JP2003534291A - Ｐ−セレクチン活性の変調による止血障害の診断及び治療方法 - Google Patents

Ｐ−セレクチン活性の変調による止血障害の診断及び治療方法

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ダキン ダブリュ ハートウェル
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Abstract

(57)【要約】 本発明は止血の変調物質としてP-セレクチンを同定する。したがって、本発明は止血の変調物質としてのP-セレクチン活性の変調物質の同定方法及び使用方法に関連する。本発明は、出血性疾患及び血栓性障害をそれらに限定せずに含む止血障害の診断及び治療のための方法及び組成物にも関連する。本発明は各種の止血状態の診断評価及び予後の方法、及びこのような症状に対して素因を示す被験体の判定方法を説明する。さらに本発明は、止血または血管系障害の治療のための臨床評価を受けている患者の診断的監視の方法、及び臨床試験における化合物の有効性の監視方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 関連出願 本出願は２０００年５月１９日に出願した仮特許出願出願番号第６０／２０５
，７３４号、発明の名称「P−セレクチン活性の変調による止血障害の診断及び
治療方法」の優先権を主張するものである。上述の出願は引用をもって本願明細
書の記載に代える。
【０００２】 発明の背景 細胞が相互に接着する能力は発達、正常な生理学、及び疾患プロセスにおいて
重要な役割を担う。この能力は、細胞表面に発現する接着分子、一般に糖たんぱ
くが媒介する。重要な接着分子の種類には、インテグリン、セレクチン及び免疫
グロブリン（Ig）スーパーファミリが含まれる。セレクチンは、活性化した内皮
及び血小板と白血球との接着を媒介する際に、中心的な役割を果たす。
【０００３】 血液凝固は、炎症及び組織修復とともに宿主側の防御機序であり、これらの機
序は組織損傷後の血管系の統合性を維持するために並行して機能する。組織損傷
に応答して、血小板、内皮細胞及び白血球は、血小板血栓の形成、損傷組織への
白血球の沈着、炎症の開始、及び傷の治癒に不可欠である。
【０００４】 P-セレクチンはCD62、顆粒膜たんぱく-140（GMP-140）、及び血小板活性依存
性顆粒外膜たんぱく（PADGEM）としても知られ、血管内皮細胞及び血小板上に発
現する内因性膜糖たんぱくで、各種の循環細胞の認識にも関与している。P-セレ
クチン分子はN末端レクチンドメイン、上皮成長因子に相同性を有する領域、相
補性調節たんぱく質に相同性を有する領域、膜貫通領域、及び短い細胞質顆粒末
端を有する。P-セレクチンリガンドには、Lex糖質構造、シアル酸、及びPSGL-1
たんぱく（米国特許第5,843,707号）が含まれる。
【０００５】 P-セレクチンは、構成的に分泌顆粒（例えばa-顆粒及びワイベル-パラーデ小
体）中に貯蔵され、細胞活性など様々な刺激に応答して血小板及び内皮細胞の表
面に移動し、血小板-白血球及び内皮-白血球相互作用を媒介する。P-セレクチン
の細胞表面での発現は厳しく制御されており、P-セクレチンは血小板が活性化す
ると細胞表面から迅速に離脱し、血漿中の可溶性フラグメントとして現れる（Be
rger, G. et al. Blood (1998) 92:4446-4452）。可溶性P-セレクチンは、膜貫
通ドメインがない代替的にスプライスされたP-セレクチンのアイソフォームから
も生じることがある（Ishiwata, N. et al. J Biol Chem (1994) 269:23708）。
健康なヒトとマウスの血漿には、ELISAで検出されるとおり可溶性P-セレクチン
は少量しか含まれておらず、血漿P-セレクチン濃度の上昇は、血小板及び内皮細
胞の生体内における活性化及び／または損傷を示唆する可能性がある。
【０００６】 P-セレクチンは、炎症時の白血球ローリング及び浸出における役割に加えて、
トロンビン内での血小板-白血球接着を媒介し、単球上の組織因子の発現を増加
させることにより、白血球によるフィブリン沈着及び血栓形成を促進する（Pala
brica, T. et al. Nature (1992) 359:848-851; Celi, A. et al. Proc Natl Ac
ad Sci USA (1994) 91:8767-8771）。
【０００７】 発明の概要 本発明は、P-セレクチン活性の変調物質（例えばP-セレクチン活性誘導物質及
び阻害物質）を用いた止血及び血栓形成プロセスの制御方法及びそのための組成
物、並びに止血障害の診断及び治療方法及びそのための組成物を提供する。
【０００８】 ある態様では、本発明は被験体において止血を誘導する方法で、P-セレクチン
活性の誘導物質を該被験体に投与するステップからなる方法を提供する。ある実
施態様では、P-セレクチン活性の誘導物質は、被験体における循環可溶性P-セレ
クチン値を上昇させる。P-セレクチン活性の誘導物質は、P-セレクチンの細胞表
面からのたんぱく分解解離を増加させることにより、またはP-セレクチン遺伝子
発現を増加させることにより可溶性P-セレクチンポリペプチド値を上昇させると
考えられる。別の実施態様では、P-セレクチン活性の誘導物質はP-セレクチンリ
ガンドまたはレセプタ（例えばPSGL-1)に結合して、例えば可溶性P-セレクチン
ポリペプチドなどのP-セレクチンポリペプチドの活性を模倣する。
【０００９】 ある例示的な実施態様では、本発明は被験体において止血を誘導する方法で、
可溶性P-セレクチンポリペプチドを該被験体に投与するステップを含む方法を提
供する。別の実施態様では、可溶性P-セレクチンポリペプチドをコードするヌク
レオチド配列を含む単離された核酸分子を被験体に投与し、止血を誘導する。さ
らなる実施態様では、可溶性P-セレクチンポリペプチドを発現する組換え細胞を
投与して、被験体に止血を誘導する。
【００１０】 別の態様では、本発明は、被験体において出血障害などの凝血機能低下に関連
する疾患を治療または予防する方法で、P-セレクチン活性の誘導物質を該被験体
に投与するステップを含む方法を提供する。ある実施態様では、可溶性P-セレク
チンポリペプチドを被験体に投与し、凝血機能低下に関連する疾患を治療または
予防する。
【００１１】 さらなる態様では、本発明は、被験体において血管系関連疾患を治療する方法
で、P-セレクチン活性の誘導物質を該被験体に投与するステップを含む方法を提
供する。ある好ましい実施態様では、可溶性P-セレクチンポリペプチドを被験体
に投与し、血管系関連疾患を治療または予防する。ある実施態様では、血管系関
連疾患は腫瘍である。別の実施態様では、腫瘍に関連する血管系においてプロコ
アギュラント状態を誘導するのに効果的な分子、例えば腫瘍細胞のある成分また
は凝固因子に機能的に連結している腫瘍関連血管系に結合する第一の結合領域、
または凝固因子に結合する第二の結合領域からなる分子などを、該被験体にさら
に投与する。
【００１２】 本発明の別の態様は、被験体において止血を低減する方法で、P-セレクチン活
性の阻害物質を該被験体に投与するステップからなる方法を提供する。ある実施
態様では、P-セレクチン活性の阻害物質は、被験体の血漿中の可溶性P-セレクチ
ン値を低減する。P-セレクチン活性の阻害物質は、P-セレクチンの細胞表面から
のたんぱく分解解離を低減することにより、またはP-セレクチン遺伝子発現を低
減することにより、可溶性P-セレクチンポリペプチド値を低減すると考えられる
。別の実施態様では、P-セレクチン活性の阻害物質は抗P-セレクチン抗体である
。さらに別の実施態様では、P-セレクチン活性の阻害物質は組換え可溶性PSGL-1
ポリペプチドである。さらなる実施態様では、本発明は被験体における止血を低
減させる方法で、例えば可溶性P-セレクチンポリペプチドなどのP-セレクチンポ
リペプチドをコードするヌクレオチド配列に対してアンチセンスのヌクレオチド
配列からなる単離核酸分子を投与するステップを含む方法を提供する。
【００１３】 別の態様では、本発明は被験体における血栓性疾患を治療または予防する方法
で、P-セレクチン活性の阻害物質を該被験体に投与するステップからなる方法を
提供する。本発明の方法を用いて治療または予防が可能であると考えられる血栓
性疾患には、動脈硬化、深部静脈血栓症、不安定狭心症などの狭心症、及び医療
介入後の再狭窄などが含まれる。
【００１４】 さらなる態様では、本発明は被験体における止血ポテンシャルの変調方法で、
該被験体におけるP-セレクチン活性を変調するステップからなる方法を提供する
。ある実施態様では、P-セレクチン活性の変調物質（誘導物質または阻害物質）
を被験体に投与して、止血ポテンシャルを変調する。可溶性P-セレクチン活性の
変調物質は、該被験体の血漿中の可溶性P-セレクチン値を調節することによって
作用すると考えられる。
【００１５】 本発明の別の態様では、被験体におけるプロコアギュラント状態を診断する方
法で、該被験体の生物学的サンプル中の高レベルのP-セレクチン活性を判定する
ステップからなる方法を提供する。ある実施態様では、被験体から採取した血液
または血漿の検査用サンプル中の可溶性P-セレクチン値を、止血活性が正常な被
験体から採取した対照血液または血漿サンプル中の可溶性P-セレクチン値を比較
し、対照サンプルと比較して検査用サンプル中の可溶性P-セレクチン値が高けれ
ば、該被験体がプロコアグラント状態であることを示唆している。
【００１６】 別の態様では、本発明は血栓性疾患を罹患する、または止血性疾患を発症する
リスクがある被験体を判定する方法で、該被験体の生物学的サンプル中のP-セレ
クチン活性が高いことを判定するステップからなる方法を提供する。ある実施態
様では、被験体から採取した血液または血漿サンプルをP-セレクチン結合物質と
接触させ、該サンプル中の可溶性P-セレクチンポリペプチドが高レベルであるこ
とを検出した場合、被験体が止血性疾患を罹患している、または止血性疾患を発
症するリスクがあると判定する。
【００１７】 本発明の別の態様では、止血を変調することができる化合物を判定する方法で
、検査用化合物がP-セレクチン活性を変調する能力があるかどうかを検定するス
テップからなる方法を提供する。ある実施態様では、P-セレクチン活性は可溶性
P-セレクチンの発現である。
【００１８】 さらなる態様では、本発明は、P-セレクチン活性の変調物質を１種類以上含む
、止血を変調する化合物を提供する。
【００１９】 本発明のこのほかの特徴及び特長は、後述の発明の詳細な説明及び前述の特許
請求の範囲で明らかになるであろう。
【００２０】 発明の詳細な説明 本発明は止血を調節するための治療剤及び診断剤としてのP-セレクチン活性の
変調物質（例えば誘導物質、阻害物質）を提供する。本発明は、可溶性P-セレク
チンが例えばマウスまたはヒトなどの哺乳動物においてプロコアギュラント状態
を誘導する（例えば血中の組織因子を含有するマイクロ粒子の数の増加、出血時
間の減少、及び／または凝固時間の減少による）という発見に基づく。
【００２１】 ここで用いられる「P-セレクチン活性の変調物質」という用語には、ここに記
載のとおり、１種類以上のP-セレクチン活性を変調または調節可能な化合物また
は作用物質が含まれる。好ましい実施態様では、P-セレクチン活性の変調物質は
可溶性P-セレクチンの発現を変調する。P-セレクチン活性の変調物質は、P-セレ
クチン活性の誘導物質、またはP-セレクチン活性の阻害物質であってよい。ここ
で用いられる「P-セレクチン活性の誘導物質」は、P-セレクチン活性を刺激、促
進及び／または模倣する。ここで用いられる「P-セレクチン活性の阻害物質」は
、P-セレクチン活性を低減、阻害、または拮抗する。
【００２２】 ここで区別なく用いられる「P-セレクチン活性」、「P-セレクチンの生物学的
活性」、または「P-セレクチンの機能的活性」とは、P-セレクチン感受性細胞（
例えば造血細胞または白血球）もしくは組織上、またはP-セレクチンリガンドも
しくはレセプタ上のP-セレクチンポリペプチドまたは核酸分子によって作動する
、標準技術に従ってインビトロまたはインビボで決定される活性である。例示的
な実施態様では、P-セレクチン活性は止血を変調する能力である。ある実施態様
ではP-セレクチン活性はプロコアギュラント活性である。別の実施態様では、P-
セレクチン活性は、組織因子を含有するマイクロ粒子の数を増加させる能力のこ
とである。さらに別の実施態様では、P-セレクチン活性は、PSGL-1などのP-セレ
クチンリガンドに結合する能力である。
【００２３】 従って、本発明は、被験体における止血を、少なくとも部分的に該被験体のP-
セレクチン活性を上昇または低下させることによって（例えば循環可溶性P-セレ
クチン値を上昇または低下させることによって）調節する方法を提供する。ここ
で区別なく用いられる「止血」、「止血活性」または「止血ポテンシャル」とい
う用語は、血管収縮及び凝血の生理学的特性を含む出血の制御を意味する。血液
凝固は、損傷、炎症、疾患、先天性欠損、障害、またはその他の破壊の後に、哺
乳動物の循環の完全性の維持を支援する。凝固が開始すると、ある血漿前酵素が
連続的に活性化されて酵素の形態になることで血液凝固が進行する（例えばCole
man, R.W. et al. (eds.) Hemostasis and Thrombosis, Second Edition, (1987
)参照）。第XII因子、第XI因子、第IX因子、第X因子、第VII因子及びプロトロン
ビン等を含むこれら血漿糖たんぱくは、セリンプロテアーゼの酵素原である。こ
れら血液凝固酵素のほとんどが、膜表面上で第VIII因子及び第V因子などのたん
ぱく補助因子と複合体を形成した場合のみ、生理学的スケールで作用する。この
ほかの血液因子は凝固形成を変調及び局在化したり、または血液凝塊を溶解する
。活性化たんぱく質Cはプロコアギュラント成分を不活化する特定の酵素である
。カルシウムイオンが成分反応の多くに関与している。血液凝固は、たんぱく質
成分すべてが血中に存在する内因性経路、または細胞-膜たんぱく組織因子が重
要な役割を担う外因性経路の後に生じる。血栓形成はフィブリノーゲンがトロン
ビンによって切断されてフィブリンになる際に起こる。血栓は活性化血小板とフ
ィブリンからなる。
【００２４】 ここで用いられる「プロコアギュラント状態」という用語には、血液凝固、止
血及び／または血栓形成に寄与する、及び／または促進する生理学的症状が含ま
れる。例えば適切な生理学的状況下における血液凝固のポテンシャルなどの止血
ポテンシャル、または止血活性は、プロトロンビン時間（PT）、活性化部分トロ
ンボプラスチン時間（APTT）、出血時間、及びトロンビン時間を含む十分に確立
された検査方法を用いて評価することができる。ここで区別なく用いられる「止
血を変調する、または止血の変調」及び「止血を調節する、または止血の調節」
には、止血の誘導（例えば刺激、増加）、及び止血の阻害（例えば低減、または
減少）が含まれる。
【００２５】 本発明のある態様では、P-セレクチン活性の誘導物質を投与することによって
、被験体において止血を誘導する。ある例示的な実施例では、P-セレクチン活性
の誘導物質は、可溶性P-セレクチンポリペプチドの血漿濃度を上昇させる。この
場合、P-セレクチン活性の誘導物質はP-セレクチンの細胞貯蔵プールから細胞表
面への移動を刺激するか、またはP-セレクチンを発現する細胞（例えば内皮細胞
または血小板）の表面からの可溶性P-セレクチンのたんぱく分解解離及び放出を
増加するように作用すると考えられる。別の実施態様では、P-セレクチン活性の
誘導物質は遺伝子転写または翻訳によって刺激されP-セレクチン遺伝子の発現を
増加させる。好ましい実施態様では、P-セレクチン活性の誘導物質は、膜貫通ド
メインのない可溶性P-セレクチンポリペプチドをコードするP-セレクチン遺伝子
の代替的にスプライスされたアイソフォームの発現を刺激するのが好ましいだろ
う。さらに別の実施態様では、P-セレクチン活性の誘導物質は、P-セレクチンリ
ガンドまたはレセプタ（例えばPSGL-1）に結合し、P-セレクチン感受性細胞上の
P-セレクチンポリペプチドの活性を模倣する。従って、P-セレクチン活性の誘導
物質は、例えば組織因子を含有するマイクロ粒子の放出など、P-セレクチンの生
物学的応答を誘発することができる。従って、ある実施態様では、P-セレクチン
活性の誘導物質は、例えば抗PSGL-1抗体などの抗体である。
【００２６】 本発明の別の実施態様では、可溶性P-セレクチンポリペプチドを被験体に投与
して、止血を誘導する。ここで用いられる「可溶性P-セレクチンポリペプチド」
には、P-セレクチンたんぱくの細胞外ドメインまたはその断片に相当するアミノ
酸配列を含むP-セレクチンポリペプチドが含まれる。P-セレクチンたんぱくの核
酸及びアミノ酸配列はすでに記述されている（例えばSanders, W.E. et al. (19
92) Blood 80:795-800; 及び ジェンバンク受入番号 NM_003005 及び M25322 (
ヒト); ジェンバンク受入番号NM_013114及び L23088 (ラット); ジェンバンク受
入番号NM_011347 及びM87861 (マウス); 及びジェンバンク受入番号 L12041 (ウ
シ)）。別の実施態様では、可溶性P-セレクチンポリペプチドは、少なくともレ
クチンドメイン、EGF様反復、及び２つ以上のP-セレクチンたんぱくの補体結合
ドメインからなる。さらに別の実施態様では、可溶性P-セレクチンポリペプチド
は例えばPSGL-1などのP-セレクチンリガンドに結合する。好ましい実施態様では
、本発明の可溶性P-セレクチンポリペプチドは可溶性P-セレクチン融合たんぱく
である。ある実施態様では、P-セレクチン融合たんぱくは、シグナル配列、レク
チンドメイン、EGF様反復、及び例えばヒトIgG1などの免疫グロブリンのFc領域
（ヒンジ、C1及びC2）に機能的に連結したP-セレクチンたんぱくの補体結合ドメ
イン２つ以上からなる、P-セレクチンIg融合たんぱくである。
【００２７】 本発明のさらなる実施態様では、可溶性P-セレクチンポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列からなる単離核酸分子を投与して、被験体において止血を誘
導する。さらに別の実施態様では、可溶性P-セレクチンポリペプチドを発現する
組換え細胞を被験体に投与し、止血を誘導する。
【００２８】 本発明の別の実施態様では、凝血機能低下を伴う疾患に罹患しているまたは発
症するリスクのある被験体など、止血機能が不十分な被験体において止血を誘導
する方法を提供する。ここで用いられる「凝血機能低下」という用語は、凝血塊
を形成する能力が低下、または不能であることを意味する。このような疾患には
、例えば血友病（血友病ＡまたはＢ）などの出血性疾患、及び例えばフォンウィ
ルブランド病を引き起こすフォンウィルブランド因子欠乏などの凝固因子または
血小板リガンドの欠乏が原因である疾患が含まれる。プロコアギュラント状態の
誘導は、自発的な出血を予防または停止させ、外科的介入前や損傷治癒の促進に
も有益であろう。
【００２９】 本発明の方法は、血管系関連疾患の治療にも有用である。ここで用いられる「
血管系関連疾患」とは、血管による血液の供給に依存する病理学を有する疾患で
ある。したがって、充実性腫瘍の腫瘍内血管など疾患部位の血管系における凝血
の実現は有益であることが証明されるであろうことを意図する。このような血管
系関連疾患には、BPH、糖尿病性網膜症、血管再狭窄、動静脈瘻（AVM）、髄膜腫
、血管腫、血管新生緑内障、及び乾癬などの良性及び悪性腫瘍または成長が含ま
れる。また、このグループの疾患には、滑膜炎、皮膚炎、子宮内膜症、血管線維
腫、リウマチ様関節炎、アテローム斑、角膜移植血管新生、血友病性関節、過形
成性瘢痕、オスラー-ウェーバー症候群、血管拡張性肉芽腫水晶体後方線維増殖
症、強皮症、トラコーマ、及び血管癒着が含まれる。
【００３０】 ある実施態様では、腫瘍を壊死させるために、可溶性P-セレクチンなどのP-セ
レクチン活性の阻害物質を、腫瘍血管の血栓を誘導するためにデザインされた治
療法に加えて投与する。このような治療法には、例えば米国特許第5,877,289号
に記載のように、凝固因子の標的を腫瘍血管系とする戦略を用いる。腫瘍血管ま
たは間質のマーカーを、抗体などの結合リガンドを用いて特異的に誘導してから
標的としてもよい。例示的な誘導可能な抗原には、E-セレクチン、P-セレクチン
、MHCクラスII抗原、VCAM-1、ICAM-1、エンドグリン、LAM-1に感受性のあるリガ
ンド、血管アドレシン、及びその他の接着分子が含まれる。
【００３１】 さらに、本発明はP-セレクチン活性の阻害物質を投与して被験体における止血
を減少させる方法を提供する。血管の開通性が重要な状況下では、例えば血栓形
成などの止血の阻害が望ましい。
【００３２】 例示的な実施態様では、P-セレクチン活性の阻害物質は被験体における循環し
ている可溶性P-セレクチン値を減少させる。P-セレクチン活性の阻害物質は、P-
セレクチンの細胞貯蔵プールから細胞表面への移動を減少させるか、または内皮
細胞または血小板などのP-セレクチン発現細胞の表面からの可溶性P-セレクチン
のたんぱく分解解離もしくは放出を減少させるように作用する。別の実施例では
、P-セレクチン活性の阻害物質は、P-セレクチン遺伝子発現を、遺伝子転写また
は翻訳のいずれかを低減することにより減少させる。好ましい実施例では、P-セ
レクチン活性の阻害物質は、膜貫通ドメインのない可溶性P-セレクチンポリペプ
チドをコードするP-セレクチン遺伝子の代替的にスプライスされたアイソフォー
ムの発現を減少させるのが好ましいだろう。さらに別の実施態様では、P-セレク
チン活性の阻害物質はアンタゴニストとしても作用し、P-セレクチンリガンドま
たはレセプタ（例えばPSGL-1）に結合して、P-セレクチン感受性細胞上のP-セレ
クチンポリペプチドの活性を阻害する。本発明のある実施態様では、P-セレクチ
ン活性の阻害物質は抗P-セレクチン抗体である。別の実施態様では、P-セレクチ
ン活性の阻害物質は、可溶性PSGL-1ポリペプチドである。PSGL-1核酸、ポリペプ
チド、及びそれらの可溶性形態は、米国特許第5,843,707号に開示されている。
【００３３】 また、本発明は、P-セレクチンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に
対してアンチセンス、例えば相補的であるヌクレオチド配列からなる単離核酸分
子を投与することによって、被験体における止血を減少させる方法を提供する。
【００３４】 従って、本発明の方法は血栓性疾患の治療及び予防に有用である。ここで用い
られる「血栓性疾患」という用語には、過剰または不必要な凝固または止血作用
、または凝固作用亢進状態を特徴とする疾患または症状全般が含まれる。血栓性
疾患には、血小板接着及び血栓形成が関与する疾患が含まれ、例えば血栓数の高
値、若年齢での血栓症、血栓症になりやすい家族的傾向、異常部位にみられる血
栓症など、高い血栓形成傾向として顕在化する可能性がある。血栓性疾患の例に
は、血栓塞栓症、深部静脈血栓症、肺塞栓症、脳卒中、心筋梗塞、流産、栓友病
関連抗トロンビンIII欠乏症、たんぱく質C欠乏症、たんぱく質S欠乏症、活性た
んぱく質C耐性、異常フィブリノゲン血症、フィブリン溶解障害、ホモシスチン
尿症、妊娠、炎症性疾患、骨髄増殖性疾患、動脈硬化、不安定狭心症などの狭心
症、汎発性血管内凝固、血栓性血小板減少性紫斑病、癌転移、鎌状赤血球症、及
び糸球体腎炎が、それらに限定されずに含まれる。さらに、可溶性P-セレクチン
発現または活性の阻害物質を投与して、血栓性イベントを予防し、または治療と
しての血栓溶解もしくは血管形成術または外科手術などの処置の間、またはその
後の再閉塞を予防する。
【００３５】 さらに、例えば血液などの生物学的サンプル中のP-セレクチン値を測定すると
、例えば血栓性または凝固イベントの尤度など、プロコアギュラント状態の診断
知見を得ることができる。したがって、ある実施態様では、本発明は、臨床的に
確立された止血活性の正常値を有する人の血中可溶性P-セレクチン値と比較して
、高レベルの循環可溶性P-セレクチンを検出することによって、被験体における
プロコアギュラント状態を診断する方法を提供する。別の実施態様では、本発明
は、高レベルのP-セレクチン活性（例えば高レベルの循環可溶性P-セレクチンな
ど）を検出することによって血栓性疾患を罹患する、または血栓性疾患を発症す
るリスクがある被験体を判定する方法を提供する。
【００３６】 ここで用いられる「止血性障害」には、異常なまたは不必要な止血活性を特徴
とする障害または症状が含まれる。止血性障害は、例えば血栓性障害などの過度
の凝固活性が原因であると考えられ、または例えば出血性障害などの不十分な凝
固活性が原因であると考えられる。
【００３７】 さらに、本発明の別の態様は、例えば可溶性P-セレクチンの発現などの、P-セ
レクチン活性を変調する化合物の能力を検定することにより、止血を変調するこ
とができる化合物を判定する方法を提供する。
【００３８】 本発明の様々な態様は、以下のサブセクションでさらに詳細に説明する。
【００３９】 I. 単離P-セレクチンたんぱく及び抗P-セレクチン抗体 本発明の方法には、単離P-セレクチンポリペプチド及び生物学的に活性なその
部分の使用が含まれる。ここで用いられる「P-セレクチンたんぱく」または「P-
セレクチンポリペプチド」には、可溶性P-セレクチンポリペプチド及び可溶性P-
セレクチン融合たんぱくが含まれる。
【００４０】 ヒトP-セレクチンのゲノム構成及びコード配列はすでに決定されており、cDNA
がクローニングされて配列決定されている（例えばジェンバンク受入番号NM_003
005 及び M25322）。さらに、ラット(ジェンバンク受入番号 NM_013114 及び L2
3088)、マウス (ジェンバンク受入番号 NM_011347 及びM87861)、及びウシ(ジェ
ンバンク受入番号 L12041)P-セレクチンをコードする配列が開示されている。さ
らに、ヒトとマウスのP-sレクチンのアミノ酸配列及び構造ドメインの比較がSan
ders, WE et al. (1992) Blood 80:795-800に開示されている。
【００４１】 本発明の方法における単離された可溶性P-セレクチンたんぱくは、野生種P-セ
レクチンたんぱくのアミノ酸配列と十分に同一であるアミノ酸配列を有すること
が好ましい。ここで用いられる「十分に同一」という用語は、P-セレクチンアミ
ノ酸（またはヌクレオチド）配列に同一であるか同等のアミノ酸残基（またはヌ
クレオチド）を十分なまたは最小の数だけ有し、そのためポリペプチドが野生種
P-セレクチンたんぱくと共通の構造ドメインまたはモチーフ及び／または機能的
活性を共有する、アミノ酸（またはヌクレオチド）配列のことをいう。例えば、
共通の構造ドメインのアミノ酸配列のうち少なくとも30%、40%、または50%の同
一性を有し、好ましくは60%の同一性を有し、さらに好ましくは70乃至80%の同一
性を有し、よりさらに好ましくは90乃至95%の同一性を有し、少なくとも１つ以
上、さらに好ましくは２つ以上の構造ドメインまたはモチーフを有する共通の構
造ドメインを共有するアミノ酸またはヌクレオチド配列を、ここでは十分に同一
であると定義する。例えば、可溶性P-セレクチンポリペプチドは、後述のドメイ
ンのうち少なくとも１つ以上から構成されていてよく、そのドメインとは、シグ
ナルペプチド、レクチンドメイン、EGF様反復、補体結合ドメイン、及び細胞質
ドメインである。さらに、少なくとも30%、40%、または50%、好ましくは60%、さ
らに好ましくは70%乃至80%、または90%乃至95%の同一性を共有し、共通の機能的
活性（例えばここに記載した可溶性P-セレクチン活性）を共有するアミノ酸また
はヌクレオチド配列は、ここでは十分に同一であると定義する。P-セレクチンポ
リペプチドは、自然の対立遺伝子の変異または突然変異のため、ここで開示され
たP-セレクチンポリペプチドとはアミノ酸配列が異なってもよい。したがって、
P-セレクチン活性を有する単離された可溶性P-セレクチンポリペプチドを本発明
の方法に使用することもできる。
【００４２】 ２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性の割合を決定するために、
最適比較の目的でその配列をアラインさせた（例えば、最適アラインメントのた
めに第一及び第二のアミノ酸または核酸配列の一つまたは両方にギャップを挿入
してよく、比較の目的のために同一でない配列を無視してよい）。好ましい実施
態様では、比較の目的のためにアラインさせた参照配列の長さは、参照配列の長
さの少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%、さらに好ましくは少なくとも50
%、よりさらに好ましくは少なくとも60%、よりさらに好ましくは70%、80%、また
は90%である。次に、相当するアミノ酸位またはヌクレオチド位のアミノ酸残基
またはヌクレオチドを比較する。第一の配列中のある位置が、第二の配列中の相
当する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合、そ
の位置においてこの分子は同一である（ここで用いられるアミノ酸または核酸「
同一性」は、アミノ酸または核酸「相同性」と等価である）。二つの配列間の同
一性の割合は、二つの配列の最適アラインメントのために導入する必要のあるギ
ャップの数及び各ギャップの長さを考慮して、その配列によって共有されている
同一位置の数の関数である。
【００４３】 配列の比較及び二つの配列間の同一性の割合の決定は、数学的アルゴリズムを
用いて行うことができる。好ましい実施態様では、二つのアミノ酸配列の間の同
一性の割合は、GCGソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）
のGAPプログラムに組み込まれているNeedleman and Wunsch（J. Mol. Biol. (48
):444-453 (1970)）アルゴリズムを用い、ブロッサム（Blossom）62マトリクス
またはPAM250マトリクス、及びギャップ重量16、14、12、10、8、6または4及び
長さ重量1、2、3、4、5、または6を用いて求めた。さらに別の好ましい実施例で
は、二つのヌクレオチド配列間の同一性の割合は、GCGソフトウェアパッケージ
（http://www.gcg.comで入手可能）のGAPプログラムを用い、NWSgapdna.CMPマト
リクス及びギャップ重量40、50、60、70または80、及び長さ重量1、2、3、4、5
または6を用いて求める。別の実施態様では、２つのアミノ酸またはヌクレオチ
ド配列間の同一性の割合は、ALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み込まれて
いるE. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) のア
ルゴリズムを用い、PAM120重量残基表、ギャップ長ペナルティ12、及びギャップ
ペナルティ4を用いて求めた。
【００４４】 ここで用いられるP-セレクチンポリペプチド（例えば可溶性P-セレクチンポリ
ペプチド）の「生物学的活性部分」には、P-セレクチンポリペプチド活性を有す
るP-セレクチンポリペプチドの断片が含まれる。一般に、P-セレクチンポリペプ
チドの生物学的活性部分は、例えば止血活性を変調するP-セレクチンポリペプチ
ドの少なくとも一つの活性を有する少なくとも一つのドメインまたはモチーフか
らなる。P-セレクチンポリペプチドの生物学的活性部分には、P-セレクチンたん
ぱくのアミノ酸配列と十分に同一であるまたはそれに由来し、完全長P-セレクチ
ンポリペプチドよりも少ないアミノ酸を含み、可溶性P-セレクチンポリペプチド
の少なくとも一つの活性を示す、アミノ酸配列からなるポリペプチドが含まれる
。P-セレクチンポリペプチドの生物学的活性部分は、例えば止血活性などのP-セ
レクチンポリペプチド活性を変調する薬剤を開発するための標的として用いるこ
とができる。P-セレクチンポリペプチドの生物学的活性部分は、組換え技術によ
って調製され、P-セレクチンポリペプチドの１つ以上の機能的活性を評価するこ
とができるポリペプチドからなる。
【００４５】 ある実施態様では、P-セレクチンポリペプチドは標準たんぱく精製技術を用い
て、適切な精製スキームによって細胞または組織ソースから単離することができ
る。例えば、可溶性P-セレクチンポリペプチドは、P-セレクチンを細胞表面から
切り離すために誘導された、例えば活性化内皮細胞などの細胞の培養培地から単
離することができる。別の実施態様では、P-セレクチンポリペプチドを、組換え
DNA技術によって生成する。例えば、可溶性P-セレクチンポリペプチドは、P-セ
レクチンの可溶性アイソフォーム（例えば膜貫通ドメインのないP-セレクチンの
アイソフォーム）または可溶性P-セレクチン融合たんぱくをコードするポリヌク
レオチド配列をトランスフェクトした宿主細胞から単離することができる。組換
え発現の代わりに、標準ペプチド合成技術を用いて、可溶性P-セレクチンポリペ
プチドを化学的に合成することもできる。
【００４６】 「単離」または「精製」ポリペプチドまたはたんぱく、または生物学的に活性
なその部分には、P-セレクチンポリペプチドが由来する細胞または組織ソースか
らの細胞物質またはその他の汚染たんぱく質を実質的には含まず、または化学的
に合成された場合には化学前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まない。
「細胞物質を実質的に含まない」という文言には、単離されてまたは組換えで生
成されて得られた細胞の細胞成分からたんぱく質を分離する、P-セレクチンポリ
ペプチドの調製が含まれる。ある実施態様では、「細胞物質を実質的には含まな
い」という文言には、約30%未満（乾燥重量で）の非P-セレクチンたんぱく（こ
こでは「汚染たんぱく質」とも言う）を有するP-セレクチンたんぱく、さらに好
ましくは約20%未満の非P-セレクチンたんぱくを有するP-セレクチンたんぱく、
よりさらに好ましくは約10%未満の非P-セレクチンたんぱくを有するP-セレクチ
ンたんぱく、最も好ましくは約5%未満の非P-セレクチンたんぱくを有するP-セレ
クチンたんぱくの調製が含まれる。P-セレクチンポリペプチドまたは生物学的に
活性なその部分を組換え技術によって生成した場合も、培養培地を実質的には含
まないことが好ましく、すなわち培養培地はたんぱく調製物の体積の約20%未満
、さらに好ましくは約10%未満、最も好ましくは約5%未満である。
【００４７】 「化学前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まない」という文言には、
該たんぱく質をたんぱく質の合成に関与する化学前駆体またはその他の化学物質
から分離する、P-セレクチンポリペプチドの調製が含まれる。ある実施態様では
、「化学前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まない」という文言には、
約30%未満（乾燥重量）の化学前駆体または非P-セレクチン化学物質を有するP-
セレクチンポリペプチド、さらに好ましくは約20%未満の化学前駆体または非P-
セレクチン化学物質を有するP-セレクチンポリペプチド、よりさらに好ましくは
約10%未満の化学前駆体または非P-セレクチン化学物質を有するP-セレクチンポ
リペプチド、最も好ましくは約5%未満の化学前駆体または非P-セレクチン化学物
質を有するP-セレクチンポリペプチドの調製が含まれる。
【００４８】 本発明の方法は、キメラまたは融合たんぱくである可溶性P-セレクチンポリペ
プチドも利用してよい。ここで用いられる、可溶性P-セレクチン「キメラたんぱ
く」または「融合たんぱく」は、非可溶性P-セレクチンポリペプチドに機能的に
連結する可溶性P-セレクチンポリペプチドからなる。「可溶性P-セレクチンポリ
ペプチド」は、P-セレクチンたんぱくの細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列
からなるセレクチンポリペプチド、または生物学的に活性なその部分を含み、「
非可溶性P-セレクチンポリペプチド」は、例えば可溶性P-セレクチンポリペプチ
ドとは異なる、同一のまたは異なる生物に由来するたんぱく質などのP-セレクチ
ンポリペプチドとは実質的に相同ではないたんぱく質に相当するアミノ酸配列を
有するポリペプチドのことをいう。可溶性P-セレクチン融合たんぱくの中には、
可溶性P-セレクチンポリペプチドにはP-セレクチンたんぱくの細胞外ドメインの
全体またはその部分が含まれてもよい。好ましい実施態様では、可溶性P-セレク
チン融合たんぱくは、少なくともシグナル配列、レクチンドメイン、EGF様反復
、及びP-セレクチンたんぱくの少なくとも２つの補体結合ドメインからなる。融
合たんぱくに関連して、「機能的に結合した」という文言は、可溶性P-セレクチ
ンポリペプチド及び非可溶性P-セレクチンポリペプチドが相互にインフレームで
融合することを示唆することを意図する。非可溶性P-セレクチンポリペプチドは
、可溶性P-セレクチンポリペプチドのN末端またはC末端に融合することができる
。
【００４９】 例えば、好ましい実施態様では、融合たんぱくは、免疫グロブリン（例えばヒ
トIgG1）のヒンジ、C1及びC2配列などのFc領域が可溶性P-セレクチン配列のC末
端に融合している、可溶性P-セレクチン-免疫グロブリン融合たんぱくである。
セレクチン免疫グロブリンキメラは、基本的にはWO91/08298に記載のように構築
することができる。このような融合たんぱくは、組換え可溶性P-セレクチンポリ
ペプチドの精製を促進することができる。別の実施態様では、融合たんぱくは、
N末端に異種シグナル配列を含む可溶性P-セレクチンポリペプチドである。特定
の宿主細胞（例えば哺乳類の宿主細胞など）では、可溶性P-セレクチンの発現及
び／または分泌は、異種シグナル配列を用いて増加させることができる。
【００５０】 本発明の可溶性P-セレクチンポリペプチドおよび融合たんぱくは、薬学的組成
物に混合して被験体にインビボで投与することができる。ある例示的な実施態様
では、可溶性P-セレクチンポリペプチドまたは融合たんぱくは、被験体の止血を
変調する（例えばプロコアギュラント状態を誘導する）ために用いてよい。別の
実施態様では、可溶性P-セレクチンポリペプチドまたは融合たんぱくは、例えば
出血性障害のような止血障害の治療に用いてもよい。別の実施多様では、可溶性
P-セレクチンポリペプチドまたは融合たんぱくは、血管系関連疾患の治療に用い
てもよい。可溶性P-セレクチンポリペプチド及び融合たんぱくを使用すると、例
えば（i）P-セレクチンたんぱくをコードする遺伝子の変調の異常または突然変
異、（ii）P-セレクチン遺伝子の誤調節、及び（iii）P-セレクチンたんぱくの
翻訳後変調の異常、が原因の障害の治療にも有用であると考えられる。さらに、
可溶性P-セレクチンポリペプチド及び融合たんぱくは、例えばPSGL-1などのP-セ
レクチンリガンドのバイオアベイラビリティに作用するように用いることができ
る。
【００５１】 さらに、本発明の可溶性P-セレクチンポリペプチド及び融合たんぱくは、免疫
原として、被験体における抗P-セレクチン抗体の産生と、P-セレクチンリガンド
の精製と、P-セレクチン活性を変調し及び／またはP-セレクチンポリペプチドと
P-セレクチンリガンドまたはレセプタとの相互作用を変調する分子を同定するス
クリーニングアッセイとに使用することができる。
【００５２】 好ましくは、本発明の可溶性P-セレクチン融合たんぱくは、標準組換えDNA技
術によって生成する。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするDNA断片を
、例えば、ライゲーションのための平滑末端またはスタガー末端、適切な末端を
提供するための制限酵素消化、適切な粘着性末端の平滑化、不必要な結合を避け
るためのアルカリホスファターゼ処理、及び酵素ライゲーションを用いて、従来
技術に従って、インフレームでライゲートする。別の実施態様では、融合遺伝子
は、自動DNA合成装置を含む従来技術によって合成することができる。また、遺
伝子断片のPCR増幅を行い、アンカープライマで２つの連続する遺伝子断片の間
に相補的な突出部分を生じさせ、それらをアニーリングし再増幅させてキメラ遺
伝子配列を生成することができる（例えばCurrent Protocols in Molecular Bio
logy, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992を参照）。さらに、すで
に融合部分がコードされた発現ベクターが数多く市販されている（例えばGSTポ
リペプチドなど）。可溶性P-セレクチンをコードした核酸をこのような発現ベク
ターにクローニングすれば、融合部分を可溶性P-セレクチンポリペプチドにイン
フレームで連結させることができる。
【００５３】 本発明の方法には、P-セレクチンアゴニスト（模倣物質）またはP-セレクチン
アンタゴニストのいずれかとして機能するP-セレクチンポリペプチドの変種の使
用も含まれる。P-セレクチンポリペプチドの変種は、例えば分散点変異またはP-
セレクチンたんぱくの剪断などの突然変異変性によって生成することができる。
P-セレクチンポリペプチドのアゴニストは、P-セレクチンポリペプチドの野生種
と同一の生物学的活性、またはそのサブセットを保持することができる。P-セレ
クチンポリペプチドのアンタゴニストは、P-セレクチンポリペプチドのP-セレク
チン活性（例えば止血活性）の競合的な変調などによって、P-セレクチンポリペ
プチドの野生種の１つ以上の活性を阻害することができる。したがって、特定の
生物学的作用を、限定された機能の変種で治療することによって誘発することが
できる。ある実施態様では、野生種のたんぱく質の生物学的活性のサブセットを
有する変種で被験体を治療すると、P-セレクチンポリペプチドの野生種で治療す
る場合と比較して、被験体における副作用が少ない。
【００５４】 ある実施態様では、可溶性P-セレクチンアゴニスト（模倣物質）または可溶性
P-セレクチンポリペプチドのいずれかとして機能する可溶性P-セレクチンポリペ
プチドの変種は、可溶性P-セレクチンポリペプチドアゴニストまたはアンタゴニ
スト活性のための可溶性P-セレクチンポリペプチドの、例えば剪断突然変異体な
どのスクリーニング突然変異体によって同定することができる。例えば止血活性
を変調する能力などの変種可溶性P-セレクチンポリペプチドの活性は、例えばP-
セレクチン欠乏マウスまたはフォンウィルブランド因子欠乏マウスなど、ここに
記載され例示される動物モデルなどの動物モデルにおいて検定することができる
。
【００５５】 単離されたP-セレクチンポリペプチド、またはその部分もしくは断片を免疫原
として、ポリクローナルまたモノクローナル抗体調製の標準技術を用いて、P-セ
レクチンに結合する抗体を生成することができる（一般論としてR. H. Kenneth,
in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenu
m Publishing Corp., New York, New York (1980); E. A. Lerner (1981) Yale
J. Biol. Med., 54:387-402; M. L. Gefter et al. (1977) Somatic Cell Genet
. 3:231-36を参照）。さらに、通常の当業者は、同様に有用であろうこのような
方法のバリエーションが数多くあることを理解するだろう。
【００５６】 モノクロナール抗体分泌ハイブリドーマの調製の代わりに、組換えコンビナト
リアル免疫グロブリンライブラリ（例えば抗体ファージディスプレイライブラリ
）をスクリーニングしてP-セレクチンを選別し、P-セレクチンに結合する免疫グ
ロブリンライブラリメンバーを分離することによって、モノクローナル抗P-セレ
クチン抗体を同定し、単離することができる。ファージディスプレイライブラリ
の生成、スクリーニング用キットは市販されている（例えばファルマシア社 Rec
ombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01; 及びストラタジー
ン社 SurfZAP? Phage Display Kit, カタログ番号240612）。さらに、抗体ディ
スプレイライブラリの生成、スクリーニング用に特に適する方法及び試薬の例は
、例えばLadner et al. 米国特許第5,223,409号、 Kang et al. PCT 国際公開第
WO 92/18619号、 Dower et al. PCT 国際公開第WO 91/17271号、 Winter et al.
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、 Hoogenboom et al. (1991) Nuc. Acid Res. 19:4133-4137、 Barbas et al.
(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982、 及び McCafferty et al.
Nature (1990) 348:552-554に見つけることができる。
【００５７】 さらに、キメラ及びヒト化モノクローナル抗体など、ヒト及び非ヒト部分の両
方からなり、標準組換えDNA技術を用いて作製することができる組換え抗P-セレ
クチン抗体も、本発明の方法に用いることができる。このようなキメラまたはヒ
ト化モノクローナル抗体は、例えばRobinson et al. 国際出願第PCT/US86/02269
号、 Akira, et al. ヨーロッパ特許出願第184,187号、 Taniguchi, M., ヨーロ
ッパ特許出願第171,496号、 Morrison et al. ヨーロッパ特許出願第173,494号
、 Neuberger et al. PCT 国際公開第WO 86/01533号、 Cabilly et al. 米国特
許第4,816,567号、 Cabilly et al. ヨーロッパ特許出願第125,023号、 Better
et al. (1988) Science 240:1041-1043、 Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 84:3439-3443、 Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526、
Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218、 Nishimura et a
l. (1987) Canc. Res. 47:999-1005、 Wood et al. (1985) Nature 314:446-449
、 and Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559)、 Morrison
, S. L. (1985) Science 229:1202-1207、 Oi et al. (1986) BioTechniques 4
:214、 Winter U.S. Patent 5,225,539、 Jones et al. (1986) Nature 321:552
-525、 Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534、 and Beidler et al. (19
88) J. Immunol. 141:4053-4060に記載される方法を用いた、当業に公知の組換
えDNA技術を用いて作製することができる。
【００５８】 抗P-セレクチン抗体（例えばモノクローナル抗体）を本発明の方法に用いて、
可溶性P-セレクチンポリペプチドの発現及び／または活性を変調することができ
る。また、例えばPSGL-1などのP-セレクチンリガンドまたはレセプタに対する抗
体も、本発明の方法に有用であると考えられる。例えば、抗PSGL-1抗体は、可溶
性P-セレクチンの活性を模倣するために用いてもよい。ある実施態様では、抗PS
GL-1抗体を活性化させると、組織因子を含有するマイクロ粒子の放出を誘導する
。
【００５９】 抗P-セレクチン抗体は、親和性クロマトグラフィまたは免疫沈降などの標準技
術によって可溶性P-セレクチンポリペプチドまたは融合たんぱくを単離するため
に用いることもできる。抗P-セレクチン抗体は、野生種可溶性P-セレクチン細胞
培地及び宿主細胞中の組換え生成可溶生成P-セレクチンの精製を促進することが
できる。さらに、抗P-セレクチン抗体は、可溶性P-セレクチンポリペプチドの量
及び発現パターンを評価するための可溶性P-セレクチンポリペプチドの（たとえ
ば血中などで）検出を行うために用いることができる。抗P-セレクチン抗体は、
例えば止血活性、すなわちプロコアギュラント状態を測定するなど臨床試験手順
の一部分として血中のたんぱく濃度をモニターするために、診断用に用いること
ができる。抗体を検出可能な物質と結合（すなわち物理的な結合）させて検出を
促進することができる。検出可能な物質の例には、各種酵素、補欠分子団、蛍光
物質、発光物質、生発光物質、及び放射性物質が含まれる。適切な酵素の例には
、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、b-ガラクトシダーゼ
、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれ、適切な補欠分子団の例には、ス
トレプタビジン／ビオチン、及びアビチン／ビオチンが含まれ、適切な蛍光物質
の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチアン酸フルオレセイン、
ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたは
フィコエリトリンが含まれ、発光物質の例には、ルミノールが含まれ、生発光物
質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが含まれ、適切な
放射性物質には125I、131I、35S、または3Hが含まれる。
【００６０】 II. 単離された核酸分子 本発明の方法には、P-セレクチンポリペプチド（例えば可溶性P-セレクチンポ
リペプチド）またはその生物学的活性部分をコードする単離された核酸分子の使
用も含まれる。ヒト（ジェンバンク受入番号NM_003005 及び M25322）、ラット
（ジェンバンク受入番号NM_013114 及び L23088）、マウス（ジェンバンク受入
番号NM_011347 及び M87861）、及びウシ（ジェンバンク受入番号L12041）P-セ
レクチンをコードする核酸配列が開示されている。
【００６１】 ここで用いられる「核酸分子」という用語は、DNA分子（例えばcDNAまたはゲ
ノムDNA）、及びRNA（例えばmRNA）、及びヌクレオチド類似物をもちいて生成し
たDNAまたはRNA類似物を含むことを意図する。核酸分子は一本鎖または二本鎖で
あってよいが、二本鎖DNAであることが望ましい。
【００６２】 「単離された核酸分子」という用語には、核酸の天然ソース中に存在する他の
核酸分子から分離された核酸分子が含まれる。例えば、ゲノムDNAに関しては、
「単離された」という用語には、天然の状態でゲノムDNAを伴う染色体から分離
された核酸分子が含まれる。好ましくは、「単離された」核酸は、その核酸が由
来する生物のゲノムDNA中で、天然にその核酸に隣接する配列（つまりその核酸
の5'及び3'末端に位置する配列）を含まない。例えば、様々な実施態様では、可
溶性P-セレクチンをコードする単離された核酸分子は、その核酸が由来する細胞
のゲノムDNA中の核酸分子に天然に隣接する、約5kb、 4kb、 3kb、 2kb、 1kb、
0.5kbまたは0.1kb未満のヌクレオチド配列を含んでよい。さらに、cDNA分子な
どの「単離された」核酸分子は、組換え技術で生成した場合には他の細胞物質も
しくは培養培地を実質的に含まないものであってよく、または化学合成された場
合には化学前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まないものであってよい
。
【００６３】 たとえば可溶性P-セレクチンをコードする核酸分子、可溶性P-セレクチン融合
たんぱく、またはその部分をコードする核酸分子などの本発明の核酸分子は、標
準的な分子生物学技術を用いて単離することができる（例えばSambrook, J., Fr
itsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2
nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載の通り）。
【００６４】 本発明の核酸は、cDNA、ｍRNA、またはその代わりにゲノムDNAをテンプレート
及び適切なオリゴヌクレオチドプライマとして使用して、標準PCR増幅技術によ
って増幅することもできる。このように増幅された核酸は、適切なベクターでク
ローニングしてDNA配列解析によって特徴付けを行うことができる。さらに、P-
セレクチンヌクレオチド配列に相当するオリゴヌクレオチドは、例えば自動化DN
A合成装置などを用いて、標準合成技術によって調製することができる。
【００６５】 P-セレクチンポリペプチドの「生物学的活性部分」をコードする核酸断片は、
P-セレクチン生物学的活性（可溶性P-セレクチンの例えば止血活性などの生物学
的活性は本願明細書で説明する）を有するP-セレクチン遺伝子の核酸配列の一部
分を単離し、P-セレクチンポリペプチドのコード部分を発現させ（インビトロに
おける組換え発現などにより）、P-セレクチンポリペプチドのコード部分の活性
を評価することによって調製することができる。
【００６６】 当業者は、P-セレクチンポリペプチドをコードする核酸に突然変異が生じ、そ
の結果、P-セレクチンポリペプチドの機能的能力に変化が生じることなく、コー
ドされたP-セレクチンポリペプチドのアミノ酸配列に変化が生じることによって
、変化を導入することが可能であることを理解するであろう。例えば、P-セレク
チン遺伝子の配列において、「非必須」アミノ酸残基においてアミノ酸置換を生
じさせるヌクレオチド置換を行うことができる。「非必須」アミノ酸残基は、生
物学的活性を変えずにP-セレクチンポリペプチドの野生種配列から変化させるこ
とができる残基で、「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性に必要である。例え
ば、異なる種のP-セレクチンたんぱくの間で保存されているアミノ酸残基は、特
に変化の影響を受けにくいと推測されている。
【００６７】 従って、本発明の方法には、活性に必須ではないアミノ酸残基中の変化を有す
るP-セレクチンポリペプチドをコードする核酸分子の使用も含んでよい。
【００６８】 P-セレクチンポリペプチドをコードする単離された核酸分子は、P-セレクチン
遺伝子のヌクレオチド配列に１つ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を導
入して、コードされたたんぱく質に一つ以上のアミノ酸の置換、付加また欠失が
導入されるように生成されてよい。突然変異は、部位定方向突然変異生成及びPC
R媒介突然変異生成などの従来技術によって核酸配列に導入してよい。好ましく
は、一つ以上の予測された非必須アミノ酸残基に保存的アミノ酸置換を行う。「
保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基を同様の側鎖を有するアミノ酸残基と
置換することである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当業で
定義されている。このようなファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例
えばリジン、アルギニン、ヒスチジンなど）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例え
ばアスパラギン酸、グルタミン酸など）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例
えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、シ
ステイン）、非極性側鎖を持つアミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、
イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンなど
）、b側鎖を持つアミノ酸（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳
香族側鎖を持つアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン
、ヒスチジン）が含まれる。従って、可溶性P-セレクチンポリペプチド中の予測
される非必須アミノ酸残基は、同一の側鎖ファミリーから得た別のアミノ酸残基
と置換することが好ましい。また、別の実施態様では、飽和突然変異生成などに
よってP-セレクチンコード配列の全体または部分に無作為に突然変異を導入する
ことができ、得られた変種を組換えによって発現させ、例えば活性を保持する変
種を判定するために本願明細書に記載の動物モデルなどにおいて生物学的活性に
ついてスクリーニングすることができる。好ましい実施態様では、変種可溶性P-
セレクチンポリペプチドたんぱくを、止血活性を変調する能力について検定する
ことができる。
【００６９】 本願明細書に記載のP-セレクチンポリペプチドをコードする核酸分子に加えて
、本発明の別の態様は、それに対するアンチセンスの単離された核酸分子に関連
する。「アンチセンス」核酸は、例えば二本鎖cDNA分子のコード鎖に相補的な、
またはmRNA配列に相補的なたんぱく質をコードする「センス」核酸分子に相補的
なヌクレオチド配列からなる。従って、アンチセンス核酸はセンス核酸に水素結
合することができる。アンチセンス核酸は、P-セレクチンコード鎖全体、または
その部分のみに相補的であってよい。ある実施態様では、アンチセンス核酸分子
はP-セレクチンをコードするヌクレオチド配列をコードする鎖の「コード領域」
に対してアンチセンスである。「コード領域」という用語は、アミノ酸残基に翻
訳されるコドンからなるヌクレオチド配列の領域のことをいう。別の実施態様で
は、アンチセンス核酸分子は、P-セレクチンをコードするヌクレオチド配列のコ
ード鎖の「非コード領域」に対してアンチセンスである。「非コード領域」とい
う用語は、アミノ酸に翻訳されない、コード領域に隣接する5'及び3'配列のこと
をいう。
【００７０】 P-セクレチンをコードするコード鎖配列に対して、本発明のアンチセンス核酸
はワトソン・クリックの塩基対の法則にしたがって設計することができる。アン
チセンス核酸分子はP-セレクチンmRNAのコード領域全体に相補的であってよいが
、さらにはP-セレクチンmRNAのコード領域または非コード領域の一部分のみに対
してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。例えば、ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドはP-セレクチンmRNAの翻訳開始部位を囲む領域に
相補的であってよい。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは長さが約5、1
0、15、20、25、30、35、40、45、または50ヌクレオチドであってよい。本発明
のアンチセンス核酸は、当業に公知の手順を用いて化学合成及び酵素ライゲーシ
ョン反応を用いて作製することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えばア
ンチセンスオリゴヌクレオチド）は、分子の生物学的安定を増加させるように、
またはアンチセンスが形成した二重鎖の物理的安定を増加させるように指定され
た自然発生ヌクレオチドまたは様々に修飾されたヌクレオチドを用いて、化学合
成することができる。アンチセンス核酸を生成するために用いることができる修
飾ヌクレオチドの例には、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウ
ラシル、5-ヨードウラシル、ハイポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシ
ン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメ
チル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウ
ラシル、b-D-ガラクトシルケオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1
-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニ
ン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7
-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-
チオウラシル、b-D-マンノシルケオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシ
ル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル
-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン、疑似ウラシル、ケオシン、2-チオシトシ
ン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウ
ラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、5
-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、(
acp3)w、及び2,6-ジアミノプリンが含まれる。または、アンチセンス核酸は、核
酸をアンチセンス配向にサブクローニングした（つまり、挿入した核酸から転写
したRNAは、目的の標的核酸に対してアンチセンス配向になるだろう）発現ベク
ターを用いて生物学的に作製することができる。
【００７１】 さらに別の実施態様では、本発明のP-セレクチン核酸分子は、例えば分子の安
定性、ハイブリダイゼーション、または可溶性を向上させるために、塩基部分、
糖部分、またはリン酸塩骨格を修飾することができる。例えば、核酸分子のデオ
キシリボースリン酸塩骨格を修飾して、ペプチド核酸を生成することができる（
Hyrup B. et al. (1996) Bioorganic & Medicinal Chemistry 4 (1): 5-23参照
）。ここで用いられる「ペプチド核酸」または「PNA」は、リン酸デオキシリボ
ース骨格を疑似ペプチド骨格で置換し、天然の核塩基を４つだけ保持するDNA模
倣体などの核酸模倣体のことをいう。PNAの中性骨格は、低イオン強度の条件下
で、DNAとRNAに特異的にハイブリダイゼーションすることが可能なことが示され
ている。PNAオリゴマーの合成は、Hyrup B. et al. (1996) 同上; Perry-O'Keef
e et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 14670-675に記載される標準固相ペプチ
ド合成プロトコルを用いて行うことができる。
【００７２】 P-セレクチン核酸分子のPNAは、治療及び診断用途に用いることができる。例
えば、PNAは、例えば転写または翻訳停止の誘導、または複製の阻害などによる
、遺伝子発現の配列特異的な変調のためのアンチセンスまたは抗遺伝子物質とし
て用いることもできる。P-セレクチン核酸分子のPNAは、遺伝子の一塩基対突然
変異の解析（例えばPNA定方向性PCRクランピング）に、他の酵素と共に使用する
場合には「人工制限酵素」として（例えばS1ヌクレアーゼ（Hyrup B. (1996) 同
上）、またはDNA配列決定もしくはハイブリダイゼーション用にはプローブまた
はプライマとして（Hyrup B. (1996) 同上、Perry-O'Keefe同上）使用すること
もできる。
【００７３】 別の実施態様では、P-セレクチンのPNAを（たとえばその安定性または細胞取
り込みを促進させるために）、親油性基またはその他のヘルパー基をPNAに付着
させることによって、またはPNA-DNAキメラを形成することによって、またはリ
ポソームまたは当業に公知のその他の薬物輸送技術によって修飾することができ
る。例えば、P-セレクチン核酸分子のPNA-DNAキメラを作製できれば、PNA及びDN
Aの特長的な特性を併せることができるかもしれない。このようなキメラでは、D
NA認識酵素（例えばRNAase H及びDNAポリメラーゼなど）をDNA部分と接触させる
ことが可能になり、一方でPNA部分は高い結合親和性及び特異性を提供するだろ
う。PNA-DNAキメラは、塩基スタッキング、核塩基間の結合数、及び配向の点か
ら選択された適切な長さのリンカーを用いて連結することができる（Hyrup B. (
1996) 同上）。PNA-DNAキメラの合成は、Hyrup B. (1996) supra and Finn P.J.
et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24 (17): 3357-63に記載されるとおりに行
うことができる。例えば、DNA鎖は標準ホスホラミダイト結合化学を用いて固体
支持帯状で合成することが可能で、例えば5'-(4-メトキシトリチル)アミノ-5'-
デオキシチミジンホスホラミダイトなどの修飾ヌクレオシド類似体をPNAとDNA5'
末端の間に用いることができる（Mag, M. et al. (1989) Nucleic Acid Res. 17
: 5973-88）。その後、PNAモノマーを順次結合させて5' PNAセグメント及び3' D
NAセグメントを有するキメラ分子を生成する（Finn P.J. et al. (1996) supra
）。または、キメラ分子を5' DNAセグメント及び3' PNAセグメントで合成するこ
ともできる（Peterser, K.H. et al. (1975) Bioorganic Med. Chem. Lett. 5:
1119-11124）。
【００７４】 別の実施態様では、オリゴヌクレオチドには、ペプチドなどの他の付加基（例
えばインビボにおいて宿主細胞レセプタを標的にするため）、または細胞膜（例
えばLetsinger et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556; Lem
aitre et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652; PCT公開第W088
/09810号参照）または血液脳関門（PCT 公開第 W089/10134号参照）を通した輸
送を促進する物質などをふくんでもよい。 さらに、オリゴヌクレオチドは、ハ
イブリダイゼーション誘導切断物質（例えばKrol et al. (1988) Bio-Technique
s 6:958-976参照）、または插入物質（例えばZon (1988) Pharm. Res. 5:539-54
9参照）によって修飾してもよい。この場合、オリゴヌクレオチドは別の分子（
例えばペプチド、ハイブリダイゼーション誘導架橋物質、輸送物質、またはハイ
ブリダイゼーション誘導切断物質）と結合させてもよい。
【００７５】 III. 組換え発現ベクターと宿主細胞 本発明の方法には、P-セレクチンポリペプチドをコードする核酸（または例え
ば可溶性P-セレクチンポリペプチドなどの、その部分）を含むベクター、好まし
くは発現ベクターが含まれる。ここで用いられる「ベクター」とは、結合する別
の核酸の輸送をすることができる核酸分子のことをいう。ベクターの１種が「プ
ラスミド」で、これは追加のDNAセグメントがライゲートすることができる円形
の二本鎖DNAループのことをいう。別の種類のベクターはウィルスベクターで、
追加のDNAセグメントをウィルスゲノムにライゲートすることができるベクター
である。あるベクターは、導入された宿主細胞中で自律増殖することができる（
例えばバクテリア由来の複製能力を有するバクテリアベクター、及びエピソーム
哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿
主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれ、宿主ゲノムと共に複製さ
れる。さらに、あるベクターは遺伝子の発現を機能的に結合するように方向付け
ることができる。一般に、組換えDNA技術に有用な発現ベクターはプラスミドの
形態であることが多い。本願明細書では、プラスミドが最も頻繁にベクターの形
態として使用されるため、「プラスミド」と「ベクター」は区別なく使用できる
ものとする。しかし、本発明の方法には、ウィルスベクター（例えば複製欠損レ
トロウィルス、アデノウィルス及びアデノ関連ウィルス）など、機能が同等な別
の形態の発現ベクターも含まれる。
【００７６】 本発明の方法に用いられる組換え発現ベクターは、宿主細胞中の核酸発現に適
する形態の本発明の核酸からなり、つまり、組換え発現ベクターに、核酸配列が
発現するように機能的に結合した、宿主細胞が発現用に使用されることに基づい
て選択された一つ以上の調節性配列が含まれることを意味する。組換え発現ベク
ターのうち、「機能的に結合した」という文言は、目的のヌクレオチド配列が、
ヌクレオチド配列の発現が（例えばインビトロ転写／翻訳システムにおいて、ま
たはベクターが宿主細胞に導入される場合には宿主細胞において）可能になるよ
うに調節性配列に結合していることを意味するように意図する。「調節性配列」
という用語は、プロモータ、エンハンサ、及びその他の発現制御要素（例えばポ
リアデニル化シグナル）を含むことを意図する。このような調節性配列は、例え
ばGoeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Acade
mic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。調節性配列には、多くの
種類の宿主細胞中におけるヌクレオチド配列の構成発現を方向付けられたものと
、特定の宿主細胞のみにおけるヌクレオチド配列の発現を方向付けられたものが
含まれる。当業者は、発現ベクターの設計はトランスフォームされる宿主細胞の
選択、及び望ましいたんぱく質の発現レベルなどの因子に依存する可能性がある
ことを理解するだろう。本発明の方法に用いる発現ベクターは、宿主細胞に導入
されて、本願明細書に記載の核酸によってコードされた融合たんぱくもしくはペ
プチドなどを含むたんぱく質またはペプチド（例えば可溶性P-セレクチンポリペ
プチド、及び融合たんぱくなど）を生成することができる。
【００７７】 本発明の方法に用いられた組換え発現ベクターは、例えば本発明の方法に使用
するための原核細胞または真核細胞中においてP-セレクチンポリペプチドまたは
融合たんぱくを発現するように設計することができる。例えば、可溶性P-セレク
チンポリペプチドまたは融合たんぱくは、大腸菌などの細菌細胞、昆虫細胞（バ
キュロウィルス発現ベクターを使用する）、酵母細胞または哺乳類細胞などにお
いて発現させることができる。適切な宿主細胞は、Goeddel; Gene Expression T
echnology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (19
90)でさらに詳しく検討されている。または、組換え発現ベクターは、例えばT7
プロモータ調節性配列及びT7ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写及び翻訳
することができる。
【００７８】 原核細胞におけるたんぱく質の発現は、融合または非融合たんぱくの発現を方
向付けられている構成プロモータまたは誘導プロモータを含有するベクターを有
する大腸菌の中で行われることが多い。融合ベクターは、そこでコードされるた
んぱく質、通常は組換えたんぱくのアミノ末端に多数のアミノ酸を付加する。こ
のような融合ベクターには一般に３つの目的があり、その目的とは１）組換えた
んぱくの発現の増加と、２）組換えたんぱくの可溶性及び／または安定性の増加
と、３）親和性精製におけるリガンドとして作用することによる組換えたんぱく
精製の支援と、である。融合発現ベクターでは、融合たんぱくの精製後に組換え
たんぱくを融合部分から分離することができるように、融合部分と組換えたんぱ
くの結合部に原核細胞切断部位を導入してあることが多い。このような酵素、及
び同源のその認識配列には、第Xa因子、トロンビン、及びエンテロキナーゼが含
まれる。一般的な融合発現ベクターには、標的組換えたんぱくにグルタチオンS-
トランスフェラーゼ（GST）を融合したpGEX（ファルマシアバイオテック社、Smi
th, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40）、マルトースE結合たんぱ
くを融合したpMAL（ニューイングランドバイオラブズ社、マサチューセッツ州ビ
バリー）、及びたんぱくAを融合したpRIT5（ファルマシア社、ニュージャージー
州ピスカタウェイ）が含まれる。
【００７９】 精製P-セレクチン融合たんぱく（例えば可溶性P-セレクチンIg）は、本願明細
書に記載され例示されるように止血ポテンシャルを変調するために用いることが
できる。ある実施態様では、本発明のレトロウィルス発現ベクターに発現した可
溶性P-セレクチン融合たんぱくを用いて、例えば造血細胞などの細胞に感染させ
、その後レシピエントに移植することができる。被験レシピエントの止血活性は
、十分な時間（例えば６週間）が経過した後に測定する。
【００８０】 適切な誘導非融合大腸菌発現ベクターの例には、pTrc（Amann et al., (1988)
Gene 69:301-315）及びpET 11d（Studier et al., Gene Expression Technolog
y: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (199
0) 60-89）が含まれる。pTrcベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドtr
p-lac融合プロモータからの宿主RNAポリメラーゼ転写に依存する。pET 11dベク
ターからの標的遺伝子発現は、共発現したウィルスRNAポリメラーゼ（T7 gn1）
によって媒介されたT7 gn10-lac融合プロモータからの転写に依存する。このウ
ィルスポリメラーゼは、lacUV 5プロモータの転写制御下で、T7 gn1遺伝子を収
容する定住プロファージからの宿主株BL21(DE3)またはHMS174(DE3)によって供給
される。
【００８１】 大腸菌における組換えたんぱく発現を最大にするある戦略では、組換えたんぱ
くをたんぱく分解的に切断する能力を障害した宿主細菌中にたんぱく質を発現さ
せる（Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 1
85, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-12）。別の戦略では
、核酸の核酸配列を改変して発現ベクターに挿入し、各アミノ酸の個別のコドン
がE.コリ中で優先的に利用されるものにする（Wada et al., (1992) Nucleic Ac
ids Res. 20:2111-2118）。本発明の核酸配列のこのような改変は、標準DNA合成
技術によって行うことができる。
【００８２】 別の実施態様では、P-セレクチン発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵
母菌S.cerevisiaeに発現させるためのベクターの例には、pYepSec1 (Baldari, e
t al., (1987) EMBO J. 6:229-234)、pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Ce
ll 30:933-943)、pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123)、pYES2 (
インビトロゲンコーポレーション社、カリフォルニア州サンディエゴ)、及びpic
Z (インビトロゲンコーポレーション社、カリフォルニア州サンディエゴ)が含ま
れる。
【００８３】 または、P-セレクチンポリペプチドは、バキュロウィルス発現ベクターを用い
て昆虫細胞中に発現させることもできる。培養昆虫細胞（例えばSf9細胞など）
中にたんぱく質を発現可能なバキュロウィルスベクターには、pAcシリーズ（Smi
th et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165）、及びpVLシリーズ（Lucklow
and Summers (1989) Virology 170:31-39）が含まれる。
【００８４】 さらに別の実施態様では、本発明の方法に用いられる核酸は、哺乳類発現ベク
ターを用いた哺乳類細胞に発現させる。哺乳類発現ベクターにはpCDM8 (Seed, B
. (1987) Nature 329:840) 及び pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:18
7-195) が含まれる。哺乳類細胞中で使用される場合、発現ベクターの制御機能
はウィルス調節要素によって提供される場合が多い。例えば、一般に用いられる
プロモータは、ポリオーマ、アデノウィルス２、サイトメガロウィルス、及びシ
ミアンウィルス40に由来する。原核細胞及び真核細胞の両方ともに適切なその他
の発現システムは、Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecula
r Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory
, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989の第
１６章および１７章を参照のこと。
【００８５】 別の実施態様では、本発明の方法に用いられる組換え哺乳類発現ベクターは、
特定の細胞種に優先的に核酸の発現を方向付けることができる（例えば組織特異
的調節要素を用いて核酸を発現する）。組織特異的調節要素は当業に公知である
。適切な組織特異的プロモータの例には、アルブミンプロモータ （肝特異的、P
inkert et al. (1987) Genes Dev. 1:268-277), リンパ系特異的プロモータ(Cal
ame and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275), 特にT 細胞レセプタのプロ
モータ (Winoto and Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733) 及び 免疫グロブリ
ンのプロモータ (Banerji et al. (1983) Cell 33:729-740; Queen and Baltimo
re (1983) Cell 33:741-748)、 ニューロン特異的プロモータ(例えばニューロフ
ィラメントプロモータ; Byrne and Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86:5473-5477), 内皮細胞特異的プロモータ(e.g., KDR/flk promoter; U.S. Pa
tent No. 5,888,765), 膵特異的プロモータ (Edlund et al. (1985) Science 23
0:912-916), 及び乳腺特異的プロモータ(e.g.,乳ホエープロモータ; 米国特許第
4,873,316号及びヨーロッパ出願公開第264,166号)が含まれる。例えばマウスhox
プロモータ（Kessel and Gruss (1990) Science 249:374-379）、及びa-フェト
たんぱくプロモータ（Campes and Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546）な
どの、発生調節プロモータも包含される。
【００８６】 細胞株または微生物内にある内因性P-セレクチン遺伝子の発現の特徴は、非相
同性DNA調節要素を安定細胞株またはクローン微生物のゲノムに挿入し、その挿
入調節要素が内因性P-セレクチン遺伝子に機能的に結合するように変更できる可
能性もある。例えば、通常は「転写的にサイレントな」内因性P-セレクチン遺伝
子、つまり細胞株または微生物において通常は発現しないか、または非常に少量
のみ発現するP-セレクチン遺伝子が、細胞間株または微生物において通常発現す
る遺伝子産生物の発現を促進する能力がある調節要素を挿入することによって活
性化される可能性もある。または、転写的にサイレントな内因性P-セレクチン遺
伝子は、細胞種全般に作用する乱交雑調節要素の挿入によって活性化される可能
性もある。
【００８７】 当業者に公知で例えばChappel, 米国特許第5,272,071号; May 16, 1991に公開
されたPCT 公開第WO 91/06667号に記載の標的相同性組換えなどの技術を用いて
、非相同性調節要素を安定細胞株またはクローン微生物に挿入し、内因性P-セレ
クチン遺伝子に機能的に結合させることも可能である。
【００８８】 本発明はさらに、アンチセンス配向で発現ベクターにクローニングされた、本
発明のDNA分子からなる組換え発現ベクターを提供する。つまり、（DNA分子の転
写によって）P-セレクチンmRNAに対してアンチセンスのRNA分子が発現するよう
に、DNA分子を調節配列に機能的に結合させることである。アンチセンス配向に
クローニングされた核酸に機能的に結合する調節配列は、例えばウィルスプロモ
ータ及び／またはエンハンサなど様々な細胞種中に、アンチセンスRNA分子が連
続して発現するように方向付けるように選択することもでき、または調節性配列
はアンチセンスRNAの組織特異的または細胞種特異的な構成発現を方向付けるよ
うに選択することもできる。アンチセンス発現ベクターは、高効率の調製領域の
制御下でアンチセンス核酸が産生される組換えプラスミド、ファージミド、また
は弱毒ウィルスの形態であってよく、ベクターが導入される細胞種によって活性
を決定することができる。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節の検討
には、Weintraub, H. et al., Antisense RNA as a molecular tool for geneti
c analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986を参照のこと。
【００８９】 本発明の別の態様は、例えば組換え発現ベクター内のP-セレクチン核酸分子、
または宿主細胞ゲノムの特異的部位に相同的に組み入れることを可能にする配列
を含有するP-セレクチン核酸分子など、本発明のP-セレクチン核酸分子を導入す
る宿主細胞の使用に関連する。「宿主細胞」及び「組換え宿主細胞」という用語
は、本願明細書においては区別なく用いる。このような用語は、特定の被験体細
胞だけでなくこのような細胞の後代、または後代になる可能性のあるものも意味
すると理解するものとする。突然変異または環境の影響によって後代に特定の変
更が生じる可能性があるため、このような後代は親細胞とは事実上同一ではない
かもしれないが、それでもここで用いられるようにこの用語の範囲内に含まれる
。
【００９０】 宿主細胞は原核細胞であっても真核細胞であってもよい。例えば、P-セレクチ
ンポリペプチドまたは融合たんぱくは、大腸菌などの細菌細胞、昆虫細胞、酵母
菌、または哺乳類細胞（造血細胞、白血球、ヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）、ヒ
ト微小血管内皮細胞、（HMVEC）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）、ま
たはCOS細胞など）中に発現することができる。その他の適切な宿主細胞は、当
業に公知である。
【００９１】 ベクターDNAは、原核細胞または真核細胞に、従来のトランスフォーメーショ
ン、またはトランスフェクション技術によって導入することができる。ここで用
いられる、「トランスフォーメーション」及び「トランスフェクション」は、外
来の核酸を宿主細胞に導入する、当業に公知の各種技術を意味することを意図し
、リン酸カルシウムまたは塩酸カルシウム共沈殿法、DEAE-デキストラン媒介ト
ランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔法が含まれる。適切な
宿主細胞のトランスフォーミング法またはトランスフェクティング法は、Sambro
ok, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spri
ng Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring H
arbor, NY, 1989)及びその他の実験マニュアルに見つけることができる。
【００９２】 哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのために、使用した発現ベクター
及びトランスフェクション技術によって、わずかな割合の細胞しか外来DNAを細
胞のゲノムに取り込むことができない可能性があることが知られている。取り込
まれた細胞を識別・選択するために、一般に、選択可能な（例えば抗生物質に耐
性の）マーカーをコードする遺伝子を目的の遺伝子と共に宿主細胞に導入する。
好ましい選択可能なマーカーには、G418、ヒグロマイシン、またはメトトレキセ
ートなどの、薬物耐性のものが含まれる。選択可能なマーカーをコードする核酸
は、可溶性P-セレクチンポリペプチドをコードするものと同一のベクターにのせ
て宿主細胞に導入することができ、または別のベクターにのせて導入することが
できる。導入された核酸を安定にトランスフェクトした細胞は、薬物選択によっ
て識別することができる（例えば選択可能なマーカー遺伝子を取り込んだ細胞は
生存し、他の細胞は死亡する）。
【００９３】 培養液中の原核または真核宿主細胞などの本発明の宿主細胞を使用して、本発
明の方法に使用するためのP-セレクチンポリペプチドまたは融合たんぱくを産生
する（すなわち発現する）ことができる。ある実施態様では、宿主細胞（可溶性
P-セレクチンポリペプチドまたは融合たんぱくをコードする組換え発現ベクター
が導入される）を適切な培地で培養し、可溶性P-セレクチンポリペプチドまたは
融合たんぱくを産生する。別の実施態様では、可溶性P-セレクチンポリペプチド
または融合たんぱくを、培地または宿主細胞から単離する。可溶性P-セレクチン
ポリペプチドまたは可溶性P-セレクチン融合たんぱくを発現する組換え細胞を、
被験体に投与して止血を変調することもできる。
【００９４】 IV. 治療方法 本発明は、P-セレクチン活性（例えば可溶性P-セレクチン量）を変調すること
により止血ポテンシャルを変調する方法を開示する。従って、本発明は、例えば
異常なまたは不必要な止血活性を伴う障害、または血管系関連疾患などの止血障
害のリスクがある（感受性がある）または罹患する被験体の予防方法及び治療方
法の両方を提供する。予防方法及び治療方法の両方に関して、このような処置方
法は薬理ゲノミクスの分野から得られた知見に基づき、個別に調整または変更し
てもよい。ここで用いられる「薬理ゲノミクス」は、臨床開発中及び上市された
薬物に対する、遺伝子シーケンシング、統計遺伝学、及び遺伝子発現解析などの
遺伝学的技術の応用を意味する。さらに具体的には、この用語は、患者の遺伝子
がその患者の薬物への応答をどのように決定するか（例えば患者の「薬物応答表
現型」、または「薬物応答遺伝子型」）の研究を意味する。従って、本発明の別
の態様は、各個人の薬物応答遺伝子型に従った、可溶性P-セレクチンまたはP-セ
レクチン活性の変調物質いずれかによる各個人の予防方法または治療方法を個別
に調製する方法を提供する。薬理ゲノミクスによって、臨床家または医師は、そ
の処置方法が最も有益に作用する患者にその予防方法または治療方法を施行し、
薬物に関連した毒性の副作用を経験する患者にはその処置方法を避けることが可
能になる。
【００９５】 A. 予防方法 P-セレクチン活性の評価は、止血活性の測定値として用いることができる。従
って、ある態様では、本発明は、被験体における例えば異常なまたは不必要な止
血活性を伴う障害、または血管系関連疾患などの止血障害を、P-セレクチン活性
の変調物質または可溶性P-セレクチンポリペプチドを被験体に投与することによ
って予防する方法を提供する。止血障害または血管系関連疾患のリスクがある被
験体は、例えば生物学的サンプル（すなわち可溶性P-セレクチンの血漿濃度）に
おいてP-セレクチン活性を評価するなど、本願明細書に記載される診断アッセイ
または予後アッセイのいずれかまたは組み合わせなどによって、判定することが
できる。予防物質は、疾患または障害が予防される、またはその進行が遅延され
るように、止血障害の症状の特徴の発現前に投与することができる。障害の種類
によって、例えば可溶性P-セレクチンポリペプチド、または例えばP-セレクチン
アゴニストまたはアンタゴニストなどのP-セレクチン活性の変調物質を、被験体
の処置に用いることができる。本願明細書に記載のスクリーニングアッセイに基
づいて、適切な物質を決定することができる。
【００９６】 B. 治療方法 止血障害、血管系関連疾患、及びそれらの症状を改善する方法及び組成物を、
本出願明細書で説明する。例えば凝固機能低下状態または出血性障害などの特定
の止血障害は、止血活性の欠損または低下によって、少なくともその一部が誘発
される。従って、止血活性を上昇させれば疾患徴候を改善させることができるだ
ろう。さらに、特定の血管系関連疾患は、疾患部位に血液を供給し、例えば酸素
及び栄養を提供することによってサポートされる。同様に、このような疾患部位
に血液を供給する血管系におけるプロコアギュラント状態を誘導すれば、有益な
作用が生じるだろう。
【００９７】 または、例えば血栓障害など特定のその他の止血疾患は、止血作用が存在する
、または上昇することによって、少なくともその一部が誘発される。従って、止
血作用が低下すれば疾患徴候が改善するだろう。
【００９８】 ここでは、P-セレクチン活性の変調物質を用いて止血を変調する技術について
、検討する。従って、本発明の別の態様は、治療目的の止血または止血ポテンシ
ャルの変調の方法に関連する。
【００９９】 例示的な実施態様では、本発明の変調方法は、P-セレクチン活性の変調物質、
または可溶性P-セレクチンポリペプチドの投与に関与する。P-セレクチン活性の
変調物質には、１つ以上のP-セレクチンの活性を変調する（例えば誘導する、ま
たは阻害する）物質、または可溶性P-セレクチン発現を変調する物質が含まれる
。P-セレクチン活性の変調物質は、核酸またはたんぱく質、可溶性P-セレクチン
ポリペプチドの自然発生標的分子（例えばP-セレクチンリガンド）、抗P-セレク
チン抗体、可溶性P-セレクチンアゴニストまたはアンタゴニスト、可溶性P-セレ
クチンアゴニストまたはアンタゴニストのペプチド模倣体、またはその他の低分
子など、ここに記載される物質であってよい。ある実施態様では、その物質はP-
セレクチン活性の誘導物質である。このような誘導物質の例には、活性可溶性P-
セレクチンポリペプチド、可溶性P-セレクチンポリペプチドをコードする核酸分
子、及び例えば活性抗PSGL-1抗体などの可溶性P-セレクチン模倣体が含まれる。
別の実施態様では、その物質はP-セレクチン活性の阻害物質である。このような
阻害物質の例には、アンチセンス可溶性P-セレクチン核酸分子、抗P-セレクチン
抗体、及び例えば可溶性PSGL-1などの可溶性P-セレクチン阻害物質が含まれる。
従って、本発明は異常または不必要な止血活性が特徴である疾患または障害を罹
患した個人の処置方法を提供する。ある実施態様では、その方法はP-セレクチン
活性の変調物質の投与が関与する。別の実施態様では、本発明は、止血及び／ま
たはプロコアギュラント状態を誘導するための、可溶性P-セレクチンポリペプチ
ドまたは可溶性P-セレクチンポリペプチドをコードする核酸の投与に関与する。
【０１００】 （i） 可溶性P-セレクチン発現、合成、または活性の阻害方法 上述のように、血栓障害などの特定の止血障害の原因は、高レベルまたは過剰
レベルの止血活性であると考えられる。このような状況において、血栓症などの
止血障害は、病状に原因作用または悪化作用を及ぼすと考えられる。このような
場合、循環する可溶性P-セレクチン量を減少させれば、止血または止血活性を低
下させることができると考えられる。従って、本発明に従ってP-セレクチン活性
の阻害物質を使用すれば、止血を低減させることができると考えられる。このよ
うな化合物には有機低分子、ペプチド、抗体などが、それらに限定されず含まれ
ると考えられる。
【０１０１】 例えば、可溶性P-セレクチンペプチドの内因性リガンドと競合する化合物を投
与してよい。リガンドに結合した可溶性P-セレクチンペプチドの量が結果的に減
少し、止血活性を変調するだろう。この目的に特に有用である可能性のある化合
物には、例えばIg-末端融合たんぱく（Ig-末端融合たんぱくの産生についての検
討は、例えば米国特許第5,116,964号を参照）などの可溶性融合たんぱくなどを
含むP-セレクチンリガンド、PSGL-1の細胞外ドメインを１つ以上含む化合物、ま
たはその部分及び／または類似物からなるペプチドなどの、可溶性たんぱくまた
はペプチドなどが含まれる。
【０１０２】 ある実施態様では、P-セレクチンの細胞貯蔵プールから細胞表面への移動を低
減または阻害するP-セレクチン活性の阻害因子は、循環可溶性P-セレクチン量の
低減とその結果生じる止血活性の変調に有効である可能性がある。または、P-セ
レクチン遺伝子発現、または膜貫通ドメインのないP-セレクチンの代替的にスプ
ライスされたアイソフォームの発現（例えばP-セレクチン遺伝子転写または翻訳
）を減少させるP-セレクチン活性の阻害物質を用いて、止血を低減することが可
能である。
【０１０３】 さらに、P-セレクチン遺伝子の発現を阻害するアンチセンス及びリボザイム分
子も、本発明に従って、止血の阻害のために使用してもよい。またさらに、三重
らせん鎖分子を可溶性P-セレクチン活性の阻害に使用してもよい。
【０１０４】 本発明のアンチセンス核酸分子は、一般に、P-セレクチンたんぱくをコードす
る細胞性mRNA及び／またはゲノムDNAとハイブリダイズするかまたはそれらに結
合して、例えば転写及び／または翻訳を阻害することなどによってたんぱく質の
発現を阻害するように、被験体に投与するかまたはインサイチューで生成する。
従来のヌクレオチド相補性によるハイブリダイゼーションによって、例えばDNA
二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合のように、二重らせんの大溝にお
ける特異的な相互作用によって、安定した二重鎖を形成することができる。本発
明のアンチセンス核酸分子の投与経路のある例には、組織部位への直接注射が含
まれる。または、アンチセンス核酸分子は、選択した細胞を標的にするように修
飾し、全身的に投与することができる。例えば、全身投与の場合、アンチセンス
分子は、例えば細胞表面レセプタまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体にア
ンチセンス核酸分子を結合させるなどによって、選択された細胞表面上に発現し
たレセプタまたは抗原に特異的に結合するように、修飾することができる。アン
チセンス核酸分子は本願明細書に記載のベクターを用いて細胞に送達することも
できる。細胞内のアンチセンス分子の濃度を十分にするために、アンチセンス核
酸分子が強力なpolII またはpolIIIプロモータの制御下におかれているベクター
構造体が望ましい。
【０１０５】 さらに別の実施態様では、本発明のアンチセンス核酸分子はa-アノメリック核
酸分子である。a-アノメリック核酸分子は、通常のb-ユニットと反対に鎖がお互
いに平行になっている相補RNAとの特異的な二本鎖ハイブリッドを形成する(Gaul
tier et al. (1987) Nucleic Acids. Res. 15:6625-6641)。アンチセンス核酸分
子は2'-o-メチルリボヌクレオチド(Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 1
5:6131-6148)またはキメラRNA-DNA類似体(Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215
:327-330)も含む。
【０１０６】 さらに別の実施態様では、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リ
ボザイムは、mRNAなどの一本鎖核酸を相補的な領域を有するように切断すること
ができるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒RNA分子である。従って、リボザイ
ム（例えばハンマーヘッドリボザイム(Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 3
34:585-591に記載)）を用いてP-セレクチンmRNA転写体を触媒的に切断し、P-セ
レクチンmRNAの転写を阻害することができる。P-セレクチンコード核酸について
特異性を有するリボザイムは、P-セレクチンcDNAのヌクレオチド配列に基づいて
設計することができる。例えば、テトラヒメナL-19 IVS RNAの誘導体は、P-セレ
クチンコードmRNAで切断できるように活性部位のヌクレオチド配列がヌクレオチ
ド配列と相補的であるように、作製することができる(例えばCech et al. 米国
特許第4,987,071号; and Cech et al. 米国特許第5,116,742号)。または、P-セ
レクチンmRNAを用いて、RNA分子プールから特定のリボヌクレアーゼ活性を有す
る触媒性RNAを選択することができる(例えばBartel, D. and Szostak, J.W. (19
93) Science 261:1411-1418参照)。
【０１０７】 P-セレクチン遺伝子発現を、P-セレクチン遺伝子の調節領域に相補的なヌクレ
オチド配列を標的とすることによって阻害し、標的細胞中のP-セレクチン遺伝子
の転写を防ぐ三重らせん構造を形成することもできる (例えばHelene, C. (1991
) Anticancer Drug Des. 6(6):569-84; Helene, C. et al. (1992) Ann. N.Y. A
cad. Sci. 660:27-36; and Maher, L.J. (1992) Bioassays 14(12):807-15参照)
。
【０１０８】 P-セレクチンたんぱくに特異的でその活性に干渉もする抗体を用いて、P-セレ
クチン活性を変調または阻害することもできる。このような抗体は、標準技術を
用いて、P-セレクチンたんぱくそのものに対する、またはそのたんぱく質の部分
に相当するペプチドに対するように作成することも可能である。このような抗体
には、ポリクロナール、モノクロナール、Fab断片、一本鎖抗体、またはキメラ
抗体が、それらに限定されずに含まれる。
【０１０９】 標的遺伝子たんぱくが、例えば貯蔵顆粒内に局在化するなど細胞内にあって、
抗体全体を使用する場合、内在化抗体が好ましい。抗体または標的エピトープに
結合するFab領域断片を細胞内に送達するために、リポフェクションリポソーム
を使用してもよい。抗体の断片を使用する場合、標的たんぱくの結合ドメインに
結合する最小の阻害断片が好ましい。例えば、標的遺伝子たんぱくに結合する抗
体の可変領域のドメインに相当するアミノ酸配列を有するペプチドを使用しても
よい。このようなペプチドは当業に公知の方法を用いて、化学合成するか、また
は組換えDNA技術によって生成しもよい (例えばCreighton (1983), 同上; 及び
Sambrook et al. (1989) 同上を参照)。細胞内標的遺伝子エピトープに結合する
一本鎖中和抗体を投与してもよい。このような一本鎖抗体は、例えばMarasco et
al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893)に記載の技術などを用
いて、例えば標的細胞集団内で一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列を発現
することによって、投与してもよい。
【０１１０】 ある実施態様では、P-セレクチンたんぱくの細胞外ドメインに特異的で、例え
ばその活性と干渉する抗体は、止血を変調する場合に特に有用である。このよう
な抗体は、血流から直接標的ドメインに接近することができるため、特に有効で
ある。以下に記載する、ペプチド投与に適切な投与技術のいずれも、阻害P-セレ
クチン抗体を作用部位に効果的に投与するために用いてよい。
【０１１１】 P-セレクチン機能の変調のための抗体は、米国特許第6,033,667号; 第5,800,8
15号; 及び第5,622,701号に開示されている。
【０１１２】 本願明細書に開示されるP-セレクチン阻害物質は、単体で投与してもよく、ま
たはヘパリン、アスピリン、及びワルファリン（CoumadinTM）、ニコウマロン（
SintromTM）、またはaIIbb3阻害剤などの抗血小板凝固剤などの抗凝固剤をそれ
らに限定されずに含む、止血または血栓形成を低減するために用いるその他の薬
剤、化合物または組成物と共に投与してもよい。
【０１１３】 （ii） P-セレクチンポリペプチド活性の回復または増加方法 出血性障害などの特定の止血障害の原因は、止血活性レベルの低下である。さ
らに、いくつかの血管系関連障害の進行は、疾患部位への血液供給に依存する。
このような状況において、低下したまたは不十分な止血活性は、病状に原因作用
または悪化作用を及ぼすと考えられる。このような場合、P-セレクチン活性を上
昇させるP-セレクチン活性誘導物質によって、好ましくは循環する可溶性P-セレ
クチン量を増加させることによって、止血を増加し、またはプロコアギュラント
状態を誘導することができると考えられる。
【０１１４】 本セクションでは、可溶性P-セレクチン活性レベルを上昇させることで、凝固
機能低下障害または血管系関連疾患を改善する方法を説明する。可溶性P-セレク
チンポリペプチド活性レベルは、例えば、膜貫通ドメインのない代替的にスプラ
イスされたP-セレクチンのアイソフォームなどのP-セレクチン遺伝子発現量を増
加させるか、または存在する活性可溶性P-セレクチンたんぱくの血漿濃度を増加
させることによって、可溶性P-セレクチンポリペプチド活性を上昇させることが
できると考えられる。
【０１１５】 例えば、病状を改善するのに十分な量の可溶性P-セレクチンポリペプチドまた
は融合たんぱくを、このような症状を示す患者に投与してもよい。本願明細書で
検討する技術のいずれも、このような投与に用いてもよい。当業者は、本願明細
書に記載される技術などを利用して、可溶性P-セレクチンポリペプチドの効果的
で無毒性の投与量の濃度を決定する方法を容易に知ることができるだろう。
【０１１６】 さらに、可溶性P-セレクチンポリペプチドをコードするRNA配列は、病状を示
す患者に、病状が改善されるレベルの可溶性P-セレクチンポリペプチドを生成す
るのに十分な濃度で、直接投与してもよい。後述の技術はいずれも例えばリポソ
ーム投与などの化合物の細胞内投与を実現し、このようなRNA分子の投与に用い
てもよい。該RNA分子は例えば本願明細書に記載のような組換え技術によって生
成してもよい。
【０１１７】 さらに、被験体は遺伝子置換療法によって処置されてもよい。機能的なP-セレ
クチンポリペプチドまたは融合たんぱくの産生を方向付けた可溶性P-セレクチン
、または可溶性P-セレクチン融合たんぱくをコードする遺伝子の１つ以上のコピ
ーは、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、及びレトロウィルスベクターと、
リポソームなどDNAを細胞に誘導するその他の粒子を、それらに限定されずに含
むベクターを用いて細胞に挿入してもよい。さらに、上述などの技術は、可溶性
P-セレクチン遺伝子配列をヒト細胞に導入するために用いてもよい。
【０１１８】 次いで、可溶性P-セレクチン発現遺伝子配列を含有する細胞、好ましくは自己
増殖性細胞を、被験体の病状を改善することができる部位に導入または再導入し
てもよい。
【０１１９】 ある実施態様では、細胞貯蔵プールから細胞表面へのP-セレクチンの移動を増
加または促進する、または細胞表面P-セレクチンのたんぱく分解切断を増加また
は促進するP-セクレチン活性の誘導物質は、循環する可溶性P-セレクチン量の増
加に効果的であるため、止血活性を変調することができる。または、P-セレクチ
ン遺伝子発現（例えばP-セレクチン遺伝子転写または翻訳）または膜貫通ドメイ
ンのないP-セレクチンの代替的にスプライスされたアイソフォームの発現を刺激
する化合物を用いて、止血を誘導することができる。さらに、可溶性P-セレクチ
ンアゴニストなどのP-セレクチン活性を促進するP-セレクチン活性の誘導物質を
本発明に従って用い、止血を誘導することも可能である。別の実施態様では、P-
セレクチン活性を模倣するP-セレクチン活性の誘導物質を用いて、止血活性を変
調することも可能である。例えば、細胞上のP-セレクチンリガンドまたはレセプ
タに結合しそれらを活性化する抗体などのP-セレクチン活性の誘導物質を用いて
、止血を変調することができる。ある実施態様では、PSGL-1に対する抗体、好ま
しくは活性化抗体を細胞上のPSGL-1に結合させ、止血活性を変調する。別の実施
態様では、P-セレクチン活性の誘導物質を細胞上のP-セレクチンリガンドまたは
レセプタに結合させ、組織因子を含有するマイクロ粒子の放出を誘導する。
【０１２０】 P-セレクチン活性のこのような誘導物質には、有機低分子、ペプチド、抗体な
どが、それらに限定されずに含まれてよい。
【０１２１】 本願明細書に記載のP-セレクチン活性の誘導物質は、単体で投与してもよく、
または、もしくは第VIII因子、フォンウィルブランド因子、血小板、吸収類似体
DDAVP、及びフィブリン接着剤などのフィブリンがそれらに限定されずに含まれ
る、その他の抗出血性またはプロコアギュラント薬剤、化合物または組成物と共
に投与してもよい。ある実施態様では、本願明細書に記載のP-セレクチン活性の
誘導物質を、例えば血友病Aまたはフォンウィルブランド病などを罹患する患者
で、患者の体内で第VIII因子に対する抗体が生じて第VIII因子置換療法のみの有
効性が低下している患者に投与してもよい。
【０１２２】 C. 薬理ゲノミクス 例えば本願明細書に記載のスクリーニングアッセイによって同定されたP-セレ
クチン活性の変調物質、または可溶性P-セレクチンポリペプチドを患者に投与し
、異常なまたは不必要な止血活性を伴う止血障害を処置（予防または治療）する
ことができる。このような処置とともに、薬理ゲノミクス（すなわち患者の遺伝
子型とその患者の外来化合物または薬物に対する応答の関連性の研究）を考慮し
てもよい。治療薬の代謝の差のために、薬理学的に活性な薬物の投与量と血中濃
度の関連性を変化させると、重篤な毒性または治療過誤を引き起こす可能性があ
る。従って、医師または臨床家は、P-セレクチン活性の変調物質または可溶性P-
セレクチンポリペプチドの投与を決定する場合には、関連する薬理ゲノミクス研
究から得られる知見の適用を考慮し、また、P-セレクチン活性の変調物質または
可溶性P-セレクチンポリペプチドの用量及び／または治療方法を個別に調整する
ことを考慮してもよい。
【０１２３】 薬理ゲノミクスは、患者における薬物素因の変化及び異常作用のために生じる
、薬物に対する応答についての臨床的に重要な遺伝的バリエーションを扱う。例
えばEichelbaum, M. et al. (1996) Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23(10-11
): 983-985 and Linder, M.W. et al. (1997) Clin. Chem. 43(2):254-266参照
。一般に、薬理遺伝学的条件は２種類に分けられる。薬物の体への作用のし方を
変化させる単一因子（薬物作用の変化）として伝達される遺伝的条件、または体
の薬物への作用のし方を変化させる単一因子（薬物代謝の変化）として伝達され
る遺伝的条件である。このような薬理遺伝学的条件は、まれな遺伝子欠陥か、ま
たは自然発生の多型のいずれかとして生じうる。例えば、グルコース-6-リン酸
デヒドロゲナーゼ欠損（G6PD）は一般的な遺伝的酵素欠損症で、主要な臨床合併
症は酸化剤（抗マラリア剤、スルホンアミド、鎮痛剤、ニトロフラン）またはソ
ラマメの摂取後に生じる溶血である。
【０１２４】 「ゲノムワイドアソシエーション（genome-wide association）」として知ら
れる、薬物応答を予測する遺伝子の同定を薬理ゲノミクスで行う方法は、既知の
遺伝子関連マーカ（例えば、ヒトゲノム上のそれぞれが２つの変種を有する60,0
00乃至100,000の多型もしくは可変部位でからなる「二対立」遺伝子マーカマッ
プ）からなるヒトゲノムの高分解能マップに主に依存する。このような高分解能
遺伝子マップを、第II相及び第III相臨床試験に参加している統計学的に有意な
数の患者それぞれのゲノムマップと比較して、観察された特定の薬物応答または
副作用に関連するマーカを同定することができる。または、このような高分解能
マップは、ヒトゲノム中の既知の一塩基多型（SNP）数千万個を組み合わせて作
製することもできる。ここで用いられる「SNP」とは、一本のDNAの一ヌクレオチ
ド塩基中に生じる、頻度の高い変化である。SNPは、疾患の進行に関与すること
もあるが、大半は疾患に関与していないと考えられている。このようなSNPの発
生に基いた遺伝子マップの場合、ゲノム中のSNPの特定のパターンによって個人
を遺伝子カテゴリーに分類することができる。このような場合、遺伝子が似てい
る個人に一般的であろうと考えられる形質を考慮して、遺伝子が似ている個人の
グループにあわせて治療方法を調整することができる。
【０１２５】 または、「候補遺伝子アプローチ」と呼ばれる方法を用いて、薬物応答を予測
する遺伝子を同定することができる。この方法によると、薬物標的をコードする
遺伝子が既知であれば（例えばP-セレクチン）、その遺伝子によく見られる変種
すべてを集団の中から容易に同定することができ、ある種類の遺伝子とは別の種
類の遺伝子を有することが特定の薬物応答に関連するかどうかを決定することが
できる。
【０１２６】 ある例示的な実施例では、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強度及び持続時
間の両方の主要な決定因子である。薬物代謝酵素の遺伝子多型（例えばN-アセチ
ルトランスフェラーゼ2（NAT2）、及びシトクロームP450酵素CYP2D6及びCYP2C19
）の発見によって、標準で安全な量の薬物を摂取した後に、患者によって期待通
りの薬物効果が得られなかったり、または過剰な薬物応答を示す理由が明らかに
なった。このような多型は、集団の中で２つの表現型を発現し、高代謝能群（ex
tensive metabolizer; EM）及び低代謝能群（poor metabolizer; PM）に分かれ
る。PMの発生率は集団によって異なる。例えば、CYP2D6をコードする遺伝子は高
度に多型で、PMの中にいくつかの突然変異が同定されており、その突然変異はす
べて機能的CYP2D6を欠損させる。CYP2D6及びCYP2C19の低代謝能群の場合、標準
の投与量を投与されてもきわめて頻回に過剰な薬物応答と副作用を経験する。代
謝物が活性治療部分である場合、コデインのCYP2D6形成代謝物モルフィンが媒介
するコデインの鎮痛作用が示すように、PMは治療反応を示さない。この対極にあ
るのが標準投与量には反応しない、いわゆる超迅速代謝群である。最近、超迅速
代謝の分子ベースが明らかになり、CYP2D6遺伝子増幅が原因であることが判明し
た。または、「遺伝子発現プロファイリング」といわれる方法を用いて、薬物応
答を予測する遺伝子を同定することができる。例えば、薬物（例えば本発明の可
溶性P-セレクチンポリペプチドまたはその変調物質）を投与された動物の遺伝子
発現は、毒性に関連する遺伝子経路のスイッチがオンになっているかどうかを示
す指標とすることができる。
【０１２７】 ２つ以上の上述の薬理ゲノミクスアプローチから得られた知見を用いて、各個
人について、予防または治療処置のために適切な用量または治療方法を決定する
ことができる。この知見が、投与量の決定または薬物選択に適用されれば、有害
作用または治療過誤を回避することができ、従って、可溶性P-セレクチンポリペ
プチドまたは可溶性P-セレクチン変調物質で被験体を処置する場合、治療または
予防効果を促進させることができる。
【０１２８】 VI. スクリーニングアッセイ 本発明は、変調因子、すなわち候補またはテスト化合物または薬剤を同定する
ための方法（ここでは「スクリーニングアッセイ」ともいう）で、P-セレクチン
活性を変調し、その結果止血ポテンシャルを変調するために用いることができる
方法を提供する。
【０１２９】 このアッセイは、例えば可溶性P-セレクチンポリペプチドなどのP-セレクチン
ポリペプチドに結合し、P-セレクチンポリペプチドと相互作用する他のたんぱく
に結合し、例えばP-セレクチンリガンドなど他のたんぱく質とP-セレクチンポリ
ペプチドの相互作用を変調し、その結果P-セレクチン活性を変調する化合物を同
定するように設計される。スクリーニングアッセイを用いて、例えばP-セレクチ
ン遺伝子発現、可溶性P-セレクチンアイソフォームをコードするP-セレクチン遺
伝子の代替的スプライシング、細胞貯蔵プールから細胞表面へのP-セレクチンの
移動、及び可溶性P-セレクチンの放出を引き起こす細胞表面上のP-セレクチンの
たんぱく分解切断を調節するP-セレクチン活性の変調物質を同定することができ
る。さらに、スクリーニングアッセイを用いて、例えばP-セレクチンとP-セレク
チンリガンドまたはレセプタの結合などのP-セレクチンポリペプチドの活性、ま
たはP-セレクチン感受性細胞に対するP-セレクチンの活性を模倣するP-セレクチ
ン活性の誘導物質を同定することができる。このような化合物には、ペプチド、
抗体、または有機または無機低分子が、それらに限定されずに含まれる。
【０１３０】 本願明細書に記載のアッセイなどのアッセイによって同定された化合物は、例
えば止血の変調、及び止血障害及び／または血管系関連疾患の処置に有用である
可能性もある。止血障害または血管系関連疾患が凝固レベルの全体的な低下に起
因する場合、有用な化合物によって、例えばP-セレクチン活性の誘導物質などP-
セレクチン活性のレベルが効果的に上昇するだろう。止血障害が凝固または血栓
形成の全体的な高レベルに起因する場合、P-セレクチン活性のレベルを低下させ
る化合物、例えばP-セレクチン活性の阻害物質などが有用であろう。このセクシ
ョンに記載されたような技術によって同定された化合物の有効性をテストするた
めの細胞または動物モデルは、本願明細書で検討する。
【０１３１】 テスト化合物は、生物学的ライブラリ、空間アドレス指定可能平行固相または
液相ライブラリ、デコンボリューションを必要とする合成ライブラリ法、「１ビ
ード１化合物」ライブラリ法、及び親和性クロマトグラフィ抽出を用いた合成ラ
イブラリ法などを含む当業に公知のコンビナトリアルライブラリ法における多数
のアプローチのいずれかを用いて、得ることができる。生物学的ライブラリアプ
ローチはペプチドライブラリに限定されるが、その他の４アプローチはペプチド
、非ペプチドオリゴマー、または化合物の低分子ライブラリに適用される(Lam,
K.S. (1997) Anticancer Drug Des. 12:145)。
【０１３２】 分子ライブラリの合成方法の例は当業で見つけることができ、例えばDeWitt e
t al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909; Erb et al. (1994)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med.
Chem. 37:2678; Cho et al. (1993) Science 261:1303; Carrell et al. (1994)
Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem.
Int. Ed. Engl. 33:2061; 及び Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233
にも見つけることができる。
【０１３３】 化合物のライブラリは、溶液中(例えばHoughten (1992) Biotechniques 13:41
2-421), またはビーズ上 (Lam (1991) Nature 354:82-84), チップ (Fodor (199
3) Nature 364:555-556), 細菌(Ladner USP 5,223,409), 胞子 (Ladner USP ‘4
09), プラスミド (Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869)
またはファージ上 (Scott and Smith (1990) Science 249:386-390); (Devlin
(1990) Science 249:404-406); (Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci
. 87:6378-6382); (Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310); (Ladner 同
上.)にあってよい。
【０１３４】 ある実施態様では、アッセイは、細胞とテスト化合物を接触させることを含み
、P-セレクチン活性を変調（誘導または阻害）するテスト化合物の能力を決定す
る、細胞ベースのアッセイである。例えば、白血球など、P-セレクチンリガンド
またはレセプタを発現する細胞を、そのまま、またはテスト化合物の存在下にお
いて可溶性P-セレクチンポリペプチドと接触させ、ここに記載するように、可溶
性P-セレクチンが誘導する、組織因子を含有するマイクロ粒子の放出を変調する
テスト化合物の能力を測定する。同様の細胞ベースのアッセイを用いて、例えば
テスト化合物が組織因子を含有するマイクロ粒子の放出を誘導する能力をアッセ
イすることによって、可溶性P-セレクチン止血活性を模倣する化合物を同定する
こともできる。
【０１３５】 さらに、別の実施態様では、細胞ベースのアッセイを用いて、P-セレクチンの
細胞表面への移動を変調する、またはP-セレクチンの細胞表面からのたんぱく分
解解離を変調する、テスト化合物の能力を測定することができる。細胞の表面上
におけるP-セレクチンの存在は、フローサイトメトリなどの標準技術によって評
価することができる。P-セレクチンの切断と同時に生じる可溶性P-セレクチンの
放出は、膜関連P-セレクチン量を培養培地における可溶性P-セレクチン量と比較
して測定することにより評価することができる。
【０１３６】 さらなる実施態様では、P-セレクチン活性の変調物質を、候補化合物に細胞を
接触させて、標準技術によって細胞培養液中の可溶性P-セレクチンmRNAまたはた
んぱくの発現を測定する方法によって同定する。候補化合物の存在下における可
溶性P-セレクチンmRNAまたはたんぱくの発現量を、候補化合物の欠如下における
可溶性P-セレクチンmRNAまたはたんぱくの発現量と比較する。こうして、この比
較に基づいて、候補化合物を可溶性P-セレクチン活性の変調物質と同定すること
ができる。例えば、候補化合物の存在下における可溶性P-セレクチンmRNAまたは
たんぱくの発現が、候補化合物の欠如下の発現よりも大きい（統計学的に有意に
大きい）場合、候補化合物はP-セレクチン活性の誘導物質であると同定される。
または、候補化合物の存在下における可溶性P-セレクチンmRNAまたはたんぱくの
発現が、候補化合物の欠如下の発現よりも小さい（統計学的に有意に小さい）場
合、候補化合物はP-セレクチン活性の阻害物質であると同定される。
【０１３７】 別の実施態様では、レセプタまたはリガンドに結合する可溶性P-セレクチンを
変調するテスト化合物の能力は、可溶性P-セレクチンの結合を、複合体中の標識
された可溶性P-セレクチンを検出することによって測定することができるような
放射性同位体、または酵素標識を有する可溶性P-セレクチンと結合させることに
よって、決定することができる。例えば、化合物（例えばP-セレクチンポリペプ
チド、P-セレクチンリガンド）を直接的または間接的に125I、35S、14C、または3 Hで標識し、その放射性同位体を放射能を直接計測するか、またはシンチレーシ
ョン計測によって検出することができる。さらに、化合物を例えば西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標
識し、その酵素ラベルを、適切な基質の産生物への転換を測定することによって
検出することができる。
【０１３８】 本願明細書に記載し例示する動物モデル、例えばP-セレクチンマウス及びvWF
欠損マウスなどの止血機能または疾患のモデルとして働く動物ベースシステムに
は、非組換え動物及び組換えトランスジェニック動物が、それらに限定されずに
含まれる。インビボにおける血管系関連疾患の研究用モデルには、腫瘍形成、腫
瘍転位、及び動脈硬化の動物モデルが含まれる。インビボにおける血栓障害の研
究用のモデルには、少なくとも例えばLeadley et al. (2000) J Pharmacol Toxi
col Methods 43:101, and Dorffler-Melly, et al. (2000) Basic Res Cardiol
95:503に記載の動物モデルなどの血栓形成動物モデルが含まれる。
【０１３９】 動物を用いたモデルシステムは、例えばP-セレクチン活性の変調物質である化
合物を同定するためにデザインされたスクリーニング戦略の一部としてなど、様
々な応用方法に用いることも可能である。従って、この動物を用いたモデルを用
いて、止血の変調並びに止血障害及び血管系関連疾患の処置に効果的であると考
えられる薬物、製剤、治療及び介入を同定することができると考えられる。例え
ば、動物モデルをP-セレクチン活性を変調する能力があると考えられる化合物と
接触させ、その接触に対する動物の応答を処置の前後で止血活性を評価すること
によってモニターしてもよい。止血活性の評価は、例えば血漿凝固時間検査など
臨床的に確立した検査、または例えば灌流チャンバーにおけるフィブリン形成、
可溶性P-セレクチン及びフィブリノーゲンの血漿濃度、局所シュワルツマン反応
における出血病変、組織因子活性など、本願明細書に例示された方法を用いるこ
とができる。
【０１４０】 別の態様では、本発明は本願明細書に記載の２つ以上のアッセイの組み合わせ
に関連する。例えば、P-セレクチン活性の変調物質は細胞を用いたアッセイで同
定することが可能で、P-セレクチン活性を変調する物質の能力は、インビボにお
いて、例えば止血または止血障害の動物モデルなどの動物において確認すること
ができる。
【０１４１】 本発明はさらに、上述のスクリーニングアッセイによって同定される新規物質
に関連する。従って、本願明細書に記載のP-セレクチン活性変調物質の止血ポテ
ンシャル能力を、適切な動物モデルにおいてさらに検査することは、本願発明の
範囲内である。例えば、P-セレクチン活性の誘導物質または阻害物質を用いて、
動物モデルにおいて、動物被験体のLD50及びED50を決定することが可能で、この
ようなデータを用いて、止血活性の変調物質の可能性があるこのような物質で処
理する時のインビボにおける有効性、毒性、または副作用を判定することができ
る。
【０１４２】 介入に関しては、P-セレクチン活性及び／または止血ポテンシャルを変調する
いずれの処置も、ヒト治療介入の候補として考慮されるべきである。テスト物質
の用量は、用量反応曲線から決定してもよい。さらに、本発明は、本願明細書に
記載の通り、止血を変調する新規に同定されたP-セレクチン活性変調物質の使用
に関連する。
【０１４３】 さらに、遺伝子発現パターンを用いて、例えばP-セレクチン活性変調物質など
の化合物が止血を変調する能力を評価してもよい。例えば、一つ以上の遺伝子の
発現パターンは、「遺伝子発現プロフィール」または「転写プロフィール」の一
部を形成し、このような評価に使用してもよい。ここで用いられる「遺伝子発現
プロフィール」または「転写プロフィール」には、特定の条件がそろっている状
況下において、特定の組織または細胞種に得られるmRNA発現のパターンが含まれ
る。このような条件には、例えば局所的シュワルツマン反応、またはP-セレクチ
ン欠損またはvWF欠損動物モデルにおける、本願明細書に記載の対照または実験
条件すべてを含む、止血障害及び／または血管系関連疾患が、それらに限定され
ずに含まれる。遺伝子発現プロフィールは、例えばディファレンシャルディスプ
レー法、ノーザン分析法、及び／またはRT-PCRを用いて作成することができる。
ある実施態様では、P-セレクチン遺伝子配列を、このような遺伝子の発現プロフ
ィールの作成及び確証のためにプローブ及び／またはPCRプライマとして用いて
もよい。
【０１４４】 遺伝子発現プロフィールは、例えば本願明細書に記載の動物を用いたモデルシ
ステムにおける止血疾患状態かまたは正常状態のいずれかの既知の状態を特徴づ
けることもできる。その後、これら既知の遺伝子発現プロフィールを比較して、
このような遺伝子発現プロフィールを変更し、そのプロフィールがさらに望まし
いプロフィールにさらによく似るように、テスト化合物の作用を確認してもよい
。
【０１４５】 例えば、化合物の投与を投与することにより、止血障害モデルの遺伝子発現プ
ロフィールを対照システムのプロフィールにさらによく似たものにすることもで
きる。
【０１４６】 VI. 予知医学 本発明は、診断アッセイ、予後アッセイ、及び臨床試験の監視を予後（予知）
目的に用い、それによって個人を予防的に処置する、予知医学の分野にも関連す
る。従って、本発明のある態様は、生物学的サンプル（例えば血液、血清、細胞
、組織）の意味合いで、例えば可溶性P-セレクチン発現などのP-セレクチン発現
を決定し、それにより止血活性を決定して、ある個人が止血障害を罹患している
、または止血障害の発症のリスクがあるかどうかを判定するための診断アッセイ
に関連する。本発明は、ある個人にプロコアギュラント状態が顕在化しているか
どうかを判定する予後（予知）アッセイも提供する。このようなアッセイは、止
血を変調し、それによって止血障害の発症前に個人を予防的に処置する、予後ま
たは予知目的に用いることができる。
【０１４７】 本発明の別の態様は、臨床試験において、薬剤が止血活性またはプロコアギュ
ラント状態に与える影響をモニターすることに関連する。
【０１４８】 これら及びその他の物質については、以下のセクションでさらに詳述する。
【０１４９】 A. 診断アッセイ 本発明は、止血疾患症状の診断または予後評価方法、及びこのような症状への
素因を示す被験体の同定方法を包含する。
【０１５０】 生物学的サンプルにおける止血活性の有無を検出する例示的な方法は、生物学
的サンプルを被験体から採取するステップと、P-セレクチン活性の存在が生物学
的サンプル中に検出されるように、例えば可溶性P-セレクチンたんぱくを検出す
るP-セレクチン結合物質など、P-セレクチン活性を検出することが可能な化合物
または物質と例えば血液サンプルなどの生物学的サンプルを接触させるステップ
を含む。
【０１５１】 可溶性P-セレクチンたんぱくを検出するために好ましい物質は、可溶性P-セレ
クチンたんぱくと結合することができる抗体で、好ましくは検出可能な標識を有
する抗体である。抗体はポリクローナルであってよく、またはさらに好ましくは
モノクローナルである。完全状態の抗体、またはその断片（例えばFabまたはF(a
b')2）を用いることができる。プローブまたは抗体に関して「標識された」とい
う用語は、プローブまたは抗体に検出可能な物質を結合（すなわち物理的な連結
）させることによるプローブまたは抗体の直接的標識、及び直接的に標識された
別の試薬との反応によるプローブまたは抗体の間接的標識を包含することを意図
する。間接的標識の例には、蛍光標識した二次抗体を用いた一次抗体の検出、及
び蛍光標識されたストレプタビジンによって検出されるように行われるビオチン
によるDNAプローブの末端標識が含まれる。
【０１５２】 「生物学的サンプル」という用語には、被験体から単離した細胞及び生物学的
液体、及び被験体の体内に存在する細胞または液体が含まれることを意図する。
従って、本発明の検出方法を用いて、インビトロにおける生物学的サンプル及び
インビボにおいてP-セレクチン活性を検出することができる。P-セレクチンたん
ぱくの検出用のインビトロ技術には、酸素結合免疫吸着検査法（ELISA）、ウェ
スタンブロット法、免疫沈殿法及び免疫蛍光法などが含まれる。ウェスタンブロ
ット分析法の実施方法の詳細な説明は、Sambrook et al., 1989, 同上、第１８
章を参照のこと。本願明細書で用いられるたんぱく質検出方法及び単離方法は、
例えばその内容全体を本願明細書に引用したものとするHarlow and Lane (Harlo
w, E. and Lane, D., 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)に記載されている
方法などでもよい。
【０１５３】 P-セレクチンの検出は、例えば光学顕微鏡、フローサイトメトリーまたは蛍光
分析による検出法と組み合わせた蛍光標識抗体を用いた免疫蛍光技術（後述）な
どによって行うことができる。
【０１５４】 抗原または抗体を結合することができる支持体として、固相支持体または担体
が用いられることが多い。公知の支持体または担体には、ガラス、ポリスチレン
、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然
または改質セルロース、ポリアクリルアミド、斑レイ岩、または磁鉄鉱などが含
まれる。担体の性質は、ある程度可溶性であるか、または本発明の目的のために
不溶性であってよい。支持体の材料は、結合した分子が抗原または抗体と結合す
る能力があれば、事実上いずれの可能な構造形態であってもよい。したがって、
支持体の形態はビーズのように球形、または試験管の内部表面もしくはロッドの
外部表面のように円柱状であってもよい。または、その表面はシート、テストス
トリップなどのように平面であってもよい。当業者は、抗体または抗原を結合す
るのに適切なその他の担体を理解するであろうし、または日常の実験で使用され
る前述のものを確認することができるであろう。
【０１５５】 抗P-セレクチンポリペプチド特異的抗体を標識する１つの方法は、酵素に結合
させて、酵素免疫アッセイ（EIA）を用いる方法である(Voller, "The Enzyme Li
nked Immunosorbent Assay (ELISA)", Diagnostic Horizons 2:1-7, 1978, Micr
obiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, MD; Voller,
et al., J. Clin. Pathol. 31:507-520 (1978); Butler, Meth. Enzymol. 73:48
2-523 (1981); Maggio, (ed.) Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton,
FL, 1980; Ishikawa, et al., (eds.) Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Toky
o, 1981)。抗体に結合する酵素は、適切な基質、好ましくは色素産生基質と、例
えば分光光度法、蛍光分析法、または視覚的な方法などによって、検出可能な化
学部分を生成するように反応するだろう。検出できるように抗体を標識するため
に用いることができる酵素には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレ
アーゼ、d-5-ステロイドイソメラーゼ、酵母菌アルコールデヒドロゲナーゼ、a-
グリセロホスフェート、デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西
洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グル
コースオキシダーゼ、b-ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カ
タラーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、及びア
セチルコリンエステラーゼが、それらに限定されずに含まれる。検出は、酵素用
の色素産生基質を用いて比色法によって行うことができる。検出は、基質の酵素
反応の程度を同様に調整した標準と比較する視覚的な比較によって行うことも可
能である。
【０１５６】 その他の各種免疫アッセイのいずれかを用いて検出を行うことも可能である。
例えば、抗体または抗体断片を放射標識することにより、放射免疫アッセイ（RI
A）を用いて野生種または突然変異ペプチドのフィンガープリントを検出するこ
とが可能である（例えばその内容を本願明細書に引用したものとするWeintraub,
B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioli
gand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986を参照）。放射
性同位体は、ガンマ線カウンタまたはシンチレーションカウンタを使用する方法
によって、またはオートラジオグラフィによって検出することができる。
【０１５７】 抗体を蛍光化合物で標識することも可能である。蛍光標識した抗体に適切な波
長の光を当てると、その存在は蛍光によって検出される。最も頻繁に用いられる
蛍光標識化合物の中には、蛍光イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリト
リン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタルデヒド、及びフルオレス
カミンである。
【０１５８】 抗体は、152Euまたはその他のランタニドなどの蛍光金属を用いて検出用に標
識することもできる。この金属は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（DTPA）ま
たはエチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）などの金属キレート基を用いて、抗体
に結合させることができる。
【０１５９】 抗体は、化学発光化合物に結合させることによって、検出できるように標識す
ることもできる。化学発光タグを付けた抗体の存在は、化学反応中に生じる傾向
の存在を検出して、測定する。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノー
ル、イソルミノール、テロマト酸アクリジニウムエステル、イミダゾール、アク
リジニウム塩及びオキサル酸エステルである。
【０１６０】 同様に、生物蛍光化合物を用いて、本発明の抗体を標識することも可能である
。生物蛍光は、生物システム内で発見された化学発光の一種で、触媒たんぱく質
が化学発光反応の有効性を増加させる。生物発光たんぱくの存在は、発光の存在
を検出して判定する。ラベル用の重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシ
フェラーゼ、及びエクオリンである。
【０１６１】 さらに、P-セレクチンたんぱく検出用のインビボにおける技術には、標識され
た抗P-セレクチン抗体を被験体に導入するステップを含む。例えば、その抗体は
放射性マーカーで標識されていてよく、被験体におけるそのマーカーの存在また
は位置は標準の画像技術によって検出することができる。
【０１６２】 ある実施態様では、生物学的サンプルは被験体から採取したたんぱく分子を含
有する。好ましい生物学的サンプルは、被験体から従来方法（例えば静脈穿刺）
によって単離した血液サンプルである。
【０１６３】 さらに、可溶性P-セレクチンを検出するための上述の方法のいずれも、処置ま
たは治療の経過をモニターするために用いることができる。
【０１６４】 別の実施態様では、その方法はさらに、対照被験体から対照生物学的サンプル
を採取するステップ、P-セレクチン活性の存在が生物学的サンプル中に検出され
るように、例えば可溶性P-セレクチンなどのP-セレクチン活性の能力のある化合
物または物質と対照サンプルを接触させるステップ、及び対照サンプル中に存在
するP-セレクチン活性と検査用サンプル中に存在するP-セレクチン活性を比較し
て止血活性を評価するステップを含む。
【０１６５】 ある実施態様では、P-セレクチン活性が高レベルである場合、例えばプロコア
ギュラント状態など、止血活性が高いことを示唆する。別の実施態様では、P-セ
レクチン活性が低レベルである場合、例えば凝固機能低下状態など、止血活性が
低いことを示唆する。
【０１６６】 B. 予後アッセイ 本願明細書に記載の診断方法を用いて、さらに、例えば異常なまたは不必要な
止血活性（すなわち血栓障害、出血性障害）を伴う障害など、止血障害を罹患す
る、または発症リスクのある被験体を同定することができる。ここに記載のよう
に、「異常」という用語には、特定の生理学的条件下において、臨床的に確立し
た止血活性の正常値から外れる止血活性レベルが含まれる。異常な止血活性には
、止血活性の上昇または定価が含まれる。ここで用いられる「不必要な」という
用語には、出血または血栓形成などの生物学的応答に関与する不必要な現象が含
まれる。例えば、不必要なという用語には、被験体において望ましくない止血活
性が含まれる。
【０１６７】 前述の診断アッセイまたは後述のアッセイなど、本願明細書に記載のアッセイ
を用いて、止血障害を罹患するまたは発症リスクのある被験体を同定することが
できる。したがって、本発明は、検査用サンプルを被験体から採取してP-セレク
チン活性を検出することによって、異常なまたは不必要な止血活性を伴う止血障
害を同定する方法で、異常なまたは不必要なP-セレクチン活性の存在によって、
止血障害を罹患するまたはその発症リスクのある被験体を診断する方法を提供す
る。ここで用いる「検査用サンプル」は、対象の被験体から採取した生物学的サ
ンプルのことをいう。例えば、検査用サンプルは、生物学的液体（たとえば血清
）、細胞サンプル、または組織であってよい。
【０１６８】 さらに、ここに記載の予後アッセイを用いて、止血障害を処置するために、被
験体に物質（例えばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模擬体、たんぱく質
、ペプチド、核酸、低分子、またはその他の候補薬物）を投与してよいかどうか
を判定することができる。例えば、そのような方法を用いて、被験体が出血性障
害または血栓障害用の物質で効果的に処置できるかどうかを決定することができ
る。したがって、本発明は、被験体から検査用サンプルを採取して（例えばP-セ
レクチン活性レベルによって、止血障害を処置する物質を投与しもよい被験体を
診断することができるように）P-セレクチン活性を検出し、その被験体を、例え
ば異常なまたは不必要な止血活性を伴う障害などの止血障害用の物質で効果的に
処置できるかどうかを判定する方法を提供する。
【０１６９】 さらに、P-セレクチン活性が発現している細胞種または組織はいずれもここに
記載の予後アッセイに用いてもよい。
【０１７０】 C. 臨床試験中の作用の監視 本発明は、薬物の有効性を評価し、止血障害の処置のための臨床試験に参加す
る患者の経過を監視する方法を提供する。
【０１７１】 物質（たとえば薬物）がP-セレクチン活性に及ぼす作用の監視は、基本的な薬
物スクリーニングだけでなく、臨床試験にも適用することができる。例えば、低
下したまたは不十分な止血活性を呈する被験体の臨床試験において、本願明細書
に記載のスクリーニングアッセイによってP-セレクチン活性を誘導することが判
明した物質の有効性を監視することができる。または、たとえば血栓形成または
プロコアギュラント状態などの止血活性の上昇を呈する被験体の臨床試験におい
て、スクリーニングアッセイによってP-セレクチン活性を阻害することが判明し
た物質の有効性を監視することができる。このような臨床試験では、P-セレクチ
ン活性は止血活性の表示値（リードアウト）またはマーカーとして用いることが
できる。さらに、P-セレクチン活性レベルは、特定の薬物または物質の止血活性
への作用の表示値として用いてもよい。
【０１７２】 特定の実施態様では、本発明は、P-セレクチン活性変調物質（例えば、本願明
細書に記載のスクリーニングアッセイによって同定されたアゴニスト、アンタゴ
ニスト、ペプチド模擬体、たんぱく質、ペプチド、核酸、低分子またはその他の
候補薬物）による被験体の治療の有効性を監視する方法で、（i）その物質の投
与前に被験体から投与前サンプルを採取するステップと、（ii）投与前サンプル
中のP-セレクチン活性レベルを検出するステップと、（iii）該被験体から一つ
以上の投与後サンプルを採取するステップと、（iv）投与後サンプル中のP-セレ
クチンレベルを検出するステップと、（v）投与前と投与後のサンプル中のP-セ
レクチン活性レベルを比較するステップと、（vi）その結果に従って該被験体へ
の該物質の投与量を変化させるステップと、を含む方法を提供する。例えば、P-
セレクチン活性を検出レベルよりも高くなるように上昇させる、すなわちその物
質の効力を大きくして止血を促進するするためには、P-セレクチン活性の誘導物
質の投与量を増加させることが好ましいと考えられる。または、P-セレクチン活
性を検出レベルよりも低くなるように低下させる、すなわちその物質の効力を大
きくして止血を下方変調するためには、P-セレクチン活性の阻害物質の投与量を
増加させることが好ましいと考えられる。このような実施態様に従って、観測可
能な表現型応答が無い場合でも、P-セレクチン活性を物質の有効性の指標として
用いることも可能である。
【０１７３】 VII. 薬学的組成物 本発明の方法に使用するための活性化合物は、投与に適切な薬学的組成物に混
合することができる。ここで用いる「活性化合物」という用語には、可溶性P-セ
レクチン、可溶性P-セレクチンたんぱく及びそれらの活性断片、及び抗P-セレク
チン抗体をコードする核酸分子が含まれる。活性化合物には、可溶性P-セレクチ
ン活性の例えば誘導物質及び阻害物質などの変調物質、P-セレクチン発現、合成
、及びまたは活性を変調すると同定された化合物、または抗PSGL-1抗体などのP-
セレクチン活性を模倣する化合物も含まれる。このような組成物は一般に、化合
物、核酸分子、たんぱくまたは抗体と薬学的に許容な担体からなる。ここで用い
る「薬学的に許容な担体」という用語には、溶媒、分散媒、コーティング、抗生
剤または抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤など、薬学的投与に適合なものいずれ
か及びすべてを含むことを意図する。このような媒質及び物質を薬学的に活性な
物質に用いることは、当業に公知である。従来の媒質または物質のいずれかが活
性化合物に不適合でない限り、組成物におけるそれらの使用が考慮される。補助
活性化合物もその組成物に混合することができる。
【０１７４】 本発明の薬学的組成物は、意図される投与経路に適合するように調剤する。投
与経路の例には、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（局所
）、経粘膜、眼、及び直腸投与など、患部への直接導入を含む非経口投与が含ま
れる。非経口、皮内、または皮下での適用に用いる溶液または懸濁液には、注射
用水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリ
コール、またはその他の合成溶媒などの滅菌希釈液、ベンジルアルコールまたは
メチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなど
の抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、
またはリン酸塩などの緩衝剤、及び塩化ナトリウムまたはデキストロースなど張
性を調整する薬剤などの成分を含んでよい。pHは、塩酸、または水酸化ナトリウ
ムなどの酸または塩基で調整することができる。非経口製剤は、ガラス製または
プラスチック製のアンプル、ディスポーザブル注射筒、または多人数用バイアル
に封入することができる。
【０１７５】 注射用に適する薬学的組成物には、滅菌水溶液（水溶性の）または分散液、及
び滅菌注射溶液または分散液の即時調合製剤用滅菌粉末が含まれる。静脈投与用
に適切な担体には、生理食塩水、静菌水、クレモホールEL（Cremophor ELTM；B
ASF社製、ニュージャージー州パーシッパニー）またはリン酸緩衝食塩水（PBS）
が含まれる。すべての場合において、その組成物は滅菌されており、シリンジ注
入が容易であるようにある程度液状であるべきである。製造及び保存の条件下に
おいて安定でなければならず、細菌または真菌などの微生物の汚染作用から保護
しなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリ
セロール、プロピレングリコール、及び液状ポリエチレングリコールなど）及び
適切なそれらの混合物などを含有する液体または分散媒であってよい。適切な流
動性を維持するために、例えばレクチンなどのコーティングを使用し、分散液の
場合には必要な粒子サイズを保持し、界面活性剤を使用してよい。微生物の作用
の予防は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、
及びチメロサールなどの各種の抗菌剤または抗真菌剤によって行うことができる
。多くの場合、例えば糖、例えばマニトール、ソルビトールなどのポリアルコー
ル、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含むことが望ましい。組成物に例え
ばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅延させる物質を組
成物に含むことによって、注射用組成物の吸収を遅延することができる。
【０１７６】 滅菌注射用溶液は、必要量の活性物質（例えばP-セレクチン活性の誘導物質ま
たは阻害物質、可溶性P-セレクチン融合たんぱくなど）を上述の１つの成分また
は成分の組み合わせを含有する適切な溶媒と混合し、必要に応じてろ過滅菌する
ことによって調製することができる。一般に、分散媒は、活性物質を、基本分散
媒と上述の成分の中から必要なその他の成分を含む滅菌賦形剤に混合して調製す
る。滅菌注射用溶液の調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分
と前もってろ過滅菌した溶液から得た追加の望ましい成分の粉末を得ることがで
きる真空乾燥法及び凍結乾燥法である。
【０１７７】 一般に経口組成物には、不活性希釈液または食用担体が含まれる。それらを、
ゼラチンカプセルに封入するか、または錠剤に圧縮する。経口治療用投与の目的
のために、活性化合物を賦形剤と混合し、錠剤、トローチ、またはカプセル状に
して用いることができる。経口組成物は、洗口剤として用いるために液体担体を
用いて調製することも可能で、その場合、液体担体中の化合物を口腔内に塗布し
てはき出すかまたは飲み込む。薬学的に適合な結合剤及び／またはアジュバント
物質は、組成物の一部として含まれてよい。錠剤、丸剤、カプセル、トローチな
どは、マイクロ結晶性セルロース、トラガカントゴム、またはゼラチンなどの結
合剤、デンプンまたはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、プリモゲル（Prim
ogel）またはコーンスターチなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムまたはス
テロテス（Sterotes）などの潤滑剤、コロイド状二酸化シリコンなどの流動促進
剤、ショ糖またはサッカリンなどの甘味剤、またはペパーミント、サリチル酸メ
チル、またはオレンジ香料などの着香剤などの成分のいずれか、または同様の性
質の化合物を含有してもよい。
【０１７８】 吸入による投与の場合、例えば二酸化炭素などのガスなどの適切な噴霧体を含
有する圧縮容器またはディスペンサー、またはネブライザーからエアロゾルスプ
レー状に、化合物を出す。
【０１７９】 全身投与は、経粘膜または経皮投与によって行ってもよい。経粘膜または経皮
投与の場合、調剤の際にバリアを透過するのに適した浸透剤を使用する。このよ
うな浸透剤は、一般に当業に公知で、例えば経粘膜投与の場合、界面活性剤、胆
汁酸塩、及びフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐
剤によって行うことができる。経皮投与の場合、活性化合物を、一般に当業に公
知の軟膏、ゲル、またはクリームに調剤する。
【０１８０】 直腸送達の場合、化合物を坐剤（例えばカカオバターまたはその他のグリセリ
ドなどの従来の坐剤基質で）または貯留浣腸として調製することもできる。
【０１８１】 ある実施態様では、インプラントまたはマクロカプセル封入送達システムを含
む制御放出調剤など、化合物が急速に体内から排出されることを防ぐであろう担
体と共に活性化合物を調製する。例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリ
グリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸などの生分解性、
生適合性ポリマーを使用することができる。このような調剤の調製方法は、当業
者には明らかであろう。材料はアルザ社（Alza Corporation）及びの場ファーマ
シューティカルズ社（Nova Pharmaceuticals, Inc.）から購入することもできる
。リポソーム懸濁液（ウィルス性抗原に対するモノクローナル抗体を有する感染
細胞を標的としたリポソームを含む）も、薬学的に許容な担体として用いること
もできる。これらは、例えば米国特許第4,522,811号に記載の方法など、当業に
公知の方法に従って調製することができる。
【０１８２】 投与を容易にし用量を均一にするために、経口または非経口組成物を単回投与
剤形に調剤することが特に有益である。ここで用いる単回投与剤形という用語は
、投与を受ける被験体の単回投与に適した物理的に離散したユニットのことを意
味し、各ユニットは、望ましい治療効果を生じるように計算されあらかじめ決定
された量の活性化合物を、必要な薬学的担体と共に含有する。本発明の単回投与
剤形の明細は、活性化合物に固有の特徴、及び目的とする特定の治療効果、並び
に個人の治療用にこのような活性化合物を調合する際に当業に固有の限界により
記述され、及びそれらに依存する。ある実施態様では、「治療上有効な投与量」
とは、止血または止血ポテンシャルを変調させるのに十分な活性化合物の量のこ
とを意味する。別の実施態様では、治療上有効な投与量とは、止血障害または血
管系関連疾患の症状を改善するのに十分な活性化合物の量を意味する。さらに別
の実施態様では、治療上有効な投与量とは、可溶性P-セレクチンのレベルまたは
活性を変調するのに十分な活性化合物の量を意味する。
【０１８３】 このような化合物の毒性または治療効果は、LD50（集団の50%に致死的な投与
量）またはED50（集団の50%に治療効果がある投与量）を測定するなど、細胞培
養液または実験動物において標準の薬学的手順によって決定することができる。
毒性投与量と治療効果投与量の比は治療指数で、LD50/ED50の比で表すことがで
きる。大きい治療指数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物が使
用される場合、このような化合物に罹患組織部位を狙わせる送達システムのデザ
インは慎重に行い、罹患していない細胞への損傷の可能性を最小限にして副作用
を低減するべきである。
【０１８４】 細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータを、ヒトにおける用量の範
囲を調剤する場合に用いることができる。このような化合物の用量は、毒性が小
さいかまたは無いED50を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。この用量
は投与剤形及び投与経路に依存するこの範囲内で変化してもよい。本発明の方法
に用いたどの化合物も、治療上有効な投与量は細胞培養アッセイで初めに推測す
ることができる。一回投与分は、動物モデルにおいて、細胞培養において決定さ
れたIC50を含む循環血漿濃度の範囲になるように調合することが可能である。こ
のような知見を用いて、ヒトにおける有用な投与量をさらに正確に決定すること
ができる。血漿濃度は、例えば高分解能液体クロマトグラフィによって測定する
ことも可能である。
【０１８５】 ここで定義される、たんぱく質またはポリペプチドの治療上有効な量は、体重
1kgあたり約0.001乃至30 mg、好ましくは体重1kgあたり約0.01乃至25mg/kg、さ
らに好ましくは体重1kgあたり0.1乃至20mg/kg、よりさらに好ましくは、体重1kg
あたり約1乃至10mg/kg、2乃至9mg/kg、3乃至8mg/kg、4乃至7mg/kg、または5乃至
6mg/kgの範囲内である。当業者は、疾患または障害の重篤度、前の治療、被験体
の健康状態及び／または年齢、およびその他に罹患する疾患などをこれらに限定
されずに含む特定の因子が、被験体を効果的に処置するのに必要な用量に影響す
ると考えられることを理解するであろう。さらに、治療上有効な量のたんぱく質
、ポリペプチド、または抗体による被験体の処置には、単回の処置が含まれてよ
く、または好ましくは一連の処置が含まれてよい。
【０１８６】 好ましい実施例では、被験体は、体重1kgあたり約0.1乃至20mgの範囲内の抗体
、たんぱく質、またはポリペプチドを、約１乃至１０週間、好ましくは２乃至８
週間、さらに好ましくは３乃至７週間、よりさらに好ましくは約４，５，または
６週間の間、週に１回処置する。処置に用いる抗体、たんぱく質、またはポリペ
プチドの効果的な用量は、特定の処置の経過中に増加または現象させてもよいと
いうことは理解されよう。本願明細書に記載の診断アッセイの結果によって用量
は変化し、その変化は該アッセイの結果から明らかになると考えられる。
【０１８７】 本発明は、可溶性P-セレクチン発現または活性を変調する活性物質を包含する
。物質は例えば低分子であってよい。例えば、そのような低分子には、ペプチド
、ペプチド模擬体、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレ
オチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、分子量が1モルあたり約10,
000gの有機または無機化合物（すなわちヘテロ有機化合物及び有機金属化合物を
含む）、分子量が1モルあたり約5,000gの有機または無機化合物、分子量が1モル
あたり約1,000gの有機または無機化合物、分子量が1モルあたり約500gの有機ま
たは無機化合物、及び塩、エステル、及びこのような化合物のその他の薬学的に
許容な形状が、それらに限定されずに含まれる。低分子物質の適切な投与量は、
当業の医師、獣医、または研究者の知識の範囲内における多数の因子に依存する
ものであることは理解されよう。低分子の投与量は、例えば被験体または処置さ
れるサンプルの素性、大きさ、及び状態に依存し、さらには該当する場合にはそ
の組成物を投与する経路、及び施行者が小分子に望む本発明の核酸またはポリペ
プチドへの作用に依存して変化するだろう。
【０１８８】 例示的な投与量には、被験体またはサンプル重量1kgあたり低分子がミリグラ
ムまたはマイクログラムの量が含まれる（例えば約1mg/kg乃至約500mg/kg、約10
0mg/kg乃至約5mg/kg、または約1mg/kg乃至約50mg/kg。さらに、低分子の適切な
投与量は、変調されるべき発現及び活性に関する低分子の効力に依存することも
理解されよう。このように適切な投与量は、本願明細書に記載のアッセイを用い
て決定してもよい。１種類以上のこのような低分子を、本発明のポリペプチドま
たは核酸の発現または活性を変調するために動物（例えばヒト）に投与する場合
、医師、獣医、または研究者は、例えば最初に比較的低い投与量を処方し、次い
で適切な応答が得られるまで投与量を増加させてもよい。さらに、ある動物被験
体に特異的な投与量は、使用した特定の化合物の活性、年齢、体重、健康状態、
性別、及び被験体の食餌、投与時間、投与経路、排出率、薬物の組み合わせ、及
び変調すべき発現または活性の程度などの各種因子に依存する。
【０１８９】 本発明のある実施態様では、P-セレクチン活性の変調物質を、他の物質（たと
えば低分子）と組み合わせて、または別の補足的な処置方法と共に投与する。例
えば、ある実施態様では、P-セレクチン活性の誘導物質を用いて、血管系関連疾
患を処置する。血管系関連疾患が腫瘍である場合、被験体をP-セレクチン活性の
誘導物質で処置し、さらに、例えば主要の成分または凝固因子に機能的に結合し
た腫瘍関連血管系（例えばVCAM-1）に結合する第一の結合領域、または凝固因子
に結合して疾患部位における処置の有効性を増加させる第二の結合領域などの腫
瘍関連血管系におけるプロコアギュラント状態を誘導する用に作用する分子で処
置してもよい。その他の血管系関連疾患の患部の血管を、同様に凝固因子または
プロコアギュラント物質の標的にし、P-セレクチン活性の誘導物質の作用を促進
してもよい。別の実施態様では、P-セレクチン活性の阻害物質を、例えば医療介
入後の再狭窄など血栓形成障害の治療において、抗凝固物質（例えばインテグリ
ン阻害剤、アスピリン、ヘパリン）と共に用いてもよい。
【０１９０】 さらに、抗体（またはその断片）を、毒素、治療物質、または放射性金属イオ
ンなどの治療部分と複合体形成させてもよい。本発明の複合体は、特定の生物学
的応答を修飾するために用いることが可能で、その薬物部分は従来の化学治療物
質に限定されるとは見なさない。例えば、薬物部分は望ましい生物学的活性を有
するたんぱく質またはポリペプチドであってよい。このようなたんぱく質には、
例えば、組織因子などの凝固因子、血管内皮成長因子（「VEGF」）、血小板由来
成長因子、及び組織プラスミノゲン活性化物質などのたんぱく質、例えばリンパ
球、サイトカイン及び成長因子などの生物学的応答修飾物質、または毒素などが
含まれる。
【０１９１】 治療部分と抗体の複合体形成技術は公知で、例えばMonoclonal Antibodies An
d Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc.
1985)のArnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Dru
gs In Cancer Therapy”、Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et
al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)のHellstrom et al., “A
ntibodies For Drug Delivery”、Monoclonal Antibodies ‘84: Biological An
d Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985)のTho
rpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review
”、 Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et
al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)の“Analysis, Results, And F
uture Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Can
cer Therapy”、及び Thorpe et al., “The Preparation And Cytotoxic Prope
rties Of Antibody-Toxin Conjugates”, Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)な
どを参照のこと。 または、米国特許第4,676,980号のSegalによる記載の通り、
抗体を第二の抗体と複合体形成させて、抗体のヘテロ複合体を形成することもで
きる。
【０１９２】 本発明の核酸分子をベクターに挿入し、遺伝子治療ベクターとして用いること
ができる。遺伝子治療ベクターは、例えば静脈注射、局所投与（米国特許第5,32
8,470号）、または定位注射(例えばChen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci
. USA 91:3054-3057参照)によって被験体に送達することができる。遺伝子治療
ベクターの製剤は、許容な希釈液中の遺伝子治療ベクターを含み、または遺伝子
輸送賦形剤が埋めこまれた徐放性マトリックスで構成されていてよい。または、
完全遺伝子輸送ベクターがレトロウィルスベクターなどの組換え細胞から無傷で
産生される場合、その製剤には遺伝子輸送システムを産生する一つ以上の細胞が
含まれていてよい。
【０１９３】 薬学的組成物は、容器、密閉容器、またはディスペンサーの中に投与指示書と
共に含まれていてよい。
【０１９４】 本発明は以下の実施例によってさらに具体化されるが、それらに限定されると
解釈されてはならない。本願明細書全体に引用されたすべての参考文献、特許、
及び公開特許出願、並びに図は、引用をもって本願明細書の記載に代える。
【０１９５】
【実施例】
例１ 可溶性P-セレクチン高レベルの動物における止血ポテンシャル 細胞質ドメインを欠損しているP-セレクチンを発現したトランスジェニックマ
ウス（DCTマウス）を、胚性幹細胞における同種組換えによって遺伝子置換する
ことにより作製した（Hartwell, D.W. et al. J Cell Biol (1998) 143:1129-11
41）。このような突然変異動物は、血漿中の可溶性P-セレクチンを高レベルに示
す。
【０１９６】 本例は、DCTマウスと野生種対照の止血ポテンシャルの比較研究を説明する。
【０１９７】 A. 灌流チャンバーにおけるフィブリン形成 灌流チャンバーにおいて、野生種（WT）、DCTマウス、及びP-セレクチン欠損
（Psel -/-）マウス(Mayadas, T.N. et al. Cell (1993) 74:541-554) の非抗凝
固血のフィブリン形成をエキソビボで比較した。これらのマウスは、白血球ロー
リング及び好中球血管外遊出、並びに止血が障害されている(Subramaniam, M. e
t al. Blood (1996) 87:1238-1242)。
【０１９８】 簡単に説明すると、ガラス製キャピラリー管（内径0.56 mm）をヒト線維性タ
イプIIIコラーゲン（シグマ社、セントルイス）1mg/mlで、既報の通り(Andre, P
. et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol (1996) 16:56-63)コーティングした
。マウスを2.5%トリブロモエタノール（0.15 ml/10g）で麻酔した。非抗凝固血
を、バタフライ25Gを用いてマウス大静脈から直接採取し、シラスチック管を用
いてコラーゲンでコートした灌流チャンバーを灌流させた。チャンバーの遠位に
装着したシリンジポンプ（ハーバードアパラタス社）によって流速220 ml/分を
２分間保ち、g=4Q/pr3 の式により、せん断速度212s-1を得た。血液灌流の直後
、コラーゲン表面に形成された血栓沈着物をPBSで20秒間洗浄し、氷冷した2.5%
カコジル酸塩緩衝グルタルアルデヒド（pH 7.4）中に同様のせん断速度で固定し
た。その後、灌流チャンバーをフローシステムからはずし、新たに調製した固定
緩衝液に２４時間4℃で固定した。 光学顕微鏡でエポン包埋した血栓沈着物の正
面像を可視化した。
【０１９９】 図１は非抗凝固血灌流を２分間行った後に形成された血栓沈着物を、正面から
観察した写真である（血流は左から右へ）。白色の矢印は血小板が多い血栓を示
し、黒色の矢印は血小板血栓から遠位に形成されたフィブリン尾部を示す。図２
に示すとおり、野生種動物について行った灌流チャンバー１１器（動物１体につ
き灌流チャンバー１器）のうち４器において、血小板凝塊の遠位にフィブリン尾
部が見つかった。DCTマウスについて行った灌流チャンバー９器のうち８器にお
いて、フィブリン尾部が存在した。さらに、DCTマウスのフィブリン尾部は、野
生種マウスにおいて観察されたものよりも有意に長かった。P-セレクチン欠損血
について行った灌流チャンバーは、フィブリン尾部を示すものはなかった。３つ
の遺伝子型におけるフィブリン形成の統計学的比較を、ログランク検定を用いて
行った。フィブリン尾部の長さの比較には、スチューデント検定を用いた。
【０２００】 B. 血漿中の可溶性P-セレクチンおよびフィブリノーゲンレベル 血漿中の可溶性P-セレクチンレベルを、修正サンドイッチELISA法をもちいて
既報の通り測定した(Hartwell, D.W. et al. J Cell Biol (1998) 143:1129-114
1)。簡単に説明すると、野生種（WT）及びDCTマウスの血漿サンプルを、モノク
ローナル抗マウスP-セレクチン抗体（RB40.34、ファーミンゲン社、カリフォル
ニア州サンディエゴ）でコートしたプレートとともに、３７℃で２時間インキュ
ベートした。洗浄後、ビオチニル化ウサギ抗P-セレクチン抗体（ファーミンゲン
社、カリフォルニア州サンディエゴ）をウェルに加えて、２時間インキュベート
した。エクストラビジン結合アルカリホスファターゼを加えて、その活性をリン
酸p-ニトロフェニル（シグマケミカル社、ミズーリ州セントルイス）で調べた。
プレートをエプソンLX-300ELISAリーダー（ダイナテックラボラトリーズ社、バ
ージニア州チャンティリー）で405nmで測定した。血漿フィブリノーゲン値をシ
グマ診断プロシージャNo.886（ミズーリ州セントルイス）にしたがって測定し、
mg/dLで表した。
【０２０１】 後述の表１に示すように、DCTマウスの血漿中の可溶性P-セレクチンレベルは
、野生種マウスと比較して３倍の増加が見られた。反対に、これらの動物の血漿
フィブリノーゲンレベルには有意差は見られなかった。
【０２０２】
【表１】
【０２０３】 C. 局所シュワルツマン反応における出血性病変 局所シュワルツマン反応は、内毒素及びサイトカインによって誘導される出血
性及び壊死性病変で、炎症と止血システムの相互関係の原型モデルである。簡単
に説明すると、生後１２乃至１４週に年齢を調整したオス野生種（WT）マウス及
びDCTマウスに、第０日に、100mg/マウスの大腸菌（Escherichia coli）LPS 055
:B5（ディフコラボラトリーズ社、ミシガン州デトロイト）を滅菌リン酸塩緩衝
食塩水（PBS）0.1mlに溶解した溶液を皮下注射して初回抗原刺激を与えた。２４
時間後（第１日）、組換えTNF-a（ジェンザイム社、マサチューセッツ州ケンブ
リッジ）0.3mg/マウスを皮膚の同部位に、既報の通り（Subramaniam, M. et al.
Blood (1996) 87:1238-1242）注射した。第２日、出血性病変を観察して、マウ
スの遺伝子型を知らずに０乃至４のスケールで評価した。ヘマトキシリン-エオ
シン染色パラフィン切片を病変部位から用意して、炎症細胞浸潤及び出血の程度
を、顕微鏡で０乃至４のスケールで評価した。
【０２０４】 注射部位の肉眼的及び顕微的評価から、４８時間後のDCTマウスの出血性病変
の平均サイズは野生種の約50%であることが明らかになった（図３参照）。TNFa
接種の１時間前に可溶性P-セレクチン-Ig（1mg/g、ファーミンゲン社、カリフォ
ルニア州サンディエゴ）を注射して灌流した野生種動物には、ヒトIgG1（シグマ
ケミカル社、ミズーリ州セントルイス）を注射したものと比較して、出血量に有
意に大きな減少が見られた。
【０２０５】 D. 局所シュワルツマン反応におけるフィブリン沈着 上述のようにヒトIgG1または可溶性P-セレクチンを注射した野生種マウスのシ
ュワルツマン病変部のパラフィン切片を脱パラフィンして、アビジンD溶液及び
ビオチンブロック溶液（ベクター社、カリフォルニア州バーリンゲーム）でブロ
ックし、マウスフィブリン／フィブリノーゲンと交差反応するウサギ抗ヒトフィ
ブリノーゲン抗体（1:1000希釈、A0080、ダコ社、カリフォルニア州カーピンテ
リア）で染色した。その後、切片をビオチニル化ヤギ抗ウサギ二次抗体（ザイム
ド・ラボラトリーズ社、カリフォルニア州南サンフランシスコ）、及びABCミッ
クス溶液（ベクター社、カリフォルニア州バーリンゲーム）で処理した。切片を
AEC基質キットを用いて西洋ワサビペルオキシダーゼ（ベクター社、カリフォル
ニア州バーリンゲーム）で処理して顕色させた。切片をヘマトキシリンで５分間
対比染色させた。
【０２０６】 血管壁の外側にフィブリン染色が現れる血管はすべて、「漏出」に分類した。
内皮細胞の内腔表面にフィブリン染色が現れ、血管壁の外側にフィブリンが現れ
ない血管は、「環状」に分類した。結果を図４に示す。可溶性P-セレクチンを注
射した野生種動物は、ヒトIgG1で灌流した動物と比較して、「漏出」血管の割合
に有意な減少を示し、「環状」血管の割合に増加を示した。
【０２０７】 E. 血漿凝固時間 未処理またはヒトIgG１（対照）もしくは可溶性P-セレクチン（s-P-sel）を注
入した野生種マウス、P-セレクチン欠乏、及び未処理またはヒト組換えPSGL-1(r
-PSGL-1)を注入したDCTマウスの血漿凝固時間は、以下のように測定した。簡単
に説明すると、血液1mlを眼窩後の静脈叢からマイクロヘマトクリットキャピラ
リ管で採取し、最終体積の10%の酸性クエン酸ブドウ糖（ACD：38mMクエン酸、75
mMクエン酸三ナトリウム、100mMデキストロース）が入っているポリプロピレン
管に収集した。血漿から混入細胞を除去するために、25分間1,500gで遠心分離し
、さらに2分間15,000gで遠心分離して、血小板欠乏血漿を調製した。血漿凝固時
間は、シリコン化チューブに入っている血漿に当量の予温した20mM CaCl2を加え
、血小板凝集計に入れ、３７℃で撹拌条件下（800 rpm）において誘導した。
【０２０８】 図５に示すように、DCTマウスの凝固時間は、野生種マウスと比較して有意な
減少を示した。さらに、凝固時間の有意な増加が、ヒト組換えPSGL-1IgG(10mg/k
g)を静脈注射した（第０日及び第２日）DCTマウスの第４日目に見られた。反対
に、野生種マウスに可溶性P-セレクチンを注射したところ、IgG処理対照群と比
較して凝固時間が有意に減少した。
【０２０９】 F. マウス血漿中のマイクロ粒子 未処理またはヒトIgG１（対照）もしくは可溶性P-セレクチン（s-P-sel）を注
入した野生種マウスとDCTマウスにおける、インビボで循環するマイクロ粒子レ
ベルは、以下の通り測定した。簡単に説明すると、血小板欠乏血漿を上述の通り
調製した。次いで、血小板欠乏血漿300mlを各マウスから採取し、同一の遺伝子
型のマウスから採取した血小板欠乏血漿のサンプル３つを一緒にプールし、緩衝
液（10mmol/L HEPES、5mmol/L KCl、1mmol/L MgCl2、136mmol/L NaCl、pH7.4）
で1:3に希釈して、100,000gで1.5時間遠心分離した。上清を捨てて、マイクロ粒
子のペレットを一定量（120 mL）の同一の緩衝液に再懸濁させた。
【０２１０】 フローサイトメトリー分析を、ベクトン-ディキンソンFACSCalibur（ニュージ
ャージー州フランクリンレイク）で、セルクエストソフトウェア（ベクトン-デ
ィキンソン、カリフォルニア州サンジョゼ）を用いて行った。光散乱及び蛍光チ
ャンネルは、対数出力に設定する（前向き散乱はE00で閾値12、横向き散乱は300
）。マイクロ粒子総数を計数するために、30mlのアリコートをカルセインAM（0.
25 mg/ml、モレキュラープローブ社、オレゴン州ユージーン）とともに暗所で１
５分間インキュベートした。イベント総数は、１０秒間間隔で計数する。
【０２１１】 図６は、DCTマウスのマイクロ粒子数が野生種マウスと比較して1.9倍増加した
ことを示している。さらに、野生種マウスに可溶性P-セレクチンIgを静脈注射し
た場合、ヒトIgG1と比較して、マイクロ粒子量が2.7倍増加した。
【０２１２】 プロコアギュラント活性の起源を特定するために、マウス組織因子（最終濃度
5mg/ml）を識別するヒツジ抗ウサギ組織因子IgG（アメリカン・ダイアグノステ
ィカ社、コネチカット州グリニッチ）を用いて、マイクロ粒子サンプルを室温で
20分間染色した。FITC結合ウサギ抗ヒツジIgG（1:1000希釈；ザイムド・ラボラ
トリーズ社、カリフォルニア州南サンフランシスコ）を二次抗体として用いた。
対照として、同一濃度の対照IgG抗体を用いた（ラットIgG、シグマケミカル社、
ミズーリ州セントルイス；FITC結合ヒツジIgG、カルタグラボラトリーズ社、カ
リフォルニア州バーリンゲーム）。マイクロ粒子はフローサイトメトリーで分析
した。
【０２１３】 図７は、DCTマウスの血漿中のマイクロ粒子を発現している組織因子の数が多
いことを示している。
【０２１４】 G. DCTマウスの可溶性P-セレクチン処理 可溶性PSGL-Igを注入するとDCTマウスのプロコアギュラント表現型が減少して
、マイクロ粒子数が有意に減少し、血漿の凝固時間が延長した。対照Igを注入し
てもこのような作用はなかった。
【０２１５】 血漿凝固時間は、上述のように測定した。PSGL-Igで処理したDCTマウスの血漿
中のマイクロ粒子の分析用に、第０日における眼窩後穿刺によって200ml採血し
た。血小板欠乏血漿を採取し、40mlをPBS260ml中に希釈して、直ちにFACSでマイ
クロ粒子数を分析した。その後、マウスに10mg/kgのPSGL-Igまたは対照Igを静脈
注入（第０日及び第２日）した。第４日に、もう片方の眼から200mlを採血し、
マイクロ粒子数を測定した。
【０２１６】 図１１Aは、DCTマウスにおけるPSGL-Igまたは対照Igの２回の注入前（白線）
及び後（黒線）の、DCT血漿40ml中に存在するマイクロ粒子数を示す（*=p<0.05
）。
【０２１７】 図１１Bは、可溶性PSGL-Ig（黒線）で処理したマウスにおける実験終了時の凝
固時間が、対照Ig処理群（白線）よりも有意に長かったことを示す（*=p<0.05）
。このようなデータは、インビボにおいて、可溶性P-セレクチンの阻害がプロコ
アギュラント状態を減少させることを示す。
【０２１８】 例２ フォンウィルブランド因子欠損マウス及び血友病A罹患マウスにおける可
溶性P-セレクチン活性 フォンウィルブランド因子（vWF）欠損マウスには、第VIII因子（抗血友病因
子）量が野生種の約20%しかなく、したがって、フィブリン凝塊を形成するのが
困難である（Denis, C. et al. Proc Natl Acad Sci USA (1998) 95:9524-9529
）。血友病Aを罹患するマウスは、第VIII因子を完全に欠損している (Bi, L. e
t al. (1995) Nature Genetics 10:119-121。本例では、これらの動物における
可溶性P-セレクチンの止血活性を説明する。
【０２１９】 A. 血小板欠乏血漿における組織因子活性 血小板欠乏血漿は、可溶性P-セレクチン-Ig（n=2）またはIgG1（対照；n=3）
を注入したvWF欠乏マウス（vWF -/-）の貯蔵血漿から調製した。マイクロ粒子は
、血小板欠乏血漿を繰り返し遠心分離して調製した。簡単に説明すると、最初の
遠心分離ステップは12,000gで2分間行い、混入細胞をすべて除去した。次いで、
上清を20mM HEPES、1mM EDTA pH7.2溶液に希釈して、200,000gで90分間、超遠心
分離した。上清を捨て、マイクロ粒子のペレットを10mM HEPES、136mM NaCl、pH
7.4溶液に再懸濁させた（最初の容量の1/2）。マイクロ粒子溶液の組織因子活性
は、1mM CaCl2の存在下での第VIIa因子（5nM）による第X因子（150nM）の活性を
促進する能力を通して測定した。３７℃で２０分間反応を進めてから、過剰量の
EDTA（最終濃度5mM）を加えて反応を止めた。第Xa因子の色素産生基質、スペク
トロザイム（SpectrozymeR）fXaを最終濃度0.3mMに加えた。405nmにおける吸光
度の時間変化を、動力学的ソフトウェアを搭載したプレートリーダー（DYNEXテ
クノロジーズ社）で直ちに記録した。吸光度の線形的な変化は、アッセイで産生
された第Xa因子濃度と直接相関している。
【０２２０】 以下の表２に示すとおり、可溶性P-セレクチン-Igを注入したvWF欠損マウスか
ら採取したマイクロ粒子の溶液の組織因子活性は、IgG1を注入した対照マウスよ
りも2.1倍高かった。
【０２２１】
【表２】
【０２２２】 B. 可溶性P-セレクチン-Ig注入によるプロコアギュラントマイクロ粒子産生 ヒトIgG１（対照）または可溶性P-セレクチン-Ig（sP-sel-Ig）を注入したvWF
欠損マウスにおいてインビボで循環するマイクロ粒子量を、上述のように決定し
た。図８は、vWF欠損マウスに可溶性P-セレクチン-Igを静脈注射した場合、ヒト
IgG１（対照）と比較して、マイクロ粒子数が増加したことを示す。
【０２２３】 C. プロトロンビン凝固時間 プロトロンビン凝固時間（PT）は、汎用の凝固スクリーニング検査である。こ
の検査は、TF-VII(a)複合体の活性化で開始する、凝固の外因性経路に関与する
。PT時間は、組織因子のソースとしてのトロンボプラスチン及びCa2 +を加えた、
予温（37℃）した血小板欠乏血漿中で測定する。
【０２２４】 希釈プロトロンビン時間は、保存血小板欠乏血漿サンプル（0.1ml）を希釈ウ
サギ脳トロンボプラスチン（IL TEST PT）0.2mlと混合してから測定する。凝固
時間は、第一のフィブリン線維の形成を測光検出することによって測定する。図
９は、トロンボプラスチン濃度が減少した場合、vWF欠損血漿におけるプロトロ
ンビン凝固時間が、野生種（wt）と比較して延長したことを示す。これは、vWF
欠損マウス見られた第VIII因子値が正常値の20%であることから説明することが
できる。
【０２２５】 可溶性P-セレクチン-IgまたはIgG1（対照）を注入されたvWF欠損マウスの凝固
時間を、トロンボプラスチンを大きく希釈して（1:20,000）検査した。それは、
その希釈倍率であれば、プロトロンビン凝固時間が、組織因子に好ましく依存す
ることが知られているためである。vWF欠損マウスに可溶性P-セレクチン-Igを注
入することによって、IgG1を注入したvWF欠損マウスの場合と比較して、プロト
ロンビン凝固時間が28%短縮された。
【０２２６】 D. 出血時間 出血時間は、Dejana, et al. (1979) Thromb. Res. 15:199-201に記載の通り
に測定された。簡単に説明すると、第VIII因子欠損マウスに、マウスの体重1gに
対して可溶性P-セレクチン-Ig（P-sel-Ig）またはヒトIgG1対照1.2mgを注射した
。６時間後、マウスを保定器に入れ、尾の先端から3mmの部分を剃刀で傷つけた
。その尾を直ちに、37℃の0.9%等張食塩水に、体から5cmしたの尾の先端と共に
浸した。出血時間は血流が停止するのに必要な時間と定義された。可溶性P-セレ
クチンを注入すると、血友病Aマウス（第VIII因子欠損マウス）の出血時間が減
少した。
【０２２７】 図１０に示すとおり、可溶性P-セレクチン-Igで処理した血友病Aマウスの出血
時間は、ヒトIgG1で処理した血友病Aマウスよりも有意に減少した。
【０２２８】 E. 活性部分トロンボプラスチン時間（APTT） 活性部分トロンボプラスチン時間（APTT）は、汎用の凝固スクリーニング検査
である。この検査は、凝固の内因性経路が関与する。
【０２２９】 第VIII因子欠損マウス（血友病Aマウス）において、可溶性P-セレクチンが活
性部分トロンボプラスチン時間及び血漿凝固時間に与える影響を、以下のように
測定した。簡単に説明すると、血友病Aマウスを、体重1gあたり1.2mgのP-セレク
チン-IgまたはヒトIgG1 で処理した。灌流から６時間後に、マウスをACDに出血
させた。血小板欠乏血漿を上述のように調製した。活性部分トロンボプラスチン
時間（APTT）をAPTT試薬で測定し、カルシウムイオンを加えて凝固を開始させた
。APTT及び血漿凝固時間は、可溶性P-セレクチン-Ig処理血友病Aマウスにおいて
減少する。
【０２３０】 図１４に示すように、可溶性P-セレクチン-Ig処理血友病AマウスのAPTTは、ヒ
トIgG１で処理したマウスと比べて短かった（P<0.0013、片側ｔ検定により決定
）。可溶性P-セレクチンで処理した血友病Aマウスの血漿の再石灰化凝固時間は
、対照IgG1で処理したマウスと比較して、有意に減少した（p<0.0058、片側t検
定により決定）。
【０２３１】 前述の例は、可溶性P-セレクチンの止血活性を実証する。可溶性P-セレクチン
をマウスに注入すると、動物をプロコアギュラント状態に誘導する。このような
動物がけがをした場合、フィブリンが血管損傷部位により迅速に沈着し、血管か
らの漏出を減少させる。可溶性P-セレクチンを注入した動物の血漿は、迅速に凝
固する。可溶性P-セレクチンを大量に発現するトランスジェニックマウス（DCT
マウス）も、野生種動物よりも容易にフィブリンを形成し、出血性損傷の過剰漏
出から保護する。反対に、すべての形態のP-セレクチンを欠損する動物は、野生
種よりも出血応答が高く、出血時間がわずかに長い。このデータから、可溶性P-
セレクチン量が哺乳動物における凝固ポテンシャルの予測値であることが示唆さ
れる。
【０２３２】 さらに、可溶性P-セレクチンをマウスに注入すると、血中における組織因子を
含むマイクロ粒子数が増加することが観察された。同様に、可溶性P-セレクチン
を正常値よりも大量に発現するトランスジェニックマウスには、組織因子含有マ
イクロ粒子がより多く循環している。可溶性PSGL-1（P-セレクチンのリガンド／
阻害物質）をこれらのマウスに注入すると、組織因子含有マイクロ粒子数が減少
し、血漿の凝固時間が延長する。従って、例えば可溶性P-セレクチン量の変調な
どによるP-セレクチン活性の変調は、被験体の止血ポテンシャルを上昇または低
下させることができるため、止血障害の診断または処置に有用である。
【０２３３】 例３ 可溶性P-セレクチンはヒト血液にマイクロ粒子を産生する 可溶性P-セレクチンがどのようにプロコアギュラント活性を誘導するかをさら
に実証するために、インビトロシステムを開発した。ヒトP-セレクチン-Igキメ
ラまたは対照ヒトIgG1を15mg/ml加えた後のマイクロ粒子の産生を、本願明細書
に記載の通り決定した。ヒト血液をACDに採取した。４体のドナーから採取した
血液サンプルを、別個に処理して、37℃でインキュベートした。LPS混入を避け
るために、無菌条件下においてサンプルを扱った。マイクロ粒子の産生は、PBS
で希釈した血小板欠乏血漿においてフローサイトメトリーで分析した。前向き散
乱、及び横向き散乱プロットを、新しく形成された巨大なプロコアギュラントマ
イクロ粒子を定量化するための４分解析に用いた。組織因子溶性マイクロ粒子を
フローサイトメトリで分析した。マイクロパーティクルは、FITC-結合マウス抗
ヒト組織因子（アメリカンダイアグノスティカ；American Diagnostica TM）で
染色した。
【０２３４】 図１２Aに示すとおり、６時間の可溶性P-セレクチンとのインキュベーション
後、プロコアギュラントマイクロ粒子の数は、ヒトIgG対照と比較して30%増加し
た（*=P<0.04）。
【０２３５】 図１２Bに示すとおり、組織因子陽性イベントの数は、可溶性P-セレクチン-Ig
で６時間インキュベーションすることにより、30%有意に増加した（*=P<0.05）
。
【０２３６】 例４ 可溶性P-セレクチンはヒト血液中の全血及び血漿凝固時間を短縮する ヒト血液にヒトP-セレクチン-Igキメラまたは対照ヒトIgG1を加えた場合の全
血再石灰化凝固時間及び血漿再石灰化凝固時間を、以下の通り測定した。ヒト血
液をACD中に収集した。ドナー４体から採取して個別に処理した血液サンプルを3
7℃でインキュベートした。LPS混入を避けるため、サンプルは無菌条件下で扱っ
た。全血凝固時間は、シリコン化チューブに入れてソロクロット・コアギュレー
ション（Soloclot Coagulation）及びプレートレット・アナライザ（Platelet A
nalyzer；Sienco TM）で測定した。
【０２３７】 図１３Aに示すとおり、可溶性P-セレクチンと共にインキュベートしたヒト血
液の全血凝固時間は、IgGで処理した血液と比較して２時間後には約20%短縮し（
*=p<0.02）、８時間後には60%短縮した（*=p<0.004）。
【０２３８】 図１３Bに示すとおり、可溶性P-セレクチン血液の血漿凝固時間は、対照IgG及
び未処理血漿と比較して、６時間のインキュベーション後に25%短縮し、８時間
のインキュベーション後には40%短縮した（**p<0.004）。
【０２３９】 等価物 当業者であれば、ごく通常の実験を用いるのみで、ここに説明した本発明の特
定の実施例の等価物を数多く認識し、又は確認できることであろう。このような
等価物は、上述の請求の範囲の包含するところである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 野生種マウス（WT）、P-セレクチン欠損マウス（PKO）、及びDCT
マウスにおいて、２分間の非抗凝固血灌流（血流は左から右方向）後に形成され
た血栓沈着を正面から観察した写真。白矢印は血小板を多く含む血栓、黒矢印は
血小板血栓から遠位に形成されたフィブリン尾部を示す。
【図２】 野生種マウス（WT）、P-セレクチン欠損マウス（P-sel-/-）、及
びDCTマウスから得た非抗凝固血灌流チャンバー内のフィブリン形成を示す。
【図３】 未処理、ヒトIgG１で灌流した、またはP-セレクチン-Ig（s-P-se
l）で灌流した野生種マウス（WT）及びDCTマウスにおいて、局所シュワルツマン
反応で形成した出血性病変の肉眼的または顕微的分類を示す。
【図４】 ヒトIgG1または可溶性P-セレクチン-Ig（P-sel）で灌流した野生
種マウス（WT）における、局所シュワルツマン反応のフィブリン沈着を示す。
【図５】 図５A及びBは、未処理、または組換えPSGL-1か組換え可溶性P-セ
レクチンで灌流した野生種マウス（WT）、P-セレクチン欠損マウス（P-sel-/-）
、及びDCTマウスの血漿凝固時間を示す。
【図６】 未処理、ヒトIgG1で灌流した、もしくは可溶性P-セレクチンIg（
s-P-sel）で灌流した野生種マウス（WT）、またはDCTマウスの体内を循環するマ
イクロ粒子値を示す。
【図７】 野生種マウス（WT）またはDCTマウスにおいて、組織因子を発現
するマイクロ粒子数を示す。
【図８】 可溶性P-セレクチン-Ig（s-P-sel-Ig）で灌流したフォンウィル
ブランド因子欠損マウス（vWF -/-）の体内を循環するプロコアギュラントマイ
クロ粒子の産生が高いことを示す。
【図９】 未処理、ヒトIgG1で灌流した、または可溶性P-セレクチン-Ig（s
PselIg）で灌流した野生種マウス（WT）、またはフォンウィルブランド因子欠損
マウス（vWF -/-）のプロトロンビン凝固時間を示す。
【図１０】 ヒトIgG1または可溶性P-セレクチン-Ig（P-sel-Ig）のいずれ
かで処理した血友病Aマウスにおける出血時間を示す。
【図１１】 図１１Ａは、DCTマウスを可溶性PSGL-Igで処理した後と、対照
ヒトIgで処理した後のマイクロ粒子数の減少を示す（*=p<0.05）。図１１Ｂは、
DCTマウスを可溶性PSGL-Igで処理した後と、対照ヒトIgで処理した後の凝固時間
の増加を示す（*=p<0.05）。
【図１２】 図１２Ａは、ヒト血液において、ヒトIgGまたは可溶性P-セレ
クチン-Ig（P-sel-Ig）のいずれかでインキュベーションした後の、プロコアギ
ュラントマイクロ粒子数の生成を示す。図１２Ｂは、ヒト血液において、ヒトIg
Gまたは可溶性P-セレクチン-Ig（P-sel-Ig）のいずれかでインキュベーションし
た後の、組織因子陽性マイクロ粒子の生成を示す。組織因子陽性イベント数はP-
セレクチンIgとのインキュベーションによって30%有意に増加した（*=p<0.05）
。
【図１３】 図１３Ａは、ヒトIgGまたは可溶性P-セレクチン-Ig（P-sel-Ig
）のいずれかでインキュベーションした後のヒト全血の凝固時間を示す。可溶性
P-セレクチンIgとインキュベートした全血の凝固時間は、インキュベーションか
ら２時間後では約20%、８時間後では60%短縮された（**=p<0.004）。図１３Ｂは
、ヒトIgGまたは可溶性P-セレクチン-Ig（P-sel-Ig）のいずれかでインキュベー
ションした後のヒト血漿の凝固時間を示す。可溶性P-セレクチンで処理した血液
の血漿凝固時間は、６時間後では25%、８時間後では40%短縮された（**=p<0.004
）。
【図１４】 図１４Ａは、対照Igまたは可溶性P-セレクチン-Igで処理した
第VIII因子-/-マウス（血友病Aマウス）における活性化部分トロンボプラスチン
時間（APTT）を示す。図１４Bは、対照Igまたは可溶性P-セレクチン-Igで処理し
た第VIII因子-/-マウス（血友病Aマウス）における血漿凝固時間を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 7/04 Ａ６１Ｐ 9/10 9/10 １０１ １０１ 35/00 35/00 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＣ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ， ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，Ｉ Ｎ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 アンドレ パトリック アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02130 ジャマイカ プレイン ダン ス トリート 32 アパートメント ２ (72)発明者 ハートウェル ダキン ダブリュ アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02446 ブルックライン ケント ストリ ート 205 アパートメント 33 (72)発明者 ラコヴィノヴァ イングリッド アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02130 ジャマイカ プレイン パーキン ズ スクウェア ７ Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA17 BA44 CA36 DC50 NA14 ZA402 ZA452 ZA532 ZA542 ZB262 ZC022 4C085 AA13 AA14 BB11 DD23 EE01

Claims (49)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 被験体において止血を誘導する方法で、止血が生じるように
    前記被験者にP-セレクチン活性の誘導物質を投与するステップからなる方法。
  2. 【請求項２】 該P-セレクチン活性の誘導物質が、被験体の血漿中の可溶性
    P-セレクチンポリペプチド値を上昇させる、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 該P-セレクチン活性の誘導物質が細胞表面からのたんぱく分
    解解離を増加させる、請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 該P-セレクチン活性の誘導物質がP-セレクチン遺伝子発現を
    増加させる、請求項２に記載の方法。
  5. 【請求項５】 該P-セレクチン活性の誘導物質がP-セレクチンレセプタまた
    はリガンドに結合し、P-セレクチンポリペプチドの活性を模倣する、請求項１に
    記載の方法。
  6. 【請求項６】 該P-セレクチン活性の誘導物質がP-セレクチンレセプタまた
    はリガンドに対する抗体である、請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 該P-セレクチンリガンドがPSGL-1である、請求項５に記載の
    方法。
  8. 【請求項８】 該抗体がPSGL-1に対する抗体である、請求項６に記載の方法
    。
  9. 【請求項９】 被験体において止血を誘導する方法で、止血が生じるように
    前記被験体に可溶性P-セレクチンポリペプチドを投与するステップからなる方法
    。
  10. 【請求項１０】 被験体において止血を誘導する方法で、止血が生じるよう
    に前記被験体に、可溶性P-セレクチンポリペプチドをコードするヌクレオチド配
    列からなる単離された核酸分子を投与するステップを含む方法。
  11. 【請求項１１】 被験体において止血を誘導する方法で、止血が生じるよう
    に前記被験体に可溶性P-セレクチンポリペプチドを発現する組換え細胞を投与す
    るステップからなる方法。
  12. 【請求項１２】 被験体において凝固機能低下を伴う障害を治療または予防
    する方法で、凝固機能低下を伴う障害を治療または予防するようにP-セレクチン
    活性の誘導物質を前記被験者に投与するステップからなる方法。
  13. 【請求項１３】 前記障害が出血性疾患である、請求項１２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記障害が血友病である、請求項１２に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 P-セレクチン活性の誘導物質が、被験体の血漿中の可溶性
    P-セレクチンポリペプチド値を上昇させる、請求項１２に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 被験体において凝固機能低下を伴う障害を治療または予防
    する方法で、前記被験体に可溶性P-セレクチンポリペプチドを投与するステップ
    からなる方法。
  17. 【請求項１７】 被験体において血管系関連疾患を治療する方法で、血管系
    関連疾患が治療されるように前記被験体にP-セレクチン活性の誘導物質を投与す
    る方法。
  18. 【請求項１８】 前記血管系疾患が腫瘍である、請求項１７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記被験体を、腫瘍関連血管系のプロコアギュラント状態
    を誘導するのに効果的な分子でさらに治療する、請求項１８に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記分子が、凝固因子に機能的に結合する腫瘍細胞の成分
    、または腫瘍関連血管系の成分と結合する第一の結合領域、または凝固因子に結
    合する第二の結合領域からなる、請求項１９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記第一の結合領域が、組織因子に機能的に結合する、VC
    AM-1に結合する抗体またはその抗体結合断片からなる、請求項２０に記載の方法
    。
  22. 【請求項２２】 P-セレクチン活性の誘導物質が、被験体の血漿中の可溶性
    P-セレクチンポリペプチド値を上昇させる、請求項１７に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 被験体における血管系関連疾患を治療する方法で、前記被
    験体に可溶性P-セレクチンポリペプチドを投与するステップからなる方法。
  24. 【請求項２４】 被験者における止血を低減する方法で、プロコアギュラン
    ト活性が低下するように前記被験者にP-セレクチン活性の阻害物質を投与して方
    法。
  25. 【請求項２５】 該P-セレクチン活性の阻害物質が、被験体の血漿中の可溶
    性P-セレクチンポリペプチド値を低下させる、請求項２４に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 該P-セレクチン活性の阻害物質が細胞表面からのP-セレク
    チンのたんぱく分解解離を減少させる、請求項２５に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 該P-セレクチン活性の阻害物質がP-セレクチン遺伝子発現
    を低下 させる、請求項２６に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 該P-セレクチン活性の阻害物質が抗P-セレクチン抗体であ
    る、請求項２４に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 該P-セレクチン活性の阻害物質が組換え可溶性PSGL-1であ
    る、請求項２４に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 被験体における止血を低減する方法で、止血が低減するよ
    うに、前記被験体に、P-セレクチンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
    に対してアンチセンスであるヌクレオチド配列からなる単離した核酸分子を投与
    するステップからなる方法。
  31. 【請求項３１】 被験体における血栓性障害を治療または予防する方法で、
    血栓性障害が治療または予防されるように、前記被験体にP-セレクチン活性阻害
    物質を投与するステップを含む方法。
  32. 【請求項３２】 前記障害が動脈硬化である、請求項３１に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 前記障害が深部静脈血栓症である、請求項３１に記載の方
    法。
  34. 【請求項３４】 前記障害が狭心症である、請求項３１に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 前記血栓性障害が医療介入後の再狭窄である、請求項３１
    に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 該P-セレクチン活性の阻害物質が被験体の血漿中の可溶性
    P-セレクチンポリペプチド値を低下させる、請求項３１に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 被験体における止血ポテンシャルを変調する方法で、前記
    被験体のP-セレクチン活性を変調するステップからなる方法。
  38. 【請求項３８】 前記変調ステップが、該被験者にP-セレクチン活性の変調
    物質を投与するステップからなる、請求項３７に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 該変調物質が前記被験者の血漿中の可溶性P-セレクチン値
    を調節する、請求項３８に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 該変調物質がP-セレクチン活性の阻害因子である、請求項
    ３８に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 該変調物質がP-セレクチン活性の誘導物質である、請求項
    ３８に記載の方法。
  42. 【請求項４２】 被験体におけるプロコアギュラント状態を診断する方法で
    、該被験体の生物学的サンプルにおけるP-セレクチン活性を測定するステップか
    らなり、該サンプル中における高P-セレクチン活性が該被験者のプロコアギュラ
    ント状態を示す方法。
  43. 【請求項４３】 請求項４２に記載の方法で、被験体から採取した血液の検
    査用サンプルを提供するステップと、検査用サンプルにおける可溶性P-セレクチ
    ン値と正常の止血活性を有する被験体から採取した対照血液サンプルにおける可
    溶性P-セレクチン値とを比較するステップからなり、対照サンプルと比較した検
    査用サンプルにおける高レベルの可溶性P-セレクチンが該被験体のプロコアギュ
    ラント状態を示す方法。
  44. 【請求項４４】 血栓性障害を罹患する、または血栓性障害を発症するリス
    クのある被験体を判別する方法で、該被験体の生物学的サンプルにおいてP-セレ
    クチン活性を測定するステップからなり、サンプルにおける高P-セレクチン活性
    が血栓性障害を罹患する、または血栓性障害を発症するリスクがある被験体を識
    別する方法。
  45. 【請求項４５】 請求項４４に記載の方法で、 a) 前記被験体から採取した血液サンプルをP-セレクチン結合物質と接触させ
    るステップと、 b) 前記サンプルにおける高レベルの可溶性P-セレクチンを検出することによ
    って、血栓性障害を罹患する、または血栓性障害を発症するリスクのある被験体
    を判別するステップと、 からなる、方法。
  46. 【請求項４６】 止血を変調する能力がある化合物を識別する方法で、P-セ
    レクチン活性を変調する化合物の能力を検定するステップと、それにより止血を
    変調する能力のある化合物を判別するステップからなる方法。
  47. 【請求項４７】 該P-セレクチン活性が可溶性P-セレクチンの発現である、
    請求項４６に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 請求項４６に記載の方法に従って判別した化合物からなる
    、止血を変調するための薬学的組成物。
  49. 【請求項４９】 P-セレクチン活性の変調物質である１つ以上の化合物を含
    む、止血を変調するための薬学的組成物。
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