-
Diese
Erfindung betrifft Formulierungen von Polypeptiden und ihren Derivaten,
die als Inhibitoren oder Regulatoren des Immun- oder Gerinnungssystems
fungieren und die in der Organtransplantation verwendet werden.
Die Erfindung stellt Lösungen
bereit, die zum Beispiel komplementäre Inhibitoren oder Regulatoren der
T- oder B-Lymphozytenfunktion
in modifizierten molekularen Formen einschließen, die zum Perfundieren und
Modifizieren von Organen vor der Transplantation verwendet werden
oder zum Lagern von Organen vor der Transplantation, und um Agentien
auf Organen zu lokalisieren. Die Erfindung betrifft ebenso Verfahren
zum Herstellen von erfindungsgemäßen Formulierungen
und zum Verwenden der hergestellten Formulierungen. Wo es rechtlich
zulässig
ist, betrifft die Erfindung ebenso Verfahren zum Vorbeugen, Behandeln
oder Lindern einer Krankheit oder Störung, die mit Entzündung oder
unangemessener Komplementaktivierung oder unangemessener Aktivierung
von Gerinnungs- oder thrombotischen Prozessen vor, während oder
nach der Transplantation eines Organs verbunden ist. Zum Beispiel
stellt die Erfindung Verfahren zum Vorbeugen, Behandeln oder Lindern
von hyperakuten und akuten Allotransplantat-Abstoßungen von
transplantierten Organen wie Niere, Herz, Leber oder Lungen (insbesondere
in Individuen, die durch vorhergehende transplantierte Organe sensibilisiert
wurden), ischämischen
Reperfusionsverletzungen in transplantierten Organen, Xenotransplantat- und
Hornhauttransplantat-Abstoßungen.
-
Der
Ausdruck Transplantation bezeichnet hier das Verpflanzen eines Organs,
zum Beispiel eines Herzens, einer Niere oder einer Lunge in einen
Menschen oder einen nicht-menschlichen tierischen Patienten. Es schließt ebenso
Hauttransplantate ein, die zum Beispiel nach schweren Verbrennungen
erforderlich sein können.
Zweck des Verpflanzens ist es, ein erkranktes Organ oder Gewebe
des Wirts zu entnehmen und es durch ein gesundes Organ oder Gewebe
des Spenders zu ersetzen. Der letztere kann ein kürzlich Verstorbener,
gesunder Freiwilliger oder eine andere Tierspezies sein. Wenn Spender
und Empfänger
aus derselben Spezies stammen, ist das Transplantat als Allotransplantat
bekannt, wenn Spender und Empfänger
aus verschiedenen Spezies stammen, ist das Transplantat als Xenotransplantat
bekannt. Die Verfahren, die für
die Transplantation erforderlich sind, variieren und hängen in
einem großen
Ausmaß von
der Art des Organs ab, das transplantiert wird; sie wurden in ausreichendem
Detail über
die kürzlich
zurückliegenden
Dekaden entwickelt, so dass Transplantation in Menschen im Rahmen
eines Krankenhausbetriebes heute ein alltäglicher Vorgang sind. Während die
chirurgischen Eingriffe jetzt als Routine umschrieben werden können, hängt der
Erfolg des Transplantats als eine therapeutische Vorgehensweise
von einer Anzahl möglicher
physiologischer Folgen ab. Zum Beispiel kann der Wirt das neue Organ über antikörperabhängige, hyperakute
Abstoßungsmechanismen, Zell-vermittelte
akute Abstoßung
oder chronische degenerative Prozesse abstoßen. All diese schädlichen
Prozesse können
in einem gewissen Ausmaß die
Aktivierung eines Komplements einschließen. Ferner ist es nicht möglich, ein
neues Organ unter Beibehalten der vollen Lebensfähigket des Gefäßes zu transplantieren,
wenn dieses Organ zum Beispiel durch Lagerung, die der Entnahme
aus dem Spender folgt, beschädigt
wurde.
-
Die
Verwendung von künstlichen
Blasen als Transplantate wurde ebenso berichtet (Oberpenning et al.,
1999, Nature Biotechnology, 17, 149). In diesem Beispiel wurde die
künstliche
Blase aus einzelnen Blasenzellen gezüchtet, die im Labor gewachsen
waren, und dann wurde es den Zellen ermöglicht, auf einem künstlichen
Träger
zu wachsen. Als die „neue" Blase ausgewachsen
schien, wurde sie in Hunde transplantiert.
-
Das
Komplementsystem besteht aus über
30 verschiedenen Proteinen, die wichtig in der Antwort des Immunsystems
auf fremde Antigene sind. Das Komplementsystem wird aktiviert, wenn
seine primären
Komponenten gespalten werden und die Produkte, allein oder mit anderen
Proteinen, zusätzliche
Komplementproteine aktivieren, was in einer proteolytischen Kaskade
resultiert. Die Aktivierung des Komplementsystems führt zu einer
Vielzahl von Antworten, einschließlich gesteigerter vaskulärer Permeabilität, Chemotaxos
von phagocytotischen Zellen, Aktivierung von Entzündungszellen,
Phagocytose von fremden Partikeln, direktes Abtöten von Zellen und Gewebeschaden.
Die Aktivierung des Komplementsystems kann durch Antigen-Antikörper-Komplexe
ausgelöst
werden (der klassische Weg) oder zum Beispiel durch Lipopolysaccharide,
die in Zellwänden
von pathogenen Bakterien (der alternative Weg) anwesend sind.
-
Es
ist bekannt, dass Komplementaktivierung in einer großen Vielzahl
von akuten inflammatorischen Prozessen auftritt einschließlichen
solchen, die mit Ischämie
und Reperfusionsverletzungen verbunden sind (Rossen et al., 1985,
Circ. Res., 57, 119; Morgan B. P., 1990, The Biological Effects
of Complement Activation. In „Complement,
Clinical Aspects and Relevance to Disease". (Academic Press, London)).
-
Die
Verbindung einer ungünstigen
Komplementaktivierung mit dem Versagen von Transplantaten wurde
von verschiedenen Autoren beschrieben. Aus Untersuchungen von Maus-zu-Ratte
Herz-Xenotransplantaten wurde geschlossen, dass eine vorübergehende
Unterdrückung
der Komplementaktivierung ein längerfristiges Überleben
induzierte (Koyamada et al., 1998, Transplantation, 65 1210–5). Die
Lungenfunktion in Schwein-zu-Primaten Xenotransplantaten wurde auch
verbessert, wenn ein Komplement-Regulator in dem experiementellen
Modell verwendet wurde (Yeatman et al., 1998, Transplantation, 65,
1084–93).
In einem Review erklärten
Sheerman and Sacks (Curr. Opn. Nephrol. Hypertens., 1998, 7, 305–10) die
jetzt durchgeführten
Untersuchungen über
die Rolle des Komplements in der Pathogenese von Nierenverletzungen,
aufgrund, u.a. der Transplantationsverfahren; sie schlossen mit
der Ansicht, dass eine lokale Komplement-Synthese ein mögliches
Ziel für
eine komplementbasierte Therapie sei. Diese Strategie wurde von
Johnson (Transplantation, 1997, 6, 120–7) geteilt, der die Aufmerksamkeit
ebenso auf das Auftreten von Komplementaktivierung während Hämodialyse
genauso wie bei der Xenotransplantation, lenkte und auf die Tatsache,
dass Komplementinhibitoren zum Steuern der Entzündung, die mit der Komplementaktivierung
verbunden ist, verwendet werden könnten. Nachteilige Komplementaktivierung
ist nicht auf das xenogene Transplantatgebiet beschränkt, sondern
wird auch bei der Allotransplantation beobachtet, einschließlich in
HLA-identisch übereinstimmenden
Individuen, wo bei 10% der transplantierten Nieren berichtet wurde,
dass sie durch immunologische, hauptsächlich komplementvermittelte
Mechanismen, abgestoßen
werden (Brasile et al., 1987, Transplant Proc. 19 894–5). Die
Aktivierung eines Komplements während
einer Transplantation kann auch mit thrombotischen Prozessen, die
durch die Aktivierung von Endothelialzellen ausgelöst werden,
verbunden sein (Bach et al., 1994, Immunol Rev. 141, 5–30).
-
Es
wurde gezeigt, dass der Komplementrezeptortyp 1 (CR1) auf den Membranen
von Erythrozyten, Monozyten/Makrophagen, Granulozyten, B-Zellen,
einigen T-Zellen, den follikulären
dendritischen Zellen der Milz und auf glomerulären Podozyten vorhanden ist.
CR1 bindet an die Komplementkomponenten C3b und C4b und wurde ebenso
als der C3b/C4b-Rezeptor bezeichnet. Die strukturelle Organisation
und Primärsequenz
eines Allotyps von CR1 ist bekannt (Klickstein et al., 1987, J.
Exp. Med. 165: 1095–1112,
Klickstein et al., 1988, J. Exp. Med. 168: 1699–1717; Hourcade et al., 1988,
J. Exp. Med. 168: 1255–1270,
WO 89/09220, WO 91/05047). Er besteht aus 30 Short Consensus Repeats
(SCRs), von denen jedes ungefähr
60 bis 70 Aminosäuren
enthält.
In jedem SCR sind ungefähr
29 der durchschnittlich 65 Aminosäuren konserviert. Es wurde angenommen,
dass jedes SCR eine dreidimensionale dreifache Loopstruktur durch
Disulfidbrücken
aufweist, wobei die dritten und ersten und die vierten und zweiten
Halb-Cystine die Disulfidbrücken
darstellen. CR1 ist ferner in vier Long Homologens Repeats (LHRs)
von jeweils sieben SCRs angeordnet. Einer Leitsequenz folgend besteht
das CR1-Molekül
aus dem N-teminalen LHR-A, den nächsten
zwei Wiederholungseinheiten, LHR-B und LHR-C, den am weitesten C-Terminal liegenden
LHR-D, gefolgt von zwei zusätzlichen
SCRs, einer mutmaßlichen
Transmembranregion von 25 Resten und einem cytoplasmatischen Schwanz
von 43 Resten.
-
Basierend
auf dem reifen CR1 Molekül,
das einen vorhergesagten N-terminalen
Glutaminrest aufweist, der nachfolgend als Rest 1 bezeichnet wird,
bestehen die ersten drei SCR-Domänen
von LHR-A, hierin als SCR1, SCR2 und SCR3 bezeichnet, aus den Resten
2–58,
63–120
und 125–191
des reifen CR1.
-
Hourcade
et al., 1988, J. Exp. Med. 168: 1255–1270, beobachteten eine alternative
Polyadenylierungsstelle in der humanen CR1-Transkriptionseinheit,
von der vorhergesagt wurde, dass sie eine sezernierte Form von CR1
herstellt. Die mRNA, die diese trunkierte Sequenz codiert, umfasst
die ersten 8,5 SCRs von CR1 und codiert für ein Protein von ungefähr 80 kDa,
von dem vorgeschlagen wurde, dass es die C4b Bindungsdomäne einschließt. Wenn
eine cDNA, die dieser trunkierten Sequenz entspricht, in COS-Zellen
transvetiert und dort exprimiert wurde, zeigte sie die erwartete
C4b-Bindungsaktivität,
band aber nicht an C3b (Krych et al., 1989, FASEB J. 3: A368; Krych
et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 1991, 88, 4353–7). Krych et al. beobachtete
ebenso eine der vorhergesagten ähnliche
mRNA in einigen humanen Zellinien und postulierte, dass eine solche
trunkierte lösliche
Form von CR1 mit C4b-Bindungsaktivität im Menschen
synthetisiert werden kann.
-
Zusätzlich haben
Makrides et al. (1992, J. Biol. Chem. 267 34 24754–61) SCR1
+ 2 und 1 + 2 + 3 + 4 von LHR-A als membrangebundene Proteine in
CHO-Zellen exprimiert.
Darüber
hinaus wurden Short Consensus Repeats 8 bis 11 von CR1 und der Phosphatidyl-Anker
des Decay Accelerating Factors als ein membrangebundenes stabiles
Expressionskonstrukt in einer Schweine-Endothelial-Zelllinie synthetisiert
(Mikata S. et al., Transplant Immunol 1988 2 107–10). Das US-Patent 5,847,082
beschreibt chimäre
Komplementinhibitoren, die Teile des Komplementinhibitors CD59 und
eine transmembrane Domäne
umfassen, die dazu dient das chimären Protein an der Zellmembran
zu verankern, während
die komplementinhibitorischen Eigenschaften des Ausgangs-CD59 Moleküls beibehalten
werden. Das US-Patent 5,843,778 beschreibt chimäre Proteine, die Teile des
Vaccine-Komplement-Kontrollproteins
und eine transmembrane Domäne
ebenso wie andere verbundene Fusionsproteine enthalten. In all diesen
Fällen
ist jedoch das Ausbringen eines Komplementinhibitors auf eine Zelloberfläche abhängig von
der Expression der relevanten transvetierten Gene in dieser Zelle
und tritt gewöhnlich
im Zusammenhang mit transgenen Tieren auf.
-
Einige
lösliche
Fragmente von CR1 wurden ebenso mittels rekombinanten DNA-Verfahren
hergestellt, indem die Transmembran-Regionen der exprimierten DNA
beseitigt wurden (WO 89/09220, WO 91/05047). Die löslichen
CR1-Fragmente waren funktionell aktiv, banden C3b und/oder C4b,
und zeigten Faktor 1-Cofaktor-Aktivität, abhängig von den Regionen, die
sie enthielten. Solche Konstrukte inhibierten in vitro komplementvermittelte
Funktionen, wie das neutrophile oxidative Zerreißen, die komplementvermittelte
Hämolyse,
und die C3a und C5a-Produktion. Ein besonderes lösliches Kontrakt sCR1/pBSCR1c
zeigte ebenso in vivo Aktivität
in einer umgekehrten passiven Arthus-Reaktion (WO 89/09220, WO 91/05047;
Yeh et al., 1991, J. Immunol. 146: 250), es unterdrückte eine
post-ischämische
Myocard-Entzündung
und Nekrose (WO 89/09220, WO 91/05047; Weisman et al., Science,
1990, 249: 146–1511;
Dupe, R. et al., Thrombosis & Haemostasis
(1991) 65 (6) 695) und blockierte ebenso ZNS-Entzündung,
Demyelinisierung und die Ablagerung von Komplement-Komponenten in
einem Modell von antikörper-vermittelter,
demyelinisierender, experimenteller, allergischer Enzephalomyelitis
(ADEAE) (Piddlesden et al., 1994, J. Immunol. 152, 5477).
-
Es
wurde gezeigt, dass das lösliche
CR1 komplementvermittelte Abstoßungsprozesse
in verschiedenen Transplantationsmodellen inhibiert (Pruitt & Bollinger, 1991,
J. Surg. Res 50: 350; Pruitt et al., 1991, Transplantation 52; 868,
Pruitt et al., 1994, Transplantation 57, 363–370). Es wurde ebenso gezeigt,
dass dieses Agens Gefäßverletzungen
und microvaskuläre
Thrombosen in renaler Allotransplantat-Abstoßung in der Ratte vermindert
(Pratt et al., 1996, Am. J. Pathol. 149, 2055–2066; Pratt et al., 1997,
Eur. J. Immunol, 27, 2848–2853).
-
Die
Rolle von aktivierten T-Lymphozyten in der Transplantat-Abstoßung ist
gut bekannt und ist die Basis für
verschiedene immunsuppressive therapeutische Ansätze, von denen bekannt ist,
dass zum Verzögern der
Transplantat-Abstoßung
geeignet sind. Diese schließen
Mittel wie Cyclosporin, FK506 und Rapamycin ein, die Liganden für Rezeptoren
sind, die Cyclophiline oder Immunophiline genannt werden und die
in die Signalwege der Zelle durch Inhibieren der Phosphatase-Aktivität von Calcineurin
eingreifen (siehe zum Beispiel Ho et al., 1996, Clin. Immunol. Immunopathol.,
80, S40–5).
-
Die
Verwendung des Anti-CD3 monoklonalen Antikörpers OKT3, der CD3-positive
T-Zellen ausschalten und inhibieren kann, ist ebenso wichtig. Der
Prozess selbst kann mit der Komplement-Aktivierung verbunden werden,
da Patienten mit einem renalen Allotransplantat, die mit dem monoklonalen
Antikörper
OKT3 behandelt werden, weniger Nebenwirkungen und geringere Komplementaktivierung
zeigten, wenn der Antikörper als
2-Stunden-Infusion anstelle einer Bolus-Infusion gegeben wurde;
die Autoren schlossen daraus, dass die Komplementaktivierung eine
Rolle in der Entwicklung von Nebenwirkungen nach der ersten OKT3-Dosis
zu spielen schien (Buysmann et al., 1997, Transplantation, 64, 1620–3).
-
Die
WO 98/02454 beschreibt wasserlösliche
Derivate von Polypeptiden, die zwei oder mehr heterologe membranbindende
Elemente enthalten, von denen jedes eine relativ geringe Affinität zu den
Komponenten der äußeren Zellmembran
aufweist, die aber in Kombination eine hohe Affinität und relative
Selektivität
zum Binden an äußere Membranen
von verschiedenen Zelltypen haben.
-
Die
bevorzugten Derivate dieser Erfindung haben die folgende Struktur: [P]-{L-[W]}n-X in welcher:
P
das lösliche
Polypeptid ist,
jedes L unabhängig eine flexible Linker-Gruppe
ist,
jedes W unabhängig
ein pepitidisches Membran-bindendes Element ist,
n eine ganze
Zahl von 1 oder mehr ist, und
X eine peptidische oder nicht
peptidische Membranbindungseinheit ist, die kovalent mit jedem W
verbunden sein kann.
-
Peptidische
membranbindende Elemente sind bevorzugt aufeinander folgend entweder
auf dem N- oder C-Terminus des löslichen
Polypeptids lokalisiert und sind bevorzugt 8 bis 20 Aminosäuren lang.
Die Aminosäuresequenzen
sind miteinander und mit dem löslichen
Peptid über
Linker-Gruppen verbunden, die bevorzugt ausgewählt sind aus hydrophilen und/oder
flexiblen Aminosäuresequenzen
von 4 bis 20 Aminosäuren; linearen
hydrophilen synthetischen Polymeren; und chemischen Brückengruppen.
-
Es
wurde jetzt herausgefunden, dass Organe, die mit einer neuen Formulierung
eines Mittels, das ein lösliches
Derivat eines löslichen
Polypeptids ist, das zum Beispiel als Inhibitor oder Regulator des
Immun- oder Gerinnungssystems wirkt, wobei das Polypeptid oder Derivat
gemäß WO 98/02454
verändert
wurde (solche Veränderungen
schließen
bestimmte neue membranbindende Elemente ein), perfundiert werden,
dieses Mittel adsorbieren und das Organ dieses Mittel für eine verlängerte Zeitdauer
speichern wird. Das perfundierte Mittel ist daher geeignet, ein
Organ wie die Niere oder ein aufgebautes Gewebe vor einem Komplement-Angriff
zu schützen,
ohne die Notwendigkeit, das schützende
Molekül
in einem transgenen Tier oder durch Gentherapie zu exprimieren.
-
Erfindungsgemäß wird ein
Präparat
für die
Perfusion eines Organs vor der Transplantation oder zum Lagern des
Organs bereitgestellt, das folgendes umfasst: ein lösliches
Derivat eines löslichen
Polypeptids, wobei das genannte Derivat zwei oder mehrere heterologe
membranbindende Elemente mit geringer Membranaffinität umfast,
die covalent an das Polypeptid gebunden sind, wobei die Elemente
mit Komponenten von Membranen des Organs, die extrazellulären Perfusionsflüssigkeiten
ausgesetzt sind, unabhängig
und mit thermodynamischer Additivität interagieren können; und
eine physiologisch verträgliche
Spül-Lagerungslösung.
-
„Heterolog" bedeutet, dass die
Elemente in dem nativen Protein mit voller Länge, von dem ein lösliches Protein
abgeleitet werden kann, nicht gefunden werden.
-
„Lösliches
Polypeptid" bedeutet
ein trunkiertes Derivat eines Proteins voller Länge, dem seine natürliche Membranbindungsfähigkeit
fehlt und/oder ein Polypeptid, das einen Löslichkeitsgrad in einem wässrigen Medium
von > 100 μg/ml aufweist.
-
„Membranbindendes
Element mit geringer Membranaffinität" bedeutet, dass das Element nur mäßige Affinität zu Membranen
aufweist, das heißt
eine Dissoziationskonstante größer als
0,1 μM,
bevorzugt 1 μM
bis 1 mM. Das Element weist bevorzugt eine Größe von < 5 kDa auf.
-
Das
Derivat sollte ausreichend Elemente mit niedriger Affinität für Membrankomponenten
einschließen,
um in einem Derivat mit einer hohen (bevorzugt 0,01 bis 10 nM Dissoziationskonstante)
Affinität
für spezifische
Membranen zu resultieren. Die Elemente sind so vereinigt, dass eine
insgesamt hohe Affinität
für eine besondere
Zielmembran gebildet wird, aber der Kombination fehlt eine solche
hohe Affinität
für andere
Proteine, für
die einzelne Elemente (niedrig affine) Liganden sein können.
-
Die
Elemente sollten derart ausgewählt
sein, dass sie eine geeignete Löslichkeit
in pharmazeutischen Formulierungsmedien bewahren, bevorzugt > 100 μg/ml. Bevorzugt
ist wenigstens ein Element hydrophil.
-
Bevorzugt
weist das Polypeptid antikoagulierende, antithrombotische oder immunregulatorische
Aktivität
auf. Beispiele für
Polypeptide, die immunregulatorische Aktivität aufweisen, sind Polypeptide
mit Komplement-inhibierender Aktivität. Bevorzugt ist das Polypeptid
ein CR1-Polypeptidfragment. Beispiele bevorzugter Polypeptide, die
antithrombotische oder antikoagulierende Aktivität aufweisen, sind aktiviertes
Protein C und Hirudin und Analoge desselben.
-
Insbesondere
betrifft die vorliegende Erfindung ein Präparat zum Vorbeugen einer ischämischen
Perfusionsverletzung für
die Perfusion eines Organs vor der Transplantation oder Aufbewahrung
des Organs, das folgendes umfasst:
ein lösliches Derivat eines löslichen
Polypeptids, wobei das genannte Derivat zwei oder mehr heterologe
membranbindende Elemente mit geringer Membranaffinität umfasst,
die kovalent an das Polypeptid gebunden sind, wobei die Elemente
mit Komponenten von Membranen des Organs, die extrazellulären Perfusionsflüssigkeiten ausgesetzt
sind, unabhängig
und mit thermodynamischer Additivität interagieren können; und
eine
physiologisch verträgliche
Spül-Lagerungslösung, wobei
das genannte Derivat aus einem Fragment von CRI (die ersten drei
Short Consensus Repeats, SCRI-3) konjugiert mit Myristol und einer
basischen Aminosäuresequenz
gemäß SEQ ID
Nr. 1, besteht, und die genannte physiologisch verträgliche Spül-Lagerungslösung Soltran
ist, die die folgenden Bestandteile je einen Liter Lösung aufweist:
Kaliumcitrat (8,6 g), Natriumcitrat (8,2 g), Mannitol (33,8 g),
Magnesiumsulfat (10,0 g), und einen pH-Wert von 7,1 und eine Osmolarität von 486 mOsm/l
aufweist.
-
Ebenso
wird erfindungsgemäß ein Verfahren
zum Herstellen eines Präparats
entsprechend der Erfindung bereitgestellt, das folgendes umfasst:
Exprimieren von DNA, die den Polypeptidabschnitt des Derivats codiert,
in einer rekombinanten Wirtszelle; post-translationales Modifizieren
des Polypeptids, zum chemischen Einbringen der membranbindenden
Elemente, um das Derivat zu bilden; Gewinnen des Derivats; und Vermischen
des Derivats mit der Spül-Lagerungslösung.
-
Erfindungsgemäße Verfahren
können
ferner umfassen: Präparieren
eines replizierbaren Expressionsvektors, der in der rekombinanten
Wirtszelle, die das Polypeptid codierende DNA exprimieren kann;
Transformieren der rekombinanten Wirtszelle mit dem Vektor; und
Kultivieren der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die
eine Expression des DNA-Polymers zulassen, zum Erzeugen des Polypeptids.
-
Ebenso
wird erfindungsgemäß ein Verfahren
zum Präparieren
eines Organs in vitro vor der Transplantation oder Lagerung des
Organs bereitgestellt, das folgendes umfasst: Herstellen eines Präparats entsprechend
der Erfindung; und Perfundieren des Organs mit der hergestellten
Lösung.
-
Ebenso
wird erfindungsgemäß die Verwendung
eines Präparats
zur Herstellung eines Mittels zum Vorbeugen, Behandeln oder Lindern
einer ischämischen
Reperfusionsverletzung in Verbindung mit einer Entzündung oder
unangemessener Komplementaktivierung eines Organs vor oder während oder
nach Lagerung oder vor oder während
der Transplantation bereitgestellt.
-
Die
Erfindung bietet die Lokalisierung von therapeutischen Mitteln an
zellulären
Membranen von spezifischen Organen, die durch Perfusion zugänglich sind,
wobei eine oder mehrere biologisch signifikante Wirkungen mit möglichen
therapeutischen Vorteilen bereitgestellt wird, die die Inhibierung
von Komplementaktivierung und die Inhibierung von cytotoxischer
T Lymphozyten-Funktion
einschließen,
aber nicht darauf beschränkt
sind.
-
Spül-Lagerungslösungen werden
zum Spülen
von Organen vor der Transplantation, zum Präparieren des Transplantats
für die
Transplantation verwendet. Sie wurden entwickelt, um die wahrnehmbaren
Probleme, die mit verlängerter
Lagerung von Organen verbunden sind, zu überwinden. Spül-Lagerungslösungen umfassen
sterile wässrige
Lösungen
mit einem pH, einer Osmolarität
und einer ionischen Zusammensetzung, die mit dem Organ kompatibel
ist, und berücksichtigen
die metabolische Aktivität
und den Adenin-Nukleotidgehalt des Organs während der Lagerung.
-
Es
gibt eine Anzahl von kommerziell erhältlichen Spül-Lagerungslösungen, die verschiedene chemische
Zusammensetzungen aufweisen. Die hauptsächlich im Krankenhausbereich
verwendeten sind „Euro-Collins", hergestellt von
Fresenius AG in Deutschland, „VI-ASPAN.RTM", hergestellt von
DuPont Chemical Company und „Soltran" Nieren-Perfusionslösung, hergestellt
von Baxter Healthcare Ltd., UK. Zusätzlich gibt es eine Anzahl
von Spül-Lagerungslösungen,
die beschrieben wurden und die möglicherweise
zukünftig
im Krankenhausbereich eingesetzt werden. Diese schließen diejenigen
ein, die in US-Patent 5,702,881 beschrieben sind und auf einem basalen
Säugetierzell-Kulturmedium
mit bestimmten zusätzlichen
Hilfsstoffen basieren, und solche, die in US-Patent 5,693,462 beschrieben
sind, die alternative Hilfsstoffe, besonders Amilorid enthaltende
Verbindungen enthalten.
-
Soltran
von Baxter Healthcare Ltd. enthält
die folgenden Bestandteile (pro Liter der Lösung):
Kaliumcitrat 8,6
g
Natriumcitrat 8,2 g
Mannitol 33,8 g
Magnesiumsulfat
10,0 g
-
Die
Lösung
weist einen pH von 7,1 und eine Osmolarität von 486 mOsm/l auf.
-
Kochsalzlösung, nahe
an der Isotonie (0,145 M) kann als einfache Spül-Lagerungslösung verwendet werden.
-
Es
wurde berichtet, dass verschiedene Zusätze zu Spül-Lagerungslösungen das Überleben
des Organs verbessern und Reperfusionsverletzungen vermindern. Diese
schließen
Pentoxifyllin (Okabayashi et al., 1994, Ann. Thorac. Surg. 58, 416–420), Trimetazidin
(Hauet et al., 1997, Transplantation, 64, 1082–1086) und Nitroprussid (Fujino
et al., 1997, J. Heart Lung Transplant. 16, 1073–1080) ein. In all diesen Fällen wurden
die Zusätze
zu den Spül-Lagerungslösungen gegeben
und das Transplantationsverfahren schloss die Gaben einiger zugesetzter
Mittel an den Empfänger
ein.
-
Wenn
das Derivat in der Spül-Lagerungslösung nicht
stabil ist, kann es von ihr getrennt in stabiler Form aufbewahrt
werden und kurz bevor das Organ mit dem Präparat perfundiert wird mit
der Spül-Lagerungslösung, gemischt
werden.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung werden lösliche
Derivate der löslichen
Polypeptide, die in
US 5,833,989 und
WO 98/39433 beschrieben sind, in Soltran Nieren-Perfusionslösung gelöst. Ebenso
werden in einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung die löslichen
Derivate, die in WO 98/02454 beschrieben sind, in Soltran Nieren-Perfusionslösung gelöst.
-
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung werden lösliche
Derivate von löslichen Polypeptiden,
die in WO 98/02454 und WO 98/39433 beschrieben sind, und die „Myristoyl-Elektrostatische Schalter"-Sequenz(en), wie
in WO 98/02454 und unten definiert, enthalten, in Soltran Nieren-Perfusionslösung gelöst. Es wurde
herausgefunden, dass die Bindung an Membranen mit beschränkten (singlesite)
Modifikationen mit Fettsäureacylgruppen
verbunden ist, wenn sie mit einer Gruppe von basischen Aminosäuren in
der Proteinsequenz kombiniert wird, die mit sauren Phospholipid-Kopfgruppen
interagieren und zusätzliche
Energie für
die Bindung der Zielmembran bereitstellt. Diese Kombination von
Wirkungen wurde der „Myristoyl-Elektrostatische
Schalter" genannt
(S. McLaughlin und A. Aderem, TIBS, 20, 272–276, 1994; J. F. Hancock et
al., Cell, 63, 133–139,
1990). Daher sind ein weiteres Beispiel von geeigneten membranbindenden
Elementen basische Aminosäuresequenzen
wie die, die in Proteinen wie Rad und MARCKS (myristoylated alanine-rich
C-kinase substrate, P. J. Blackshear, J. Biol Chem., 268, 1501–1504, 1993)
gefunden werden, die den elektrostatischen „Schalter" durch reversible Phosphorylierung von
Serinresten innerhalb der Sequenz vermitteln und eine gleichzeitige
Neutralisierung der positiven Ladung. Solche Sequenzen schließen aufeinander
folgende Sequenzen von Lysin oder Arginin, wie (Lys)n ein, worin
n von 3 bis 10 ist, bevorzugt 4 bis 7, sind aber nicht darauf beschränkt.
-
Geeignete
Beispiele von Aminosäure-Sequenzen,
die basische Aminosäuren
umfassen, schließen
- (i) DGPKKKKKKSPSKSSG
- (ii) GSSKSPSKKKKKKPGD
- (iii) SPSNETPKKKKKRFSEKKSG
- (iv) DGPKKKKKXSPSKSSK
- (v) SKDGKKKKKKSKTK
ein, (N-Terminus auf der linken
Seite).
-
Die
Sequenzen (i) bis (v) sind Beispiele für elektrostatische Schalter-Sequenzen.
-
In
einer stärker
bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist das lösliche
Derivat, das der SEQ ID Nr. 8 in WO 98/02454 entspricht (und das
hier als Referenz als SEQ ID Nr. 1 bereitgestellt wird) in Soltran
Nieren-Perfusionslösung
gelöst.
-
In
weiteren Ausführungsformen
der Erfindung übertragen
Polypeptid-Derivate,
in die neue peptidische membranbindende Elemente eingebettet sind,
eine hohe Affinität
für Zelltypen,
die in dem Zielorgan gefunden werden. Beispiele solcher Zelltypen
schließen
glomeruläre
Epithelial- und Endothelial-Zellen der menschlichen Niere ein. Diese
peptidischen membranbindenden Elemente W sind Liganden für Zelloberflächenproteine,
die als Marker für
ein bestimmtes Organ oder Gewebe dienen.
-
Es
ist für
den Fachmann offensichtlich, dass verschiedene Proteine mit anderen
Spül-Lagerungslösungen als
den oben erläuterten
formuliert werden können.
Zum Beispiel beschreiben WO 98/02454 und WO 98/39433 einige neue
Komplementinhibitoren, die zum Bilden eines löslichen Derivats modifiziert
werden können
und in Soltran-Verdünnung
formuliert wurden.
-
Die
Formulierungen der Erfindung sind zum Vorbeugen, Behandeln oder
Lindern von vielen komplementvermittelten und komplementbezogenen
Erkrankungen geeignet, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, hyperakute
und akute Transplantat-Abstoßung
von transplantierten Organen, wie der Niere, des Herzens, der Leber
oder den Lungen (insbesondere in Individuen, die durch vorhergehende
transplantierte Organe sensibilisiert wurden), Ischämie-Reperfusionsverletzungen
in transplantierten Organen, Transplantat- und Hornhaut-Transplantat-Abstoßung.
-
Beschreibung
der Figur
-
1 zeigt
Blut-Harnstoff-Stickstoff(BUN)-Daten in DA-DA Nieren-Isotransplantat-Empfängern (n
= 6) zwei Wochen nach der Transplantation. Die Kontrollgruppe ist
signifikant verschieden (p < 0,0001)
von der von der Norm, wohingegen die behandelte Gruppe nicht signifikant
von der Norm abweicht (p = 0,0530). Die Daten zeigen, dass in den
Organen, die mit einer Verbindung der Erfindung perfundiert wurden,
die Nierenfunktion nach der Transplantation während der ersten Woche nach
der Transplantation verbessert wurde.
-
Die
Erfindung wird ferner mittels Beispielen beschrieben.
-
IN DEN BEISPIELEN
VERWENDETE ALLGEMEINE VERFAHREN
-
(i) Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelektrophorese
(SDS-PAGE)
-
SGS
PAGE wurde allgemein unter Verwendung des Novex-Systems (Novex,
Deutschland) entsprechend der Anleitung des Herstellers durchgeführt. Vorgepackte
Acrylamidgele mit 4–20%
Konzentration wurden am häufigsten
verwendet. Die Proben für
Elektrophorese, einschließlich
den Proteinmolekulargewichts-Standards (zum Beispiel LMW Kit, Pharmacia
oder Novex Mark 12) wurden gewöhnlich
in 1% (Gew/Vol) SDS-enthaltendem Puffer (mit oder ohne 5%igen (Vo/Vol)
2-Mercaptoethanol) verdünnt
und bei Raumtemperatur für
ungefähr
eine halbe Stunde stehengelassen, bevor sie auf das Gel aufgetragen
wurden.
-
(ii) Reduktion von Disulfiden
und Modifikationen von Thiolen in Proteinen
-
Es
gibt eine Reihe von eingesetzten Verfahren, um die Hauptziele zu
erreichen. Der Grund, warum es nötig
sein kann, selektive Reduktion von Disulfiden durchzuführen, ist,
dass während
der Rückfaltung,
dem Konzentrieren und dem weiteren Reinigen von multi-Thiol-Proteinen
ungeeignete Disulfid-Paarungen auftreten können. Zusätzlich ist es, selbst wenn
die richtige Disulfid-Paarung auftritt, möglich, dass ein freies Cystein in
dem Protein mit dem Reduzierungsagens, zum Beispiel Glutathion,
blockiert wird. Diese Derivate sind im allgemeinen ziemlich stabil.
Um sie zum Beispiel für
die nachfolgende Konjugation mit einer anderen funktionellen Gruppe
reaktiver zu machen, müssen
sie selektiv, zum Beispiel mit Dithiothreitol (DTT) oder mit Tris(2-Carboxyethyl)Phosphin·HCl (TCEP),
reduziert werden und dann optional mit einer Funktion, die mäßig instabil
ist, modifiziert werden. Ein Beispiel für das letztere ist Ellmans
Reagens (DTNB), das gemischte Disulfide ergibt. Indem Fall, in dem
die Behandlung mit DTNB weggelassen wird, ist die genaue Beachtung
des experimentellen Designs notwendig, um sicherzustellen, dass
die Dimerisierung der freien Thiol-haltigen Proteine minimiert wird.
Mit Bezug auf den oben genannten Ausdruck „selektiv reduziert" bedeutet dies, dass
die Reaktionsbedingungen, zum Beispiel die Dauer, Temperatur, molaren
Verhältnisse
der Reaktanten vorsichtig gesteuert werden müssen, so dass die Disulfidbrücken innerhalb
der natürlichen
Architektur des Proteins nicht reduziert werden. Alle Reagenzien
sind zum Beispiel von Sigma oder Pierce kommerziell erhältlich.
-
Die
folgenden allgemeinen Beispiele stellen den Typ von Bedingungen
dar, die verwendet werden können
und die für
die Bildung von freien Thiolen und deren möglichen Modifikationen geeignet
sind. Die besonderen Reaktionsbedingungen zum Erreichen einer optimalen
Thiolreduktion und/oder -modifikation, werden idealerweise für jede Proteincharge
bestimmt.
-
TCEP
kann als eine 20 mM Lösung
in 50 mM Hepes (pH ungefähr
4,5) hergestellt werden und kann bei –40°C gelagert werden. DTT kann
10 mM in Natriumphosphat, pH 7,0, hergestellt werden und kann bei –40°C gelagert
werden. DTNB kann 10 mM in Natriumphosphat, pH 7,0, hergestellt
werden und kann bei –40°C gelagert
werden. Alle der oben genannten Reagenzien werden normalerweise
in ihrem molaren Gleichgewicht oder molaren Überschuss verwendet, die genauen
Konzentrationen werden idealerweise experimentell bestimmt. Die
Dauer und die Temperatur der Reaktion werden ebenso experimentell
bestimmt. Im Allgemeinen würde
die Dauer in einem Bereich von einer bis 24 Stunden und die Temperatur
in einem Bereich von 2 bis 30 Grad C liegen. Ein Überschuss
an Reagens kann auf einfache Weise durch Pufferaustausch entfernt werden,
zum Beispiel unter Verwendung von Sephadex G25. Ein geeigneter Puffer
ist 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,0.
-
(iii) Antikomplement-Aktivität gemessen
durch die auf klassischem Weg vermittelte Hämolyse von Schaf-Erythrocyten
-
Die
funktionelle Aktivität
der Komplementinhibitoren wurde durch Messen der Inhibierung der
komplementvermittelten Lyse von Schaf-Erythrocyten, die mit Hasen-Antikörpern (Diamedix
Corporation, Miami, USA) sensibilisiert wurden, bestimmt. Der Assay
ist so gestaltet, dass er für
den klassischen Weg der Komplement-Aktivierung spezifisch ist. 1:100 verdünntes Humanserum
(Endkonzentration in der Assay-Mischung) in 0,1 M Hepes/0,15 M NaCl/0,1%
Gelatine, pH 7,4, wurde als Quelle für das Komplement verwendet.
Das Serum wurde aus einem Pool von Freiwilligen, wie es im Wesentlichen
in Dacie & Lewis,
1975, beschrieben ist, hergestellt. In Kürze: das Blut wurde für fünf Minuten
auf 37°C
erwärmt,
die Gerinnsel entfernt und das verbleibende Serum durch Zentrifugieren
geklärt.
Die Serumfraktion wurde in kleine Aliquots aufgeteilt und bei 196°C oder –80°C gelagert.
Die Aliquots wurden wie benötigt
aufgetaut und unmittelbar vor der Verwendung in Hepes-Puffer verdünnt. Die
Inhibierung der komplementvermittelten Lyse von sensibilisierten
Schaf-Erythrocyten wurde
unter Verwendung eines Standard-Hämolyse-Assays, unter Verwenden
von Microtiterplatten mit einem V-Boden-Format wie folgt gemessen:
50 μl einer Konzentrationsreihe
des Inhibitors, der in Hepes-Puffer gelöst war, wurden mit 50 μl des verdünnten Serums
und 100 μl
sensibilisierten Schaf-Erythrocyten
vermischt und dann für
eine Stunde bei 37°C
inkubiert. Die Proben wurden bei 1600 Upm für drei Minuten bei Raumtemperatur
geschüttelt,
bevor 150 μl Überstand in
eine Microtiterplatte mit flachem Boden überführt wurden und die Absorption
bei 405 oder 410 nm bestimmt wurde. Die maximale Lyse (Amax) wurde
durch Inkubieren des Serums mit Erythrozyten in Abwesenheit jeglichen
Inhibitors bestimmt. Die Hintergrund-Lyse (Ao) wurde durch Inkubieren
der Erythrozyten in Abwesenheit jeglichen Serums oder Inhibitors
bestimmt. Die Inhibierung wurde als eine Fraktion der gesamten Zell-Lyse ausgedrückt, so
dass der IH50 die Konzentration des Inhibitors ausdrückt, der
benötigt
wird, um eine 50%ige Inhibierung der Lyse zu erreichen. % Inhibierung = [1 – [(A – Ao/(Amax – Ao)]] × 100
-
(iv) Anti-Komplement-Aktivität gemessen
durch die auf dem alternative Weg vermittelte Hämolyse von Meerschweinchen-Erythrocyten
-
Die
funktionelle Aktivität
der Komplementinhibitoren wurde durch Messen der Inhibierung von
komplementvermittelter Lyse von Meerschweinchen-Erythrocyten, wie sie im Wesentlichen
von Scesney, S. M. et al. (1996) J. Immunol. 26 1729–1735 beschrieben
wurde, bestimmt. Der Assay ist so gestaltet, dass er für den alternativen
Weg der Komplement-Aktivierung spezifisch ist. Humanserum, das aus
einem Pool von Freiwilligen, wie es im Wesentlichen in Dacie & Lewis, 1975,
beschrieben ist, wurde als Komplementquelle verwendet. In Kürze: das
Blut wurde für
5 Minuten auf 37°C
erwärmt,
die Gerinnsel entfernt und das verbleibende Serum durch Zentrifugieren
geklärt.
Die Serumfraktion wurde in kleine Aliquots geteilt und bei –196°C gelagert.
Die Aliquots wurden wie benötigt
unmittelbar vor der Verwendung aufgetaut und in 0,1 M Hepes/0,15
M NaCl/0,1% Gelatine/8 mM EGTA 5 mM MgCl2 pH
7,4 (Puffer A) verdünnt.
-
Meerschweinchen-Erythrozyten,
genauso wie Alsevers, wurden bei TCS Microbiology gekauft und bei +4°C gelagert.
Sie wurden innerhalb von zwei Wochen verwendet. 50 μl einer Konzentrationsreihe
des Inhibitors, die in Puffer A in einer Microtiterplatte mit V-Boden
verdünnt
wurden, wurden zunächst
mit 100 μl
Serum, das 1:3 (in Puffer A) verdünnt wurde, gemischt und zweitens
mit 50 μl
Meerschweinchen-Erythrozyten
(1:49 in Puffer A verdünnt)
und für
eine Stunde bei 37°C
inkubiert. Die Platte wurde bei 1600 Upm für drei Minuten geschüttelt, bevor
150 μl jedes Überstands
in eine Microtiterplatte mit flachem Boden überführt wurden und die Absorption
bei 405 nm bestimmt wurde, was die Menge an Lyse in jeder Testlösung wiedergibt.
Die maximale Lyse (Amax) wurde durch Inkubieren des Serums mit Erythrozyten
in Abwesenheit jeglichen Inhibitors bestimmt. Die Hintergrund-Lyse
(Ao) wurde durch Inkubieren der Erythrozyten in Abwesenheit jeglichen
Serums oder Inhibitors bestimmt. Um zu prüfen, ob der Inhibitor selbst
irgendeine Wirkung auf die Lyse hat, wurden Erythrozyten nur mit
Inhibitor inkubiert; wobei keine der Verbindungen direkte Wirkungen
auf die Lyse der roten Blutzellen hatte. Die Endverdünnung des
Serums, das in diesem Assay verwendet wurde, absorbierte bei 405 nm,
aber der Grad an Absorption (ungefähr 10% von Amax) wurde für vernachlässigbar
in der Wirkung auf die gesamten Assay-Ergebnisse gehalten und wurde
in den Berechnungen vernachlässigt.
Die Inhibierung wurde als Fraktion der gesamten Zell-Lyse ausgedrückt, so
dass der IH50 die Konzentration des Inhibitors ausdrückt, der
benötigt
wird, um eine 50%ige Inhibierung der Lyse zu erreichen. % Inhibierung = [1 – [(A – Ao/(Amax – Ao)]] × 100
-
Beispiel 1. Synthese und
Isolation der membrangerichteten Komplementinhibitor-SEQ ID Nr. 1 (Referenz:
WO 98/02454, Beispiel 8).
-
a) Alternatives Verfahren
für die
weitere Reinigung.
-
Gereinigtes
SCR1-3/cys Protein, wie es in WO 98/02454, Beispiel 6 (ungefähr 90 Micromolar
in phosphatgepufferter Kochsalzlösung
(PBS); 87 ml) definiert wird wurde mit Triscarboxyethylphosphin
(0,315 ml 50 mM Stammlösung
in 50 mM Hepes, pH 4,5) für
18 Stunden bei 25°C
behandelt. Ethanolamin wurde zur Lösung gegeben, um eine Endkonzentration
von 0,05 M unter Zugabe von 0,26 ml unverdünntem Stammreagens (vermutlich
16,6 M) zu erhalten. MSWP-1 (Beispiel 2 in WO 98/02454) (2,35 ml
10 mM Stammlösung
in 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,0) wurde zur Lösung gegeben und für weitere
drei Stunden bei 25°C
inkubiert und dann für
15 Minuten auf Eis gelegt. 40 g gewaschenes und durch Absaugen getrocknetes
Toyopearl Butyl wurde zugegeben und die Mischung wurde geschüttelt und
für fünf Minuten
auf Eis stehen gelassen. Die Mischung wurde erneut geschüttelt und
in eine Glashülse
mit einem Innendurchmesser von 41 mm gegeben, und die Matrix wurde
als normale Chromatographie entwickelt, alles bei ungefähr 4°C. Die Säule wurde
zuerst mit 0,1 M Natriumphosphatpuffer und dann mit 0,3 M Ethanolamin
entwickelt. Ein Hauptpeak A280 wurde aus der Matrix unter Verwendung
des Ethanolaminpuffers eluiert. Sie wurde als Einzelfraktion (40
ml) gesammelt und auf eine Sephadex G25 Säule (Vt 160 ml) gegeben, die
mit PBS equilibriert wurde. Die Fraktion wurde mit dem Gleichgewichtspuffer
durchgeführt.
Die Vo-Fraktion (70 ml) wurde als Produkt betrachtet und bei –40°C gelagert.
Nach SDS-PAGE gefolgt von Färben
mit Coomassie Brilliant Blue enthielt die Vo-Fraktion ein einzelnes Haupt-Polypeptid
einer geschätzten
Reinheit > 90% mit
einem offensichtlichen Molekulargewicht von 24000.
-
b) Alternatives Reinigungsverfahren
II
-
Das
Verfahren war im Wesentlichen das in a) Beschriebene, aber der Puffer
für den
Sephadex G25-Schritt war PBS/50 mg ml–1 Mannitol
USP/0,1 M L-Arginin
BP, pH 7,4. Das Einstellen des pH erfolgte durch Zugabe von HCl
zu der Lösung
bis der pH 7,4 erreichte.
-
Beispiel 2. Synthese eines
Myristoyl-Elektrostatischen Schalter-Peptidreagens, das zwei peptidische
Membran bindende Elemente (SEQ ID Nr. 3) einschließt.
-
- N-Myristoyl) -Gly-Ser-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro-Gly-Leu-Ser-Ser-Arg-Leu-Asp-Ala-(S-2-Thiopyridyl)Cys-NH2
-
Das
Peptid:
Gly-Ser-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro-Gly-Leu-Ser-Ser-Arg-Leu-Asp-Ala-Cys-NH2 (SEQ ID No. 4)
wurde unter Verwendung
der Festphasensynthese über
die allgemeine Fmoc/tBu Strategie, die von Sheppard und Atherton
(E. Atherton und R. C. Sheppard, Solid Phase Synthesis, IRL Press,
Oxford, 1989) entwickelt wurde, hergestellt. Kieselgur-unterstütztes Polydimethyl-Acrylamidharz
(Macrosorb 100) wurde als Feststoffträger verwendet und mit Ethylendiamin
derivatisiert.
-
Kupplungsreaktionen
wurden unter Verwendung von N-α-Fmoc
geschützten
Reagenzien, die mit N,N'-Diisopropyl-Carbodiimid/N-Hydroxybenzotriazol
(in vierfachem molaren Überschuss)
voraktiviert waren, unter Bromphenol-Blau Beobachtung, durchgeführt. Für Fmoc-Spaltungen
wurden 20% Piperidin in DMF verwendet. Die Reaktionen zum Zusammenbau
der Peptidkette wurden durch wiederholte Zyklen von Kupplung und
Entfernen des Schutzes, einschließlich des Anhängens des
modifizierten Rink-Linker-Reagens (p-[(R,S)-α-[1-(9H-fluoreny-9-yl-methoxyformamido]2,4-dimethoxybenzyl]-phenoxyessigsäure) das
so gestaltet ist, dass ein C-terminales Amid in der endgültigen Spaltung
erhalten wird, durchgeführt.
Die Seitenketten-Funktionalitäten
der einzelnen Aminosäuren
wurden wie folgt geschützt:
Ser(t-butyl),
Lys(boc), Asp(o-t-butyl), Cys(trityl).
-
Nach
Beendigung des Peptid-Zusammenbaus und während das Peptid immer noch
an dem Harz anhaftete, wurde die Myristoyl-Gruppe an die Aminogruppe
des N-terminalen Glycins durch direkte Kupplung von Myristinsäure durch
dasselbe Aktivierungsverfahren angeheftet. Dieses modifizierte Peptid
wurde dann vom Harz abgespalten und die Seitenketten-Schutzgruppen
gleichzeitig durch Behandeln mit Trifluoressigsäure, die 2,5% Wasser und 2,5%
Triisopropylsilan enthielt, entfernt.
-
Das
Rohprodukt wurde mit 2,2'-Dithiopyridin
in 0,01 M Ammoniumacetatlösung
bei pH 8–9
für ungefähr 2 Stunden
behandelt, dann mit Essigsäure
angesäuert
und durch präparative
Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie
(HPLC) in 0,1% Trifluoressigsäure
(TFA)/Wasser und 0,1% TFA/Acetonitril als Gradienten-Komponente gereinigt.
Nach der Lyophilisierung war das Peptid ein weißes amorphes Pulver, das in
wenigstens 10 mg/ml Dimethylsulfoxid löslich war. Massenspektrometrie
mit schnellem Atombeschuss ergab Hauptpeaks bei m/e 2433,6 Dalton
und 2455,6 Dalton, was den mono-protonierten und mono-Natrium-Molekularionen
des Peptids entspricht. Der 2-Thiopyridylgehalt des Peptids wurde
durch Lösen
des Peptids auf 0,02 mM in 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,0 und Reduzieren
von 0,003 ml durch Zugabe von 1 mM Dithiothreitol (1,0 ml) gemessen.
Die Änderung
in der optischen Dichte bei 343 nm wurde zum Berechnen der Menge
an Pyridin-2-thion verwendet, das unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten
bei dieser Wellenlänge
von 8080 cm–1M–1 freigesetzt
wurde. Dies zeigte an, dass der Peptidgehalt bei ungefähr 47% des
Trockengewichts lag. Die zwei peptidischen Membran-Bindungselemente
in diesem Molekül
entsprachen der kationischen Sequenz Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro
[SEQ ID No. 5] und der Zellbindungs-Sequenz Leu-Ser-Ser-Arg-Leu-Asp-Ala
[SEQ ID Nr. 6].
-
Beispiel 3. Synthese und
Isolation eines Komplementinhibitor-Proteins, wobei zwei peptidische
Membran-Bindungselemente SEQ ID Nr. 2 eingeschlossen werden.
-
- a) Die Synthese und Isolierung von SCR1-3/cys
wurde ausführlich
vorher, in WO 98/02454, Beispiel 6, beschrieben. Alternative Verfahren
für das
Isolieren von gereinigtem Protein wurden durchgeführt. Die
Veränderungen
lagen hauptsächlich
im Rückfaltungsprozess
und werden in b) dieses Beispiels (unten) offenbart.
- b) Das Isolieren von SCR1-3/cys aus E. coli Einschlusskörpern schließt das Solubilisieren
des Zellniederschlags, gefolgt von Chromatographie auf einer Kationen-Austauschmatrix,
zum Beispiel Macroprep High S, ein. Der alternative Prozess zum
Rückfalten,
der in a) erwähnt
wurde, war:
Mit dem Produkt der Ionen-Austauschsäule (ungefähr 3 mg
Gesamtprotein pro ml; 400 ml) wurde ein Pufferaustausch bei Raumtemperatur
unter Verwendung von Sephadex G25-Medium in 0,3 M Ethanolamin/1 mM
EDTA/1 mM L-Cystein/1 mM L-Cystin·2HCl (pH-Einstellung
nicht erforderlich) durchgeführt
und ein 600 ml Vo-Volumen
gesammelt. Das Vo-Eluat wurden dann weiter in kaltem Rückfaltungspuffer
verdünnt,
um eine 10fache Endverdünnung
des Originalvolumens zu ergeben, die auf die G25-Säule gegeben
wurde. 1 mM zusätzliches
L-Cystin·2HCl
wurde nach drei Stunden zugegeben und die Lösung wurde für drei Tage bei
ungefähr
2–3°C statisch
gehalten. (In späteren
Wiederholungsuntersuchungen wurde direkt eine 2 mM L-Cystin·2HCl-Konzentration,
bevorzugt gegenüber
zwei einzelnen 1 mM Zugaben, verwendet.) Die Lösung wurde dann unter Verwendung
einer YM10-Membran zu einem Endvolumen des Retentats von ungefähr 200 ml
ultrafiltriert, das mit 9 Vol. 0,1 M NaH2PO4/1 M (NH4)2SO4, pH 7,0 (Puffer
A) bei Raumtemperatur gemischt wurde und sofort bei 3000 Upm für 20 Minuten
zentrifugiert wurde. Der Überstand
der Zentrifugation wurden dann bei Raumtemperatur auf Toyopearl
Butyl 650 M chromatographiert, und das Zielprotein wurde unter Verwendung
eines Gradienten (entwickelt über
einem Bettvolumen) von Puffer A in 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,0,
eluiert. Ein einzelner Hauptpeak A280 trat während der Gradientenelution
auf, und dieser wurde separat gesammelt und als das Produkt angesehen.
- c) Konjugation von SCR1-3/cys und MSWP-Reagens.
Die Synthese
des Konjugats folgte derselben Methodik wie sie vorher für ähnliche
Konjugate unter Verwendung alternativer MSWP-Reagenzien beschrieben
wurde, zum Beispiel wie es im obigen Beispiel 1 beschrieben wurde,
außer
dass das in Beispiel 2 beschriebene MSWP-Reagens verwendet wurde.
Die Synthese wurde auf Basis der Analyse der Proben nach der Reaktion
durch SDS-PAGE, gefolgt von Proteinfärbung mit Coomassie Brilliant
Blue, die eine Verlagerung in der Mobilität des SCR1-3/cys (offensichtliches Molekulargewicht
22000) zu einem geringfügig
höheren
Molekulargewicht (24000), die mit der Zugabe des MSWP-Reagens in
einem 1:1 molaren Verhältnis übereinstimmt,
als erfolgreich beurteilt. Das Produkt der Reaktion wurde durch
Pufferaustausch in PBS (50 mg pro ml Mannitol/0,1 M L-Arginin·HCl formuliert,
dessen pH mit Salzsäure
auf 7 eingestellt wurde. Das Produkt wies eine Proteinkonzentration
von 2,3 mg/ml auf, basierend auf A280 und einem molaren Extinktionskoeffizienten
von 30000. Das Produkt zeigte anti-hämolytische Aktivität in in
vitro hämolytischen
Assays des klassischen Wegs (IH50 = 0,3 nM) und des alternativen
Wegs (IC50 = 100 nM). Einzelheiten der zwei hämolytischen Assays wurden vorher
beschrieben und in den allgemeinen Verfahren gegeben.
- d) Weitere Reinigung und anfängliche
Formulierung in PBS/Mannitol/Arginin-Puffer
Das Zielprotein (63 mg),
das auf einem ähnlichen
Weg wie dem oben in c) Beschriebenen, jedoch ohne Pufferaustausch
synthetisiert wurde, wurde 20fach (Gesamtvolumen 700 ml) in 0,1
M Natriumphosphat/1 M Ammoniumsulfat, pH 7,0, verdünnt. Die
Lösung
wurde dann Chargen-weise bei 4°C
mit 35 g durch Absaugen getrocknetem Macroprep Methyl vermischt
und dann direkt in eine Glashülse
gefüllt,
und die Matrix wurde als normale Chromatographie entwickelt. Die
Matrix wurde mit 0,1 M Natriumphosphat/1 M Ammoniumsulfat, pH 7,0,
gewaschen bis die Grundlinie stabilisiert war und dann wurde das
Zielprotein unter Verwenden von 0,3 M Ethanolamin eluiert. Ein A280
Peak, der das Protein enthielt, wurde gesammelt und sofort einem
Säure-Pufferaustausch
unter Verwenden von Sephadex G25 in PBS/50 mg pro ml Mannitol (USP)/0,1
M L-Arginin (USP) unterzogen und auf pH 7 mit Salzsäure eingestellt.
Das Produkt wies basierend auf A280 eine Proteinkonzentration von
0,3 mg/ml und einem molaren Extinktionskoeffizienten von 30000 auf.
Die Vo-Fraktion der G25-Säule
wurde mit einem ähnlichen
Produkt zusammengefasst und wurde zu einem ungefähr 15fachen Konzentrat ultrafiltriert
(YM10 Membran; Amicon). Das Retentat wurde dann durch eine 0,2 μm Filter
(Sartorius, NMWL) geführt,
und das Filtrat wurde aliquotiert und eingefroren. Dieses Material
wurde als das Produkt betrachtet. Das Produkt wies basierend auf
A280 eine Proteinkonzentration von 4,0 mg/ml und einem molaren Extinktionskoeffizienten
von 30000 auf. Die Reinheit, die durch nicht-reduzierende SDS-PAGE bestimmt wurde,
gefolgt von einer Proteinfärbung
unter Verwendung von Coomassie Brilliant Blue, zeigte, dass ungefähr 95% des
färbbaren
Proteins ein offensichtliches Molekulargewicht von ungefähr 23000
aufwiesen – dies
war das veränderte
Zielprotein. Sichtbare Verunreinigungen schlossen Proteindimer ein,
mit einem offensichtlichen Molekulargewicht von ungefähr 37000,
und unverändertes
Protein, mit einem offensichtlichen Molekulargewicht von ungefähr 21000.
Das Produkt zeigte anti-hämolytische
Aktivität
in in vitro hämolytischen
Assays des klassischen Wegs (IH50 = 0,1 nM) und des alternativen
Wegs (IC50 = 100 nM). Einzelheiten der zwei hämolytischen Assays wurden vorher
beschrieben und werden in den allgemeinen Verfahren gegeben.
-
Beispiel 4. Formulierung
des Komplementinhibitors aus Beispiel 1 in Soltran Nieren-Perfusionslösung
-
Das
Material, das wie im obigen Beispiel 1b) beschrieben hergestellt
wurde, wurde aus PBS/Mannitol/Argininpuffer, wie im oben beschriebenen
Beispiel 3d, lyophilisiert. Es wurde in Wasser auf das Anfangsvolumen
wieder gelöst
und dann in Soltran-Perfusat verdünnt, was in einer Lösung mit
einer Konzentration von ungefähr
200 μg/ml
(~8 μM)
resultierte. Die Lösung
wurde sofort verwendet.
-
Beispiel 5. Formulierung
des Komplementinhibitors aus Beispiel 3 in Soltran Nieren-Perfusionslösung
-
Das
Material, das wie im obigen Beispiel 3c beschrieben hergestellt
wurde (0,01 ml), wurde in Soltran-Perfusat (0,99 ml) gelöst. Dies
resultierte in einer Lösung
mit einer Konzentration von ungefähr 0,02 mg/ml (0,87 μM). Die Lösung wurde
dann eingefroren bei –40°C gelagert.
Sie wurde fünf
Tage später
aufgetaut und im hämolytischen
Assay des klassischen Wegs verwendet (Allgemeines Verfahren Nr.
3); sie zeigte einen IH50 von 0,2 nM, was anzeigte, dass sie ihre
gesamte Aktivität
behalten hatte.
-
Beispiel 6. Verfahren
für die
Perfusion einer Niere mit den Komplementinhibitoren der Erfindung
-
Eine
Spender-Rattenniere wurde aus dem Tier unter Verwendung von Standard-Anästhesie-
und Operationsverfahren isoliert und extrahiert. Das Organ wurde
mit der gesamten renalen Arterie und einem Teil der Aorta, der intakt,
aber am anterioren Ende ligiert war, entnommen. Die renale Vene
wurde für
das nachfolgende Transplantationsverfahren an einem geeigneten Punkt
abgeschnitten. Komplementinhibitoren, die, wie oben beschrieben
(ungefähr
2 ml), in Trägerlösungen verdünnt wurden,
wurden dann durch das isolierte Organ durch langsame Injektion in
das Lumen der Aorta verabreicht. Es wurde dafür gesorgt, dass die Zuführung von Luftblasen
in die Gefäße des Organs
während
dieses Verfahrens vermieden wurde. Die Lösungen, die auf diese Weise
verabreicht werden, perfundieren die Niere und traten durch die
renale Vene aus.
-
Beispiel 7. Verfahren
für die
Transplantation von Nieren und experimentelle Bestimmung der Verzögerung der Komplementinhibitoren
durch Immunfluoreszenz
-
Die
Niere einer Empfängerratte
wurde entnommen und eine wie in Beispiel 6 präparierte Spenderniere wurde
an ihrer Stelle positioniert. Das Segment der Aorta, das verwendet
wurde, um die Perfusion des Organs zu ermöglichen, wurde entfernt und
die renale Arterie wurde auf eine geeignete Länge geschnitten. Die Spender-
und Empfänger-Arterie,
die Vene und der Harnleiter wurden dann durch Standard-Microgefäß-Chirurgische
Techniken, die den Blutfluss zum Spenderorgan zurückführen und
eine Urindrainage erlauben, Ende-zu-Ende verbunden. Zum Bestimmen
der Retention der Komplementinhibitoren innerhalb des Organs wurden
die perfundierten transplantierten Organe zu verschiedenen Zeitpunkten
nach der Transplantation entnommen und sofort bei –196°C eingefroren.
Gefrorene, 4 μm
dicke Schnitte wurden dann aus diesen Geweben hergestellt und für eine Stunde
bei 4°C
mit dem geeigneten Volumen eines fluoreszenz-markierten monoklonalen
Maus-Antikörpers (C-3
konjugiertes 3E10 bei 0,47 mg/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung), der gegen
die ersten drei bakteriell exprimierten Short Consensus Repeats
des menschlichen CR1 erzeugt wurde, inkubiert. Photomicrographie
von Schnitten unter ultraviolettem Licht zeigten, dass wenn die
Rattenniere solchen Verbindungen wie denen des obigen Beispiels
3 und des Beispiels 8 der WO 98/02454 ausgesetzt wird, dies in einer
genauen immunfluoreszenten Darstellung der vaskulären und
parenchymalen Strukturen des Organs resultierte und dass diese Markierung
weiterhin bestand, wenn die Nieren in Empfängertiere transplantiert wurden.
-
Beispiel 8. Verfahren
für die
Transplantation von Nieren und experimentelle Bestimmung der Wirkung
von Komplementinhibitoren in der ersten Woche nach Transplantation
-
Die
Niere einer Empfängerratte
wurde entfernt und eine wie in Beispiel 6 präparierte Spenderniere wurde
an ihrer Stelle positioniert. Das Segment der Aorta, das verwendet
wurde, um die Perfusion des Organs zu ermöglichen, wurde entfernt und
die renale Arterie auf eine geeignete Länge geschnitten. Die Spender-
und Empfänger-Arterie, die Vene
und der Harnleiter wurden dann durch Standard-Mikrogefäß-Chirurgischen Techniken,
die den Blutfluss zum Spenderorgan zurückführen und eine Urindrainage
erlauben, Ende-zu-Ende verbunden. Wie im obigen Beispiel 1 wurden,
zum Bestimmen der Wirkung der Verbindungen innerhalb des Organs,
die perfundierten transplantierten Organe zu verschiedenen Zeitpunkten
nach der Transplantation entnommen, von denen Teile entweder bei –196°C eingefroren
wurden oder die in einer 4% Formaldehydlösung in Kochsalzlösung fixiert
wurden. 4 μm
dicke Schnitte gefrorenen Gewebes wurden mit einem Maus-Anti-Ratte C5b-9
Neoantigen-Antikörper
gefärbt
(ein Geschenk von Dr. W. Couser, University of Washington, Seattle, USA;
publiziert in: Nangaku M. Pippin J. Couser WG. Journal of the American
Society of Nephrology, 10 (11): 2323–31, 1999 Nov.) und wurden
mit einem Anti-Maus-Ig Antikörper,
der mit FITC (Dako) konjugiert war, visualisiert.
-
Formaldehydlösung/Kochsalzlösung fixierte
Gewebe wurden verarbeitet und unter Verwendung von Standardverfahren
in Paraffinwachs-Blöcke
eingebettet. 2 μm
dicke Schnitte dieser Gewebe wurden mit Hämotoxylin und Eosin und mit
PAS-(Periodic-Acid-Schiff)Färbung unter
Verwendung von Standardverfahren gefärbt (Theory and Practice of
Histological Techniques, Ed. John D. Bancroft and Alan Sevens, 3rd Edition, Churchill Livingstone, London,
1990). Diese Färbung
erbrachte den histopathologischen Beweis, dass Organe, die mit der
Verbindung des Beispiels 1 in einer Konzentration von 40 Mikrogramm/ml
und unter Verwendung des obigen Perfusionsverfahrens aus Beispiel
6 und des Transplantationsverfahrens aus Beispiel 7 perfundiert wurden,
eine verminderte Komplementaktivierung und eine verminderte Gewebeverletzung
im Vergleich zu Organen aufwiesen, die nicht mit den membrangerichteten
Inhibitoren der Komplementaktivierung perfundiert wurden. Die Blutproben,
die von der Schwanzspitze der Empfänger der perfundierten und
transplantierten Spender-Nieren jeden Tag nach der Transplantation
entnommen wurden, wurden auf den Harnstoff-Stickstoff-Gehalt als
Marker für
die Nierenfunktion, unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen
Kits (Sigma UK), analysiert. Die Analysedaten solcher Proben ergaben
den Beweis, dass die Organe, die mit der Verbindung aus Beispiel
1 perfundiert wurden eine verbesserte Nierenfunktion nach der Transplantation
während
der ersten Woche nach der Transplantation aufwiesen.
-
Beispiel 9. Verfahren
für die
Transplantation von Nieren und experimentelle Bestimmung der Wirkung
der Komplementinhibitoren über
20 Wochen nach der Transplantation.
-
Die
erste Niere einer Empfängerratte
wurde entfernt und eine wie in Beispiel 6 präparierte Spenderniere wurde
an ihrer Stelle positioniert. Das Segment der Aorta, dass verwendet
wurde, um die Perfusion des Organs zu ermöglichen, wurde entfernt und
die renale Arterie auf die geeignete Länge geschnitten. Die Spender-
und Empfänger-Arterie,
die Vene und der Harnleiter wurden durch Standard-Mikrogefäß-Chirurgische Techniken,
die den Blutfluss zum Spenderorgan zurückführen und eine Urindrainage
erlauben, Ende-zu-Ende verbunden. Sieben Tage nach der ersten Transplantation
wurde die erste Niere der Empfängerratte
entfernt, wodurch der Empfänger
von der Nierenfunktion des transplantierten Testorgans abhängig gemacht
wurde. Um die Wirkung der Verbindung aus Beispiel 1 in dem Organ
zu bestimmen wurden die perfundierten transplantieren Organe 20
Wochen nach der Transplantation entnommen, von denen Teile in einer
4% Paraformaldehyd-Lösung
in Kochsalzlösung
fixiert wurden. Formaldehydlösung/Kochsalzlösung fixierte
Gewebe wurden verarbeitet und unter Verwendung von Standardverfahren
in Paraffinwachs-Blöcke
eingebettet. 2 μm
dicke Schnitte dieser Gewebe wurden mit Hämotoxylin und Eosin und mit
PAS-(Periodic-Acid-Schiff)Färbung unter Verwendung
von Standardverfahren, die in Beispiel 8 genannt sind, gefärbt. Diese
Färbung
erbrachte den histopathologischen Beweis, dass Organe, die mit der
Verbindung aus Beispiel 1 perfundiert und wie in den obigen Beispielen
6 und 7 transplantiert wurden eine verminderte Gewebeverletzung
im Vergleich zu Organen aufwiesen, die mit einer Lösung perfundiert
wurden, die die membrangerichteten Inhibitoren nicht enthielt. Die Blutproben,
die den Empfängern
der perfundierten und transplantierten Spender-Nieren zu regelmäßigen Zeitintervallen über 20 Wochen
nach der Transplantation entnommen wurden, wurden auf den Harnstoff-Stickstoff-Gehalt
als Marker für
die Nierenfunktion, unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen
Kits (Sigma UK), analysiert. Die Analysedaten solcher Proben ergaben
den Beweis, dass die Organe, die mit der Verbindung aus Beispiel
1 perfundiert wurden eine verbesserte Nierenfunktion nach der Transplantation über 20 Wochen
nach der Transplantation aufwiesen.
-
SEQUENZINFORMATION
-
AMERKUNG:
-
Die
unten gezeigt Nummerierung der Aminosäuren der SCR-Konstrukt (SEQ
ID Nrn. 1 bis 2) geht davon aus, dass das N-terminale Methionin
(verwendet für
die E. coli Expression) M1 ist. Dies steht im Gegensatz zu der Nummerierung
in den Beispielen, in denen MO verwendet wird. Deshalb muss von
der unten gezeigten Sequenznummerierung „1" von den Zahlen abgezogen werden, um
mit den Beispielen überein
zu stimmen.
-
-
-
-
