ES2218559T3 - Analogos peptidicos de la proteina basica de mielina humana. - Google Patents
Analogos peptidicos de la proteina basica de mielina humana.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION ESTA DIRIGIDA HACIA ANALOGOS DE PEPTIDO DE PROTEINA BASICA DE MIELINA HUMANA. EL ANALOGO DE PEPTIDO TIENE AL MENOS SIETE AMINOACIDOS Y ESTA DERIVADA DE LOS RESIDUOS 83 A 99 DE PROTEINA BASICA DE MIELINA HUMANA. LOS ANALOGOS SON ALTERADOS DESDE LA SECUENCIA NATIVA AL MENOS EN LAS POSICIONES 91, 95 O 97. EN OTRAS POSICIONES PUEDEN REALIZARSE ALTERACIONES ADICIONALES. SE PROPORCIONAN COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE CONTIENEN ESTOS ANALOGOS DE PEPTIDO. LOS ANALOGOS DE PEPTIDO SON UTILES PARA EL TRATAMIENTO DE ESCLEROSIS MULTIPLE.
Description
Análogos peptídicos de la proteína básica de
mielina humana.
La presente invención se refiere, de manera
general, a métodos para tratar la esclerosis múltiple utilizando
análogos peptídicos de la proteína básica de mielina humana.
La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad
inflamatoria crónica que afecta aproximadamente a 250.000
individuos en los Estados Unidos. Aunque el curso clínico puede ser
bastante variable, la forma más común se manifiesta por déficits
neurológicos recurrentes, en particular, parálisis, déficits
sensoriales, y problemas visuales.
El proceso inflamatorio se produce principalmente
en la materia blanca del sistema nervioso central y está mediado por
los linfocitos T, linfocitos B, y macrófagos. Estas células son
responsables de la desmielinización de los axones. La lesión
característica de la EM se denomina la placa debido a su apariencia
microscópica.
Se cree que la esclerosis múltiple surge de
células T patógenas que, de alguna forma, evitan los mecanismos que
establecen la tolerancia propia, y atacan a los tejidos normales.
La reactividad de las células T hacia la proteína básica de mielina
puede ser un componente crítico en el desarrollo de EM. Las células
T patógenas encontradas en las lesiones presentan una heterogeneidad
restringida de receptores de antígenos (TCR). Las células T
aisladas de las placas presentan una reordenación de un número
restringido de segmentos génicos V\alpha y V\beta. Además, los
TCRs presentan varias fracciones dominantes de aminoácidos en la
tercera región complementaria dominante (CDR), que es el sitio
principal de contacto con el antígeno. Teniendo todo esto en cuenta,
se han identificado tres fracciones CDR3 en clones de células T que
se sabe reconocen un epítopo en los aminoácidos
82-106 de la proteína básica de mielina. Estas
fracciones se encontraron en el 44% de las secuencias TCR
reordenadas que implican un gen V\beta particular reordenado en
las células T aisladas de los cerebros de dos pacientes con EM.
No se ha establecido un tratamiento definitivo
para EM. Históricamente, se han utilizado corticoesteroides y ACTH
para tratar EM. Básicamente, estos medicamentos reducen la
respuesta inflamatoria mediante toxicidad para los linfocitos. La
recuperación puede resultar acelerada respecto a exacerbaciones
agudas, pero estos medicamentos no previenen ataques futuros ni
previenen el desarrollo de discapacidades adicionales o la
progresión crónica de EM (Carter y Rodríguez, Mayo Clinic
Proc. 64:664, 1989; Weiner y Hafler, Ann. Neurol.
23:211, 1988). Además, los importantes efectos secundarios de los
tratamientos con esteroides hacen a estas drogas poco deseables
para una utilización a largo plazo.
Se han utilizado otros compuestos tóxicos como
azatioprina, un antagonista de purina, ciclofosfamida y
ciclosporina, para tratar los síntomas de EM. De manera similar al
tratamiento con corticosteroides, estos medicamentos son
beneficiosos como mucho a corto plazo y son altamente tóxicos. Los
efectos secundarios incluyen incrementos de malignidades,
leucopenias, hepatitis tóxica, problemas gastrointestinales,
hipertensión, y toxicidad renal (Mitchell, Cont. Clin.
Neurol. 77:231, 1993; Weiner y Hafler, supra). Las
terapias basadas en anticuerpos dirigidos frente a las células T,
como anticuerpos anti-CD4, están actualmente en
estudio para el tratamiento de EM. Sin embargo, estos agentes pueden
causar efectos secundarios perjudiciales al comprometer
inmunológicamente al paciente.
Más recientemente, se han administrado
citoquinas, como IFN-\gamma e
IFN-\beta con intención de aliviar los síntomas de
EM. Sin embargo, un estudio piloto que implicaba
IFN-\gamma se dio por terminado porque 7 de 18
pacientes tratados con este medicamento, experimentaron una
exacerbación clínica durante el mes que siguió el inicio del
tratamiento. Aún más, se produjo un incremento en la respuesta
específica a MBP (Weiner y Hafler, supra).
El betaserón, un interferón beta modificado, ha
sido aprobado recientemente para ser utilizado en pacientes con EM.
Aunque el tratamiento con betaserón mostró alguna mejoría en las
proporciones de exacerbación (Paty et al., Neurology
43:662, 1993), no existió diferencia en la proporción de deterioro
clínico entre los grupos tratados y control (IFNB MS Study Group,
Neurology 43:655, 1993; Paty et al., supra). Se
observaron frecuentemente efectos secundarios. De estos efectos
secundarios el más frecuente fue fiebre (40%-58% de los pacientes),
síntomas semejantes a los de la gripe (76% de los pacientes),
escalofríos (46% de los pacientes), mialgias (41% de los
pacientes), y sudoración (23% de los pacientes). Además, fueron
frecuentes reacciones en el sitio de inyección (85%), incluyendo
inflamación, dolor, hipersensibilidad y necrosis (IFNB MS Study
Group, supra; Connelly, Annals of Pharm. 28:610,
1994).
A la vista de los problemas asociados con los
tratamientos de EM existentes, existe una necesidad apremiante de
tratamientos mejorados que sean más eficaces y que no presenten
estas desventajas. La presente invención explota la utilización de
análogos peptídicos que antagonizan una respuesta de células T a la
proteína básica de mielina humana para tratar de manera eficaz la
EM, a la vez que proporciona otras ventajas relacionadas.
De acuerdo con la presente invención, se
proporciona un análogo peptídico que comprende al menos siete
aminoácidos consecutivos seleccionados de los restos 86 a 99 de la
proteína básica de mielina humana de la Figura 1, incluyendo el
resto 91, en el que la L-lisina en la posición 91 se
sustituye por otro aminoácido, o el resto 97, en el que la
L-arginina en la posición 97 se sustituye por otro
aminoácido, o el resto 95, en el que la L-treonina
en la posición 95 se sustituye por otro aminoácido, y donde el
mencionado análogo peptídico contiene de 2 a 5 sustituciones con un
aminoácido distinto del aminoácido presente en la proteína nativa en
esa posición y donde el análogo peptídico a) compite por la unión
del péptido nativo MBP a MHC; b) no produce proliferación de una
línea de células T reactiva para MBP (87-99); y c)
inhibe la inducción por MBP (87-99) de
encefalomielitis alérgica experimental (EAE) en roedores.
En una realización, el análogo peptídico
comprende al menos 7 aminoácidos seleccionados de los restos
86-99, L-lisina en la posición 91 se
sustituye y de uno a tres L-aminoácidos adicionales
seleccionados de los restos 86, 87, 88, 95, 98 ó 99 se sustituyen
por otro aminoácido. En una segunda realización relacionada, la
L-treonina en la posición 95 se sustituye y de uno a
tres aminoácidos adicionales seleccionados de los restos 86, 87,
88, 91, 98 y 99 ó 86, 87, 88, 97, 98 y 99 se sustituyen por otro
aminoácido. En una tercera realización relacionada, la
L-arginina en la posición 97 se sustituye y de uno a
tres aminoácidos adicionales seleccionados de los restos 86, 87, 88,
95, 98 ó 99 se sustituyen por otro aminoácido.
En otro conjunto de realizaciones, el análogo
peptídico comprende los restos 83-99 de la proteína
básica de mielina humana, en las que los análogos peptídicos
contienen, preferiblemente, de dos a cinco sustituciones. En los
aspectos preferidos de la invención, los análogos peptídicos
presentan los restos 89, 91, 95 ó 97 reemplazados por alanina y los
aminoácidos adicionales están reemplazados por la forma D del
aminoácido correspondiente.
En otras realizaciones, los análogos peptídicos
comprenden al menos siete aminoácidos seleccionados de los restos 86
a 99 de la proteína básica de mielina humana en los que bien la
L-lisina en la posición 91, la
L-treonina en la posición 95, o la
L-arginina en la posición 97 están reemplazadas por
otro aminoácido, y, además, los aminoácidos
N-terminales y C-terminales están
reemplazados con el fin de reducir la proteolisis después de la
administración del análogo peptídico. En un aspecto preferido, los
aminoácidos N- y/o C-terminales son de la forma
D.
En otras realizaciones, los análogos peptídicos
comprenden al menos siete aminoácidos seleccionados de los restos 86
a 99 de la proteína básica de mielina humana en los que bien la
L-lisina en la posición 91, la
L-treonina en la posición 95, o la
L-arginina en la posición 97 están reemplazadas por
otro aminoácido, y, además, se realizan hasta otras tres
sustituciones de aminoácidos. Cualquier resto en el intervalo
86-99 puede reemplazarse excepto cuando el resto 91
esté reemplazado en el análogo peptídico, en cuyo caso el resto 97
puede no estar reemplazado. De la misma manera, en un análogo
peptídico en el que el resto 97 esté reemplazado, el resto 91 puede
no estar reemplazado.
Otras realizaciones proporcionan análogos
peptídicos que comprenden al menos siete aminoácidos seleccionados
de los restos 86 a 99 de la proteína básica de mielina humana en
los que bien la L-lisina en la posición 91, la
L-treonina en la posición 95, o la
L-arginina en la posición 97 están reemplazadas por
otro aminoácido. En los aspectos preferidos, el resto 91, 95 ó 97
están reemplazados bien por alanina o por el
D-aminoácido correspondiente.
Aspectos adicionales de la presente invención
proporcionan una composición farmacéutica que comprende un análogo
peptídico de acuerdo con las realizaciones expuestas más arriba, en
la que el análogo peptídico está contenido en un vehículo o
diluyente aceptable desde un punto de vista fisiológico.
Estos y otros aspectos de la invención resultarán
evidentes con la descripción detallada siguiente y con los dibujos
adjuntos. Además, más adelante, se enumeran varias referencias que
describen con más detalle determinados procedimientos o
composiciones.
La Figura 1, representa el ADN y la secuencia de
aminoácidos esperada de la proteína básica de mielina humana.
La Figura 2, representa la respuesta de células
de nódulo linfático de drenaje de ratas Lewis inmunizadas
9-10 días previamente con MBP
(87-99) a MBP 10\muM (87-99),
medio, el péptido no relacionado motilina, y seis análogos
diferentes de MBP. A, L-alanina; k,
D-lisina; t, D-treonina; r,
D-arginina.
La Figura 3 es un gráfico que muestra la
respuesta proliferativa de la línea de células T NBI a los análogos
de la proteína básica de mielina humana (87-99) con
el resto 91 reemplazado. Se ensayaron diez sustituciones diferentes.
Se determinó la respuesta proliferativa de la línea de células T de
rata en respuesta a concentraciones de análogos peptídicos en el
intervalo de 0 a 150 \muM. Se muestra la magnitud de la
proliferación como cuentas por minuto; los errores estándar de la
media fueron menores de \pm 10%. MOT, motilina, un péptido no
relacionado con MBP; MBP (87-99), restos
87-99 de la proteína básica de mielina humana; K,
lisina; R, arginina; N, asparagina; H, histidina; L, leucina; S,
serina; G, glicina; k, D-lisina; E, ácido glutámico;
F, fenilalanina; A, alanina.
La Figura 4 es un gráfico que muestra la
respuesta proliferativa de la línea de células T NBI a los análogos
de la proteína básica de mielina humana (87-99) con
el resto 95 reemplazado. Se ensayaron diez sustituciones diferentes.
Se determinó la respuesta proliferativa de las células T a
concentraciones de análogos peptídicos en el intervalo de 0 a 150
\muM. Se muestra la magnitud de la proliferación como cuentas por
minuto; los errores estándar de la media fueron menores de \pm
10%. MOT, motilina, un péptido no relacionado con MBP; MBP
(87-99), restos 87-99 de la proteína
básica de mielina humana; T, treonina; A, alanina; t,
D-treonina; G, glicina; I, isoleucina; Y, tirosina;
Q, glutamina; S, serina; K, lisina; E, ácido glutámico; H,
histidina.
La Figura 5 es un gráfico que muestra la
respuesta proliferativa de la línea de células T NBI a los análogos
de la proteína básica de mielina humana (87-99) con
el resto 97 reemplazado. Se ensayaron once sustituciones diferentes.
Se determinó la respuesta proliferativa de la línea de células T de
rata en respuesta a concentraciones de los análogos peptídicos en
el intervalo de 0 a 150 \muM. la magnitud de la proliferación se
muestra en cuentas por minuto. MBP 87-99, proteína
básica de mielina (87-99); R, arginina; a,
D-alanina; r, D-arginina; G,
glicina; K, lisina; Q, glutamina; E, ácido glutámico; T, treonina;
L, leucina; F, fenialanina; H, histidina; A, alanina.
La Figura 6 es un gráfico que ilustra la
capacidad de análogos peptídicos de MBP para inhibir la
proliferación de células T de rata que son reactivas a MBP. Se
muestra la respuesta proliferativa de células de nódulo linfático de
drenaje de ratas inmunizadas con MBP (87-99) a
16,7, 50 ó 150 \muM de cada análogo, o a MBP 5 \muM
(87-99). Se añadieron los análogos en presencia de
MBP 5 \muM (87-99). La magnitud de la
proliferación se muestra como cuentas por minuto. Los controles
consistieron en MBP (87-99) sólo a 5 \muM y medio
solo. h88/A91 se refiere a un análogo peptídico de MBP
(87-99) representativo con un resto de
D-histidina en la posición 88 y de alanina en la
posición 91; h88/A91/p99 se refiere a otro análogo peptídico de MBP
(87-99) representativo con
D-histidina en la posición 88, alanina en el resto
91 y D-prolina en el resto 99.
La Figura 7 es un gráfico que demuestra la
inhibición de la inducción de EAE en ratas Lewis después de
inyección con MBP (87-99). Las flechas indican los
días en los que se administró bien PBS (control) o el análogo
peptídico h88/A91. Se registró EAE como 0, sin síntomas; 1,
parálisis del rabo; 2, debilidad de las extremidades posteriores;
3, parálisis de las extremidades posteriores; parálisis de las
extremidades posteriores y anteriores.
La Figura 8 representa la secuencia de
aminoácidos en un código de letra única para los restos 83 a 99 de
la proteína básica de mielina humana y las secuencias de
aminoácidos de los análogos peptídicos NBI-5719,
NBI-5748, NBI-5765,
NBI-5788, y NBI-5789. Una raya
indica identidad de aminoácidos. MBP (83-99),
restos 83 a 99 de la proteína básica de mielina; a,
D-alanina; A, L-alanina; K,
L-lisina; L, L-leucina.
La Figura 9 es un gráfico que demuestra la
inhibición de la inducción de EAE en ratas Lewis después de
inyección con MBP (83-99). Las ratas Lewis se
inyectaron con MBP (83-99) en el día 0. En el día 9,
las ratas se inyectaron bien con un péptido control, mioglobina de
esperma de ballena (110-121), o con el análogo
peptídico, NBI-5788. Cada punto de datos representa
la media de la puntuación clínica de seis animales.
La Figura 10 es un gráfico que demuestra la
inhibición de la inducción de EAE en ratas Lewis después de
inyección con MBP (83-99). Las ratas Lewis se
inyectaron con MBP (83-99) en el día 0. En el día 9,
las ratas se inyectaron bien con un péptido control, mioglobina de
esperma de ballena (110-121), o con el análogo
peptídico, NBI-5788. Cada punto de datos representa
la media de la puntuación clínica de seis animales.
La Figura 11 es un gráfico que demuestra la
inhibición de la inducción de EAE en ratas Lewis después de
inyección con MBP (83-99). Las ratas Lewis se
inyectaron con MBP (83-99) en el día 0. En el día
9, las ratas se inyectaron bien con un péptido control, mioglobina
de esperma de ballena (110-121), o con el análogo
peptídico, NBI-5765. Cada punto de datos representa
la media de la puntuación clínica de seis animales.
La Figura 12 es un gráfico que demuestra la
inhibición de la inducción de EAE en ratones SJL/J después de
inyección con MBP (87-99). Se inyectaron grupos de
ratones por vía intraperitoneal semanalmente durante cuatro semanas
bien con un péptido control o con el análogo peptídico,
NBI-5719 o NBI-5765. Cada punto de
datos representa la media de la puntuación clínica de diez
ratones.
La Figura 13 es un gráfico que ilustra la
capacidad de un análogo peptídico de MBP para inhibir la
proliferación de un clon de células T humano restringido para Dr2a,
que es reactivo a MBP. Se representa la respuesta proliferativa del
clon de células T incubado con diferentes concentraciones de MBP
(83-99) y con 50 micromolar bien del análogo
peptídico o de mioglobina de esperma de ballena, el péptido
control.
La Figura 14 es un gráfico que ilustra la
capacidad de análogos peptídicos de MBP para inhibir la
proliferación de un clon de células T humano restringido para Dr2a,
que es reactivo a MBP. Se representa la respuesta proliferativa del
clon de células T incubado con diferentes concentraciones de MBP
(83-99) y con 50 micromolar bien del análogo
peptídico o de mioglobina de esperma de ballena, el péptido
control.
La Figura 15 es un gráfico que ilustra la
capacidad de un análogo peptídico de MBP para inhibir la
proliferación de un clon de células T humano restringido para Dr2a,
que es reactivo a MBP. Se representa la respuesta proliferativa del
clon de células T incubado con diferentes concentraciones de MBP
(83-99) y con 50 micromolar bien del análogo
peptídico o de mioglobina de esperma de ballena, el péptido
control.
La Figura 16 es un gráfico que ilustra la
capacidad de un análogo peptídico de MBP para inhibir la
proliferación de un clon de células T humano restringido para Dr2b,
que es reactivo a MBP. Se representa la respuesta proliferativa del
clon de células T incubado con diferentes concentraciones de MBP
(83-99) y con 50 micromolar bien del análogo
peptídico o de mioglobina de esperma de ballena, el péptido
control.
La Figura 17 es un gráfico que ilustra la
capacidad de un análogo peptídico de MBP para inhibir la
proliferación de un clon de células T humano restringido para Dr2b,
que es reactivo a MBP. Se representa la respuesta proliferativa del
clon de células T incubado con diferentes concentraciones de MBP
(83-99) y con 50 micromolar bien del análogo
peptídico o de mioglobina de esperma de ballena, el péptido
control.
La Figura 18 es un gráfico que ilustra la
capacidad de un análogo peptídico de MBP para inhibir la
proliferación de un clon de células T humano restringido para Dr2b,
que es reactivo a MBP. Se representa la respuesta proliferativa del
clon de células T incubado con diferentes concentraciones de MBP
(83-99) y con 50 micromolar bien del análogo
peptídico o de mioglobina de esperma de ballena, el péptido
control.
La Figura 19 es un gráfico que ilustra la
capacidad de un análogo peptídico de MBP para inhibir la
proliferación de un clon de células T humano restringido para Dr2b,
que es reactivo a MBP. Se representa la respuesta proliferativa del
clon de células T incubado con diferentes concentraciones de MBP
(83-99) y con 50 micromolar bien del análogo
peptídico o de mioglobina de esperma de ballena, el péptido
control.
La Figura 20 es un gráfico que ilustra la
capacidad de un análogo peptídico de MBP para inhibir la
proliferación de un clon de células T humano restringido para Dr2b,
que es reactivo a MBP. Se representa la respuesta proliferativa del
clon de células T incubado con diferentes concentraciones de MBP
(83-99) y con 50 micromolar bien del análogo
peptídico o de mioglobina de esperma de ballena, el péptido
control.
La Figura 21 es un gráfico que representa la
producción de TNF-\alpha e
IFN-\gamma por un clon de células T humano
restringido para Dr2b, 5F6, que es reactivo a MBP. El clon de
células T se incubó en presencia de MBP (93-99) 3
\muM bien con 10 \muM de NBI-5788 o con
mioglobina de esperma de ballena o con medio sólo. Se muestra el
nivel de expresión de TNF-\alpha e
IFN-\gamma en pg/ml.
Antes de exponer la invención, puede resultar de
ayuda para entender ésta explicar las definiciones de determinados
términos y abreviaturas que van a ser utilizadas de ahora en
adelante en la presente memoria.
"Proteína básica de mielina humana"
("MBP") se refiere a una proteína que se encuentra en el
citoplasma de células oligodendrogliales humanas. La secuencia de
nucleótidos y la secuencia se aminoácidos que se predice para la
MBP humana se presentan en la Figura 1.
Aunque no se representa en la Figura 1, las
diferentes formas moleculares de la proteína básica de mielina
humana generadas por rotura diferencial o por modificación
post-translacional también se encuentran en el
ámbito de esta invención.
Los "Análogos peptídicos" de la proteína
básica de mielina tienen una longitud de al menos 7 aminoácidos y
contienen al menos una diferencia respecto a la secuencia de
aminoácidos de la proteína básica de mielina humana nativa, siendo
una de éstas una diferencia en el resto 91, 95 ó 97. A no ser que se
indique otra cosa, los aminoácidos mencionados se refieren a la
forma L. Un L-aminoácido del péptido nativo puede
estar reemplazado por cualquiera de los otros 20
L-aminoácidos encontrados habitualmente en las
proteínas, por cualquiera de los D-aminoácidos
correspondientes, por aminoácidos raros, como
4-hidroxiprolina, e hidroxilisina, o por un
aminoácido no proteico, como \beta-alanina y
homoserina. También están incluidos en el ámbito de la presente
invención los aminoácidos que han sido alterados por medios químicos
como metilación (por ejemplo,
\alpha-metilvalina), amidación del aminoácido
C-terminal por una alquilamina como etilamina,
etanolamina, y etilendiamina, y acilación o metilación de una
función de la cadena lateral de un aminoácido (por ejemplo,
acilación del grupo amino epsilon de la lisina).
"Resto 83", "resto 89", "resto
91", "resto 95", y "resto 97" (también llamados
posición 83, posición 89, posición 91, posición 95, y posición 97,
respectivamente), se refiere a los aminoácidos 83, 89, 91, 95, y 97
de la proteína básica de mielina humana como se representa en la
Figura 1 o al aminoácido en una posición comparable. Más
específicamente, el sistema de numeración para estos restos se
refiere a la posición del aminoácido en la proteína humana nativa,
independientemente de la longitud del péptido o de la posición del
aminoácido en ese péptido.
Los aminoácidos se denominan por su código
estándar de tres letras o de una letra. A no ser que se especifique
otra cosa, se entiende la forma L del aminoácido. Cuando se utiliza
el código de una letra, las letras mayúsculas se refieren a la
forma L y las letras minúsculas a la forma D. El código de una
letra es como sigue: A, alanina; C, cisteína; D, ácido aspártico; E,
ácido glutámico; F, fenilalanina; G, glicina; H, histidina; I,
isoleucina; K, lisina; L, leucina; M, metionina; N, asparagina; P,
prolina; Q, glutamina; R, arginina; S, serina; T, treonina; V,
valina; W, triptófano; e Y, tirosina.
Como se ha mencionado más arriba, la presente
invención proporciona análogos peptídicos que comprenden al menos 7
aminoácidos seleccionados de los restos 83-99 de la
proteína básica de mielina humana y que incluyen un reemplazamiento
de la L-lisina en la posición 91,
L-treonina en la posición 95, o
L-arginina en la posición 97, por otro aminoácido.
En un aspecto, el análogo peptídico incluye sustituciones
adicionales de uno a tres L-aminoácidos en las
posiciones 86, 87, 88, 91, 95, 97, 98 y/ó 99 de la proteína básica
de mielina humana siempre que 91 y 97 no estén reemplazados al
mismo tiempo en el mismo análogo peptídico. En otro aspecto, el
análogo peptídico tiene adicionalmente los restos
N-terminales y/o C-terminales
reemplazados por un aminoácido de manera que se reduce la
proteolisis después de la administración a un paciente en
comparación con un análogo peptídico sin estas sustituciones
adicionales. En un aspecto adicional, el análogo peptídico de MBP
comprende al menos siete aminoácidos seleccionados de los restos
86-99 y tiene uno de los restos en la posición 91,
95 ó 97 reemplazado por un aminoácido que no está presente en la
proteína MBP nativa. Además de estas sustituciones únicas, pueden
realizarse de una a tres sustituciones adicionales de los restos 86
a 99, siempre que los restos 91 y 97 no estén reemplazados en el
mismo análogo peptídico. En otro aspecto adicional, el análogo
peptídico de MBP comprende los restos 83 a 99, la
L-lisina en la posición 91 está reemplazada por otro
aminoácido y de dos a cuatro aminoácidos adicionales seleccionados
de los restos 83 a 90 y 92 a 99 están reemplazados por otro
aminoácido. Preferiblemente, al menos un aminoácido se sustituye
por una aminoácido cargado. Además, los aminoácidos
N-terminales y/o C-terminales pueden
reemplazarse por un D-aminoácido.
Los análogos peptídicos tienen preferiblemente de
7 a 17 aminoácidos, y habitualmente no son más largos de 20
aminoácidos. Los análogos peptídicos particularmente preferidos
tienen una longitud de 14 a 17 aminoácidos. Los restos 83, 89, 91,
95, y 97, que son L-acido glutámico,
L-fenilalanina, L-lisina,
L-treonina, y L-arginina,
respectivamente, en la proteína humana nativa, son restos clave.
Dentro del objetivo de la invención, los análogos deben tener un
aminoácido distinto de L-lisina en la posición 91,
un aminoácido distinto de L-treonina en la
posición 95, o un aminoácido distinto de L-arginina
en la posición 97.
Como se ha mencionado arriba, cualquier
reemplazamiento de aminoácido en la posición 91 se encuentra en el
ámbito de esta invención. Los análogos peptídicos preferidos
incluyen el reemplazamiento de la L-lisina por
cualquiera de los aminoácidos siguientes: D-lisina,
alanina, glicina, ácido glutámico, fenilalanina, arginina,
asparagina, histidina, leucina o serina. Estos aminoácidos incluyen
tanto aminoácidos conservativos (carga, polaridad, hidrofobicidad y
tamaño similares) como aminoácidos no conservativos. Aunque seria de
esperar que solamente las sustituciones con aminoácidos no
conservativos proporcionaran un efecto terapéutico, de manera
inesperada incluso los cambios conservativos (por ejemplo,
arginina) afectan de manera importante la función del análogo
peptídico en comparación con el péptido nativo. Esta diversidad en
el reemplazamiento se ilustra adicionalmente por el hecho de que
los aminoácidos preferidos mencionados arriba son hidrofóbicos e
hidrofílicos, cargados y no cargados, polares y no polares.
Además, cualquier reemplazamiento del aminoácido
en el resto 95 también se encuentra en el ámbito de esta invención.
Los análogos peptídicos preferidos contienen sustituciones de
L-treonina por cualquiera de los aminoácidos
siguientes: D-treonina, alanina, glicina,
isoleucina, tirosina, glutamina, serina, lisina, ácido glutámico e
histidina. Otras sustituciones preferidas son por aminoácidos no
conservativos. Las sustituciones particularmente preferidas son por
alanina o por D-treonina.
De manera similar, cualquier reemplazamiento de
aminoácido en la posición 97 se encuentra en el ámbito de esta
invención. Los análogos peptídicos preferidos incluyen
sustituciones de L-arginina por
D-alanina, D-arginina, glicina,
lisina, glutamina, ácido glutámico, treonina, leucina, fenilalanina,
histidina o alanina. Otras sustituciones preferidas son por
aminoácidos no conservativos. Las sustituciones particularmente
preferidas son por alanina y por D-arginina.
Además, cualquier aminoácido en la posición 83 y
en la posición 89 se encuentra en el ámbito de esta invención. Los
análogos peptídicos preferidos contienen sustituciones del L-ácido
glutámico en el resto 83 por cualquiera de los aminoácidos
siguientes: D-alanina, L-alanina,
D-ácido glutámico y L-fenilalanina en la posición
89 por alanina, leucina, valina, isoleucina.
Además, en determinadas realizaciones al menos
otro aminoácido seleccionado de los restos 86, 87, 88, 89, 95, 98 ó
99 está reemplazado. En estas realizaciones, si se cambian otros
dos aminoácidos, uno se selecciona preferiblemente de los restos
86, 87, 88 ó 89, y el otro se selecciona de los restos 98 ó 99. De
manera alternativa, pueden realizarse hasta tres sustituciones en
cualquiera de las posiciones. En otras realizaciones, se
sustituyen al menos de dos a cuatro aminoácidos (además de la
posición 91). En estas realizaciones, los aminoácidos reemplazados
se seleccionan preferiblemente de las posiciones 83, 84, 89 y
98.
Con estas consideraciones generales en mente, los
análogos peptídicos que se encuentran en el ámbito de la invención
presentan un reemplazamiento en el resto 91, resto 95, o resto 97.
Un conjunto de análogos peptídicos preferido presenta sustituciones
dobles. En una realización, el resto 91 está reemplazado como se
describe arriba, el resto 87 está reemplazado por
D-valina, el resto 88 por
D-histidina o el resto 99 por
D-prolina. De manera similar, en otra realización,
el resto 97 está reemplazado como se describe arriba, y bien el
resto 87 está reemplazado por D-valina, el resto 88
por D-histidina o el resto 99 por
D-prolina. En otra realización más, el resto 95 está
reemplazado como se describe arriba y el resto 87 está reemplazado
por D-valina, el resto 88 por
D-histidina o el resto 99 por
D-prolina.
Un segundo conjunto de análogos peptídicos
preferido presenta tres sustituciones. En una realización, el resto
91 está reemplazado por alanina, el resto 87 está reemplazado por
D-valina o el resto 88 está reemplazado por
D-histidina y el resto 99 está reemplazado por
D-prolina. En otra realización, el resto 97 está
reemplazado por alanina, el resto 88 está reemplazado por
D-histidina y el resto 99 por
D-prolina. En otra realización más, el resto 95
está reemplazado por alanina, el resto 88 está reemplazado por
D-histidina y el resto 99 por
D-prolina. En otra realización más, el resto 83 está
reemplazado por D-alanina, el resto 89 está
reemplazado por alanina, y el resto 91 está reemplazado por
alanina.
Un tercer conjunto de análogos peptídicos
preferido tiene cuatro sustituciones. En una realización, el resto
83 está reemplazado por D-alanina, el resto 84 está
reemplazado por lisina, el resto 89 está reemplazado por leucina y
el resto 91 está reemplazado por alanina. En otra realización, el
resto 83 está reemplazado por D-alanina, el resto 84
está reemplazado por lisina, y los restos 89 y 91 están
reemplazados por alanina.
Un cuarto conjunto de análogos peptídicos
preferido tiene cinco sustituciones. En una realización, los restos
83 y 98 están reemplazados por D-alanina, el resto
84 está reemplazado por lisina, y los restos 89 y 91 están
reemplazados por alanina. En otra realización, los restos 83 y 89
están reemplazados por D-alanina, el resto 84 está
reemplazado por lisina, el resto 89 está reemplazado por leucina y
el resto 91 está reemplazado por alanina.
Los análogos peptídicos pueden sintetizarse por
técnicas químicas estándar, incluyendo síntesis por un
procedimiento automatizado. En general, los análogos peptídicos se
preparan por metodología de síntesis de péptidos en fase sólida que
implica el acoplamiento de cada resto de aminoácido protegido a un
soporte de resina, preferiblemente resina
4-metil-bencidrilamina, por
activación con diciclohexilcarbodiimida para dar lugar a un péptido
con una amida en el C-terminal. De manera
alternativa, se puede utilizar una resina de clorometilo (resina
Merrifield) para dar lugar a un péptido con el ácido carboxílico
libre en el extremo C-terminal. Los grupos
funcionales de las cadenas laterales se protegen como sigue:
bencilo para serina, treonina, ácido glutámico y ácido aspártico;
tosilo para histidina y arginina;
2-clorobenciloxicarbonilo para lisina y
2,6-diclorobencilo para tirosina. Después del
acoplamiento, el grupo protector
t-butiloxicarbonilo en la función alfa amino de los
aminoácidos añadidos se elimina por tratamiento con ácido
trifluoroacético seguido de neutralización con
di-isopropiletilamina. Se acopla entonces el
siguiente resto protegido en el grupo amino libre, alargando la
cadena peptídica. Después de que el último resto se haya unido, el
péptido protegido-resina se trata con fluoruro de
hidrógeno para separar el péptido de la resina, así como para
desproteger los grupos funcionales de la cadena lateral. El
producto crudo puede purificarse adicionalmente por filtración en
gel, HPLC, cromatografía de partición o cromatrografía de
intercambio iónico.
Los análogos peptídicos de la presente invención
deben (a) competir por la unión a MHC con el péptido MBP nativo
(por ejemplo, 87-99 en ratas; 83-99
en humanos); (b) no causar proliferación de una línea de células T
reactiva a MBP (87-99); y c) inhibir la inducción
de encefalomielitis alérgica experimental (EAE) por MBP
(87-99) en roedores.
De esta manera, los análogos peptídicos pueden
rastrearse para determinar su capacidad para tratar MS mediante (1)
un ensayo que determine unión competitiva a MHC, (2) un ensayo que
determine una proliferación de células T, y (3) un ensayo que
evalúe la inhibición de la inducción de EAE. Aquellos análogos que
inhiban la unión de los péptidos nativos, que no estimulen la
proliferación de líneas celulares reactivas a MBP, y que inhiban el
desarrollo de EAE causado por MBP humana nativa
(87-99), resultan útiles como agentes terapéuticos.
Aunque no es esencial, se puede llevar a cabo un ensayo adicional
de seguridad con el fin de demostrar que el análogo no induce EAE
por sí mismo.
La unión de péptidos a moléculas MHC puede
ensayarse en células enteras. Brevemente, se cultivan células de
bazo de ratas Lewis durante 3 horas para permitir que las células
adherentes se peguen a las placas petri de poliestireno. Se
eliminan las células no adherentes. Las células adherentes, que
contienen células que expresan moléculas MHC clase II, se recogen
raspando las placas. La unión de los análogos peptídicos a las
células se determina por un ensayo de fluorescencia. En este
ensayo, las células adherentes de bazo se mezclan con diferentes
concentraciones de análogos peptídicos y se incuban durante 1 hora
a 37ºC en un incubador de CO_{2}. Después de la incubación, se
añade MBP (87-99) marcado con biotina a los pocillos
de cultivo. Las células se incuban durante otra hora y se lavan
tres veces con medio. Se añade estreptavidina conjugada con
ficoeritrina o con fluoresceína junto con un anticuerpo monoclonal
OX-6 ó OX-17 marcado con
flourocromo, que reaccionan con MHC de rata Clase II
I-A y I-E, respectivamente. Las
células se lavan dos veces antes del análisis por citometría de
flujo. Se calcula la intensidad de la fluorescencia restando el
valor de fluorescencia obtenido de las células teñidas con
ficoeritrina-estreptavidina sólo (tinción control)
del valor de fluorescencia obtenido del péptido nativo MBP marcado
con biotina más ficoeritrina-estreptavidina
(tinción experimental). La tinción en ausencia del análogo
establece el valor 100%. El porcentaje de inhibición se calcula para
cada análogo y se expresa como valores CI_{50}. Un análogo
peptídico con un valor de CI_{50} menor de 100 \muM es adecuado
para rastreos adicionales.
Los análogos peptídicos candidatos se ensayan
además para determinar su capacidad de causar o inhibir la
proliferación de líneas de células T. Se puede utilizar dos ensayos
diferentes como alternativas. El primero determina la capacidad del
análogo de producir proliferación de células T de una manera
directa. El segundo determina la capacidad del análogo peptídico
para inhibir la proliferación de células T inducida por el péptido
MBP nativo.
En el ensayo de proliferación directo, se puede
utilizar líneas de células T reactivas a MBP
(87-99) como células diana. Las líneas de células T
se establecen a partir de nódulos linfáticos obtenidos de ratas
inyectadas con MBP (87-99). Las células del nódulo
linfático se aislan y se cultivan durante 5 a 8 días con MBP
(87-99) y se utiliza IL-2 como
fuente de factores de crecimiento de las células T. Las células
viables se recogen y se lleva a cabo una segunda ronda de
estimulación con MBP (87-99 ó 83-99)
y se utilizan esplenocitos irradiados como fuente de factores de
crecimiento. Después de 5 ó 6 cambios de esta manera, se determina
el potencial proliferativo de las líneas celulares. En el ensayo de
proliferación se utilizan líneas reactivas a MBP. En este ensayo,
las líneas de células T se cultivan durante tres días con diferentes
concentraciones de los análogos peptídicos y con esplenocitos
autólogos irradiados. Después de tres días, se añaden
0,5-1,0 \muCi de
[^{3}H]-timidina durante 12-16
horas. Los cultivos se recogen y se determinan las cuentas
incorporadas. Se calculan las CPM medias y el error estándar de la
media de cultivos en triplicado.
Como alternativa a la utilización de líneas de
células T descrita más arriba, se pueden utilizar células de nódulo
linfático de drenaje de ratas Lewis inyectadas con MBP
(87-99). Preferiblemente, este ensayo se utiliza en
combinación con el ensayo de proliferación en el que se utilizan
líneas de células T. Brevemente, se inyectan ratas Lewis por vía
subcutánea con el péptido MBP (87-99) en adyuvante
Freund completo. De nueve a diez días después, se aislan células de
nódulo linfático de drenaje y se preparan suspensiones de células
únicas. Las células de nódulo linfático se incuban con diferentes
concentraciones de análogos peptídicos durante tres días en una
cámara con aire húmedo que contiene 6,5% de CO_{2}. Después de la
incubación, se realiza un pulso a los cultivos con
1-2 \muCi de [^{3}H]-timidina
durante 12-18 horas. Los cultivos se recogen en
filtros de fibra de vidrio y se cuentan en un contador de
centelleo. De los datos determinados en cultivos en triplicado se
calculan las CPM medias y el error estándar de la media. Los
análogos peptídicos que producen resultados que son más de tres
desviaciones estándar por debajo de la respuesta media obtenida con
una concentración de MBP (87-99) comparable se
consideran no estimulatorios. Los análogos peptídicos que no
estimulan la proliferación a concentraciones menores de o iguales a
50 \muM son adecuados para rastreos adicionales.
Las células T humanas reactivas a MBP
(83-99) pueden utilizarse alternativamente para
determinar la capacidad del análogo peptídico de inhibir la
proliferación de células T inducida por el péptido MBP
(83-99) nativo. Las células T específicas para MBP
pueden obtenerse como se ha descrito previamente por Martin et
al., J. Immunol., 148:1359-1366,
1992. Brevemente, las líneas de células T se establecen por cultivo
de células T humanas con células de sangre periférica
DR-compatibles irradiadas en MEM suplementado con
L-glutamina 2 mM, 50 \mug/ml de gentamicina,
penicilina y estreptomicina, 100 U/ml de IL-2r, y
10% de suero humano AB negativo. La proliferación de estas líneas
de células T se estimula mediante cultivo de un clon con diferentes
concentraciones (1,1-30 \muM) del péptido MBP
(89-99) nativo, 50 \muM del análogo peptídico o
péptido SWM, en presencia de células de sangre periférica
DR-compatibles irradiadas, después de incubación
durante aproximadamente 60 horas, se pulsan las células con
[^{3}H]-timidina durante 12 horas y se recogen.
Se determina la cantidad de [^{3}H]-timidina
incorporada.
Como se discute con más detalle más adelante,
también puede determinarse la producción de citoquinas. En
particular, es especialmente interesante la producción de
TNF-\alpha e IFN-\gamma. Se
piensa que estas citoquinas proinflamatorias juegan un papel en la
patogénesis de la enfermedad. Brevemente, un clon de células T se
incuba en presencia de péptido MBP estimulante y del análogo
peptídico o del péptido control (SWM) o de medio sólo. Después de
una incubación de 24 horas, se determinan los niveles de
TNF-\alpha e IFN-\gamma en el
sobrenadante utilizando kits EIA disponibles comercialmente
(Endogen, Cambridge, MA).
Los péptidos candidatos que compiten con MBP
(87-99) para la unión a MHC y que no causan una
proliferación directa de la línea de células T o que pueden inhibir
la proliferación producida por MBP (87-99), se
ensayan adicionalmente para determinar su capacidad de inhibir la
inducción de EAE por MBP (87-99). Brevemente, se
inyectan 500 \mug de MBP (87-99) como una emulsión
en adyuvante Freund completo suplementado con Mycobacterium
tubercolisis (H37Ra) matado con calor. Se inyectan las ratas
por vía subcutánea en la base del rabo con 200 \mul de la
emulsión. Las ratas se dividen en dos grupos. Aproximadamente 2
días antes de la inducción de la enfermedad (habitualmente 10 días
después de la inyección de MBP (87-99)) se inyectan
las ratas por vía intraperitoneal bien con PBS o con análogos
peptídicos en PBS. Se evalúan los signos clínicos de los animales a
diario por un observador que desconozca el protocolo de tratamiento.
Se registra EAE en una escala 0-4: 0, clínicamente
normal; 1, parálisis fláccida del rabo; 2, debilidad de las
extremidades posteriores; 3, parálisis de las extremidades
posteriores; 4, las extremidades posteriores y anteriores están
afectadas. Se considera que los análogos peptídicos inyectados a 5
mg/kg o menos (aproximadamente 1 mg por rata) inhiben el desarrollo
de EAE si existe una reducción del 50% en la puntuación cumulativa
media durante los siete días siguientes a la aparición de los
síntomas de la enfermedad en el grupo control.
Además, como medida de seguridad, pero que no
resulta esencial para esta invención, se pueden ensayar análogos
peptídicos adecuados para determinar la inducción directa de EAE.
Como se describe con detalle en el Ejemplo 2, se inyectan
diferentes cantidades de análogos peptídicos en la base del rabo de
las ratas, y se examinan las ratas diariamente para detectar signos
de EAE. Un análogo peptídico que se considera que no causa EAE
tiene una puntuación cumulativa media menor o igual a 1 en siete
días cuando se inyecta 1 mg (5 mg/kg) en adyuvante Freund
completo.
Los análogos peptídicos de la presente invención
resultan útiles en métodos para tratar y prevenir la esclerosis
múltiple mediante administración al paciente de una cantidad eficaz
desde un punto de vista terapéutico de un análogo peptídico de la
proteína básica de mielina humana como se describe en la presente
memoria. Los pacientes adecuados para este tratamiento deben ser
identificados mediante criterios que establezcan un diagnóstico de
EM clínicamente definida como se define en el grupo de trabajo
sobre el diagnóstico de EM (Poser et al., Ann.
Neurol. 13:227, 1983). Brevemente, un individuo con EM
clínicamente definida ha tenido dos ataques y evidencia clínica
bien de dos lesiones o evidencia clínica de una lesión y evidencia
paraclínica de otra lesión independiente. La EM definida puede ser
también diagnosticada por evidencia de dos ataques y bandas
oligoclonales de IgG en el fluido cerebroespinal o por combinación
de un ataque, evidencia clínica de dos lesiones y banda oligoclonal
de IgG en el fluido cerebroespinal. Se utilizan criterios
ligeramente menores para el diagnóstico de EM clínicamente
probable.
El tratamiento eficaz de la esclerosis múltiple
puede examinarse de distintas maneras. El cumplimiento de
cualquiera de los criterios siguientes evidencia un tratamiento
eficaz. Se utilizan tres criterios principales: EDSS (escala del
estado de la discapacidad extendida), aparición de exacerbaciones o
MRI (imagen de resonancia magnética).
La EDSS es un medio para clasificar el deterioro
clínico debido a EM (Kurtzke, Neurology 33:1444, 1983). Se
evalúan ocho sistemas funcionales para evaluar el tipo y la
gravedad del deterioro neurológico. Brevemente, antes del
tratamiento, se evalúan los pacientes para determinar el deterioro
en los sistemas siguientes: piramidal, cerebelo, tronco cerebral,
sensorial, intestino y vejiga, visual, cerebral, y otro. Los
seguimientos se conducen a intervalos definidos. La escala va de 0
(normal) a 10 (muerte debida a EM). Un descenso de un grado
completo define un tratamiento eficaz en el contexto de la presente
invención (Kurtzke, Ann. Neurol. 36:573-79,
1994).
Las exacerbaciones se definen como la aparición
de un síntoma nuevo que es atribuible a EM acompañado de una
anormalidad neurológica nueva (IFNB MS Study Group, supra).
Además, la exacerbación debe durar al menos 24 horas y debe estar
precedida de estabilidad o mejora durante al menos 30 días.
Brevemente, los médicos realizan un examen neurológico estándar al
paciente. Las exacerbaciones son bien suaves, moderadas o graves de
acuerdo con cambios en una Escala de Clasificación Neurológica
(Sipe et al., Neurology 34:1368, 1984). Se determina
una proporción de exacerbación anual y la proporción de pacientes
sin exacerbación. La terapia se considera eficaz si existe una
diferencia estadísticamente significativa en la proporción de
pacientes sin exacerbación entre el grupo tratado y el grupo
placebo en cualquiera de estas determinaciones. Además, también se
puede determinar el momento en el que se produce la primera
exacerbación y la duración de la exacerbación y la gravedad. A este
respecto, una determinación de la eficacia de la terapia es una
diferencia estadísticamente significativa en el momento en que se
produce la primera exacerbación o en la duración y gravedad en el
grupo tratado comparado con el grupo
control.
control.
Se puede utilizar MRI para determinar las
lesiones activas utilizando imagen mejorada por
gadolinio-DTPA (McDonald et al., Ann.
Neurol. 36:14, 1994) o la localización y extensión de las
lesiones utilizando técnicas T_{2}-pesadas.
Brevemente, se obtienen líneas basales de MRI. Se utiliza el mismo
plano de imagen y posición del paciente para cada estudio
posterior. La posición y las secuencias de imágenes se eligen para
maximizar la detección de la lesión y para facilitar la
localización de la lesión. La misma posición y las mismas
secuencias de imágenes se utilizan en estudios posteriores. La
presencia, localización y extensión de las lesiones de EM se
determinan por radiólogos. Las áreas de las lesiones se resaltan y
se suma trozo a trozo para determinar el área total de la lesión.
Se pueden realizar tres análisis: evidencia de lesiones nuevas,
velocidad de aparición de lesiones activas, porcentaje de cambio en
el área de la lesión (Paty et al., Neurology 43:665,
1993). Se considera una mejora debida a la terapia cuando hay una
mejora estidísticamente significativa en un paciente individual
comparado con la línea basal o en un grupo tratado frente a un
grupo placebo.
Los pacientes candidatos para la prevención
pueden ser identificados por la presencia de factores genéticos.
Por ejemplo, la mayoría de los pacientes con EM tienen HLA DR2a y
DR2b. Los pacientes con EM que tienen predisposición genética a EM
que resultan adecuados para recibir tratamiento pertenecen a dos
grupos. El primero, son pacientes con enfermedad temprana del tipo
remisión de recaídas. Los criterios de entrada deben incluir la
duración de la enfermedad de más de un año, puntuación EDSS de 1,0
a 3,5, proporción de exacerbación de más de 0,5 por año, y sin
exacerbaciones clínicas durante 2 meses antes del estudio. El
segundo grupo incluiría a gente con una progresión de la enfermedad
mayor de 1,0 unidad/año de EDSS en los dos años anteriores.
La eficacia del análogo peptídico en el contexto
de la prevención se juzga en base a los criterios siguientes:
frecuencia de células T reactivas a MBP determinada por dilución
limitante, respuesta proliferativa de líneas de células T y clones
reactivos a MBP, perfiles de citoquinas de líneas de células T y
clones a MBP establecidas de pacientes. La eficacia se establece por
el descenso en la frecuencia de células reactivas, una reducción en
la incorporación de timidina con el péptido reemplazado comparado
con el nativo, y una reducción en TNF e
IFN-\alpha. Las determinaciones clínicas incluyen
la proporción de recaídas en intervalos de uno y dos años, y un
cambio en EDSS, incluyendo el tiempo de progresión desde la línea
basal a 1,0 unidad en el EDSS que persista durante seis meses. En
una curva Kaplan-Meier, un retraso en la progresión
sostenida de discapacidad demuestra eficacia. Otros criterios
incluyen un cambio en el área y volumen de las imágenes T2 en MRI, y
el número y volumen de lesiones determinados por imágenes mejoradas
con gadolinio.
Los análogos peptídicos de la presente invención
pueden administrarse bien solos, o como una composición
farmacéutica. Brevemente, las composiciones farmacéuticas de la
presente invención pueden comprender uno o más de los análogos
peptídicos descritos en la presente memoria, en combinación con uno
o más vehículos, diluyentes o excipientes aceptables desde un punto
de vista farmacéutico o fisiológico. Estas composiciones pueden
comprender tampones como disolución salina neutra tamponada,
disolución salina tamponada con fosfato y semejantes, carbohidratos
como glucosa, manosa, sacarosa o dextranos, manitol, proteínas,
polipéptidos o aminoácidos como glicina, antioxidantes, agentes
quelantes como EDTA o glutatión, adyuvantes (por ejemplo hidróxido
de aluminio) y conservantes. Además, las composiciones
farmacéuticas de la presente invención pueden contener también uno
o más ingredientes activos adicionales, como, por ejemplo,
citoquinas como interferón \beta.
Las composiciones de la presente invención pueden
formularse para la forma de administración indicada, incluyendo,
por ejemplo, para administración oral, nasal, venosa, intracraneal,
intraperitoneal, subcutánea, o intramuscular. En otras
realizaciones de la invención, las composiciones descritas en la
presente memoria, pueden administrarse como parte de un implante de
liberación sostenida. En otras realizaciones, las composiciones de
la presente invención pueden formularse como un liofilizado,
utilizando excipientes apropiados que proporcionen estabilidad como
liofilizado, y posteriormente a la rehidratación.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención pueden administrarse de una forma apropiada de acuerdo
con la enfermedad que se va a tratar (o prevenir). La cantidad y
frecuencia de la administración se determinará de acuerdo con
factores como la condición del paciente, y el tipo y gravedad de la
enfermedad del paciente. En realizaciones particularmente
preferidas de la invención, el análogo peptídico o las composiciones
farmacéuticas descritos en la presente memoria pueden administrarse
en una dosis que varía entre 5 y 50 mg/kg, aunque las dosis
apropiadas pueden ser determinadas mediante ensayos clínicos. Los
pacientes pueden estudiarse para determinar la eficacia terapéutica
por MRI, EDSS, y signos de exacerbación clínica, como se ha
descrito más arriba.
Los ejemplos siguientes se ofrecen a modo de
ilustración y no a modo de limitación.
Los péptidos se sintetizaron mediante metodología
de fase sólida en un sintetizador de péptidos (Beckman modelo 990).
Se prepararon péptidos con un extremo carboxilo terminal amidado
con una resina p-metilbencidrilamina (resina MBHA);
para péptidos con un extremo carboxilo terminal libre, se utilizó
una resina Merrifield acoplada con el aminoácido protegido
apropiado. Las dos resinas se obtuvieron de Bachem Fine Chemicals
(Torrance, CA). Los aminoácidos derivatizados (Bachem Fine
Chemicals) utilizados en la síntesis tenían configuración L a no
ser que se especifique otra cosa, y la función
N-alfa-amino estaba protegida
exclusivamente con el grupo t-butiloxicarbonilo. Los
grupos funcionales de las cadenas laterales se protegieron como
sigue: bencilo para serina, treonina, ácido glutámico, y ácido
aspártico; tosilo para histidina y arginina;
2-clorobenciloxicarbonilo para lisina y
2,6-diclorobencilo para tirosina. El acoplamiento
del aminoácido del extremo carboxilo terminal a la resina MBHA se
llevó a cabo con diciclohexilcarbodiimida y los aminoácidos
posteriores se acoplaron con diciclohexilcarbodiimida de acuerdo con
Ling et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:4302,
1984). Después de que se haya incorporado el último aminoácido, se
eliminó el grupo protector t-butiloxicarbonilo y el
conjugado péptido-resina se trató con una mezcla de
14 ml de ácido fluorhídrico (HF), 1,4 ml de anisol, y 0,28 ml de
sulfuro de metiletilo por gramo de conjugado de resina a –20ºC
durante 0,5 h y a 0ºC durante 0,5 h. Se eliminó el HF en vacío a
0ºC, y el péptido resultante y la mezcla de resina se lavaron dos
veces con éter dietílico y dos veces con cloroformo y éter
dietílico alternativamente. El péptido se extrajo cinco veces con
ácido acético 2 M, y el extracto se liofilizó. El producto
liofilizado se purificó en primer lugar en una columna de Sephadex
G-25 (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ)
en 30% de ácido acético para eliminar los fragmentos truncados y
las sales inorgánicas (Ling et al., 1984). Después, los
péptidos se purificaron adicionalmente mediante una cromatografía
de intercambio catiónico con carboximetilcelulosa
CM-32 (Ling et al., 1984). La purificación
final se consiguió mediante cromatografía de partición en
Sephadex-25 (Ling et al., 1984). El producto
sintético se caracterizó mediante análisis de aminoácidos, análisis
de espectrometría de masas, y HPLC de fase
reversa.
reversa.
El péptido MBP y los análogos peptídicos se
disolvieron en disolución salina tamponada con fosfato (PBS) y se
emulsionaron con un volumen igual de adyuvante Freund incompleto
suplementado con 4 mg/ml de Mycobacterium tuberculosis H37Ra
matados con calor en aceite (Laboratorios Difco, Inc., Detroit,
MI). Las ratas se inmunizaron por vía subcutánea en la base del
rabo con 0,1-0,2 ml que contenían 500 \mug de
péptido en la emulsión y se estudiaron para determinar signos
clínicos diariamente. Se puntuó EAE en una escala de
0-4, como sigue: 0, clínicamente normal; 1, rabo
fláccido; 2, debilidad de las extremidades posteriores; 3,
parálisis de las extremidades posteriores; 4, extremidades
posteriores y anteriores afectadas.
Se derivaron líneas de células T establecidas
específicas de antígeno utilizando el método desarrollado por
Ben-Nun et al. (Eur. J. Immunol.
11:195, 1981). Se inyectaron ratas Lewis con MBP
(87-99) o MBP (83-99) como se ha
descrito más arriba. De nueve a diez días después se cultivaron
células de nódulo linfático de drenaje (10^{7}/ml) durante
5-8 días en medio estimulante (medio Eagle
modificado por Dulbecco suplementado con 5 x 10^{-5} M
2-mercaptoetanol, 2 mM L-glutamina,
1 mM piruvato sódico, 100 \mug/ml penicilina, 100 \mug/ml
estreptomicina y 10% suero fetal bovino (Laboratorios Hyclone,
Logan, UT) junto a 10-20 \muM del péptido MBP
(87-99) y 15 U/ml de IL-2. Después
de 5 a 8 días de cultivo, se recogieron las células viables de la
interfase después de una separación Ficoll-Hypaque y
se lavaron tres veces. Estas células se volvieron a cultivar a 1 x
10^{7} células/ml en medio con 5 x 10^{5} esplenocitos
autólogos irradiados (3.000 rad) como células accesorias y
10-20 \muM de MBP (87-99). Después
de 5 a 6 ciclos de estimulación, se rastrearon las placas para
determinar la capacidad de las células de proliferar en respuesta a
MBP (87-99). Las líneas positivas se transfirieron a
placas de 24 pocillos con la base plana y se volvieron a
estimular.
Se determinó la capacidad de unión a MHC de los
péptidos MBP y de los análogos peptídicos. Se utilizó un ensayo que
caracteriza la unión de péptidos a moléculas MHC en células
presentadoras de antígeno (APC) (Mozes et al., EMBO
J. 8:4049, 1989; Gautam et al., PNAS 91:767,
1994). Se cultivaron células de bazo en medio Eagle modificado por
Dulbecco suplementado con 10% de suero fetal bovino (Laboratorios
Hyclone, Logan, UT) en placas petri estándar de poliestireno (100 x
15 mm) en un incubador a 37ºC con 6,5% CO_{2} durante 3 horas.
Posteriormente, se eliminaron las células no adherentes, y las
placas se lavaron tres veces con PBS. Se recogieron las células
adherentes utilizando un raspador de células. Se determinó la unión
de los análogos de MBP (87-99) utilizando un ensayo
de fluorescencia. Brevemente, se mezclaron 5 x 10^{5} células de
bazo adherentes en tampón de tinción (PBS con 0,1% de albúmina
sérica bovina) con diferentes concentraciones de análogos de MBP que
variaban de 0-400 \muM en pocillos individuales
de placas de microcultivo de 96 pocillos con forma U y se incubaron
durante 1 h a 37ºC en un incubador con 6,5% CO_{2}. Después de la
incubación, se añadió 10 \muM de péptido nativo MBP marcado con
biotina a los pocillos de cultivo durante 1 h. Las células se
lavaron tres veces con el tampón de tinción. Se añadió
estreptavidina conjugada con ficoeritrina o con fluoresceína
(Becton Dickinson, San José, CA) como agente de segunda etapa (1
\mug/pocillo) junto con 1 \mug/pocillo de anticuerpo monoclonal
OX-6 u OX-17 marcado con fluorocromo
(Pharmingen, San Diego, CA), que reacciona con MHC de rata clase II
I-A o I-E, respectivamente. Las
células se lavaron dos veces antes del análisis citofluorográfico
en un FACScan (Becton Dickinson). Se calculó la intensidad de
fluorescencia para cada muestra sustrayendo la fluorescencia
obtenida de las células OX positivas teñidas con
ficoeritrina-estreptavidina sólo (tinción control)
de la fluorescencia obtenida de las células OX positivas teñidas
con MBP marcado con biotina más
ficoeritrina-estreptavidina. Se calculó el
porcentaje de inhibición para cada análogo y se expresó como
valores de CI_{50}.
El análogo peptídico, h88/A91, que contiene
D-histidina en la posición 88 y alanina en la
posición 91 compitió tan eficazmente como MBP
(87-99) en la unión a MHC frente a MBP
(87-99). A 200 \muM, MBP (87-99)
inhibió la unión en un 68,4% y h88/A91 inhibió la unión en un
67,64%. A 100 \muM, MBP (87-89) inhibió la unión
en un 40% y a83, A89, A91 inhibieron la unión en un 25%.
Se obtuvieron ratas Lewis hembra, de
aproximadamente seis semanas de edad, de Harlan Sprague,
Indianapolis, IN. Los péptidos MBP se disolvieron en disolución
salina tamponada con fosfato (PBS) y se emulsionaron con un volumen
igual de adyuvante Freund completo (Laboratorios Difco, Inc.,
Detroit, MI) suplementado con 2 mg/ml de Mycobacterium
tuberculosis H37Ra matados con calor, en aceite (Difco). Las
ratas se inmunizaron por vía subcutánea en la base del rabo con 0,1
ml que contenían 100 \mug del péptido en la emulsión. De nueve a
diez días después de la inmunización, las ratas se sacrificaron, se
obtuvo su nódulo linfático de drenaje y se hizo una suspensión de
células únicas. Las células se resuspendieron a 5 x 10^{6}
células por ml en medio de estimulación que contenía medio Eagle
modificado por Dulbecco (Gibco BRL, Galthersburg, MD) suplementado
con 2-mercaptoetanol (5 x 10^{-5} M),
L-glutamina (2 mM), piruvato sódico (1 mM),
penicilina (100 \mug/ml), estreptomicina (100 \mug/ml), y 1%
suero normal de rata.
Para el ensayo, se añadieron 100 \mul de la
suspensión de células de nódulo linfático a una placa de 96
pocillos de base plana en presencia de un volumen igual de medio
que contenía 10 \muM de varios péptidos (incluyendo: motilina
como control negativo; MBP87-99; medio solo o
alanina o D-aminoácido reemplazado en la posición
91, 95 ó 97). Los cultivos se incubaron entonces a 37ºC en aire
húmedo que contenía 7,5% CO_{2}. Después de 3 días de incubación,
se añadió 1,0 \muCi de timidina tritiada (20 Ci/mM; New England
Nuclear) a cada pocillo y las placas se volvieron a incubar durante
12-16 horas adicionales. Posteriormente, las placas
se recogieron con un recolector Matrix filtermate (Packard) y se
contaron utilizando un Contador Automático Direct Beta (Packard). Se
calcularon las cpm medias y el error estándar de la media de
pocillos en triplicado.
Como se puede ver en la Figura 2, MBP
(87-99) estimuló las células de nódulo linfático en
contraste con los análogos peptídicos. Las sustituciones de alanina
en las posiciones 95 y 97 y las sustituciones de
D-aminoácido en los residuos 91, 95 y 97 no
estimularon las células por encima del péptido control,
motilina.
Los ensayos de proliferación de líneas de células
T específicas de antígeno se llevaron a cabo en placas de
microtitulación de 96 pocillos de fondo plano como se ha descrito
(Zamvil et al., Nature 317:355-358,
1985; Offner et al., J. Immunol.
148:1706-1711, 1992; Gold et al., J.
Immunol. 148:1712-1717, 1992; Karin et
al., J. Exp. Med. 180:2227-2237, 1994).
Las líneas de células T se establecieron como se ha descrito en el
Ejemplo 3. Se añadió una dilución inicial 1:10 de una disolución
stock 1,5 mM de MBP o de los análogos peptídicos en el medio de
cultivo tisular. Las muestras se diluyeron en series de diluciones
de tres veces (volumen final 100 \mul). Las líneas de células T
continuas que respondieron se resuspendieron a 4 x 10^{5} células
por ml y se añadieron alicuotas de 50 \mul a cada pocillo (5 x
10^{4} células por pocillo). También se añadieron a cada pocillo
aproximadamente 1 x 10^{6} esplenocitos irradiados (3.000 R). Los
cultivos se incubaron entonces a 37ºC en aire húmedo que contenía
7,5% CO_{2} durante 3 días. De doce a dieciséis horas antes de
la recogida, se añadieron 0,5-1,0 \muCi de
[^{3}H]-timidina (20 Ci/mM; New England Nuclear)
a cada pocillo y se volvieron a incubar los cultivos. Las placas se
recogieron entonces con un recolector Matrix filtermate (Packard) y
se contaron utilizando un Contador Automático Direct Beta
(Packard). Se calcularon las cpm medias y el error estándar de la
media de pocillos en triplicado.
Como se puede observar en las Figuras 3, 4 y 5 un
análogo peptídico con cualquier reemplazamiento en la posición 91,
95 ó 97 no estimula la proliferación de una línea de células T
reactiva a MBP (87-99). El efecto resultó dramático
porque incluso 150 \muM del análogo peptídico resultó de 1 a 2
logs menos eficaz en la estimulación de la proliferación.
El antagonismo de células T se detectó en un
ensayo de proliferación de prepulso como describe De Magistris
et al. (Cell 58:625, 1992) con leves modificaciones.
Se irradiaron con radiación \gamma (3.000 rad) células de bazo
presentadoras de antígeno y se incubaron con agitación a una
concentración de 10^{7}células/pocillo con
0,2-2,0 \muM del péptido MBP nativo
(87-99) en medio de estimulación en placas de
cultivo tisular de 10 ml durante 2 a 4 horas a 37ºC en aire húmedo
que contenía 6,5% CO_{2}. Las células de bazo se lavaron entonces
y se volvieron a cultivar a una concentración de 5 x 10^{5}
células/pocillo en placas de microtitulación de 96 pocillos con
forma de U junto a 5 x 10^{4} células T reactivas a MBP
(87-99). Se añadieron varias concentraciones de
péptidos antagonistas, que variaban de 5 a 150 \muM durante 72
horas adicionales. Cada pocillo se pulsó con 0,5-1
\muCi de [^{3}H]-timidina (actividad específica
10 Ci/mmol) durante las 12-16 horas finales.
Posteriormente, se recogieron los cultivos en filtros de fibra de
vidrio y se expresó la respuesta proliferativa en CPM \pm EEM.
Los datos presentados en la Figura 6, demuestran
que el análogo peptídico con un doble reemplazamiento, h88/A91, y
el análogo peptídico con un triple reemplazamiento, h88/A91/p99,
inhibieron de manera significativa la proliferación de una línea de
células T reactiva a MBP. El análogo con un triple reemplazamiento
produjo inhibición a 50 \muM y a concentraciones superiores,
mientras que el análogo doblemente reemplazado produjo inhibición a
150 \muM.
Se inyectaron ratas Lewis hembra, de
6-8 semanas de edad, en la base del rabo con 500
\mug de MBP (87-99) en CFA que contenía 500 \mug
de Mycobacterium tuberculosis en un volumen de 200 \mul.
Las ratas se dividieron en grupos de 5. El grupo control recibió
0,5 ml de PBS y el grupo de tratamiento recibió el análogo
peptídico h88/A91 (1 mg/0,5 ml PBS) por vía intraperitoneal, dos
veces, en los días 9 y 10 después de la inmunización. Los animales
se estudiaron diariamente para detectar síntomas de enfermedad. EAE
se puntuó en la escala siguiente: 0, sin síntomas; 1, parálisis del
rabo; 2, debilidad de las extremidades posteriores; 3, parálisis de
las extremidades posteriores; 4, extremidades posteriores y
anteriores afectadas.
Los datos de dos experimentos diferentes se
obtuvieron como puntuación media cumulativa de 5 animales (Figura
7). Los animales control no tratados desarrollaron un alto grado de
enfermedad mientras que el análogo h88/A91 del péptido MBP
87-99 fue eficaz previniendo significativamente el
desarrollo de EAE en dos experimentos. Aunque el análogo se
administró justo antes de la aparición de síntomas claros, fue
capaz de detener el desarrollo de EAE.
Se evaluó la capacidad de los análogos peptídicos
para causar EAE in vivo. Se inyectaron las ratas con MBP
(87-99) o el análogo peptídico h88/A91 como se ha
descrito en el Ejemplo 2. Los animales se estudiaron diariamente
para detectar evidencias de EAE. Las ratas que recibieron MBP
(87-99) tuvieron una incidencia de EAE del 100%
(18/18 ratas) con una puntuación clínica máxima media de 2,4 \pm
0,2. Por el contrario, 0/12 ratas que recibieron el análogo
peptídico h88/A91 tuvieron EAE. Por lo tanto, este análogo peptídico
no induce EAE.
El análogo peptídico 91K>A es capaz de inhibir
la transferencia adoptiva de la enfermedad por células T inmunes en
la cepa de ratas Lewis (Karin et al., 1994). Se investigó
una caracterización adicional de los efectos de APL en el sistema
inmune en ratas Lewis inyectadas con HBP.
En este sistema, se indujo encefalomielitis
alérgica experimental (EAE) en doce ratas Lewis hembra mediante
inyección del péptido MBP (83-99) en adyuvante
Freund completo (CFA) en la base del rabo. Nueve días después, las
ratas se dividieron en dos grupos de seis animales y se inyectaron
por vía subcutánea con 13,2 mg/kg bien del análogo peptídico o de
un péptido control, mioglobina de esperma de ballena (SWM)
(110-121). Los animales se estudiaron diariamente
para detectar síntomas de la enfermedad y se puntuaron de manera
ciega en una escala ascendente no lineal de 0-4 con
incrementos que significan parálisis creciente. Cada puntuación
individual se promedió con grupos cohortes para obtener la
puntuación clínica media. Los resultados de un experimento de este
tipo se muestran en la Figura 9.
Como se puede ver en la Figura 9, la gravedad de
la enfermedad en los animales tratados con el APL
NBI-5788 (Figura 8) fue alrededor de un 50% menor
comparado con el grupo control. La Figura 10 muestra la gravedad
media de la enfermedad de los resultados de tres experimentos
independientes de terapia. El APL NBI-5788 redujo
de manera significativa la gravedad y duración de la enfermedad en
este sistema modelo. La Figura 11 muestra los resultados del
tratamiento utilizando otro APL, NBI-5765 (Figura
8). Este APL también redujo de manera significativa la magnitud de
la enfermedad en el grupo tratado comparado con los animales
control.
Aunque estos resultados demuestran claramente que
APL inhibe el desarrollo de EAE, también se ha desarrollado un
sistema modelo de animal murino de EAE. El ratón SJL/J
(H-2^{5}) desarrolla una forma crónica de recaída
de EAE en respuesta a inmunización con el péptido MBP
(83-99) en presencia de la vacuna pertussis. Se
evaluó la capacidad de los análogos peptídicos
NBI-5719 y NBI-5765 para inhibir la
enfermedad (véase la Figura 12).
Se inyectaron semanalmente por vía
intraperitoneal grupos de 10 animales durante 4 semanas con 20 mg/kg
bien de un péptido control o del análogo peptídico. Los animales se
estudiaron entonces para detectar la enfermedad durante los
siguientes 2-3 meses. Como puede observarse en la
Figura 12, los ratones SJL/J desarrollaron síntomas de EAE
empezando alrededor del día 20 en el grupo control y duraron
aproximadamente 3 semanas. Empezando alrededor del día 70, se
produjo una recaída que alcanzó una puntuación clínica media de
aproximadamente 1. Sin embargo, la inyección semanal con el APL
NBI-5765 o NBI-5719 durante cuatro
semanas no sólo redujo el grado de la enfermedad en la primera
fase, sino que también redujo la gravedad de la recaída. Esto
resulta particularmente sorprendente porque los animales no habían
sido expuestos al APL durante aproximadamente un mes.
Se evaluó la capacidad de los análogos peptídicos
NBI-5719, 5748, 5765, 5788 y 5789 para afectar la
proliferación de células T humanas. Se cultivó una cantidad
constante del análogo peptídico o del péptido control SWM (50
\muM) con diferentes concentraciones del péptido MBP
(83-99) nativo (1,1-30 \muM) en
presencia de células de sangre periférica DR compatibles irradiadas
y de clones de células T irradiados derivados de diferentes
pacientes con MS. Las células T humanas (1 x 10^{6}) se
cultivaron con células de sangre periférica (PBL, 5 x 10^{6}) DR
compatibles irradiadas en medio que contenía IMDM suplementado con
3 \muM MBP83-99, 2 mM L-glutamina,
50 \mug/ml gentamicina penicilina/estreptomicina, 100 U/ml
IL-2r y 10% suero humano AB negativo. Las células se
cultivaron durante 60 horas aproximadamente, se pulsaron con
timidina tritiada durante 12 horas, y se recogieron. Se determinó la
cantidad de timidina tritiada incorporada, y los datos se
representaron como la media más o menos el error estándar de la
media de muestras replicadas. En las Figuras 13 y 14 se muestran
resultados representativos.
Como se puede observar en la Figura 13, el
análogo peptídico NBI-5788 que corresponde a MBP
(83-99) (83E>a, 84N>K, 89F>L, y 91K>A)
inhibió la capacidad de un clon de células T humano restringido
para Dr2a para responder a diferentes concentraciones de MBP
(83-99), mientras que el péptido irrelevante
(mioglobina de esperma de ballena, SWM 110-121)
tuvo un efecto pequeño en la capacidad proliferativa de las células
T. La Figura 14 muestra que todos los péptidos inhibieron la
capacidad de las células T restringidas para Dr2a para responder al
péptido MBP nativo de manera dependiente de la concentración.
Se determinó entonces la potencia de
NBI-5788 variando las concentraciones del APL (2,
10, ó 50 \muM) en presencia de diferentes cantidades del MBP
nativo (83-99) (1,1-30 \muM). Como
se puede observar en la Figura 15, tanto a 10 \muM como a 50
\muM, NBI-5788 alteró de manera significativa la
capacidad de la línea de células T Dr2a para responder a MBP
(83-99), pero no se observó una inhibición
significativa con el péptido irrelevante SWM.
Se determinó la capacidad del análogo peptídico
para inhibir la respuesta proliferativa de células T reactivas a MBP
aisladas de individuos Dr2b (Drb 1*1501). Se cultivó una cantidad
constante de NBI-5788 (50 \muM) con diferentes
concentraciones del péptido nativo (1,1-30 \muM)
en presencia de células de sangre periférica DR compatibles
irradiadas y de clones de células T irradiados derivados de
diferentes pacientes con MS.
Las Figuras 16, 17 y 18 representan los
resultados utilizando tres líneas de células T diferentes. Cada
clon de célula T varía en la cantidad de timidina incorporada en
respuesta al péptido MBP. De cualquier manera,
NBI-5788 inhibió la capacidad de los clones de
células T para responder al péptido MBP de manera dependiente de la
concentración. El péptido irrelevante SWM tuvo una influencia
pequeña en la capacidad de las células T para responder al péptido
MBP.
La Figura 19 muestra la capacidad de
NBI-5719, NBI-5748,
NBI-5765, NBI-5788 y
NBI-5789 para inhibir la proliferación dependiente
de MBP del clon de células T humano restringido para Dr2b 5F6. Como
se observa más arriba con las células T restringidas para Dr2b
(Figura 14), el APL inhibió la proliferación dependiente de MBP de
manera dependiente de la concentración. Sin embargo, el péptido
control SWM tuvo un efecto pequeño en la respuesta
proliferativa.
La Figura 20 representa la capacidad de
NBI-5719 y NBI-5765 para inhibir la
proliferación dependiente de MBP del clon de células T humanas
restringido para Dr4 Dw4 MS-1. Como se observa más
arriba con las células T restringidas para Dr2, el APL inhibió la
proliferación dependiente de MBP de manera dependiente de la
concentración.
A continuación se determinó la capacidad del
análogo peptídico ligando para influir en la producción de
citoquinas. El clon de células T restringido para Dr2b 5F6 se
incubó en presencia del péptido MBP 3 \muM bien con 10 \muM de
NBI-5788 o SWM o medio sólo. Como control, las
células se cultivaron en presencia de medio sólo. Después de 24
horas, se recogieron los sobrenadantes y se determinaron,
utilizando kits EIA disponibles comercialmente, los niveles del
factor tumoral de necrosis alfa (TNF-\alpha) y del
interferon-\gamma
(IFN-\gamma).
Como se puede observar en la Figura 21, MBP
estimuló la producción tanto de TNF-\alpha como
de IFN-\gamma (aproximadamente 200 y 160 pg/ml,
respectivamente). Sin embargo, el análogo peptídico ligando
NBI-5788 inhibió de forma dramática la producción
de ambas citoquinas proinflamatorias hasta aproximadamente los
niveles alcanzados con medio sólo. El péptido irrelevante SWM tuvo
un efecto mínimo en la producción de citoquinas. Ninguno de los
análogos peptídicos NBI-5719,
NBI-5748, NBI-5765,
NBI-5788 o NBI-5789, estimuló la
producción de citoquinas por encima del nivel basal, aún a
concentraciones de 50 \muM (datos no mostrados).
Claims (27)
1. Un análogo peptídico que comprende al menos
siete aminoácidos consecutivos seleccionados de los restos 86 a 99
de la proteína básica de mielina humana de la Figura 1, incluyendo
el resto 91, en el que la L-lisina de la posición 91
está reemplazada por otro aminoácido, o el resto 97, en el que la
L-arginina de la posición 97 está reemplazada por
otro aminoácido, o el resto 95, en el que la
L-treonina de la posición 95 está reemplazada por
otro aminoácido, y en el que el mencionado análogo peptídico
contiene de 2 a 5 sustituciones por un aminoácido distinto del
aminoácido presente en la proteína nativa en esa posición y en el
que el análogo peptídico a) compite por la unión a MHC con el
péptido MBP nativo; b) no produce proliferación de una línea de
células T reactiva a MBP (87-99); y c) inhibe la
inducción de encefalomielitis alérgica experimental (EAE) por MBP
(87-99) en roedores.
2. El análogo peptídico de la reivindicación 1,
que comprende de siete a doce aminoácidos.
3. El análogo peptídico de cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, en el que la L-lisina de la
posición 91 o la L-arginina de la posición 97 está
reemplazada por otro aminoácido, que además comprende el
reemplazamiento de uno a tres restos adicionales seleccionados de
los restos 86-90, 92-96, 98 y 99 por
otro aminoácido.
4. El análogo peptídico de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, en el que la L-treonina de
la posición 95 está reemplazada por otro aminoácido, que además
comprende el reemplazamiento de uno a tres restos adicionales
seleccionados de los restos 86-90,
92-94, y 96-99, de los restos
86-94, 96, 98 y 99 por otro aminoácido.
5. Un análogo peptídico de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que de uno a tres
L-aminoácidos seleccionados del grupo que consiste
en valina en la posición 86, valina en la posición 87, histidina en
la posición 88, treonina en la posición 95, treonina en la posición
98 y prolina en la posición 99 están reemplazados por un aminoácido
distinto del aminoácido presente en la proteína nativa en esa
posición.
6. El análogo peptídico de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el resto 91 está reemplazado por
alanina.
7. El análogo peptídico de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el resto 95 está reemplazado por
alanina.
8. El análogo peptídico de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el resto 97 está reemplazado por
alanina.
9. El análogo peptídico de cualquiera de las
reivindicaciones 6, 7 u 8, en el que al menos el resto 87 está
reemplazado por D-valina, el resto 88 está
reemplazado por D-histidina, y el resto 99 está
reemplazado por D-prolina.
10. El análogo peptídico de una cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 9, en el que el resto 88 está reemplazado por
un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en serina, ácido
glutámico, tirosina, leucina, D-histidina,
glutamina, fenilalanina y lisina.
11. Un análogo peptídico de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el aminoácido
N-terminal y el aminoácido
C-terminal están reemplazados por otro aminoácido,
de manera que después de la administración del análogo peptídico
in vivo se reduce la proteolisis.
12. El análogo peptídico de la reivindicación 11,
en el que los aminoácidos N-terminales y/o
C-terminales son D-aminoácidos.
13. El análogo peptídico de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en el que la L-lisina de
la posición 91 está reemplazada por un aminoácido no
conservativo.
14. El análogo peptídico de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, en el que el resto 91 está reemplazado por
un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en arginina,
asparagina, histidina, leucina, serina, glicina, ácido glutámico,
fenilalanina, alanina y D-lisina.
15. El análogo peptídico de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en el que la L-treonina de
la posición 95 está reemplazada por un aminoácido no
conservativo.
16. El análogo peptídico de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12 y 15, en el que el resto 95 está
reemplazado por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste
en alanina, D-treonina, glicina, isoleucina,
tirosina, glutamina, serina, lisina, ácido glutámico e
histidina.
17. El análogo peptídico de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, donde la L-arginina de la
posición 97 está reemplazada por un aminoácido no conservativo.
18. El análogo peptídico de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12 y 17, en el que el resto 97 está
reemplazado por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste
en D-alanina, D-arginina, glicina,
lisina, glutamina, ácido glutámico, treonina, leucina,
fenilalanina, histidina y alanina.
19. El análogo peptídico de la reivindicación 1,
que comprende los restos 83 a 99 de la proteína básica de mielina
humana de la Fig. 1, en el que la L-lisina de la
posición 91 está reemplazada por otro aminoácido, y de dos a cuatro
L-aminoácidos adicionales seleccionados de los
restos 83 a 90 y 92 a 99 están reemplazados por un aminoácido
distinto del aminoácido presente en la proteína nativa en esa
posición.
20. El análogo peptídico de la reivindicación 19,
en el que la L-lisina de la posición 91 está
reemplazada por alanina.
21. El análogo peptídico de la reivindicación 19
ó 20, que incluye un reemplazamiento de la fenilalanina de la
posición 89 por otro aminoácido.
22. El análogo peptídico de cualquiera de las
reivindicaciones 19, 20 ó 21, en el que el aminoácido
N-terminal y/o el aminoácido
C-terminal están reemplazados por otro
aminoácido.
23. El análogo peptídico de la reivindicación 22,
en el que los aminoácidos N-terminales y/o
C-terminales están reemplazados por un
D-aminoácido.
24. El análogo peptídico de una cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 23, en el que al menos uno de los
L-aminoácidos adicionales seleccionados de los
restos 83 a 90 y 92 a 99 está reemplazado por un aminoácido
cargado.
25. El análogo peptídico de la reivindicación 1,
que comprende al menos siete aminoácidos consecutivos y no
reemplazados seleccionados de los restos 86 a 99 de la proteína
básica de mielina humana, en el que la L-lisina que
corresponde a la posición 91 está reemplazada por un aminoácido
seleccionado del grupo que consiste en arginina, asparagina,
histidina, leucina, serina, glicina, ácido glutámico, fenilalanina,
alanina y D-lisina, y en el que el aminoácido
N-terminal y/o el aminoácido
C-terminal están reemplazados por otro aminoácido,
de manera que después de la administración del análogo peptídico
in vivo se reduce la proteolisis.
26. Una composición farmacéutica que comprende un
análogo peptídico de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en combinación con un vehículo o
diluyente aceptable desde un punto de vista fisiológico.
27. Un análogo peptídico de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, para utilizarse en el
tratamiento de la esclerosis múltiple.
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