ES2560448T3 - Procedimientos de tratamiento de enfermedades con copolímeros aleatorios - Google Patents

Abstract

Una composición de copolímero aleatorio para su uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmune mediada por linfocitos TH1, en la que la composición de copolímero aleatorio comprende copolímeros aleatorios que consisten en restos de aminoácido YFAK (L-tirosina, L-fenilalanina, L-alanina y L-lisina) en una proporción de rendimiento molar de aproximadamente 1,0: 1,2: 20,0<30,0: 6,0 respectivamente, en la que la variabilidad de la proporción de rendimiento comprende un intervalo de un 10 % entre los diferentes restos de aminoácido, y la longitud del copolímero está entre 35 y 75 restos de aminoácido, en la que la composición es para suministrar subcutáneamente a un sujeto en dos o más dosis, cada dosis separada por un intervalo de tiempo de al menos 7 días, induciendo de ese modo una respuesta inmune influenciada por TH2.

Description

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Cuando se sintetizan, una preparación habitual de copolímeros aleatorios es una mezcla de péptidos de diversas longitudes, la mayoría de los cuales tienen la longitud deseada pero contienen péptidos más cortos o más largos creados de forma inevitable con los procedimientos de síntesis disponibles en la actualidad.

En ciertas realizaciones preferentes, los copolímeros objeto se formulan para uso como un medicamento con el fin de que tengan una capacidad de polidispersión inferior a 25.000, y más preferentemente inferior a 10000, 5000, 1000, 500, 100, 50, o incluso inferior a 10.

Síntesis de copolímeros aleatorios

Los copolímeros aleatorios usados en la presente invención se pueden fabricar mediante cualquier procedimiento disponible para un experto en la materia.

Para los fines de la presente solicitud, las expresiones "temperatura ambiental" y "temperatura ambiente" se refieren a una temperatura que varía de aproximadamente 20 ºC a aproximadamente 26 ºC.

Un procedimiento de síntesis preferente de los copolímeros aleatorios de la presente invención es mediante síntesis en fase sólida. La síntesis se realiza en múltiples etapas mediante el enfoque de Síntesis de Péptidos en Fase Sólida (SPPS) usando aminoácidos protegidos con Fmoc. La SPPS se basa en la adición secuencial de derivados de aminoácidos protegidos, con protección de la cadena lateral cuando sea apropiado, a un soporte polimérico (perla). El grupo Fmoc inestable en base se usa para protección de N. después de la retirada del grupo protector (mediante hidrólisis de piperidina), se añade la siguiente mezcla de aminoácidos usando un reactivo de acoplamiento (TBTU). Después de acoplar el aminoácido final, el extremo N-terminal se acetila.

El péptido resultante (unido al soporte polimérico a través de su extremo C-terminal) se extingue con TFA para proporcionar el péptido en bruto. Durante esta etapa de escisión, todos los grupos protectores de las cadenas laterales también se escinden. Después de precipitación con éter diisopropílico, el sólido se filtra y se seca. El péptido resultante se analiza y se almacena a 2-8 ºC.

Ejemplo de síntesis en fase sólida

El copolímero aleatorio, YFAK, que consiste en L-alanina, L-lisina, L-fenilalanina y L-tirosina se prepara en su forma protegida sobre resina de Wang. Algunas resinas usadas fueron Fmoc-L-Tyr(t-Bu)-Wang (0,62 mmol/g), Fmoc-LPhe-Wang (0,72 mmol/g), Fmoc-L-Ala-Wang (0,70 mmol/g), y Fmoc-L-Lys(Boc)-Wang (0,72 mmol/g). Los cuatro aminoácidos protegidos con F-moc, Fmoc-L-Tyr(t-Bu)-OH, Fmoc-L-Phe-OH, Fmoc-L-Ala-OH, y Fmoc-L-Lys-OH, se usan en una proporción de aportación molar de 1:1:10:6 respectivamente durante cada etapa de acoplamiento. Otros reactivos usados en la síntesis son 2-(1H-Benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio, tetrafluoroborato (TBTU), N,N-diisopropiletilamina (DIPEA), piperidina, y ácido trifluoroacético (TFA). Los disolventes usados son Nmetilpirrolidona (NMP), isopropanol (IsOH, IPA, i-PrOH), cloruro de metileno, y éter isopropílico. La estequiometría de cada acoplamiento es la que sigue a continuación:

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restos 1 a 10 usando 2 equivalentes de aminoácidos protegidos con Fmoc;

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restos 11 a 30 usando 2 equivalentes con doble acoplamiento de aminoácidos protegidos con Fmoc;

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restos 31 a 52 usando 2,5 equivalentes de aminoácidos protegidos con Fmoc con doble acoplamiento.

Un ejemplo de proporciones de aportación de aminoácidos en un ejemplo representativo de síntesis de YFAK con contenidos de alanina progresivamente más elevados es el que sigue a continuación:

Posiciones

Y F A K

0-10

3,7 5,5 64,4 26,4

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4,3 5,1 71,4 19,2

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4,0 4,7 71,5 19,8

31-40

3,6 4,7 74,3 17,4

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3,0 4,1 76,0 16,8

Polipéptidos no naturales y modificación química de copolímeros

El peso molecular de un copolímero aleatorio se puede ajustar durante la síntesis del polipéptido o después de haber sintetizado el copolímero. Para ajustar el peso molecular durante la síntesis del polipéptido, las condiciones de síntesis o las cantidades de aminoácidos se ajustan de modo que la síntesis se detiene cuando el polipéptido alcanza la longitud aproximada que se desea. Después de la síntesis, se pueden obtener los polipéptidos con el peso molecular deseado mediante cualquier procedimiento de selección de tamaño disponible, tal como

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cromatografía de los polipéptidos en una columna o gel de dimensionamiento de peso molecular, y recogida de los intervalos deseados de peso molecular. Los presentes polipéptidos también se pueden hidrolizar parcialmente para retirar las especies de peso molecular elevado, por ejemplo, mediante hidrólisis en ácido o enzimática, y a continuación se pueden purificar para retirar el ácido o enzimas.

En una realización, los copolímeros aleatorios con un peso molecular deseado se pueden preparar mediante un procedimiento que incluye hacer reaccionar un polipéptido protegido con ácido bromhídrico para formar polipéptido de a trifluoroacetilo que tiene el perfil de peso molecular deseado. La reacción se realiza durante un tiempo y a una temperatura que se determina previamente con una o más reacciones de ensayo. Durante la reacción de ensayo, el tiempo y la temperatura varían y se determina el intervalo de peso molecular de un lote dado de los polipéptidos de ensayo. Para el lote se usan las condiciones del ensayo que proporcionan el intervalo de peso molecular óptimo para ese lote de polipéptidos. Por lo tanto, se puede producir un polipéptido de trifluoroacetilo que tiene el perfil de peso molecular deseado mediante un procedimiento que incluye hacer reaccionar el polipéptido protegido con ácido bromhídrico durante un tiempo y a una temperatura determinada previamente con la reacción de ensayo. El polipéptido de trifluoroacetilo con el perfil de peso molecular deseado se trata a continuación con una solución acuosa de piperidina para formar un polipéptido de toxicidad baja que tiene el peso molecular deseado.

En una realización preferente, una muestra de ensayo de polipéptido protegido a partir de un lote dado se hace reaccionar con ácido bromhídrico durante aproximadamente 10-50 horas a una temperatura de aproximadamente 20-28 ºC. Las mejores condiciones para ese lote se determinan realizando varias reacciones de ensayo. Por ejemplo, en una realización, el polipéptido protegido se hace reaccionar con ácido bromhídrico durante aproximadamente 17 horas a una temperatura de aproximadamente 26 ºC.

Los documentos de Publicación de PCT Internacional con números WO 00/05250, WO 00/05249; WO 02/59143, WO 0027417, WO 96/32119, los documentos de Publicación de Patente de Estados Unidos con números 2004/003888, 2002/005546, 2003/0004099, 2003/0064915 y 2002/0037848, los documentos de patente de Estados Unidos con números 6.514.938, 5.800.808 y 5.858.964, y el documento de solicitud de PCT, PCT/US05/06822, describen adicionalmente procedimientos para sintetizar copolímeros aleatorios, composiciones que comprenden copolímeros aleatorios, formulaciones terapéuticas de copolímeros aleatorios, procedimientos para administrar copolímeros aleatorios a un sujeto, enfermedades que se pueden tratar con copolímeros aleatorios, y agentes terapéuticamente eficaces adicionales que se pueden coadministrar a un sujeto con los copolímeros aleatorios.

Es evidente que esto se proporciona solamente a modo de ejemplo, y que las composiciones se pueden variar tanto con respecto a los componentes como las proporciones relativas de los componentes si los criterios generales mencionados anteriormente se adhieren a esto.

IV. Enfermedades

La invención proporciona composiciones para tratar o prevenir enfermedades en un sujeto. Un sujeto que está en riesgo de desarrollar una enfermedad, que se sospecha que está afectado con una enfermedad, o que está afectado con la enfermedad se puede tratar usando las composiciones proporcionadas por la invención.

La enfermedad que se puede tratar con las composiciones para uso de la presente invención comprende una enfermedad que está mediada con linfocitos TH1.

La enfermedad que se puede tratar con las composiciones para uso de la presente invención comprende enfermedades autoinmunes. Algunas enfermedades autoinmunes contempladas en la presente invención incluyen enfermedad mediada por células (por ejemplo, linfocitos T). Tales trastornos pueden ser, entre otros, afecciones artríticas, enfermedades desmielinizantes y enfermedades inflamatorias. Las composiciones de la invención tienen un interés en particular para el tratamiento de enfermedades inflamatorias desmielinizantes, que incluyen esclerosis múltiple, EAE, neuritis óptica, mielitis transversa aguda, y encefalitis diseminada aguda. En una realización específica, cualquier enfermedad autoinmune se puede tratar con los presentes polipéptidos siempre y cuando el polipéptido contemplados se una a una proteína de clase II de MHC que se ha asociado con la enfermedad autoinmune. La evolución de la enfermedad se puede medir mediante el control de los síntomas clínicos o de diagnóstico usando procedimientos conocidos.

En una realización, la enfermedad tratada con los procedimientos que se proporcionan en el presente documento es una "afección artrítica". Como se usa en el presente documento, una afección artrítica es una afección en la que se observa al menos un síntoma de artritis reumatoide en al menos una articulación de un mamífero, por ejemplo en un hombro, rodilla, cadera, columna vertebral o un dedo del mamífero. La RA es una enfermedad autoinmune humana común con una prevalencia de aproximadamente un 1 % entre las personas de raza blanca (Harris, B. J. y col., 1997, En Textbook of Rheumatology 898-932), que en la actualidad afecta a 2,5 millones de americanos. La RA se caracteriza por inflamación crónica de las articulaciones sinoviales e infiltración mediante linfocitos T activados, macrófagos y células plasmáticas, que conducía una destrucción progresiva del cartílago articular. Es la forma más grave de enfermedad articular. La susceptibilidad heredada a la RA está fuertemente asociada con el sujeto afectado que tiene en el sitio DRB1 de clase II de MHC el alelo DRB 1*0401, DRB 1*0404, o DRB1*0405 o el alelo DRB1*0101. La naturaleza del autoantígeno(s) en RA no se entiende bien, aunque el tipo II del colágeno (CII) es un

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candidato importante. Se ha identificado un epítopo inmunodominante de linfocitos T en el tipo II del colágeno que corresponde a los restos 261-273 (Fugger, L. y col., 1996, Eur. J Immunol. 26: 928-933).

Otros ejemplos de afecciones artríticas incluyendo "poliartritis", que es una afección artrítica que afecta a más de una sola articulación; "artritis juvenil", una afección artrítica de seres humanos con edad inferior a 21; y el síndrome de Felty, que puede incluir los síntomas de neutropenia, esplenomegalia, pérdida de peso, anemia, linfadenopatía, y manchas de pigmento en la piel.

En otra realización, la enfermedad tratada con las composiciones proporcionadas en el presente documento es la esclerosis múltiple (MS). El transcurso de la enfermedad para la esclerosis múltiple es altamente variado, impredecible, y, en la mayoría de los pacientes, remitente. La evidencia patológica de la MS es una inflamación y desmielinización multifásica del SNC, multicéntrica. En particular al inicio de la enfermedad, los episodios pueden estar separados por meses o años de remisión. Aproximadamente un 70 % de los pacientes de tipo recidivanterecurrente (RR), que se caracteriza por exacerbaciones agudas con remisiones completas o parciales. El resto de los pacientes presentan MS progresiva crónica, que se subdivide adicionalmente en (a) progresiva primaria (PP), (b) progresiva recidivante (RP), que es un patrón que combina características de RR y RP y tiene una gravedad clínica intermedia, y (c) progresiva secundaria (SP), que tiene muchos pacientes con evolución de RR a lo largo del tiempo. En una realización preferente específica, la enfermera tratada con el presente procedimiento es la esclerosis múltiple recidivante-recurrente.

Algunos síntomas clínicos de la MS incluyen pérdida sensorial (parestesias), síntomas motores (calambres musculares después de espasticidad) y autonómicos (disfunción de vejiga, intestino, sexual) de la médula espinal; síntomas cerebelares (por ejemplo, tríada de Charcot de nistagmo, ataxia, temblor); fatiga y mareo; alteración en el procesamiento de la información en ensayos neuropsicológicos; síntomas oculares, que incluye diplopía en la visión lateral; neuralgia del trigémino; y neuritis óptica.

El autoantígeno más probable en la MS es una de varias proteínas de mielina (por ejemplo, proteína proteolipídica (PLP); glicoproteína oligodendrocítica de mielina (MOG); proteína básica de mielina (MBP); glicoproteína asociada con mielina (MAG), proteína básica oligodendrocítica asociada con mielina (MBOP); MBP modificada por citrulina (la isoforma C8 de MBP en la que se han desiminado 6 argininas en citrulina), fosfodiesterasa de nucleótido cíclico (CNPasa), alfa-B cristalina, etc.). La proteína de membrana integral, PLP, es un autoantígeno dominante de la mielina. Las células de la microglmía y los macrófagos funcionan de forma conjunta como células que presentan antígenos, dando como resultado la activación de citoquinas, complementos, ay otros gobernadores del proceso inflamatorio, dirigiéndose a células específicas de la oligodendroglía y su mielina de membrana. Un aumento cuantitativo de los linfocitos TH1 autorreactivos para mielina con la capacidad para secretar IFN-γ se asocia con la patogénesis de MS y EAE, lo que sugiere que los linfocitos T inductores/auxiliares autoinmunes en la sangre periférica de los pacientes con MS pueden iniciar y/o regular el procedimiento de desmielinización en pacientes con MS. Por otro lado, existe una bibliografía extendida sobre el papel protector de los linfocitos TH2 que producen citoquinas antiinflamatorias tales como IL-4 e IL-10. Se espera que el desplazamiento del equilibrio del tipo de linfocitos TH1 a TH2 sea beneficioso para la prevención y tratamiento de MS y EAE.

En otra realización, la enfermedad tratada con la invención que se proporciona en el presente documento es la Diabetes Mellitus Dependiente de Insulina. La diabetes mellitus humana de tipo I o dependiente de insulina (IDDM) se caracteriza por destrucción autoinmune de las células en los islotes de Langerhans pancreáticos. La supresión de linfocitos β da como resultado la incapacidad de regular los niveles de glucosa en la sangre. La diabetes manifiesta se produce cuando el nivel de glucosa en la sangre se eleva por encima de un nivel específico, normalmente de aproximadamente 250 mg/dl. En los seres humanos, un periodo presintomático largo precedía al inicio de la diabetes. Durante este periodo, se produce una pérdida gradual de la función de los linfocitos beta pancreáticos. El desarrollo de la enfermedad está implicado con la presencia de autoanticuerpos frente a insulina, ácido glutámico descarboxilasa, y la tirosina fosfatasa IA2 (IA2), cada uno de los cuales son un ejemplo de autoproteína, -polipéptido o -péptido de acuerdo con la presente invención. En la actualidad la IDDM humana se trata controlando los niveles de glucosa en sangre para guiar la inyección, o administración basada en bomba, de la insulina recombinante. Los regímenes de dieta y ejercicio contribuyen a conseguir un control adecuado de la glucosa en sangre.

Los marcadores que se pueden evaluar durante el estadio presintomático son la presencia de insulitis en el páncreas, el nivel y frecuencia de anticuerpos en células de los islotes, anticuerpos en la superficie de las células de los islotes, expresión anómala de las moléculas de MHC de Clase II en linfocitos beta pancreáticos, concentración de glucosa en la sangre, y la concentración de insulina en plasma. Un aumento del número de linfocitos T en el páncreas, anticuerpos en células de los islotes y glucosa en sangre es indicativo de la enfermedad, como es una disminución de la concentración de insulina.

La presencia de combinaciones de autoanticuerpos con diversas especificidades en el suero es altamente sensible y específica para la diabetes mellitus de tipo I humana. Por ejemplo, la presencia de autoanticuerpos frente a GAD y/o IA-2 es sensible en aproximadamente un 98 % y específica en un 99 % para la identificación de la diabetes mellitus de tipo I a partir del suero de control. En parientes de primer grado no diabéticos de pacientes con diabetes de tipo I, la presencia de autoanticuerpos específicos para dos de los tres autoantígenos que incluyen GAD, insulina e IA-2 expresa un valor predictivo positivo > 90 % para el desarrollo de DM de tipo I en 5 años.

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mientras que la dosificación semanal de Copaxone™ y la dosificación de Co-14, ya sea semanal o tres veces a la semana, no indujo una cantidad apreciable de anticuerpos frente a los respectivos copolímeros.

Cuando se midieron las concentraciones de anticuerpo para el péptido PLP (139-151), tanto Copaxone™ como Co14 (YFAK), independientemente del intervalo de dosificación, indujeron pequeños aumentos similares en las

5 cantidades de formación de IgG1 frente al péptido PLP (139-151) (Figura 7) en comparación con la dosificación de vehículo solo. Las concentraciones de IgG2b frente a PLP (139-151) tampoco se vieron afectadas significativamente (Figura 8). Estos resultados muestran que el efecto protector de Copaxone™ o Co-14 (YFAK) no se ejerce a través de la modulación de las cantidades de anticuerpo frente al péptido PLP (139-151).

Ejemplo 2. Respuesta de linfocitos T a copolímeros aleatorios

10 Los perfiles de TH1 y TH2 de ratones inyectados con 5 µg de Copaxone™ o Co-14 (YFAK) tres veces a la semana o en base semanal, hasta el día 22 de tratamiento. En los días 2, 8, 9, 15, 16, 22, 23, 29, se recogieron los bazos y se aislaron los esplenocitos. Se reestimularon 400.000 células por pocillo de esplenocitos con diversas concentraciones (0,8, 4 o 20 µg/ml) de Co-14 (YFAK) durante tres días. En el día 3 del cultivo celular, las células se transfirieron a placas de ELISPOT (ensayo de puntos por inmunoabsorción unida a enzimas), revestidas con IFN-γ (interferón

15 gamma) o IL-13 (interleuquina 13). La respuesta de linfocitos T se examina midiendo la producción de IFN-γ (una citoquina de TH1) y la producción de IL-13 (una citoquina de TH2). El grado de estimulación de linfocitos T también se examina midiendo la proliferación de las células mostrada como captación de timidina tritiada.

Se observó un estallido de respuesta en la primera semana de dosificación, seguido de una respuesta disminuida pero sostenida. Como se observa en la Figura 9, la respuesta está influenciada por TH2, con la producción de IL-13

20 inducida más fuertemente que la de IFN-γ en todos los casos en las células tratadas con Copaxone™ o Co-14 (YFAK). La influencia de TH2 se confirma además por la cantidad de 23 citoquinas y quimioquinas, como se observa en la Figura 10.

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