamine, 50㎎/㎏, 미합중국 아이오와주 포트 다지 소재, 포트 다지 라보레이토리즈(Fort Dodge Laboratories))의 복강 내 주사에 의해 깊이 마취시켰다.

양안 동작 현미경(binocular operating microscope)을 사용하여, 오른쪽 안구에서 측부 외안각 절개술을 수행하였고, 결막(conjunctiva)은 측부에서 각막까지 절개시켰다. 후인 구상 근육(retractor bulbi muscle)들의 분리 후, 시신경들을 무딘 해부(blunt dissection)에 의해 안와 내로 노출시켰다.

교정된 교차-작동 겸자(cross-action forceps)를 사용하여 상기 시신경을 눈으로부터 1 내지 2㎜ 파괴 손상에 적용시켰다. 단기간 동안에 경미한 및 심각한 파괴 손상들을 가하였으며, 이러한 단기간이 2차 퇴화 및 처치에 대한 그의 응답을 증명하기에 최적인 것으로 나타났다(Yoles, 1998). 손상되지 않은 대측(對側)의 신경들은 건드리지 않고 그대로 두었다.

망막 신경절 세포들의 역행적 표지화에 의한 2차 퇴화의 측정: 파괴 손상 2주 후에, 손상부위에 대한 말단에 형광 친지질성 염료, 4-(4-디데실아미노)스티릴)-N-메틸피리디늄 이오다이드(4-Di-10-Asp)(네덜란드 소재, 몰레큘라 프로브스 유럽 비브이(Molecular Probes Europe BV, Netherlands))의 손상 후 적용 후에 시신경축색들 및 그들에 부착된 망막 신경절 세포들의 2차 퇴화를 측정하였다.

손상되지 않은 축색들 만이 그들의 세포 본체에로 다시 염료를 전송할 수 있기 때문에, 2주 후의 손상부위에 대한 말단에의 염료의 적용은 1차 손상 및 2차 퇴화 모두에서 생존한 축색들 만이 계수될 수 있다는 것을 확인한다. 단지 신경섬유들이 조직학적으로 손상되지 않은 신경들 만이 손상부위에 대한 말단에 적용된 염료를 취하여 그들의 세포 본체로 이송시킬 수 있기 때문에, 이러한 접근은 기능적으로 손상되지 않은 신경들과 그 축색은 손상되었으나, 그 세포 본체들은 여전히 생존하고 있는 신경들 사이의 차별화를 가능하게 한다.

이 방법을 사용하여, 표지된 망막 신경절 세포들의 수는 여전히 기능하는 신경들의 수를 신뢰할 수 있을 정도로 반영한다. 표지화 및 측정은 다음과 같이 수행하였다: 신경의 혈액 공급에 손상됨이 없이, 우측 시신경을 2차에 걸쳐 노출시켰다.

손상부위의 말단 경계로부터 1 내지 2㎜로 완전 축색절단을 수행하였으며, 4-Di-10-Asp의 고체 크리스탈(crystal)(0.2 내지 0.4㎜ 직경)을 새로이 형성된 축색절단의 부위에 침적시켰다. 염료 적용 5일 후, 생쥐들을 살처분시켰다. 망막을 눈으로부터 떼어내고, 4% 파라포름알데히드 용액 중에서 전체를 평판으로 준비하고, 형광 현미경에 의해 표지된 망막 신경절 세포들을 검사하였다.

효소-연결된 면역흡수 분석: 항-MBP T-세포들을 전개 매질 중에서 1주일 동안 성장시키고, 계속해서 PBS로 세척하고, 자극 매질 중에 재현탁시켰다. ConA(1.25㎍/㎖) 또는 난백알부민 항원(10㎍/㎖)과 함께, 또는 항원 없이, 자극 매질 중에서, 37℃, 98% 상대습도 및 10% 이산화탄소 조건에서, 조사된 흉선세포들(10⁷세포들/㎖)의 존재 중에서 상기 T-세포들(0.5*10⁶세포들/㎖)을 배양시켰다.

게다가, 조사된 흉선세포들(10⁷세포들/㎖) 만을 자극 매질 중에서 배양시켰다. 48시간 후, 상기 세포들을 원심분리시키고, 그들의 상등액을 수집하여 샘플로 취하였다. 샌드위치 효소-결합된 면역흡수 분석(ELISA) 키트(미합중국 위스콘신주 매디슨 소재, 프로메가(Promega))를 사용하고, 신경영양물질 표준물(ELISA 판독기를 사용하여 450㎚에서 흡수율을 측정)과 비교하여 상기 샘플들 중의 신경영양물질(NT-3), 신경 성장 인자(NGF) 및 신경영양물질-4/5의 농도들을 결정하였다.

상기 샘플들 중에서 뇌-유래의 신경영양인자(BDNF)를 민감한 샌드위치 ELISA 방법으로 결정하였다. 요약하면, 편평한 바닥의 96-웰 플레이트를 0.025M 탄산수소나트륨(NaHCO₃) 및 0.025M 탄산나트륨(Na₂CO₃)(pH 8.2) 중의 닭 항-인간 BDNF 항체(미합중국 위스콘신주 메디슨 소재, 프로메가)로 피복시켰다. 재조합 인간 BDNF(미합중국 뉴저지주 플랜더스 소재, 리서치 다이아그노스틱스(Research Diagnostics; 표준물로 사용하였음)를 PBS(pH 8.2) 중에 3% 소 혈청 알부민(BSA), 0.05% 폴리옥시에틸렌-소르비탄 모노라우레이트(Tween-20) 및 1% FCS를 포함하는 블록화 용액(blocking solution) 중에서의 연속 희석에 사용하였다.

결합된 BDNF는 상기 플레이트들을 생쥐 항-인간 BDNF 항체(리서치 다이아그노스틱스)와 함께 배양시켰으며, 계속해서 블록화 용액 중의 퍼옥시다제-결합 염소 항-생쥐 IgG(미합중국 펜실바니아주 웨스트 그로브 소재, 잭슨 임뮤노리서치(Jackson Immunoresearch))와 함께 배양시켰다.

상기 플레이트들은 3,3',5,5'-테트라메틸-벤지딘 액체 기재 시스템(미합중국 미주리주 세인트 루이스 소재, 시그마(Sigma))를 사용하여 전개시켰다. 1M 인산(H₃PO₄)을 가하는 것에 의해 반응을 중단시켰으며, 광학밀도는 450㎚에서 결정하였다. 각 실험에 대한 결과들을 자극 매질과 함께 배양된, 조사된 흉선세포들의 배경 수준을 차감한 후, 샘플 1㎖ 당 분비된 신경영양물질의 양으로서 계산하였다.

면역조직화학(Immunohistochemistry). 신경들의 길이방향의 냉동절개물(cryosection)(10㎛ 두께)을 젤라틴-피복된 슬라이들 위에 올려놓고, 형광 염색이 준비되는 동안 냉동시켰다. 상기 영역(section)들을 실온에서 10분간 에탄올로 고정시키고, 2차 증류수로 2번 세척한 후, 0.05% 트윈-20(Tween-20)을 포함하는 PBS 중에서 3분간 배양시켰다.

계속해서, 영역들은 실온에서 3% FCS 및 2% BSA를 포함하는 PBS 중에 희석된 TCR에 대한 생쥐 항-쥐 모노클로날 항체들과 함께 1시간 동안 배양시켰다. 계속해서, 상기 영역들은 0.05% 트윈-20을 포함하는 PBS로 3회 세척하고, 실온에서 1시간 동안 염소 항 생쥐 IgG에 결합된 Cy-3(생쥐, 인간, 소 및 말의 혈청 단백질에 대한 최소의 교차-반응을 갖는 것; 미합중국 펜실바니아주 웨스트 그로브에 소재하는 잭슨 임뮤노리서치)와 함께 배양시켰다.

상기 영역들은 트윈-20을 포함하는 PBS로 세척하고, 1,4-디아조비시클로(2,2,2)옥탄을 포함하는 글리세롤로 처치하여 형광의 소멸(quenching)을 억제시켰다. 상기 영역들은 짜이스 유니버설 형광 현미경(Zeiss Universal fluorescence microscope)으로 관찰되었다.

실시예 1 : 항-Cop 1 T-세포들에 의한 신경 보호

Cop 1에 반응성인 T-세포들의 입양 전달은 손상된 시신경의 신경 보호임

본 발명자들의 실험실로부터의 앞서의 연구에서, 생쥐에서의 급성 중추신경계 외상 후, MBP와 같은 중추신경계 자가 항원에 특이적인 뇌척수의 T-세포들의 수동적 전달이 손상의 확산을 방지하고, 그에 따라 2차 퇴화를 정지시킨다는 것이 밝혀졌다(WO 99/60021 호를 참조하시오).

여기에서, Cop 1에 대해 반응성인 T-세포들의 신경 보호 영향이 입증되었으며, 여기에서 MBP-반응성 T-세포들과는 달리, T-세포들은 뇌척수유래가 아니다. 시신경의 경미한 손상(도 1A) 또는 심각한 손상(도 1B) 직후, 생쥐들은 불완전 프룬드 부형제 중의 PBS 또는 불완전 프룬드 부형제 중의 Cop 1-특이성 T-세포들로 주사되었다. 2차 퇴화의 평가를 위하여, 손상 2주 후, 신경추적자 염료 4-Di-10-Asp를 손상부위의 말단의 시신경에 적용시켰다.

5일 후, 상기 생쥐들을 살처분시키고, 그리고 그들의 망막들을 절개해내고, 평판-탑재시켰다. 각 망막 중의 광디스크(optic disk)로부터 대략 동일한 거리에 위치하는 4개의 영역들로부터 표지된(생존하는) 망막 신경절 세포들을 형광현미경 하에서 계수하였다.

그 결과들을 도 1A 및 도 1B에 나타내었다. PBS의 신경 보호 효과와 비교하여 Cop 1-반응성 T-세포들의 신경 보호 효과는 경미한 파괴 손상(P<0.05, 스튜던트 티-테스트) 및 심각한 파괴 손상(P<0.05, 스튜던트 티-테스트) 모두에서 명백하였다. 이 결과들은 3회의 실험들의 합이다. 각 그룹은 6 내지 10마리의 생쥐들을 포함한다.

Cop 1-반응성 T-세포들은 손상된 및 손상되지 않은 신경 조직들에 축적됨

항-MBP T-세포들의 파괴-손상된 생쥐들 내로의 수동적 전달이 손상부위에 주사된 T-세포들의 막대한 축적에 후속된다는 것이 본 발명자들의 실험실에서 앞서 보여주었다.

본 발명에서 Cop 1-반응성 T-세포들의 수동적 전달은 또한 PBS-처리된, 손상된 생쥐들에서의 내인성 항-MBP T-세포들의 축적에 비해 손상부위에 주사된 T-세포들의 명백한 축적의 원인이 된다는 것이다. Cop 1-처리된 생쥐들에서의 T-세포 축적은 주사 7일 후 최대이었다.

이들 발견들은 서로 다른 특이성들의 T-세포주들로 주사된 앞서의 결과들과 동일선상에 있는 것이다. 이 연구에서, 손상되지 않은 신경들과는 대조적으로 손상된 신경들의 손상영역들에의 T-세포 축적은 비-선택적이며, 여기에서 중추신경계 자가 항원들에 특이성인 T-세포들만이 축적된다는 것이 밝혀졌다.

따라서, 손상된 신경 중의 Cop 1에 대한 T-세포들의 축적은 고유의 중추신경계 단백질들 중의 어느것과도 교차-인식에 대한 어떠한 표시도 제공하지 않으며, 그에 따라 활성도 제공하지 않는다.

그러나, 난백알부민(OVA)에 대한 T-세포들과는 달리(그 결과들은 나타내지 않음), MBP에 대한 T-세포들과 유사하게, Cop 1에 대한 T-세포들은 손상되지 않은 신경 중에 축적되었다. 비록 MBP에 특이성인 T-세포들에 비해 Cop 1에 반응성인 T-세포들의 축적이 덜하기는 하나, 이러한 결과들은 생체 내에서의 Cop 과 MBP 사이에서의 교차-반응성의 개념을 더욱 지지한다.

MBP 및 Cop 1에 특이성인 주사된 T-세포주들의 시토킨 및 신경영양물질의 프로파일

자극되지 않은 T-세포들로부터 및 자극 매질 중의 ConA 미토겐 또는 MBP 항원 또는 Cop 1 항원으로 48시간 동안 자극된 T-세포들로부터의 상등액들을 샌드위치 ELISA방법에 적용시켰다.

이들 세포들에 의해 분비된 생성물들을 포함하는 상기 배양된 매질을 수집하고, 그들의 시토킨 함량을 ELISA 방법으로 정량하였다. 그 결과들을 표 2에 나타내었다.

상기 활성화된 T-세포들은 자극되지 않은 T-세포들이 분비한 것 보다 더 많은 양의 시토킨을 분비하였다. 상기 MBP-자극된 T-세포들은 바람직하게 Th1-특이성 시토킨 INF를 발현시키는 반면에 Cop 1-자극된 T-세포들은 바람직하게 Th2-특이성 시토킨 IL-10을 발현시켰다. 분비된 시토킨의 최대량은 ConA으로 자극된 T-세포들의 상등액에서 검출되었다(표 2).

	휴지 상태	MBP로의 자극	Cop 1으로의 자극	ConA로의 자극
	Tmbp	Tcop	Tmbp	Tcop	Tmbp	Tcop	Tmbp	Tcop
IFN-γ(pgr/㎖)	725	6645	15692	925	7242	11825	22758	22525
IL-10(pgr/㎖)	41	382	1941	13	365	7244	3565	6503

그들의 특이성 항원들로 활성화된 T-세포들에 의한 신경영양 발현 및 분비의 상향-조절은 최근 본 발명자들의 실험실에서 입증되었다. T-세포-중개된 신경보호에 내재하는 메카니즘을 간파하기 위한 시도에서, 본 발명에서의 T-세포 상등액들을 ELISA 방법에 적용시켜 신경 보호에 대응하는 T-세포들의 신경영양물질(NT) 프로파일을 결정하였다.

상기 Cop 1-자극된 T-세포들은 NGF 및 NT-4/5 모두를 분비하였으나, 항-MBP T-세포들에 의해 분비된 것 보다 적은 양이었다. 항-MBP T-세포들에 의한 생산에 비해, Cop 1-자극된 T-세포들에 의한 NT-3의 생산은 명확하지 않았으나; BDNF의 생산은 막대하였다(도 2A). 따라서, 상기 Cop 1-자극된 T-세포들은 BDNF의 주목할 만한 예외와 함께 시험된 모든 신경영양인자들을 소량으로 생산하였다.

서로 다르게 자극된 T-세포들에 의해 분비된 NT-3 및 BDNF의 양의 서로 다른4개의 결과들은 유사한 결과들을 낳았다. 각 경우에서, Cop 1-자극된 T-세포들은 항-MBP T-세포들에 비해 약 2.5배 많은 BDNF와 단지 10%의 양의 NT-3를 생산하였다(도 2B).

실시예 2: Cop 1으로의 백신화

Cop 1으로의 백신화가 2차 퇴화로부터 시신경섬유들을 보호함

이 실시예는 2일 후의 주어진 촉진제와 함께, 불완전 프룬드 부형제 중의 Cop 1으로의 백신화가 임계 시간 간격 내에 절대적인 시간 간격 이내에 신경 보호를 위한 충분히 강한 면역 응답을 가져올 수 있는지를 보여주기 위한 것이다.

불완전 프룬드 부형제 중의 Cop 1으로의 백신화 직후, 마취시킨 생쥐들에게 시신경의 경미한 파괴 손상을 가하였으며, 2일 후, 촉진제를 가하였다. 2주 후, 망막 신경절 세포들을 역행적으로 표지화시켰으며, 5일 후, 상기 생쥐들을 살처분시키고, 그들의 망막들을 절개해내었다. 불완전 프룬드 부형제 중의 Cop 1으로 백신화된 생쥐들은 불완전 프룬드 부형제 중의 PBS로 주사된 대조군 생쥐들과 비교하여 명백한 신경 보호의 증거를 나타내었다(도 3).

실시예 3: 글루타메이트 독성으로부터의 보호

실험 1: Cop 1으로의 백신화가 글루타메이트 독성으로부터 시신경섬유를 보호함

Cop 1으로의 면역화에 의해 얻어지는 손상된 신경들의 신경 보호를 약속하기 때문에, 보호가 외상에 의해 야기된 신경 손상에 제한되는 것인지의 여부 또는 글루타메이트-유발 독성에 의해 야기된 유해한 환경 조건들로부터의 보다 종합적인 신경 보호가 될 것인지를 찾아내는 것은 중요하다. 따라서, 이하의 실험이 수행되었다.

면역화: C57B1/6J OLA 쥐(8 내지 10주령)들을 5㎎/㎖의 미코박테리아 H37RA(디프코)를 포함하는 등량의 완전 프룬드 부형제에 에멀젼화시킨 전체 75㎍의 Cop 1을 각각 주사하였다. 두번째 그룹의 생쥐들은 인산염-완충화된 생리식염수의 완전 프룬드 부형제로의 에멀젼을 주사하였다. 전체 용적 0.1㎖의 상기 에멀젼은 망막 내로 글루타메이트를 도입시키기 10일 전에 피부 내로 주사되었다.

글루타메이트 독성: 면역화 10일 후, 상기 생쥐들을 마취시키고, 200nmole의 글루타메이트를 포함하는 1㎕의 생리식염수를 우측 눈의 안구 유리체내로 주사하였다. 좌측 눈은 주사하지 않고 대조군으로 제공하였다.

망막 신경절 세포들의 표지화: 망막 신경절 세포 생존의 평가 3일(72시간) 전에, 각 생쥐를 마취시키고, 입체접촉기구(stereotactic device)내에 위치시켰다. 두개골을 노출시키고, 건조 및 청결상태를 유지시켰다. 봉합부를 확인하고 표시하였다. 주사의 표시된 지점은 뇌 표면으로부터 2㎜의 깊이, 전후축들 내의 봉합부 후방 2.92㎜ 및 중정선에 대한 측방 0.5㎜이었다. 우측반구 및 좌측반구들 내의 표시된 좌표 상의 두피내에 창을 천공시켰다. 계속해서, 해밀턴 주사기(Hamilton syringe)를 사용하여 신경추적자 염료 플루오로골드(생리식염수 내 4% 용액)를 적용시켰다(1㎕, 분당 0.5㎕의 속도).

망막 신경절 세포 생존의 평가: 글루타메이트 투여 7일 후, 상기 안구들을 적출해내고, 그들의 망막들을 분리해내어 4% 파라포름알데히드 용액 중에서 평판-탑재시켰다. 광디스크로부터 대략 1㎜ 이내에 위치하는, 동일한 크기(0.078㎟)의 6내지 8개의 영역들로부터 표지된 세포들을 형광 현미경 하에서 계수하였으며, 평균하였다. 그 결과들을 도 4에 나타내었다. 글루타메이트 독성은 Cop 1으로 면역화된 생쥐들에서 보다 대조군들에서 대략 4배 더 높은 것으로 밝혀졌다.

실험 2: 글루타메이트 독성 및 눈의 긴장 항진증(ocular hypertension)에 대한 신경들의 보호를 위한 백신화

본 발명에서, 축색 손상 후의 효과적 신경 보호를 제공하는, 수초 희소돌기아교세포 당단백(MMOG ; myelin oligodendrocyte glycoprotein) 또는 MBP로부터 유도된 펩티드로의 적극적 또는 수동적 면역화(Moalem et al., 1999a; Moalem et al., 1999b 및 Fisher et al., 2000)는 글루타메이트에 의해 야기된 독성으로부터 신경들을 보호하지는 못하는 것으로 밝혀졌다.

그러나, Cop-1으로의 백신화에 의해서는 글루타메이트 독성으로부터의 보호가 달성되었다. 더욱이, Cop-1으로의 면역화는 압력이 높게 잔류하고, 면역화에 의해 영향을 받지 않는 조건 하에서의, 녹내장에 걸린 생쥐 모델에서의 눈의 긴장 항진증에 의한 망막 신경절 세포의 사멸로부터의 매우 효과적인 보호를 제공한다는 것이 밝혀졌다.

재료들 및 방법들

동물들: 동물들은 동물 보호 및 사용 위원회(IACUC ; Institutional Animal Care and Use Committee)에서 제정된 규정들에 따라 취급되었다. C57BL/6J 스트레인 및 Balb/c 스트레인들의 쥐들(8 내지 13주령) 및 동계의 성체 루이스 생쥐들(8 내지 12주령)을 와이즈만 인스티튜트 오브 사이언스의 동물급여센터로부터 공급받았으며, 광- 및 온도-조절된 방에 보관하였다. 상기 생쥐들은 각 실험에 대해 연령과 크기들을 맞추었다. 이들을 실험들에 사용하기에 앞서, 생쥐들은 케타민(ketamine) 80㎎/㎏ 및 자일라진(xylazine) 16㎎/㎏의 복강 내 투여에 의해 마취되었다.

항원들: Cop 1은 테바 파마슈티칼스 리미티드(이스라엘 페타 틱바 소재)로부터 구입하였다. 수초 희소돌기아교세포 당단백(MOG) 펩티드(pMOG) 1-22(GQFRVIGPGHPIRALVGDEAEL)(서열 번호:33)는 자동 다중 펩티드 합성기(automatic multiple peptide synthesizer ; 독일 랑겐펠트 소재, 아비메드(Abimed)의 에이엠에스422(AMS422))와 Fmoc 기술을 사용하여 와이즈만 인스티튜트 오브 사이언스의 화학부 소재 엠. 프리드킨(M. Fridkin) 박사의 실험실에서 합성되었다. 기니아 피그척수들로부터의 MBP는 이스라엘 소재 시그마로부터 구입하였다.

면역화: 쥐들 및 생쥐들은 각각 75㎍ 또는 100㎍의 Cop-1, 또는 0.5 또는 5㎎/㎖ 미코박테리움 튜베르쿨로시스를 포함하는 등량의 완전 프룬드 부형제중에 에멀젼화된 pMOG 300㎍으로 면역화시켰다. 전체 용적 0.15㎖의 상기 에멀젼을 옆구리의 1개소에서 피하주사시켰다.

1주일 후, pMOG로 면역화된 상기 쥐들에게 촉진제로서 다른 옆구리에 동일한 면역화를 가하였다. 대조군 쥐들은 완전 프룬드 부형제(미합중국 미시간주 디트로이트 소재 디프코) 중의 인산염-완충 생리식염수(PBS)로 주사하였다.

시신경의 파괴 손상: 쥐들과 생쥐들을 마취시키고, 안구로부터 1 내지 2㎜로 시신경의 인트라오비탈부 내에 심각한 파괴 손상에 적용시켰다. 양안 동작 현미경을 사용하여, 결막을 절개해내고, 시신경을 노출시켰다. 교정된 교차-작동 겸자를 사용하여 혈액 공급에 간섭하지 않도록 주의하면서, 상기 신경을 2s(쥐) 및 30s(생쥐)로 파괴시켰다.

글루타메이트 및 NMDA 주사: 마취된 쥐 및 생쥐의 우측 눈을 그 공막 상부에 27-게이지 바늘로 천공시키고, 30-게이지 바늘을 갖는 10-㎕ 해밀턴 주사기를 그 유리체(vitreal body)에 가능한 한 삽입시켰다. 쥐들은 생리식염수 중에 용해시킨 L-글루타메이트 전체 용적 1㎕(200nmole) 또는 N-메틸-D-아스파르테이트(NMDA; 75nmole; 미합중국 매사츄세츠 보스톤 소재 알비아이(RBI)) 1㎕로 주사하였다. 생쥐들은 L-글루타메이트 2㎕(375nmole)로 주사하였다.

쥐들에의 입체접촉 염료의 사전-손상 적용: 두개골을 노출시키고, 15% 과산화수소를 사용하여 건조 및 청결상태를 유지시켰다. 봉합부를 확인하고 표시하였다. 각 반구들의 상구(superior colliculus) 상에 창을 천공시켰다(0.292㎜ 후방 및 중정선에 대해 0.05㎜ 측방). 입체접촉 측정장치(stereotactic measuring device)와 해밀턴 주사기를 사용하여, 각 반구의 상구의 1 지점에서 뇌의 뼈의 표면으로부터 0.16㎜ 또는 0.175㎜의 깊이(쥐의 스트레인에 따라)에서 상기 쥐들에게 플루오로골드(생리식염수 중의 5%, 미합중국 콜로라도주 덴버 소재, 플루오로크롬(Fluorochrome) ; 1㎕)를 주사하였다. 주사 완료 후, 상기 상처를 봉합시켰다. 상기 염료의 역행적 흡수(uptake)는 살아있는 세포들의 표식(marker)을 제공한다.

쥐에서의 망막 신경절 세포 생존의 평가. 치사량의 펜토바르비톨(170㎎/㎏)을 쥐들에게 투입하였다. 그들의 눈들을 적출해내고, 망막들을 분리하여 4% 파라포름알데히드 용액(4% PBS) 중에서 전체적으로 평판-탑재시켰다. 동일한 크기(0.7㎟)의 4 내지 6개의 선택된 영역들로부터 표지된 세포들을 계수하였다. 상기 선택된 영역들은 광디스크로부터의 거리에 대한 함수로서 망막 신경절 세포 밀도의 편차를 극복하기 위하여 광디스크(0.3㎜)로부터 대략 동일한 거리에 위치하는 것들이다. 상기 영역들은 형광 현미경(800배의 배율) 하에서 상기 쥐에게 수용된 처치들로부터 차단된 관찰자들에 의해 계수되었다. 각 망막에서의 영역 당 망막 신경절 세포들의 수의 평균이 계산되었다.

생쥐들에서의 망막 신경절 세포 생존의 평가: 형광 친지질성 염료, 4-(4-디데실아미노)스티릴)-N-메틸피리디늄 이오다이드(4-Di-10-Asp)(네덜란드 소재, 몰레큘라 프로브스 유럽 비브이(Molecular Probes Europe BV, Netherlands))를 시신경 선단(head)에 대한 말단에의 손상 후 적용 후에 생쥐들에서의 망막 신경절 세포들의 생존을 측정하였다. 표지화 및 측정은 다음과 같이 수행되었다. 신경의 혈액 공급에 손상됨이 없이, 시신경을 노출시켰다.

상기 시신경 선단으로부터 1 내지 2㎜로 완전 축색절단을 수행하였으며, 4-Di-10-Asp의 고체 크리스탈(0.2 내지 0.4㎜ 직경)을 축색절단이 수행된 부위에 침적시켰다. 염료 적용 5일 후, 생쥐들을 살처분시켰다. 망막을 눈으로부터 떼어내고, 4% 파라포름알데히드 용액 중에서 전체를 평판으로 준비하고, 형광 현미경에 의해 표지된 망막 신경절 세포들을 검사하였다.

IOP 실험 동물들에서, 상기 신경절 세포들을 역행적 이동 덱스트란 테트라메틸로다민(DTMR ; dextran tetramethylrhodamine ; 미합중국 오레곤주 소재, 몰레큘라 프로브스(Molecular Proves))에 의해 표지화시켰다. 3000Mw DTMR의 크리스탈들을 눈알(globe)로부터 2 내지 3㎜의 시신경의 절단 단부에 적용시켰다. 24시간 후, 상기 망막들을 전체적으로 탑재시키고, 매 1/4씩 마다 2개씩, 8개의 영역들(광디스크의 가장자리로부터 0.66 내지 1.103㎜)에서의 표지된 신경절 세포들을 400배의 배율의 현미경 하에서 계수하였다.

쥐 Cop-1-T-세포주의 생성: Cop-1 항원으로 면역화시킨 C57BL/6J로부터 수득된 유출 임파선 세포들로부터 쥐 T-세포주를 생성시켰다. 상기 항원을 PBS에 용해시켰고(1㎎/㎖), 5㎎/㎖ 미코박테리움 튜베르쿨로시스(디프코)로 보충된, 등량의 완전 프룬드 부형제에 에멀젼화시켰다.

쥐의 뒷다리 패드에로의 면역화 10일 후, 상기 쥐들을 살처분시키고, 그들의 유출 임파선들을 외과적으로 제거하여 분리시켰다. 상기 세포들을 세척하고, L-글루타민(2mM), 2-머캅토에탄올(5*10^-5M), 페니실린(100단위/㎖), 스트렙토마이신(100㎍/㎖) 및 자기유래의 혈청 0.5%(용적/용적)들로 보충된, RPMI를 포함하는 자극 매질 중에서 상기 항원(10㎍/㎖)으로 활성화시켰다.

37℃, 98% 상대습도 및 10% 이산화탄소에서 72시간 동안 배양 후, 상기 세포들을 5% 태아소혈청(용적/용적) 및 콘카나발린 에이(ConA)-자극된 비장세포들의 상등액으로부터 나온 10% T-세포 성장 인자들이 부가된, 비-필수아미노산들(1㎖/100㎖), 피루브산나트륨(1mM), L-글루타민, β-머캅토에탄올, 페니실린 및 스트렙토마이신들로 보충된 RPMI를 포함하는 전개 매질로 이전시켰다.

세포들을 전개 매질 내에서 10 내지 14일간 성장시킨 후, 전개 매질 중에 조사된(2500rad) 흉선세포들(10⁷세포들/㎖)의 존재 중에서 그들의 항원(10㎍/㎖)로 재자극시켰다. 상기 T-세포주들을 반복된 자극 및 전개에 의해 확장시켰다. 기본적으로 상기 세포주는 앞서 언급된 것과 유사한 표현형을 갖는다(Aharoni et al., 1997).

생쥐 Cop-1-T-세포주의 생성: 상기 항원으로 면역화시킨 루이스 생쥐들로부터 수득된 유출 임파선 세포들로부터 T-세포주들을 생성시켰다. 상기 항원을 PBS에 용해시켰고(1㎎/㎖), 4㎎/㎖ 미코박테리움 튜베르쿨로시스(디프코)로 보충된, 등량의 불완전 프룬드 부형제(미합중국 미시간주 디트로이트 소재 디프코 라보레이토리즈(Difco Laboratories))에 에멀젼화시켰다.

상기 항원을 생쥐들의 뒷다리 패드에로0.1㎖의 에멀젼으로 주사한 10일 후, 상기 생쥐들을 살처분시키고, 그들의 유출 임파선들을 외과적으로 제거하여 분리시켰다. 상기 세포들을 세척하고, L-글루타민(2mM), 2-머캅토에탄올(5*10^-5M), 피루브산나트륨(1mM), 페니실린(100IU/㎖), 스트렙토마이신(100㎍/㎖), 비-필수아미노산들(1㎖/100㎖) 및 자기유래의 혈청 1%(용적/용적)들로 보충된, 둘베코의 변형 이글 매질(DMEM)을 포함하는 자극 매질 중에서 상기 항원(10㎍/㎖)으로 활성화시켰다. 37℃, 98% 상대습도 및 10% 이산화탄소에서 72시간 동안 배양 후, 상기 세포들을 10% 태아소혈청(용적/용적) 및 콘카나발린 에이(ConA)-자극된 비장세포들의 상등액으로부터 나온 10% T-세포 성장 인자들이 부가된, 상기한 바와 동일한 농도들의 DMEM, L-글루타민, 2-머캅토에탄올, 피루브산나트륨, 비-필수아미노산들 및 항생제들로 이루어지는 전개 매질로 이전시켰다.

세포들을 전개 매질내에서 4 내지 10일간 성장시킨 후, 전개 매질 중에 조사된(2000rad) 흉선세포들(10⁷세포들/㎖)의 존재 중에서 그들의 항원(10㎍/㎖)로 재자극시켰다. 상기 T-세포주들을 반복된 자극 및 전개에 의해 확장시켰다.

조직학적 분석: 글루타메이트 또는 생리식염수 주사 7일 후, 치사량의 펜토바르비톨(170㎎/㎏)의 주사에 의해 쥐들을 살처분시켰으며, 그들의 눈들을 적출해내고, 4℃에서 48시간 동안 포름알데히드 용액(4% PBS) 중에서 고정시켰다. 영역(10㎛ 두께)들을 파라핀 중에 매립시키고, 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin)으로 염색시켰다.

생쥐들에서의 눈의 긴장 항진의 생성/생쥐들에서의 안내압의 상승: 수컷 생쥐들을 케타민(15㎎/㎏), 아세프로마진(acepromazine)(1.5㎎/㎏) 및 자일라진(0.3㎎/㎏)의 혼합물로 마취시켰다. 연정맥 및 상공막의 정맥(limbal and episcleral vein)들의 레이저 광응집에 의해 안내압(IOP)을 상승시켰다. 청-녹 아르곤 레이저로 생쥐들을 1주일 간격으로 2회 처치하였다(2회 처치에서 0.2초 당 1watt로 전체 130 내지 150점(spot)들을 부여; 미합중국 캘리포니아주 팔로 알토 소재, 코헤런트(Coherent)). 안내압을 측정하였다.

각막(cornea)을 마취시키기 위하여 동물 신경안정제(veterinarytranquilizer) 아세프로마진 3.0㎎/㎏을 생쥐에 근육내 주사하고, 또한 눈들의 상부상에 프로파라카인(proparacaine) 0.5%를 적용시킨 후, 토노-펜(TONO-PEN ; 미합중국 매사츄세츠 노르웰 소재, 멘토르(Mentor))을 사용하여 매주 마다 안내압을 측정하였다.

결과들

수초-관련 항원들은 글루타메이트 독성에 대해 보호적이지 못함.앞서 본 발명자들의 실험실에서 수초-관련 항원들로의 수동적 및 적극적 면역화가 생쥐들 및 쥐들에서의 시신경 파괴 손상(실시예 1 및 2들; Moalem et al., 1999 및 Fisher et al., 2000) 및 성체 생쥐들에서의 척수 좌상(contusive)(Hauben et al., 2000a 및 Hauben et al., 2000b)과 관련된 외상-후 퇴화를 감소시킬 수 있음을 입증하였다.

비-기계적 손상 후에도 이러한 면역 신경보호가 마찬가지로 발휘될 어떨지를 결정하기 위하여, 수초-관련 항원들로의 적극적 면역화 또는 이들 항원들에 반응성인 T-세포들의 수동적 전이가 글루타메이트의 안구 유리체내로의 주사에 의해 유발된 독성에 대해 신경 보호를 제공하는 지의 여부를 먼저 시험하였다.

쥐들 및 생쥐들의 시신경들을 파괴 손상에 적용시켰다. 본 발명자들의 실험실에서 유래된 면역 신경보호 프로토콜(protocol)들을 사용하여, 쥐들에서는 MOG-유래의 펩티드들로의 적극적 면역화(Fisher et al., 2000)를, 그리고 생쥐들에서는 항-MBP T-세포들의 수동적 전이(Moalem et al., 1999)를 수행하였다.

쥐들 및 생쥐들 모두에서 1주일 후에 측정할 수 있는 망막 신경절 세포 사멸에 이르도록 앞서 나타낸 바의 농도로의 글루타메이트의 안구 유리체내로의 주사에 의해 글루타메이트 상해(glutamate insult)를 적용시켰다(Yoles et al., 2000).

글루타메이트의 안구 유리체내로의 주사(200nmole)에 앞서 쥐들을 pMOG로 면역화시켰다. 글루타메이트 주사 1주일 후, 망막 신경절 세포 생존이 평가되었을 때, pMOG로의 면역화의 유리한 영향이 검출되었다는 증거는 없었다(도 5A). 유사하게, 생쥐들의 항-MBP T-세포들의 수동적 전이 직후의 글루타메이트 주사의 경우에서 유리한 영향이 검출되지 않았다(도 5B).

따라서, 비록 pMOG(1-22)로의 백신화가 최근 시신경의 파괴 손상 후 쥐들에서의 신경 보호 영향을 나타낸다는 것이 밝혀지기는 했으나(Fisher et al., 2000), 상기 pMOG-백신화된 쥐들을 글루타메이트 손상에 적용시킨 후의 연구에서는 어떠한 신경 보호도 관찰되지 않았다.

이들 발견들로 본 발명자들은 다음의 2가지 가능성 즉, 글루타메이트-유발 망막 신경절 세포 사멸이 면역 체계에 포함되지 않음을 암시하는 글루타메이트 독성에 따른 망막 신경절 세포들의 손상은 면역 신경 보호를 받지 못한다는 점 또는 pMOG 및 MBP와 같은 수초-관련 항원들이 글루타메이트 독성에 대한 보호를 위한 올바른 항원들이 아니라는 점들을 고려하게 되었다.

글루타메이트에 의한 세포 사멸의 비율이 정상적인 쥐들 또는 생쥐들에 비해 성숙 T-세포들이 결여된 쥐들 또는 생쥐들에서 보다 높았다는 것을 나타내는 본 발명자들의 실험실로부터의 최근 결과들(Kipnis et al., 2000)은 중추신경계 손상에 대한 이로운 생리적 응답은 T-세포들을 포함한다는 것을 강하게 암시한다.

따라서, 이러한 내인성 글루타메이트-유발 T-세포 응답의 촉진은 손상된 망막들에 이로운 영향을 갖는다고 여겨진다.

Cop-1 면역화가 글루타메이트 독성에 대해 보호한다.글루타메이트-유발 독성에 대한 이로운 면역 응답을 일으킬 것으로 여겨지는 생리적 항원들에 대한 연구가 본 단계에서 여전히 제1의 목표이기는 하나, 본 발명자들은 글루타메이트에 대한 면역 응답의 외인성 면역 체계 조작(manipulation)의 목적을 위해 사용될 수 있는 항원의 발견에 관심을 가졌다.

우선, 글루타메이트 주사가 망막 신경절 세포들이 임파구들에 접근할 수 있게 되는지 어떤지를 조사하였다. 많은 수의 임파구들이 글루타메이트 주사 24시간 이내에 글루타메이트-주사된 눈으로 침투하였으며(도 6A 및 도 6B), 이는 면역 조작이 그들의 글루타메이트에의 국부적 노출 후의 망막 신경절 세포들의 생존에 영향을 주는 것을 암시한다.

이들을 함께 고려하여 보면, 이들 두 발견들로 본 발명자들은 글루타메이트 독성이 T-세포로 중개된 보호 영향을 활성화시킨다고 믿게 되었으며, 이러한 이로운 면역 응답을 촉진시키는 방법을 찾게 되었다. 적절한 항원을 찾는 과정에서, 다발성 경화증 환자들의 치료제로서 사용되었었고, 최근 성체 생쥐의 신경 파괴 손상 모델에서 신경 보호를 촉진시키는 것으로 밝혀진(Kipnis et al., 2000a), 올리고펩티드인 합성 중합체, 코폴리머-1(Cop-1)이 유력한 후보로 고려되었다.

우선, Cop-1으로의 면역화가 생쥐들 만에서 뿐만 아니라 쥐들에서의 시신경 파괴 손상 후의 망막 신경절 세포 생존에 이로운 영향을 주는지 어떤지를 시험하였다. 이 연구를 위해, Balb/c 쥐들이 사용되었다. 생쥐들에서의 시신경 파괴 손상 후에도 이로운 것으로 입증된 프로토콜을 사용하는 Cop-1으로의 면역화는 또한 쥐들에서 시신경 손상 후에도 이로웠다(도 7).

다음으로, 동일한 프로토콜이 글루타메이트-유도 독성에 대해서도 신경 보호를 이끌어낼 수 있는지 어떤지를 시험하였다. 이 연구를 위해, C57bl/6 쥐들이 사용되었으며, 여기에서 글루타메이트 손상에 따른 망막 신경절의 손실은 Balb/c에 배해 더 높았다(Kipnis et al., 2000b). 글루타메이트의 안구 유리체 내로의 주사 10일 전, C57bl/6 쥐들을 5㎎/㎖ 박테리아를 포함하는 부형제 중에 에멀젼화시킨 Cop-1으로 면역화시켰다.

신경 손실과 자가면역 질병에 대한 저항 사이의 유전적 연관 때문에 C57bl/6 쥐들에서 글루타메이트 주사에 의해 유발된 망막 신경절 세포들의 손실이 Balb/c 쥐들에 비해 더 크다는 본 발명자들의 실험실에서의 최근 발견(Kipnis et al., 2000b)에 기초하여 C57bl/6 쥐들이 선택되었다. Cop-1으로의 면역화가 글루타메이트 독성의 분명한 감소의 결과를 낳았다(도 8A).

이 모델에서 Cop-1으로의 면역화를 위한 치료적 기회를 구축하기 위한 시도에서, 2가지의 서로 다른 박테리아 농도(0.5 또는 5㎎/㎖)를 포함하는 부형제 중에 에멀젼화된 Cop-1을 사용하는 실험을 반복하였으며, 상기 쥐들은 글루타메이트 손상에 대해 서로 다른 시간들에서 면역화되었다. 글루타메이트가 주사된 그날 면역화된 쥐들은 상기에 대응하는 부형제들에 에멀젼화시킨 PBS로 주사된 쥐들에서 나타난 것 보다 명백하게 더 높은 망막 신경절 세포의 생존율을 나타내었다(도 8B 및도 8C).

두 부형제들 모두 명백한 효과들을 나타내었다. 상기 Cop-1의 보호 효율은 면역화와 글루타메이트 손상 사이에서의 시간에 따라 감소하였으며: 글루타메이트 주사 직후 또는 24시간 후에 Cop-1 면역화가 주어졌을 때의 망막 신경절 세포들의 생존율의 평균 백분율이 PBS-주사된 망막들에서 보다 명백하게 더 높았으며, 글루타메이트 주사 48시간 후에 Cop-1이 주어졌을 경우에는 명백하지 않았다(도 8D). 흥미롭게도, Cop-1 면역화는 NMDA에 의해 야기된 독성으로부터 쥐들을 보호하는 데는 실패하였으며(도 9), 이 생체 모델에서 이들 전형적인 독성유도(apoptotic) 사멸로부터의 서로 다른 특징들로의 망막 신경절 세포 사멸의 원인이 된다는 것이 최근 본 발명자들의 실험실에서 밝혀졌다.

Cop-1에 대해 반응성인 T-세포들의 입양 전달이 글루타메이트 독성에 대해 보호한다.Cop-1으로의 관측된 면역화가 글루타메이트 독성에 대한 T-세포-중개된 신경 보호를 유도하는 지를 결정하기 위하여, 글루타메이트의 주사(200nmole) 직후, 5*10⁶Cop-1-반응성 T-세포(복강 내로 250㎕)들을 쥐들 내로 수동적으로 이동시켰다.

1주일 후, PBS로 복강 내로 주사한 대조군 쥐들(1238 ±2, n=3)에 비해 Cop-1-반응성 T-세포들로 주사된 쥐들(1978 ±86, n=6)에서 명백하게 보다 많은 망막 신경절 세포들이 생존하였다(도 10).

Cop-1 면역화는 생쥐들에서의 눈의 긴장 항진증에 의해 야기된 망막 신경절세포들의 사멸로부터 보호한다.루이스 생쥐들을 레이저로 1주일 간격으로 2회 처치하여 안내압을 증가시켰다. 계속해서, 3주간의 기간에 걸쳐 지시된 시간들에서의 측정들은 레이저 처치 2주 후에서 안내압이 30 ±0.4㎜Hg(평균 ±SEM)으로 증가되었으며, 그 후 대략 같은 수준으로 유지됨을 나타냈다(도 11A). 초기 레이저 처치 3주 후에 측정되었을 때, 이들 생쥐들에서의 망막 신경절 세포 생존율은 레이저로 처치되지 않은 대조군 생쥐들에 비해 명백하게 더 낮았다(19.9% ±0.51%, 평균 ±SEM)(도 11B).

망막 신경절 세포들의 생존에 대한 Cop-1 면역화의 영향을 검사하기 위하여, 생쥐들을 최초 레이저 처치 당일날 완전 프룬드 부형제 중에 에멀젼화된 Cop-1으로 면역화시켰다. 3주 후, 상기 망막 신경절 세포들을 역행적으로 표지화시켰으며, 24시간 후, 상기 망막들을 절개해내고, 전체적으로 탑재시킨 후, 표지된 망막 신경절 세포들을 계수하였다. Cop-1으로 면역화된 생쥐들에서의 생존하는 망막 신경절 세포들의 수는 PBS/CFA로 주사된 대조군들에 비해 명백하게 더 높았다(도 11C).

상기 생쥐들의 두 그룹 모두에서 안내압은 아무런 주사들의 적용을 받지 않은, 레이저-처치된 생쥐들의 그룹에서의 안내압보다 높게 유지되었다(도 11A). 생쥐들의 안내압이 이미 높은 경우, Cop-1으로 면역화된 생쥐들에서 약간 더 작기는 하나, 유사한 영향이 나타났다(도 11D).

(7) 결과들의 토론

산업사회들에서 가장 흔하기는 하나, 치명적인 외상성 손상들의 하나인 척수손상들에 대한 치료법은 아직 발견되지 않았다. 지난 40여년 이상, 말초신경계와는 달리, 중추신경계 신경들은 단지 제한된 손상 후 재생 능력만을 갖는 것으로 알려져 왔다.

지난 20여년 동안, 재생을 촉진시키기 위한 시도들은 단지 부분적 회복만을 이끌어내는 접근법들만을 만들어 냈다. 인간 척수에 의해 유지되는 대부분의 외상성 손상들이 부분적임에도 불구하고, 그 결과의 기능성 손상은 초기 손상의 심각성에 비해 보다 더 심각할 것으로 고려될 수 있으며; 2차 퇴화의 자가-전개 과정은 결정적인 것으로 나타난다.

손상-유래의 2차 퇴화를 정지시키기 위한 실질적인 연구들이 최근 행해졌다. 지금까지의 모든 시도들은 약학적인 기초 하에서 수행되었었으며, 일부는 척수 충격으로부터의 개선된 회복의 결과를 가져왔었다. 대조적으로, 본 발명자들은 자가-보존의 자연적 메카니즘을 향상시키는 것으로 여겨지며, 단일 처치 후, 장기간의 회복을 유도하는 세포요법을 기술하고 있다. 이 회복의 정도는 약학적 방법들을 사용하여 보고된 것들을 초과하는 것으로 나타났다.

대부분의 조직들에서, 상처-유도 손상은 조직을 보호하고 그 항상성을 보존하도록 작용하는 세포상 면역 응답을 촉발시킨다. 이 응답은 대식세포(macrophage)들 및 면역 체계의 천부의 무기(innate arm)를 포함하는 다른 세포들에 기여하여 왔다. 적응성 면역에 대응하는 임파구들은 조직 보존에 기여하는 것으로는 생각되지 않았었다. 전통적인 교시에 따르면, 적응성 면역은 외부 위험인자들에 대해 지향되었다.

그러나, 본 발명에서는 적응성 T-세포 면역 응답이 외부 독소들에 의해 침입되지 않은 경우에서조차 보호가 가능하다는 것을 밝혔다. 조직 보존의 경우에서, T-세포들의 특이성은 조직 자가-항원들에 대한 것이다.

상기 실시예들의 결과들은 글루타메이트 독성에 노출된 시신경들에서와 마찬가지로 파괴 손상된 중추신경계 신경들에서의 Cop 1에 대해 반응성인 T-세포들의 신경 보호 영향을 증명하였다. 부분 시신경 파괴의 생쥐 모델에서, 중추신경계 손상의 바로 그날에 Cop 1-반응성 T-세포들의 입양 투여 또는 Cop 1으로의 면역화는 신경 섬유들의 2차 퇴화에 대해 뚜렷한 보호 영향을 나타내었다. 시신경에 대한 외상성 손상 후 손상의 확산을 방지하는 가능한 방법으로는 이것이 최초이다.

생쥐 시신경의 파괴 손상 후, Cop 1-반응성 T-세포들의 주사는 2차 퇴화의 파괴적 영향에 대한 명백한 보호의 결과를 가져왔다. 기대된 바와 같이, T-세포들이 손상의 부위에 축적되었으나, 이들은 또한 비-손상된 신경에서도 축적되었다. 비-손상된 중추신경계 내의 T-세포들의 축적은 단지 당해 항원에 의한 T-세포 수용기의 인식이 있는 경우에만 가능한 것이다. 활성화된 T-세포들은 그들의 특이성에 불구하고, 혈액-뇌 장벽(BBB ; blood-brain barrier)을 통하여 통과할 수 있으나, 단지 중추신경계 항원들에 반응성인 것들만이 비-손상된 신경 내에 축적될 수 있다(Hickey, 1991).

따라서, 본 발명은 Cop 1-반응성 T-세포들과 중추신경계 수초의 성분들 간의 생체 내 교차-인식을 처음으로 증명하였다. 손상부에서의 이러한 인식은 활성화된 T-세포들에 의한 적절한 신경 영양 인자들 또는 아직 밝혀지지 않은 다른 인자들의분비를 경유하는 것으로 여겨지는 보호성 표현형에 대한 T-세포들의 스위칭을 유도하는, T-세포 활성화를 촉발시키는 데 기능한다.

본 발명은 그들의 특이성 항원에 의해 활성화된 Cop 1-반응성 T-세포들이 신경 생존에서 중요한 역할을 하는 신경 영양 물질인 BDNF(Yan et al, 1992; Sendtner et al, 1992)를 상당한 양으로 분비한다는 것을 증명하였다.

Cop 1은 원래 수초 염기성 단백질(MBP)의 활성을 의태하고, 설치류에서 염증성의 수초탈락 질병 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)를 유발시키기 위하여 설계되었다. 그러나, 이는 비-뇌척수막성이고, 심지어 MBP, 단백지질 단백질(PLP) 또는 희소돌기아교세포 당단백(MOG)에 의해 유발된 실험적 자가면역 뇌척수염을 억제시킨다는 것이 밝혀졌다(MBP의 경우 Teitelbaum et al., 1971; PLP의 경우 Teitelbaum et al., 1996; MOG의 경우 Ben-Nun et al., 1996을 참조).

Cop 1은 설치류에서 실험적 자가면역 뇌척수염의 전개를 방지하고, 인간들에서 다발성 경화증을 개선시킨다. Cop 1에 대한 항체와 MBP 사이 또는 이들 항원들에 직접적으로 지향되는 T-세포들 사이에서의 부분적 교차-반응성이 연구들에서 입증되었다(Webb et al., 1973 및 Teitelbaum et al., 1988). Cop 1은 MBP 면역우성 항원결정기(MBP immunodominant epitope)에 대한 T-세포 항원 수용기의 길항제로서 작용할 수 있다(Aharoni, 1998).

이는 또한 여러 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 2 분자들과 결합하고, 이들이 특이성의 항원-인식 특성들을 갖는 T-세포들과 결합하는 것을 방지할 수 있다(Fridkis-Hareli et al., 1998). 설치류에서, Cop 1은 뇌척수막성 T-세포들을 억제하는 조절 세포들의 발현을 유도한다. 설치류에서의 이러한 T-세포들의 입양 전달은 MBP, PLP 또는 전체 척수 파쇄액에 의해 유도된 실험적 자가면역 뇌척수염의 전개를 방지한다는 것이 밝혀졌다(MBP의 경우 Aharoni et al., 1993; PLP의 경우 Teitelbaum et al., 1996; 전체 척수 파쇄액의 경우 Aharoni et al., 1997을 참조).

따라서, MBP 또는 다른 수초-관련 단백질들로의 면역화와는 달리, Cop 1으로의 면역화는 실험적 자가면역 뇌척수염을 유발하지 않으며, 부형제의 부재 중에서 Cop 1에 의해 유발된 T-세포들은 조절성을 갖는다. 손상 직후 불완전 프룬드 부형제 중의 Cop 1으로의 면역화 및 2일 후의 촉진제에 의하여 강한 신경 보호 영향을 갖는다. 이러한 면역화는 대략 1주일 이내에 그 세포상 응답이 정점에 달하는 것으로 여겨지나, 심지어 그 시간 이전에 중추신경계 중에 존재하는 T-세포들의 수가 적어도 일부 신경 보호 활성에 영향을 주기에 명백하게 충분히 크게 될 것이라고 가정하는 것도 타당하다.

손상의 부위에 뇌척수막성의 T-세포들이 축적되기에 충분하도록 면역 응답이 강하게 되는 것을 나타내는, 실험적 자가면역 뇌척수염의 증후 10일 후, MBP로의 면역화에 따라 그들의 손상을 가하게 되고, 그리고 실험적 자가면역 뇌척수염 증후군을 생산한다.

본 발명은 불완전 프룬드 부형제 중의 Cop 1으로의 면역화 및 2일 후의 촉진제에 의하여 시신경에서의 면역 응답이 2차 퇴화를 방지하게 충분하였다는 것을 나타내고 있다. 이러한 응답이 T-세포들의 수동적 전이 후에 얻어진 응답에 비해 어느 정도 지연된다는 것도 가능하기는 하나, 1차 손상으로부터 빠져나온 신경섬유들의 보호를 위해 필요한 기회의 시간 내에서 여전히 달성될 수 있는 것이다.

2차 퇴화의 결과의 신경들의 손상이 경미한 파괴 손상 1주일 후에 대략 25%이고, 손상 2주일 후에 대략 55%에 달한다는 것이 생쥐의 시신경에서의 앞서의 연구들에서 밝혀졌다(Yoles, 1998).

따라서, 비록 상기 응답이 요구되는 강도에 다다르기까지 1주일이 걸리더라도, 그때에서도 신경섬유들은 여전히 보호가 필요하다. 활성화된 Cop 1-반응성 T-세포들의 입양 전달 후 및 Cop 1으로의 활성 면역화 이후에서 얻어진 결과들 간의 비교는, 2차 퇴화로부터의 보호의 양이 두 경우 모두에서 거의 같기 때문에, 최대로 유효하게 되기까지 걸리는 시간에 있어서 두 처치 모두 명백한 차이는 없다는 것을 암시한다.

본 발명에서 Cop 1은 그의 공지된 영향과 반대되는 영향을 나타낸다는 것은 강조되어야 한다. Cop 1은 T-세포 자가면역을 억제하기 위하여 설계된 약물로 알려져 있는 반면에, 본 발명에서는 특이적인 항-수초 T-세포 자가면역의 활성화에 필요한 영향을 갖는다.

결론적으로, 앞서의 연구들은 생쥐 중추신경계에서의 축색성 손상이 수초 단백질에 대해 지향하는 자가면역 T-세포 응답을 일깨운다는 것을 나타내고 있으나, 이는 2차 퇴화로부터 신경섬유들을 보호하기에는 너무 약하다.

자가면역 질병을 수반하는 위험 없이 이러한 자가면역 응답을 촉진시키는 것이 본 발명에서 중추신경계에 의해 교차-인식하기는 하나 뇌척수막성이 아닌, 코폴리머를 사용하는 것에 의해 달성되었다.

수동적 전달 또는 손상시의 면역화에 의해 수득된, 중합체에 대한 T-세포 면역 응답이 외상 후 유지의 유효한 수단을 제공한다. T-세포 중개 신경 보호는 본 발명에서 중추신경계 신경들의 급성 및 만성적 손상들 모두에 적용할 수 있다는 것이 입증되었으며, 여기에서 신경들은 퇴화에 대해 취약하며, 신경 보호에 대해 따를 수 있다. 이는 또한 글루타메이트 독성에 의해 야기된 1차 및 2차 퇴화로부터의 보호에도 적용될 수 있다.

Cop 1으로의 수동적 또는 적극적 면역화에 의해 달성된 T-세포 의존성 면역 신경 보호는 또한 본 발명에서 만성적으로 높은 안내압을 갖는 쥐들 및 생쥐들의 모델에서 글루타메이트로 유도된 독성에 대한 유효한 치료법이 된다는 결과들로 나타났다.

Cop 1으로의 수동적 및 적극적 면역화 모두가 글루타메이트 독성으로부터 유효한 신경 보호를 제공한다는 실시예 3에서의 연구들의 결과로서, 백신화가 글루타메이트와 관련된 신경성 독성을 감소시키는 하나의 방법으로 개발될 수 있다.

이들 결과들은 (1) 자가면역 질병 다발성 경화증을 앓는 환자들에 면역억제제로서 사용되어 왔던 Cop 1이 글루타메이트-유발 신경독성들에 대해 백신화로서 유효하다는 것; (2) 국부 스트레스 신호에 기인하는 중추신경계 신경들의 손상이 계통적 면역 조작으로부터 이롭게 될 수 있다는 것; (3) 동일한 신경들, 이 경우 망막 신경절 세포들이 손상의 속성 및 부위에 불구하고 계통적 면역 응답(이 응답의 항원적 특이성이 변할 수 있음에도 불구하고)으로부터 이롭게 될 수 있다는 것;(4) 손상의 형태(기계적 또는 생화학적)에 명백하게 의존적이지 않더라도, Cop 1의 이로운 활성이 상기 손상이 활성화시키는 사멸의 메카니즘에 대해 절대적으로 의존적임을 나타낸다는 것 등의 다수의 흥미로운 의미들을 갖는다.

실시예 3에서, 상기 유도된 면역 활성은 글루타메이트에 의해 야기된 사멸에 대해서 세포들을 보호하나, NMDA에 의해 야기된 사멸에 대해서는 그렇지 않다. 또한, (5) 면역원으로서 작용하는 Cop 1은 수초 단백질의 교차-인식을 절대적으로 필요로 하지 않는 메카니즘에 의한 신경 보호를 유도한다.

2차 퇴화에 대한 면역 신경 보호와 자가면역 질병들에 대한 면역 요법 사이에는 중요한 차이가 있다는 것은 강조되어야 한다. 전자가 이로운 T-세포들의 적극적 내포를 요구하는 반면에, 후자는 뇌척수막성 T-세포들의 면역 조절로부터의 또는 그들의 억제로부터의 두 가지 모두에서 이롭게 될 수 있다.

면역원(immunogen)으로서 작용하는 Cop 1은 신경성 손상으로부터의 보호 및 자가면역 질병들에 대한 요법의 두 가지 목적들을 위해 작용할 수 있다. 아마도, 이는 "안전한" T-세포 반응을 불러내는 것에 의해 달성되며, 이는 한편으로는 신경 보호를 위해 요구되는 이로운 자가면역 T-세포 응답을 제공하고(Moalem et al., 1999a; Moalem et al., 1999b; Kipnis et al., 2000a; Moalem et al., 2000c; 및 Schwartz et al., 1999), 다른 한편으로는 자가면역 질병의 회피를 위해 요구되는 면역 조절을 제공한다(Neuhaus et al., 2000).

MBP에 반응성인 T-세포들이 부분적으로 파괴된 시신경들(Moalem et al., 1999 및 Schwartz et al., 1999) 및 척수 좌상(Hauben et al., 2000a)의 생쥐 모델에서 신경 보호를 한다는 것이 본 발명자들의 실험실에서 밝혀졌다.

본 발명자들의 실험실에서의 앞서의 발견들은 Cop 1-반응성 T-세포들과 중추신경계 수초의 성분들 사이에서의 생체 내에서 입증되었다(Kipnis et al., 2000a). 본 발명자들은 이러한 인식이 T-세포 재활성화 및 그에 따라 T-세포들이 보호의 표현형을 향하여 스위칭 시키는 원인이 되는 것에 의해 축색 손상 후 T-세포 신경 보호를 수행하는 가능한 메카니즘을 나타낸다는 것으로 제시한다.

그들의 특이적 항원에 의해 활성화된 경우에, MBP-반응성 T-세포들과 마찬가지로(Moalem et al., 2000), Cop 1-반응성 T-세포들(실시예 1 및 2; Kipnis et al., 2000a)은 신경 생존에 중요한 역할을 하는 뇌-유도 뇌영양 인자들을 상당한 양으로 분비한다는 것(Sendtner et al., 1992 및 Yan et al., 1992)이 또한 본 발명자들에 의해 밝혀졌다.

실시예 1에서, 본 발명자들의 실험실에서 백질에 대한 물리적인 외상 후 Cop 1에 대한 T-세포 면역이 실험되었으며, 여기에서 항-Cop 1 T-세포들이 노출된 수초 에피토프와 교차-반응할 수 있다.

실시예 3에서의 발견은 수초 항원들이 포함되지 않는 것으로 여겨지는 조건 하에서 신경 세포 본체들에 직접적으로 영향을 주는 것으로 여겨지는 글루타메이트 독성에 대해 Cop 1으로의 면역화가 활성이며, 이는 항-Cop 1 T-세포들이 그들의 이질 혼교(heterogeneity)로 인하여 망막에 관련된 것들을 포함하여 다양한 항원들에 대응한다는 것을 암시한다.

상기 Cop 1-반응성 T-세포들은 직접적으로 글루타메이트 자체와 상호작용할수 있다. 이러한 상호작용은 Cop 1-반응성 T-세포들 또는 내인성 T-세포들을 보호 표현형으로 전환시킬 수 있다.

Cop 1-반응성 T-세포들이 유리체 내로 주사된 글루타메이트와 또는 망막 내의 소교세포(microglia)-활성화된 T-세포들과 상호작용할 수 있다는 가능성은 글루타메이트 주사 24시간 후 유리체 내에서 관찰된 침입 임파구들의 큰 수들에 의해 지지되었다.

Cop 1으로 주사된 쥐들에서, 상기 침입 임파구들은 Cop 1에 특이적인 것들 몇몇을 포함하는 것으로 여겨진다. Cop 1-반응성 T-세포들의 수동적 전달이 Cop 1으로의 적극적 면역화와 유사한 영향을 갖는다는 발견과 함께, 상기한 발견은 백신화의 영향이 체액의 면역성 또는 Cop 1 자체에 의해서라기 보다는 결국 T-세포들에 의해 중개된다는 것을 암시한다.

2차 퇴화의 중개자인 글루타메이트가 1차 손상으로부터 시간상 약간의 거리를 두고 나타나기 때문에(Yoles et al., 1998), 직접적인 글루타메이트 독성의 경우에서 24시간의 처치 기회는 중추신경계 외상의 경우에서 Cop 1으로의 처치의 기회가 더 광범위하다는 것을 의미한다.

독성 손상이 NMDA에 의해 야기된 경우에는 Cop 1이 어떠한 보호 효과도 갖지 않는다는 것은 주목하는 것은 흥미로운 것이다. 이는 NMDA가 독성유도의 명백한 신호들 없이 그리고 NMDA-수용기 길항제들 이외의 요법을 위한 명백한 기회 없이, 대부분의 즉시적인 사멸 신호를 부여한다는 것을 보여주는 본 발명자들의 실험실로부터의 연구들과 동일선상에 있는 것이다.

따라서, Cop 1으로의 면역화가 NMDA-유도 독성에 대해 효과적이지 않다는 것은 놀랄만한 것이 아니다. 억제제로서라기 보다 신경 보호로서의 Cop 1의 활성이 그 투여 경로에 의존적 인지의 여부에 대하여는 여전히 조사되어야 한다. 중추신경계 항원들에 특이적인 T-세포들 또는 Cop 1과 같은 교차-반응성 항원들에 특이적인 T-세포들의 국부적 축적이 어떻게 중추신경계 손상 후의 신경 보호를 중개하는 가도 역시 결정되어야 할 것으로 남는다.

T-세포 중개 신경 보호가 신경들이 퇴화에 대해 취약하며, 신경 보호에 따를 수 있는 중추신경계 신경들의 급성 및 만성 손상들 모두에 적용될 수 있다는 것이 실시예 3에서의 연구들에서 입증되었다(Schwartz et al., 2000a; Schwartz et al., 2000b; Doble et al., 1999; 및 Grunblatt et al., 2000). 만성조건인 녹내장은 종종 안내압과 관련되어 있으며, 또한 맹목(blindness)의 원인을 유발한다.

그러나, 기계적 압축이 아마도 시신경 손상에 대한 유일한 이유가 아니고, 그리고 그에 따라 안내압의 저하에 더해 이러한 처치가 신경 보호 요법을 포함한다는 것을 암시하는, 상기 안내압이 통상의 범위 이내에서 유지된다고 하더라도, 질병은 발전을 계속할 수 있다는 것은 일반적인 경험이다(참조를 위해서는 Osborne et al., 1999; Schwartz et al., 2000c; 및 Weinreb et al., 1999를 참고하라).

예를 들면, 글루타메이트 길항제(Chaudhary et al., 1998) 또는 산화질소 합성효소(nitric oxide synthase) 저해제(Neufeld et al., 1999)로의 처치가 증가된 안내압의 생쥐 모델에서 망막 신경절 세포사멸을 약화시킨다는 것이 최근의 연구들에서 밝혀졌다.

그러나, 병소(pathology)에서 가능하게 이로울지라도, 이들 약제들에 의한 생리학적 응답과의 간섭이 정상의 조직들에 대해 해로울 수 있으며, 바람직하지 못한 부작용들을 유도한다는 위험이 있다. 따라서, 임상학적 관점으로부터의 보다 바람직한 접근은 조직의 자체 방어 기구를 제어하고 증가시키는 것이다.

압력이 여전히 높은 경우에서조차 신경 보호가 달성되었다는 본 발명의 발견은 임상학적 관점에서 잠재적으로 매우 유리하다. 이는 정상으로 감소된 압력이 잔류하는 신경들이 정상인들보다 더 취약한, 녹내장을 앓는 환자들의 안전에 필수적인 것은 아니기 때문이다(Agis, 2000). 게다가, 이러한 환자들에서 안전한 것으로 고려될 수 있는 안내압 즉, 12㎜Hg로의 감소가 가능하지는 않을 것 같다.

이제 본 발명에서 충분히 기술되는 바, 본 발명의 정신 및 관점에서 벗어남이 없이, 그리고 실험의 수행 없이, 당해 기술분야에서 숙련된 자는 등가의 인자들, 농도들 및 조건들의 폭 넓은 범위 내에서 동일하게 수행할 수 있음은 이해될 수 있는 것이다.

비록 본 발명이 특정의 구체예들과 관련하여 기술되기는 하였으나, 그 이상의 변형들 또한 가능함은 이해될 수 있는 것이다. 이상에서 본 발명은 기재된 구체예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.

저널 기사들 또는 요약들, 대응하는 미합중국 출원공개 또는 외국 특허 출원들, 미합중국 특허들 또는 다른 특허들을 포함하여 본 명세서에서 인용된 모든 참조들은 데이터들, 표들, 도면들 및 문장들을 포함하여 참고 문헌들에 나타난 것들을 전체적으로 본 명세서에서 참고로 인용되었다. 거기에 더해, 본 명세서에서 은급된 참고들 내에 언급된 참고들의 전체 내용들을 참고로 전체적으로 포함시켰다.

본 발명의 임의의 관점, 설명 또는 구체예의 어떠한 형태로도의 허용이 아닌, 공지된 방법의 단계들, 통상의 방법들의 단계들, 공지의 방법들 또는 통상의 방법들에 대한 참조는 관련 기술에서 기술되거나, 교시되거나 또는 암시된 것들이다.

상기 특정의 구체예들의 앞서의 설명은 본 발명의 일반적인 특성들을 충분히 나타내어 다른 사람들이 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게 알려진 지식(본 명세서에서의 참조들의 내용들을 포함하여)을 적용시켜 실험 없이, 본 발명의 일반적인 관점에서 벗어남이 없이 용이하게 변형 및/또는 여러 적용예들로의 적용이 가능하다.

따라서, 이러한 적용들 및 변형들은 본 명세서에서 제시한 교시들 및 안내들에 기초하여, 기술된 구체예들의 등가물의 의미 및 범위 내로 고려되어야 한다. 본 명세서에서의 구문 및 용어들은 설명의 목적이며, 제한의 목적이 아님은 이해되어야 하며, 본 명세서에서의 이러한 구문 및 용어들은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자의 지식과 함께 본 명세서에서 제시한 교시들 및 안내의 관점에서 숙련된 자들에 의해 해석되어질 수 있는 것이다.

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Claims (40)

1. (a) Cop 1 또는 Cop 1-관련 펩티드 또는 폴리펩티드에 의해 활성화된 T-세포들; 또는

   (b) Cop 1 또는 Cop 1-관련 펩티드 또는 폴리펩티드;

   의 유효량을 개인에게 투여하는 것을 포함함을 특징으로 하는 글루타메이트(glutamate) 독성물질로부터 중추신경계 (CNS) 세포를 보호하기 위한 방법
2. 제 1항에 있어서,

   글루타메이트 독성으로부터 CNS 세포를 보호하기 위해, CNS 로부터 종양을 제거하거나, 동 부분에 수술을 시술한 후 개인에게 처리함을 특징으로 하는 방법
3. (a) Cop 1 또는 Cop 1-관련 펩티드 또는 폴리펩티드에 의해 활성화된 T-세포들; 또는

   (b) Cop 1 또는 Cop 1-관련 펩티드 또는 폴리펩티드;

   의 유효량을 글루타메이트 독성에 의해 야기되는 질병이나 손상, 혹은 이것에 의해 질병이 악화된 개인에게 투여하는 것을 포함함을 특징으로 하는 글루타메이트 독성에 의해 야기되는 질병이나 손상, 혹은 이것에 의해 질병의 악화를 처치하기 위한 방법
4. 제 3 항에 있어서, 상기 손상 또는 질병이 척수 손상, 무딘 외상, 관통 외상, 출혈 충격 또는 빈혈성 충격을 포함함을 특징으로 하는 방법.
5. 제 3 항에 있어서, 상기 손상 또는 질병이 당뇨성 신경장애, 노인성 치매, 알쯔하이머병, 파킨스병, 안면신경마비, 녹내장, 헌팅턴 무도병, 근위축성 축삭 경화증, 간질발작 상태, 무동맥성 시신경장애 또는 비타민 결핍임을 특징으로 하는 상기 방법.
6. 제 3 항에 있어서, 상기 손상 또는 질병이 간질, 기억상실, 불안, 정신병, 발작, 산화 스트레스(oxidative stress), 혹은 마취제 내성 및 의존성을 특징으로 하는 상기 방법.
7. 제 3 항에 있어서, 상기 손상 또는 질병이 비정상적으로 상승되는 안압을 특징으로 하는 상기 방법.
8. 제 3 항에 있어서, 상기 손상 또는 질병이 자가면역 질병이 아닌 다른 것임을 특징으로 하는 상기 방법.
9. 제 1항 또는 제 3항에 있어서, 상기 투여 단계가 상기 개인에게 Cop 1 또는Cop 1-관련 펩티드 또는 폴리펩티드에 의해 활성화된 T-세표들의 유효량을 투여하는 것을 포함함을 특징으로 하는 상기 방법.
10. 제 9항에 있어서, 상기 신경계-특이성의 활성화된 T-세포들이 자기 유래의 T-세포들 또는 관련된 공여체들 또는 HLA-일치되거나 부분적으로 일치된, 부분-동동간 또는 완전-동종간 공여체들로부터의 동종간 T-세포들임을 특징으로 하는 상기 방법.
11. 제 10 항에 있어서, 상기 T-세포들이 자기유래의 중추신경계 세포들로부터 저장되었거나 또는 유도되었던 자기 유래의 T-세포들임을 특징으로 하는 상기 방법.
12. 제 10 항에 있어서, 상기 T-세포들이 부분-동종간 T-세포들임을 특징으로 하는 상기 방법.
13. 제 1 항 또는 제 3항에 있어서, 상기 투여 단계가 Cop1 또는 Cop 1-관련 펩티드 또는 폴리펩티드의 유효량을 임의의 개인에게 투여하는 것을 특징으로 하는 상기 방법.
14. 제 13 항에 있어서, 상기 Cop 1 또는 Cop 1-관련 펩티드 또는 폴리펩티드가Cop 1임을 특징으로 하는 상기 방법.
15. 제 13 항에 있어서, 상기 Cop 1 또는 Cop 1-관련 펩티드 또는 폴리펩티드가 Cop 1임을 특징으로 하는 상기 방법.
16. 제 13항에 있어서, 상기 Cop 1 또는 Cop 1-관련 펩티드 또는 폴리펩티드가 상기 개인의 활성 면역화를 촉진시켜, 임계 T-세포 응답을 구축하도록 하는 방식으로 투여됨을 특징으로 하는 상기 방법.
17. 제 1항 또는 제 3항에 있어서, 상기 Cop-1 관련 펩티드 또는 폴리펩티드가 수초 염기성 단백질(MBP)과 기능적으로 교차 -반응하고, 항원 존재 중에서 MHC 클래스 2에 대해 MBP와 경쟁할 수 있는 랜덤 코폴리머를 포함함을 특징으로 하는 상기 방법.
18. 제 17항에 있어서, 상기 랜덤 코폴리머가 하기 그룹들 즉,

    (a) 리신 및 아르기닌;

    (b) 글루탐산 및 아스파르트산;

    (c) 알라닌 및 글리신; 및

    (d) 티로신 및 트립토판;

    중의 적어도 3개의 그룹의 각각으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산을포함하는 랜덤 코폴리머로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 상기 방법.
19. 제 18항에 있어서, 상기 랜덤 코폴리머가 각각이 서로 다른 상기 그룹 (a) 내지 (d)들 중의 하나인 서로 다른 4개의 아마노산들을 포함함을 특징으로 하는 상기 방법.
20. 제 19항에 있어서, 상기 4개의 서로 다른 아미노산들이 알라닌, 글루탐산, 리신 및 티로신임을 특징으로 하는 상기 방법.
21. 제 20항에 있어서, 상기 랜덤 코폴리머가 각각이 서로 다른 상기 그룹(a) 내지 (d)들 중의 3개의 그룹 중의 하나인 서로 다른 3개의 아미노산들을 포함함을 특징으로 하는 상기 방법.
22. 제 21항에 있어서, 상기 랜덤 코폴리머가 티로신, 알라닌 및 리신을 포함함을 특징으로 하는 상기 방법.
23. 제 21항에 있어서, 상기 랜덤 코폴리머가 티로신, 글루탐산 및 리신을 포함함을 특징으로 하는 상기 방법.
24. 제 21항에 있어서, 상기 랜덤 코폴리머가 리신, 글루탐산 및 알라닌을 포함함을 특징으로 하는 상기 방법.
25. 제 21항에 있어서, 상기 랜덤 코폴리머가 티로신, 글루탐산 및 알라닌을 포함함을 특징으로 하는 상기 방법.
26. Cop 1 또는 Cop 1- 관련된 펩티드 또는 폴리 펩티드의 유효량 및 약학적으로 수용 가능한 담체들을 포함함을 특징으로 하는 중추신경계 세포를 글루타메이트 독성물질로 부터 보호 하거나, 혹은 글루타메이트 독성물질에 의해 초래되거나 악화되는 손상 또는 질병을 치료하기 위한 약학 조성물.
27. 제 26항에 있어서, Cop 1의 유효량을 포함함을 특징으로 하는 상기 약학 조성물.
28. 제 26항에 있어서, Cop 1-관련된 펩티드 또는 폴리 펩티드의 유효량을 포함함을 특징으로 하는 상기 약학 조성물.
29. 제 28항에 있어서, 상기 Cop 1- 관련 펩티드 또는 폴리 펩티드가 수초 염기성 단백질(MBP)과 기능적으로 교차-반응하고, 항원 존재 중에서 MHC 클래스 2에 대해 MBP와 경쟁할 수 있는 랜덤 코폴리머를 포함함을 특징으로 하는 상기 약학 조성물.
30. 제 29항에 있어서, 상기 램덤 코폴리머가 하기 그룹들 즉,

    (a) 리신 및 아르기닌;

    (b) 글루탐산 및 아스파르트산;

    (c) 알라닌 및 글리신; 및

    (d)티로신 및 트립토판;

    중의 적어도 3개의 그룹의 각각으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산을 포함함을 특징으로 하는 상기 약학 조성물.
31. 제 30항에 있어서, 상기 랜덤 코폴리머가 각각이 서로 다른 상기 그룹 (a) 내지 (d)들 중의 하나인 서로 다른 4개의 아미노산들을 포함함을 특징으로 하는 상기 약학 조성물.
32. 제 31항에 있어서, 상기 4개의 서로 다른 아미노산들이 알라닌, 글루탐산, 리신 및 티로신임을 특징으로 하는 상기 약학 조성물.
33. 제 30항에 있어서, 상기 랜덤 코폴리머가 각각이 서로 다른 상기 그룹(a) 내지 (d)들 중의 3개의 그룹 중의 하나인 서로 다른 3개의 아마노산들을 포함함을 특징으로 하는 상기 약학 조성물
34. 제 31항 또는 제 33항에 있어서, 상기 랜덤 코폴리머가 티로신, 알라닌 및 리신을 포함함을 특징으로 하는 상기 약학 조성물.
35. 제 31항 또는 제 33항에 있어서, 상기 랜덤 코폴리머가 티로신, 글루탐산 및 리신을 포함함을 특징으로하는 상기 약학 조성물.
36. 제 31항 또는 제 33항에 있어서, 상기 랜덤 코폴리머가 리신, 글루탐산 및 알라닌을 포함함을 특징으로 하는 상기 약학 조성물.
37. 제 31항 또는 제 33항에 있어서, 상기 랜덤 코폴리머가 티로신, 글루탐산 및 알라닌을 포함함을 특징으로 하는 상기 약학 조성물.
38. 글루타메이트 독성물질로부터 중추신경계를 보호하기 위한 약물의 제제 중의 Cop 1 또는 Cop 1- 관련 펩티드 혹은 폴리펩티드의 사용 방법.
39. 글루타메이트 독성물질로 부터 중추신경계를 보호하기위한 Cop 1, Cop 1 -관련 펩티드 또는 폴리펩티드의 사용방법.
40. 글루타메이트 독성물질에 의해 초래되거나, 촉진되는 손상 및 질병을 치료하기 위한 Cop 1, Cop 1 -관련 펩티드 또는 폴리펩티드의 사용방법.