ES2273668T3 - Soluciones para el trasplante de organos que contienen conjugados de compuestos peptidicos solubles que aseguran la union de la membrana. - Google Patents

Abstract

Una preparación de prevención de lesión de reperfusión isquémica para perfusión de un órgano antes del transplante o almacenamiento del órgano que comprende: un derivado soluble de un polipéptido soluble, comprendiendo el citado derivado dos o más elementos de unión a membrana heterólogos con baja afinidad a membrana asociados covalentemente con el polipéptido elementos que son capaces de interactuar, independientemente y con aditividad termodinámica, con componentes de membranas del órgano expuesto a fluidos de perfusión extracelulares; y una solución de inundado de almacenamiento fisiológicamente aceptable, donde el citado derivado consiste en un fragmento de CRI (las tres Primeras Repeticiones de Coincidencia Cortas, SCRI-3) conjugado a miristoilo y una secuencia de aminoácidos básicos, como SEQ ID No. 1; y la citada solución de inundado de almacenamiento fisiológicamente aceptable es Soltran, que contiene los siguientes constituyentes por 1 litro de solución, citrato de potasio (8, 6 g), citrato de sodio (8, 2 g), manita (33, 8 g) sulfato de magnesio (10, 0 g) y tiene un pH de 7, 1 y una osmolaridad de 486 mOsm/l.

Description

Soluciones para el transplante de órganos que contienen conjugados de compuestos peptídicos solubles que aseguran la unión de la membrana.

Esta invención se refiere a formulaciones de polipéptidos y sus derivados que actúan como inhibidores o reguladores de los sistemas inmune o de coagulación y se utilizan en transplantes de órganos. La invención proporciona soluciones que incluyen, por ejemplo, inhibidores de complementos o reguladores de la función de linfocitos T ó B en formas moleculares modificadas que pueden utilizarse para perfundir y modificar órganos antes del transplante o para almacenar órganos antes del transplante, y para localizar agentes en órganos. La invención se refiere también a métodos de hacer formulaciones según la invención y a la utilización de estas formulaciones hechas. Cuando está legalmente permitido, la invención se refiere también a métodos de prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad asociada con inflamación, activación de complemento inapropiada o activación inapropiada de coagulante o procesos trombóticos antes, durante, o después del transplante de un órgano. Por ejemplo, la invención proporciona métodos de prevención, tratamiento o mejora del rechazo hiperagudo o agudo de aloinjerto de órganos transplantados tales como riñón, corazón, hígado o pulmones (particularmente en individuos sensibilizados por órganos previamente transplantados), lesión de reperfusión de isquemia en órganos transplantados, rechazo de xenoinjerto y rechazo de injerto corneal.

El término transplante indica aquí la colocación de un órgano, por ejemplo, corazón, riñón o pulmón en un paciente humano o un animal. Incluye también transplantes de piel, como pueden ser necesarios, por ejemplo, después de quemaduras graves. El propósito del reemplazamiento es la extracción de un órgano o tejido enfermo del huésped y su substitución por un órgano o tejido sano del donante. Este último puede proceder de un cadáver reciente, un voluntario sano o un animal de otra especie. Cuando donante y receptor son de la misma especie, el transplante se conoce como aloinjerto. Cuando donante y receptor son de distinta especie el transplante se conoce como xenoinjerto. Las técnicas necesarias para el transplante son diversas y dependen en gran medida de la naturaleza del órgano que se transplanta; han sido desarrolladas con suficiente detalle en las últimas décadas en que el transplante en el hombre es ahora una actividad de común en el marco de los hospitales. Aunque las operaciones quirúrgicas se pueden describir ahora como de rutina, el éxito del transplante como modalidad terapéutica depende de una serie de posibles cuestiones fisiológicas. Por ejemplo, el huésped puede rechazar el nuevo órgano a través de mecanismos de rechazo hiperagudo dependiente de anticuerpo, procesos de rechazo agudo mediado por células o procesos de degeneración crónica. Todos estos procesos destructivos pueden envolver la activación del complemento en algún grado. Además puede no poderse transplantar un nuevo órgano que retenga una completa viabilidad vascular si, por ejemplo, un órgano se ha deteriorado en el almacenamiento después de separarlo del donante,

Se ha publicado también la utilización de vejigas artificiales como transplantes (Oberpenning y col. 1999 Nature Biotechnology, 17, 149). En este caso, se ha hecho crecer la vejiga artificial a partir de células de vejiga de un individuo en el laboratorio y haciendo luego crecer las células en un soporte artificial, Cuando la nueva "vejiga" ha llegado a su completo crecimiento se ha transplantado a perros.

El sistema del complemento se compone de más de 30 proteínas diferentes que son importantes en la respuesta del sistema inmune a antígenos extraños. El sistema del complemento se activa cuando sus componentes primarios se escinden y los productos, solos o con otras proteínas, activan las proteínas del complemento adicionales lo que da lugar a una cascada proteolítica. La activación del sistema del complemento conduce a una variedad de respuestas que incluye permeabilidad vascular incrementada, quimiotaxis de células fagocíticas, activación de células inflamatorias, opsonización de partículas extrañas, muerte directa de células y daño a tejidos. La activación del sistema del complemento puede ser disparada por complejos antígeno-anticuerpo (el camino clásico) o, por ejemplo, por lipopolisacáridos presentes en las paredes celulares de bacterias patógenas (el camino alternativo).

Se sabe que la activación del complemento tiene lugar en una amplia variedad de procesos inflamatorios agudos que incluyen los asociados con lesiones de isquemia y reperfusión (Rossen y col. 1985 Circ. Res., 57, 119; Morgan B.P., 1990. "Los efectos biológicos de la activación del complemento". En Complement, Clinical Aspects and Relevance to Disease (Academic Press, Londres).

La asociación de activación adversa del complemento con fallo del transplante y/o injertos ha sido descrita por varios autores: En estudios de xenoinjertos cardiacos de ratón a rata se ha llegado a la conclusión de que la supresión temporal de activación del complemento inducía supervivencia a largo plazo (Koyamada y col., 1998, Transplantation, 65 1210-5). La función de los pulmones en xenotransplantes de cerdo a primate mejoraba también cuando se utilizaba un regulador del complemento en el modelo experimental (Yeatman y col. 1998, Transplantation, 65, 1084-93). En una revisión, Sheerin y Sacks (Curr. Opin. Nefrol. Hypertens, 1998, 7, 305-10) aclararon los estudios que ahora llevan a cabo acerca del papel del complemento en la patogénesis de lesión renal, debida, entre otros, a los procedimientos de transplante; llegaron a la conclusión de que la síntesis del complemento local era una diana potencial para terapia basada en complemento. Esta estrategia fue compartida por Johnson (Transplantation, 1997, 6, 120-7) quien también presta atención a la aparición de activación del complemento durante la hemodiálisis renal así como xenotransplante y el hecho de que los inhibidores del complemento puedan utilizarse para control de la inflamación asociada con activación del complemento. La activación adversa del complemento no está limitada al área de transplante xenogeneico sino que se observa también en transplante de aloinjertos, incluso en individuos emparejados con idéntico HLA, donde se ha informado que el 10 por ciento de los riñones transplantados ha sido rechazado por mecanismos inmunológicos, principalmente mediados por complemento (Brasile y col. 1987 Transplant. Proc. 19 894-5). La activación del complemento durante el transplante se puede asociar también con procesos trombóticos que pueden dispararse por activación de células endoteliales (Bach y col. 1994, Inmunol Rev. 141, 5-30)

Se ha demostrado que el tipo 1 de receptor del complemento (CR1) está presente en las membranas de eritrocitos, monocitos/macrófagos, granulocitos, células B, algunas células T, células dendríticas foliculares del bazo, y podocitos glomerulares. El CR1 une a los componentes del complemento C3b y C4b y se conoce también como receptor C3b/C4b. La organización estructural y secuencia primaria de un alotipo de CR1 es conocida (Klickstein y col., 1987, J. Exp. Med. 165: 1095-1112, Klickstein y col. 1988, J. Exp. Med 168:1699-1717; Hourcade y col. 1988, J. Exp. Med. 168:1255-1270 WO 89/09220, WO 91/05047). Se compone de 30 repeticiones de coincidencia cortas (SCRs) que contienen cada una alrededor de 60-70 aminoácidos. En cada SCR, se conservan alrededor de 29 de una media de 65. Se ha propuesto que cada SCR forme una estructura tridimensional en triple bucle a través de uniones disulfuro siendo la tercera y primera y la cuarta y segunda semi-cistinas en enlaces disulfuro. El CR1 está dispuesto además como 4 repeticiones homólogas largas (LHRs) de 7 SCRs cada una. Después de una secuencia líder, la molécula de CR1 consta de LHR-A de terminal N, las siguientes dos repeticiones, LHR-B y LHR-C, y la mayor parte de LHR-D de terminal C seguido de dos SCRs adicionales, una región de transmembrana putativa de 25 radicales y una cola citoplásmica de 43 radicales.

Basándose en la molécula de CR1 maduro que tiene un radical de glutamina de terminal N predicho, designado después como radical 1, los primeros tres dominios de SCR de LHR-A, citados aquí como SCR1, SCR2 y SCR3, consisten en los radicales 2-58, 63-120 y 125-191, respectivamente, de CR1 maduro.

Hourcade y col. 1988, J. Exp. Med. 168: 1255-1270 observaron una sede de poliadenilación alternativa en la unidad transcripcional de CR1 humano de la que se predecía la producción de una forma secretada de CR1. El ARNm codificado por esta secuencia truncada comprende las primeras 8,5 SCRs de CR1, y codifica una proteína de aproximadamente 80 kDa que se supone que incluye el dominio de unión de C4b. Cuando se transfecta un ADNc que corresponde a esta secuencia truncada a células COS y se expresa, ello demuestra la actividad de unión de C4b esperada pero no la unión a C3b (Krych y col. 1989, FASEB J. 3: A368; Krych y col. Proc. Nat. Acad. Sci 1991, 88, 4353-7). Krych y col observaron también un ARNm similar al predicho en varias líneas celulares humanas y han postulado que tal forma soluble truncada de CR1 con actividad de unión a C4b puede ser sintetizada en humanos.

Además, Makrides y col. (1992, J. Biol. Chem. 267 34 24754-61) han expresado SCR 1+2 y 1+2+3+4 de LHR-A como proteínas unidas a membrana en células CHO. Además, las repeticiones de coincidencia cortas 8 a 11 de CR1 y el ancla de fosfatidilo de Factor de Aceleración de la Degradación (Decay Accelerating Factor) han sido sintetizadoa como construcción de expresión estable unida a membrana en una línea celular endotelial de cerdo (Mikata S., y col. Transplant Inmunol. 1998 2: 107-10). La Patente estadounidense 5847082 describe inhibidores del complemento quiméricos que comprenden porciones del inhibidor del complemento CD59 y un dominio de transmembrana que sirve para anclar la proteína quimérica a la membrana celular mientras se retienen aún las propiedades inhibidoras del complemento de la molécula CD59 progenitora. La Patente estadounidense 5843778 describe proteínas quiméricas que contienen porciones de la proteína de control del complemento de vacuna y un dominio de transmembrana así como otras proteínas de fusión relacionadas. En todos estos casos, sin embargo, el suministro de un inhibidor del complemento a una superficie celular depende de la expresión del gen transfectado correspondiente a esa célula y tiene lugar normalmente en el contexto de un animal transgénico.

Varios fragmentos de CR1 solubles han sido generados también a través de procedimientos de ADN recombinante por eliminación de la región de transmembrana desde los ADNs que son expresados (WO 89/09220, WO 91/05047). Los fragmentos de CR1 solubles eran C3b y/o C4b unidos, funcionalmente activos y mostraban actividad de co-factor de Factor I dependiendo de las regiones que contuvieran. Estas construcciones inhibían in vitro funciones relacionadas con complemento tales como estallido oxidante de neutrófilos, hemolisis mediada por complemento, y producción de C3a y C5a. Una construcción soluble particular, sCR1/pSCR1c, mostraba también actividad in vivo en una reacción de Arthus pasiva inversa (WO 89/09220, WO 91/05047, Yeh y col. 1991, J. Immunol. 149-250), suprimía inflamación miocárdica post-isquémica y necrosis (WO 89/09220, WO 91/05047; Weisman y col. Science, 1990, 249: 146-1511; Dupe, R. y col. Trombosis & Haemostasis (1991) 65(6) 695) y también bloqueaba inflamación del SNC, desmielinación y depósito de componentes de complemento en un modelo de encefalomielitis alérgica experimental desmielinante mediada por anticuerpo (ADEAE), (Piddlesden y col. 1994, J. Immunol. 152, 5477.

Se ha demostrado que CR1 soluble inhibe procesos de rechazo mediados por complemento en varios modelos de transplante (Pruitt & Bollinger, 1991, J. Surg. Res. 50:350; Pruitt y co. 1991 Transplantation 52; 868, Pruitt y col. 1994, Transplantation 57, 363-370). Se ha visto que también este agente reduce lesión vascular y trombosis microvascular en rechazo de aloinjerto renal en la rata (Pratt y col. 1996, Am. J. Pathol. 149, 2055-2066. Pratt y col., 1997, Eur. J. Inmunol. 27, 2848-2853)

El papel de linfocitos T activados en el rechazo de transplantes está bien establecido y es la base de varios métodos terapéuticos inmuno-supresores conocidos por su utilidad en retrasar rechazo del injerto. Estos incluyen agentes tales como ciclosporina, FK506 y rapamicina, que son ligandos para los receptores conocidos como ciclofilinas o inmunofilinas y que intervienen en caminos de señalización celular a través de la inhibición de la actividad de fosfatasa de calcineurina (véase, por ejemplo, Ho y col. 1996, Clin. Immunol. Immunopathol., 80, p. 40-5)

La utilización de los OKT3 anticuerpos monoclonales anti-CD3 que pueden eliminar e inhibir células-T positivas a CD3 es también pertinente. Este proceso puede, él mismo, estar unido a activación del complemento ya que pacientes de aloinjerto renal tratados con el anticuerpo monoclonal OKT3 experimentaban menos efectos secundarios y menos activación del complemento si el anticuerpo era administrado como una infusión de dos horas en lugar de como una infusión de bolus; los autores llegaron a la conclusión de que la activación del complemento parecía jugar un papel en el desarrollo de los efectos secundarios después de la primera dosis de OKT3 (Buysmann y col. 1997, Transplantation, 64, 1620-3).

La Patente WO 98/02454 describe derivados hidrosolubles de polipéptidos que contienen dos o más elementos de unión a membrana heterólogos cada uno de los cuales tienen una afinidad relativamente baja para los componentes de la membrana celular exterior pero que, en combinación, dan alta afinidad y selectividad relativa para unión a membranas exteriores de diferentes tipos de células.

Los derivados preferidos de esa invención tienen la siguiente estructura

[P]-\{L-[W]\}_{n}-X

en la que

P

es el polipéptido soluble

cada L es, independientemente, un grupo flexible de unión,

cada W es, independientemente, un elemento peptídico de unión a membrana

n

es un entero de 1 o más y

X

es un una entidad peptídica o no peptídica de unión a membrana que puede estar unida covalentemente a un W

Los elementos peptídicos de unión a membrana están situados preferiblemente en forma secuencial ya sea en el terminal N ó en el C del polipéptido soluble y tienen una longitud de preferiblemente 8 a 20 aminoácidos. Las secuencias de aminoácidos están unidas entre sí y al péptido soluble por grupos de unión que se seleccionan preferiblemente de secuencias de aminoácidos hidrófilas y/o flexibles de 4 a 20 aminoácidos; polímeros sintéticos lineales hidrófilos, y grupos puentes químicos.

Se ha encontrado ahora que órganos perfundidos con una nueva formulación de un agente que es un derivado soluble de un polipéptido soluble que actúa, por ejemplo, como un inhibidor o regulador de los sistemas inmune o de coagulación, polipéptido o derivado que ha sido modificado según WO 98/02454 (incluyendo tales modificaciones ciertos nuevos elementos de unión a membrana), adsorben ese agente y que el órgano retendrá el agente durante períodos prolongados. El agente perfundido es así capaz de proteger un órgano tal como el riñón, o un tejido tratado por ingeniería genética, del ataque del complemento sin necesidad de expresión de la molécula protectora en un animal transgénico o a través de terapia génica.

Según la invención, se proporciona una preparación para perfusión de un órgano antes del transplante o almacenamiento del órgano que comprende un derivado soluble de un pelipéptido soluble, comprendiendo el citado derivado dos o más elementos heterólogos de unión a membrana con baja afinidad a membrana asociados covalentemente con el polipéptido, elementos que son capaces de interactuar, independientemente y con aditividad termodinámica, con componentes de membranas del órgano expuesto a fluidos de perfusión extracelular; y una solución de almacenamiento de inundación fisiológicamente aceptable.

Por "heterólogo" se entiende que los elementos no se encuentran en la proteína de longitud completa natural de la que puede derivarse una proteína soluble.

Por "polipéptido soluble" se entiende un derivado truncado de una proteína de longitud completa que carece de su capacidad natural de unión a membrana, y/o un polipéptido que tiene un nivel de solubilidad en medios acuosos de >100 \mug/ml.

Por "elemento de unión a membrana con baja afinidad a membrana" se entiende que el elemento tiene solamente una moderada afinidad a membranas, que es una disociación constante mayor de 0,1 \muM, preferiblemente 1 \muM-1 mM. El elemento tiene preferiblemente un tamaño < 5 kDa.

El derivado deberá incorporar suficientes elementos con bajas afinidades a componentes de membrana para dar por resultado un derivado con una elevada afinidad (preferiblemente una constante de disociación de 0,01-10 nM) a membranas específicas. Los elementos se combinan de manera que crean una alta afinidad global para la membrana diana particular pero la combinación carece de esa alta afinidad para otras proteínas para las que los elementos pueden ser ligandos (de baja afinidad)

Los elementos deberán elegirse de manera que retengan solubilidad útil en medios de formulación farmacéutica, preferiblemente mayor de 100 \mug/ml. Preferiblemente, al menos un elemento es hidrófilo.

Preferiblemente el polipéptido tiene actividad anticoagulante, antitrombótica o inmunoreguladora. Entre los ejemplos de polipéptidos que tienen actividad inmunoreguladora están polipéptidos con actividad inhibidora del complemento. Preferiblemente, el polipéptido es un fragmento de polipéptido CR1. Ejemplos de polipéptidos preferidos que tienen actividad antitrombótica o anticoagulante son Proteína C activada e hirudina y sus análogos.

Específicamente, la presente invención se refiere a una preparación para prevención de lesión de reperfusión isquémica para perfusión de un órgano antes del transplante o almacenamiento del órgano que comprende:

un derivado soluble de un polipéptido soluble, comprendiendo el citado derivado dos o más elementos heterólogos de unión a membrana con baja afinidad a membrana asociados covalentemente con el polipéptido, elementos que son capaces de interactuar, independientemente y con aditividad termodinámica, con componentes de membranas del órgano expuesto a fluidos de perfusión extracelular; y

una solución de almacenamiento de inundación fisiológicamante aceptable, donde el citado derivado consiste en un fragmento de CRI (las primeras tres Repeticiones de Coincidencia Cortas, SCRI-3) conjugado a miristoilo y una secuencia de aminoácido básica, como SEQ ID No. 1, siendo Soltran la citada solución de almacenamiento de inundación fisiológicamente aceptable, que contiene los siguientes constituyentes por litro de solución, citrato de potasio (8,6 g), citrato de sodio (8,2 g), manita (33,8 g), sulfato de magnesio (10,0 g) y tiene un pH de 7,1 y una osmolaridad de 486 mOsm/l.

Además, según la invención se proporciona un método para producir una preparación según la invención que comprende: expresar ADN que codifica la porción de polipéptido del derivado en una célula huésped recombinante; modificación post-traduccional del polipéptido para introducir químicamente los elementos de unión a membrana para formar el derivado; recuperación del derivado;

\hbox{y mezclado del
derivado con la solución de inundación  de
almacenamiento.}

Los métodos según la invención pueden comprender además: preparación de un vector de expresión replicable capaz, en la célula huésped recombinante, de expresar el ADN que codifica el polipéptido; transformación de la célula huésped recombinante con el vector; y cultivo de la célula huésped transformada bajo condiciones que permiten la expresión del polímero de ADN para producir el polipéptido.

Además, según la invención se proporciona un método para preparar un órgano in vitro antes del transplante o almacenamiento del órgano, que comprende: hacer una preparación según la invención; y perfusión del órgano con la solución preparada.

Además, según la invención se proporciona la utilización de la preparación en la manufactura de un agente para la prevención, tratamiento o mejora de lesión de reperfusión isquémica asociada con inflamación o activación inapropiada del complemento de un órgano, antes, durante o después del almacenamiento o antes o durante el transplante.

La invención proporciona la localización de agentes terapéuticos en membranas celulares de órganos específicos a los que se accede por perfusión, con lo que se proporciona uno o más de varios efectos biológicamente significativos con ventajas terapéuticas potenciales que incluyen, sin que quede limitado a ellas, inhibición de activación de complemento, inhibición de función de linfocitos T citotóxica.

Las soluciones de inundación de almacenamiento se utilizan para inundar órganos antes del transplante para preparar el injerto para el transplante. Se diseñan para resolver los problemas percibidos asociados con almacenamiento prolongado de órganos. Las soluciones de inundación de almacenamiento consisten en soluciones acuosas estériles con un pH, osmolaridad y composición iónica compatibles con el órgano y teniendo en cuenta la actividad metabólica y el contenido del nucleótido adenina del órgano durante el almacenamiento.

Existe un cierto número de soluciones de inundación de almacenamiento comercialmente disponibles que tienen diferentes composiciones químicas. Las que se utilizan principalmente en el marco de los hospitales son "Euro-Collins", fabricada por Fresenius AG de Alemania, "VI-ASPAN.RTM", fabricada por DuPont Chemical Company y solución de perfusión de riñón "Soltran", fabricada por Baxter Healthcare Ltd. Reino Unido. Además, están descritas un número de soluciones de almacenamiento de inundación y que se podrán emplear dentro de algún tiempo en el marco de los hospitales. Estas incluyen las descritas en la Patente estadounidense No. 5702881, basadas en un medio de cultivo de células de mamífero con excipientes específicos adicionales y las descritas en la Patente estadounidense No. 5693462, que contiene excipientes alternativos, especialmente compuestos que contienen amiloride.

El Soltran de Baxter Healthcare Ltd contiene los siguientes constituyentes (por 1 litro de solución)

Citrato de potasio	8,6 g
Citrato de sodio	8,2 g
Manita	33,8 g
Sulfato de magnesio	10,0 g

La solución tiene un pH de 7,1 y una osmolaridad de 486 mOsm/litro.

Se puede emplear una solución salína próxima a isotónica (0,145 M) como simple solución de inundación de almacenamiento.

Se han indicado varias adiciones a las soluciones de inundación de almacenamiento para mejorar la supervivencia del órgano y reducir las lesiones de reperfusión. Estas incluyen pentoxifilina (Okabayashi y col., 1994, Ann. Thorac. Surg. 58, 416-420), trimetazidina (Hauet y col., Transplantation, 64 1082-1086) y nitroprusiato (Fujino y col., 1997, J. Heart Lung Transplant. 16, 1073-1080). En todos estos casos, las adiciones se hicieron a soluciones de almacenamiento de inundación y el procedimiento de transplante suponía la transferencia al receptor de agente añadido.

Si el derivado es inestable en la solución de inundación de almacenamiento, el derivado se puede almacenar por separado de la solución de inundación de almacenamiento en forma estable y mezclarlo con la solución de inundación de almacenamiento inmediatamente antes de que el órgano sea perfundido con la preparación.

En un modo de realización preferido de la invención, se diluyen derivados solubles de polipéptidos solubles descritos en la Patente estadounidense 5833989 y WO 98/39433 en solución Soltran de perfusión de riñón. También en un modo de realización preferido de la invención, se diluyen los derivados solubles descritos en WO 98/02454 en solución de perfusión de riñón Soltran.

En otro modo de realización preferido de la invención, se diluyen derivados solubles de los pelipéptidos solubles, descritos en WO 98/02454 y WO 98/39433 que contienen la(s) secuencia(s) de "cambio electrostático de miristoilo" como se definen en WO 98/02454 y después, en solución Soltran de perfusión de riñón. Se ha encontrado que la unión a membrana está asociada con modificación limitada (en un solo punto) con grupos acilo graso cuando se combina con un racimo de aminoácidos básicos en la secuencia de proteína que puede interactuar con grupos ácidos de cabeza de fosfolípido y proporcionar la energía adicional para unión dirigida a la membrana diana. Esta combinación de efectos se conoce como "cambio electrostático de miristoilo" (S. McLaughlin y A. Aderem TIBS, 20 272-276, 1994; J.F. Hancock y col. Cell, 63, 133-139, 1990). Según esto, otro ejemplo de elementos de unión a membrana adecuados son secuencias de aminoácidos básicos tales como las que se encuentran en proteínas como Rad y MARCKS (substrato de C-cinasa rico en alanina miristoilado), P. J. Blckshear, J. Biol. Chem. 268, 1501-1504, 1993) que median el "cambio" electrostático a través de fosforilación reversible de radicales de serina dentro de la secuencia y una neutralización concomitante de la carga positiva neta. Estas secuencias incluyen, sin que quede restringido a ellas, secuencias consecutivas de lisina o arginina tales como (Lys)n donde n es de 3 a 10, preferiblemente 4 a 7.

Ejemplos adecuados de secuencias de aminoácidos que comprenden aminoácidos básicos incluyen,

(i)

DGPKKKKKKSPSKSSG

(ii)

GSSKSPSKKKKKKPGD

(iii)

SPSNETPKKKKKRFSEKKSG

(iv)

DGPKKKKKXSPSKSSK

(v)

SKDGKKKKKKSKTK

(Terminal N a la izquierda)

Las secuencias (i) a (v) son ejemplos de secuencias de cambio electrostático.

En un modo de realización más preferido de la invención, se diluye el derivado soluble que corresponde a SEQ ID No. 8 de WO 98/02454 (dado aquí como vía de referencia como SEQ ID No. 1) en solución Soltran de perfusión de riñón.

En otros modos de realización de la invención, derivados de polipéptidos a los que se incorporan nuevos elementos peptídicos de unión a membrana confieren una alta afinidad a tipos de células encontradas en el órgano diana. Ejemplos de tales tipos de células incluyen células glomerulares epiteliales y endoteliales de riñón humano. Estos elementos peptídicos de unión a membrana W son ligandos para proteínas de superficie celular que actúan como marcadores para el órgano o tejido particular.

A cualquier especialista en esta área le resultará evidente que se pueden formular diferentes proteínas con diferentes soluciones de inundación de almacenamiento que las dadas antes como ejemplo. Por ejemplo, WO 98/02454 y WO 98/394333 describen varios nuevos inhibidores de complemento que pueden modificarse para formar un derivado soluble y formularse en diluyente Soltran.

Las formulaciones de la invención son útiles en la prevención, tratamiento o mejora de muchos trastornos mediados por complemento o relacionados con complemento que incluyen, sin que quede limitado a ellos, rechazo hiperagudo o agudo de aloinjerto de órganos transplantados tales como riñón, corazón, hígado o pulmones (en particular en individuos sensibilizados por órganos transplantados previamente), lesión de reperfusión- isquémia en órganos transplantados, rechazo de xenoinjerto y rechazo de injerto corneal.

Descripción de la figura

La Figura 1 muestra datos de nitrógeno de urea en sangre (BUN) en receptores de iso-injerto renal DA-DA (n=6) a 2 semanas del transplante. El grupo de control es significativamente diferente (p<0,0001) del normal, mientras que el grupo tratado no es significativamente diferente del normal (p=0,0530). Los datos muestran que los órganos perfundidos con un compuesto de la invención tenían mejorada la función renal después del transplante durante la primera semana post-transplante.

La invención se describe además por vía de ejemplos.

Métodos generales utilizados en los ejemplos (i) Electroforesis de gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE)

SDS-PAGE se llevó a cabo SDS PAGE utilizando por lo general el sistema Novex (Novex, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los geles pre-empaquetados de concentraciones de acrilamida 4-20% fueron los más frecuentemente utilizados. Las muestras para electroforesis, incluyendo patrones de peso molecular de proteína (por ejemplo LMW Kit, Pharmacia o Novex Merk 12) se diluyeron norrmalmente en tampón que contenía SDS al 1% (peso/peso) (con o sin 2-mercaptoetanol al 5% (volumen/volumen) y se dejaron a temperatura ambiente durante aproximadamente media hora antes de la aplicación al gel.

(ii) Reducción de disulfuros y modificación de tioalcoholes en proteínas

Existen una serie de métodos empleados para alcanzar los objetivos del título. La razón de que puede ser necesario llevar a cabo reducción selectiva de disulfuros es que durante el reduplicado, concentración y posterior purificación de proteínas multi-tioalcohol puede tener lugar un emparejamiento inapropiado de disulfuros. Además, incluso si ocurre un emparejamiento correcto de disulfuros, puede resultar bloqueada una cisteína libre de la proteína con el agente reductor, por ejemplo glutation. Estos derivados son generalmente bastante estables. Con el fin de hacerlos más reactivos, por ejemplo para subsiguiente conjugación a otro grupo funcional, necesitan ser reducidos selectivamente, con ditiotreitol (DTT) por ejemplo o con Tris(2-carboxietil)fosfina.HCl (TCEP), modificados opcionalmente luego con una función que sea moderadamente inestable. Un ejemplo de esto último es el reactivo Ellmans (DTNB) que da un disulfuro mixto. En el caso en que se omita el tratamiento con DTNB, se necesita una atención cuidadosa al diseño experimental para asegurar que la dimerización de la proteína que contiene tioalcohol libre es mínima. El término "reducido selectivamente" anterior significa que las condiciones de reacción, por ejemplo, duración, temperatura, relaciones molares de reactivos, han sido cuidadosamente controladas de manera que los puentes disulfuro dentro de la arquitectura natural de la proteína no se han reducido. Todos los reactivos están comercialmente disponibles, por ejemplo de Sigma o Pierce.

Los siguientes ejemplos generales ilustran el tipo de condiciones que se pueden utilizar y que son útiles para la generación de tioalcoholes libres y su modificación opcional. Las condiciones de reacción específicas para alcanzar una reducción óptima del tioalcohol y/o modificación se determinan teóricamente para cada partida de proteínas

La TCEP se puede preparar como una solución 20 mM en Hepes 50 mM (aproximadamente pH 4,5) y puede almacenarse a -40ºC. El DTT se puede preparar a 10 mM en fosfato de sodio, pH 7,0, y puede almacenarse a -40ºC. El reactivo DTNB se puede preparar a 10 mM en fosfato de sodio, pH 7,0, y puede almacenarse a -40ºC. Todos los reactivos anteriores se utilizan típicamente a equivalencia molar o exceso molar, identificándose idealmente de forma experimental las concentraciones precisas. La duración y la temperatura de reacción se determinan asimismo experimentalmente. Por lo general la duración estará en el intervalo 1 a 24 horas y la temperatura en el intervalo de 2 a 30ºC. El exceso de reactivo se puede separar convenientemente por intercambio de tampón, por ejemplo utilizando Sephadex G 25. Un tampón adecuado es fosfato de sodio 0,1 M pH 7,0.

(iii) Medida de la actividad anti-complemento por hemolisis de eritrocitos de oveja mediada por el camino clásico

La actividad funcional de inhibidores de complemento se comprobó por medida de la inhibición de lisis mediada por complemento de eritrocitos de oveja sensibilizados con anticuerpos de conejo (Diamedix Corporation, Miami, EEUU). El ensayo se diseñó como específico para el camino clásico de activación del complemento. Se diluyó suero humano 1:100 (concentración final en mezcla de ensayo) en Hepes 0,1 M/NaCl 0,15 M/gelatina 0,1%, pH 7,4, que se utilizó como fuente del complemento. El suero se preparó del reunido del donado por un grupo de voluntarios de la manera como se describe esencialmente en Dacie & Lewis, 1975. En breves palabras, se calentó la sangre a 37ºC durante 5 minutos, se separó el coágulo y se clarificó el suero remanente por centrifugación. Se dividió la fracción de suero en pequeñas partes alícuotas y se almacenó a 196ºC ó -80ºC. Se dejaron descongelar las partes alícuotas según se requerían y se diluyeron en el tampón Hepes inmediatamente antes de su uso. Se midió la inhibición de la lisis mediada por complemento de los eritrocitos de oveja sensibilizados utilizando un ensayo hemolítico convencional empleando un formato de placa de microvaloración de fondo en v como sigue:

Se mezclaron 50 \mul de un intervalo de concentraciones de inhibidor diluido en tampón Hepes con 50 \mul del suero diluido y 100 \mul de eritrocitos de oveja sensibilizados y se incubaron entonces durante 1 hora a 37ºC. Se centrifugaron las muestras a 1600 rpm a temperatura ambiente durante 3 minutos antes de transferir 150 \mul del sobrenadante a una placa de microvaloración de fondo plano y determinar la absorción a 405 o 410 nm. Se determinó la lisis máxima (A max) por incubación del suero con eritrocitos en ausencia de inhibidor. La lisis de fondo (Ao) se determinó por incubación de eritrocitos en la ausencia de suero o inhibidor. La inhibición se expresó como una fracción del total de lisis de células de manera que IH50 representa la concentración de inhibidor requerida para dar un 50% de inhibición de lisis.

%\ de\ inhibición\ = [1-[(\underbar{A – Ao})/ (Amax -Ao)]]\ x\ 100

(iv) Actividad anti-complemento medida por hemolisis de eritrocitos de cobaya mediada por camino alternativo

Se comprobó la actividad funcional de inhibidores de complemento por medida de la inhibición de lisis mediada por complemento de eritrocitos de cobaya esencialmente como describen Scesney, S. M. y col. (1996) J. Immunol. 26 1729-1735. El ensayo se diseñó para que fuera específico para el camino alternativo de activación de complemento. El suero humano preparado con el donado por un grupo de voluntarios esencialmente como se describe en Dacie & Lewis, 1975, se utilizó como fuente del complemento. En resumen, se calentó sangre a 37ºC durante 5 minutos, se separó el coágulo y el suero remanente se clarificó por centrifugación. Se dividió la fracción de suero en pequeñas partes alícuotas y se almacenó a -196ºC. Las partes alícuotas se descongelaron según se requerían y se diluyeron en Hepes 0,1 M/NaCl 0,15 M// gelatina al 0,1%/ EGTA 8 mM/ MgCl_{2} 5 mM, pH 7,4, (tampón A) inmediatamente antes del uso.

Los eritrocitos de cobaya se compraron en TCS Microbiology y se almacenaron a +4ºC. Se utilizaron en dos semanas. Se mezclaron 50 \mul de un intervalo de concentraciones de inhibidor diluidas en tampón A en una placa de microvaloración de fondo en v primero con 100 \mul de suero que había sido diluido 1:3 (en tampón A) y, segundo, con 50 \mul de eritrocitos de cobaya (diluidos 1:49 en tampón A) y se incubó durante 1 hora a 37ºC. Se centrifugó la placa a 1600 rpm durante 3 minutos antes de transferir 150 \mul de cada sobrenadante a una placa de microvaloración de fondo plano y determinar la absorción a 405 nm, que refleja la cantidad de lisis en cada solución de ensayo. La lisis máxima (A max)) se determinó por incubación de suero con eritrocitos en ausencia de inhibidor. La lisis de fondo (Ao) se determinó por incubación de eritrocitos en ausencia de suero o inhibidor. Para comprobar si el propio inhibidor tenía algún efecto sobre la lisis, se incubaron eritrocitos con inhibidor solo; ninguno de los compuestos tenía efecto directo sobre la lisis de las células rojas de la sangre. La dilución final del suero utilizado en el ensayo absorbía a 405 nm pero el nivel de absorbancia (aproximadamente 10% de A max) se consideró que solo tenía un efecto insignificante sobre los resultados de ensayo globales y se ignoró en los cálculos. La inhibición se expresó como una fracción de la lisis celular total de manera que IH50 representa la concentración de inhibidor requerida para dar 50% de inhibición de lisis.

%\ de\ inhibición\ = [1-[\underbar{A – Ao})/ (Amax -Ao)]]\ x\ 100

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Ejemplo 1

Síntesis y aislamiento de un inhibidor de complemento insertado dirigidamente a membrana - SEQ ID No. 1 (Referencia WO 98/02454. Ejemplo 8) a) Método alternativo para más purificación

Se trató proteína SCR1-3/cys purificada tal como se define en WO 98/02454, Ejemplo 6, (aproximadamente 90 micromolar en solución salina tamponada con fosfato (PBS); 87 ml) con Triscarboxietilfosfina (0,315 ml de material de reserva 50 mM en Hepes 50 mM, pH 5) durante 18 horas a 25ºC. Se añadió etanolamina a la solución a una concentración final 0,05 M por adición de 0,26 ml de reactivo de reserva sin diluir (que se supone 16,6 M). Se añadió MSWP-1 (Ejemplo 2 en WO 98/02454) (2,35 ml de material de reserva 10 mM en fosfato de sodio 0,1 M pH 7,0) y la solución se incubó durante otras tres horas a 25ºC y después se colocó sobre hielo durante 15 minutos. Se añadieron 40 g de Toyopearl Butil, lavado y secado por succión y la mezcla se agitó en torbellino y se dejó durante 5 minutos sobre hielo. Se agitó en torbellino de nuevo la mezcla y se vertió en columna de vidrio de diámetro interior de 41 mm y la matriz se reveló como cromatografía normal, todo a aproximadamente 4ºC. La columna se reveló primero con fosfato de sodio 0,1 M y después con etanolamina 0,3 M. Eluyó un pico mayor A280 desde la matriz utilizando el tampón de etanolamina. Se recogió como fracción única (40 ml) y se aplicó a una columna Sephadex G 25 (Vt 160 ml) que había sido equilibrada con PBS. La fracción se extrajo con tampón de equilibrio. Se registró la fracción Vo (70 ml) como producto y se almacenó a -40ºC. Según SDS PAGE seguido de teñido con Azul Brillante Coomassie, la fracción Vo contenía un polipéptido individual mayor de pureza estimada >90% con un peso molecular aparente de 24000.

\newpage

b) Método II de purificación alternativa

El método era esencialmente como se ha descrito en el apartado a) anterior pero el tampón para la etapa de Sephadex G25 era PBS/manita de 50 mg ml^{-1} USP (Farmacopea EEUU)/L-arginina 0,1M BP (Farmacopea Británica) pH 7,4. El ajuste del pH se llevó a cabo por adición de HCl a la solución hasta que el pH alcanzaba 7,4.

Ejemplo 2 Síntesis de un reactivo miristoilo/péptido de cambio electrostático que incorpora dos elementos peptídicos de unión a membrana (SEQ ID NO:3)

N-(Miristoil)-Gly-Ser-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro-Gly-Leu-Ser-Ser-Arg-Leu-Asp-Ala-(S-2-Tiopiridil)Cys-NH_{2}.

El péptido

Gly-Ser-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro-Gly-Leu-Se-Ser-Arg-Leu-Asp-Ala-Cys-NH_{2} (SEQ ID NO:4)

se preparó utilizando síntesis en fase sólida a través de la estrategia general Fmoc/tBu desarrollada por Shephard y Atherton (E. Atherton y R.C. Sheppard, Síntesis en Fase Sólida, IRL Press, Oxford, 1989). Se utilizó resina de polidimetilacrilamida sobre soporte de kieselgur (Macrosorb 100) como soporte sólido y se obtuvo el derivado con etilen diamina.

Se llevaron a cabo reacciones de copulación empleando reactivos N-\alpha-Fmoc-protegidos preactivados con N,N'-diisopropilcarbodiimida/N-hidroxibenzotriazol (en exceso de cuatro veces molar) haciendo seguimiento con azul de bromofenol. Para las escisiones de Fmoc se utilizó piperidina al 20% en DMF. Se llevaron a cabo reacciones para estructurar la cadena de péptido por ciclos repetidos de copulación y desprotección incluyendo la unión del reactivo de unión Rink modificado ácido (p-[(R,S)-\alpha-[1-(9H-fluoren-9-il-metoxi-formamido]2,4 dimetoxibencil]-fenoxi acético) diseñado para producir una amida de terminal en C en la escisión final. Las funcionalidades de la cadena lateral de los aminoácidos individuales se protegieron como sigue:

Ser (tButilo), Lys (Boc), Asp (O-tButilo), Cys (Tritilo)

Al completar la estructura del péptido y con el péptido aún unido a la resina, el grupo miristoilo se enlazó al grupo amino de la glicina de terminal N por copulación directa de ácido mirístico por el mismo procedimiento de activación. Este péptido modificado se escindió entonces de la resina y se separaron los grupos protectores de la cadena lateral al mismo tiempo por tratamiento con ácido trifluoroacético que contenía 2,5% de agua y 2,5% de triisopropil silano.

El producto bruto se trató con 2,2'-ditiopiridina en solución de acetato de amonio 0,01 M a pH 8-9 durante aproximadamente 2 horas, se aciduló entonces con ácido acético y se purificó por cromatografía de líquidos preparativa de alto rendimiento (HPLC) en ácido trifluoroacético al 0,1% (TFA)/agua y TFA al 0,1%/acetonitrilo como componente de gradiente. Después de liofilización, el péptido era un polvo blanco amorfo soluble a al menos 10 mg/ml en dimetilsulfóxido. La espectrometría de masas de bombardeo atómico rápido dio picos principales a m/e 2433,6 Daltons y 2455,6 Daltons que corresponden a los iones moleculares mono-protonados y mono-sodiados del péptido. Se midió el contenido de 2-tiopiridilo del péptido por disolución del mismo a 0,02 mM en fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,0, y reducción de 0,003 ml por adición de ditiotreitol 1mM (1,0 ml). El cambio en la densidad óptica a 343 nm se utilizó para calcular la cantidad de piridina 2-tiona liberada utilizando un coeficiente de extinción a esta longitud de onda de 8080 cm^{-1} M^{-1}. Esto indicó que el contenido de péptido era aproximadamente 47% del peso seco. Los dos elementos peptídicos de unión a membrana en esta molécula corresponden a la secuencia catiónica Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro [SEQ ID No. 5] y la secuencia de unión a célula Leu-Ser-Ser-Arg-Leu-Asp-Ala [SEQ ID No. 6].

Ejemplo 3 Síntesis y aislamiento de una proteína inhibidora de complemento que incorpora dos elementos peptídicos de unión a membrana SQ ID No. 2

a)

La síntesis y aislamiento de SCR1-3/cys ha sido descrita antes con detalle en WO 98/02454, Ejemplo 6. Se han llevado a cabo métodos alternativos para el aislamiento de proteína purificada. Los cambios eran principalmente los del proceso de reduplicado y se describen en este Ejemplo (a continuación).

b)

El aislamiento de SCR1-3/cys de cuerpos de inclusión de E. coli incluye la solubilización del aglomerado de células seguido de cromatografía en una matriz de intercambio de cationes, por ejemplo Macroprep High S. El proceso alternativo para reduplicado al que se ha citado en a) anterior era:

El producto de la columna de intercambio de iones (aproximadamente 3 mg de proteína total por ml; 400 ml) se intercambió en tampón a temperatura ambiente utilizando medio Sephadex G 25 en etanolamina 0,3 M/EDTA 1 mM/cisteína 1 mM/L-cistina 1 nmM.2HCl (no se requiere ajuste del pH), recogiendo un volumen Vo de 600 ml. Se diluyó entonces el eluato Vo más en tampón duplicado frío para dar una dilución final de 10-veces el volumen original aplicado a la columna G25. Se añadió L-cistina 1 mM.2HCl adicional a las 3 horas y la solución se dejó reposar a aproximadamente 2-3ºC durante 3 días. Los últimos experimentos se repitieron utilizando la concentración 2 mM de L-cistína.2HCl directamente en lugar de dos adiciones separadas de 1 mM).

La solución se ultrafiltró entonces utilizando membrana YM10 hasta un volumen de retentato final de aproximadamente 200 ml, que se mezcló con 9 volúmenes de NaH_{2}PO_{4} 0,1 M/(NH4)_{2}SO_{4} 1 M, pH 7,0, (Tampón A) a temperatura ambiente e inmediatamente se centrifugó a 3000 rpm durante 20 minutos. Se cromatografió entonces el sobrenadante de la centrifugación a temperatura ambiente en Toyopearl Butyl 650 M y la proteína diana se eluyó utilizando un gradiente (revelada sobre 1 volumen de lecho) de tampón A a fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,0. Fue evidente un pico único mayor A280 durante la elución de gradiente y este se recogió por separado y se consideró como producto.

c)

Conjugación de SCR1-3/cys y reactivo MSWP

La síntesis del conjugado se siguió con la misma metodología que se ha descrito previamente para conjugados similares utilizando reactivos MSWP alternativos, por ejemplo, como se ha descrito en el Ejemplo 1 anterior, excepto en que se empleó el reactivo MSWP descrito en el Ejemplo 2. La síntesis se juzgó un éxito sobre la base del análisis de las muestras de post-reacción por SDS PAGE seguido de teñido para proteína con Azul Brillante Coomassie, que mostró un desplazamiento en la movilidad de SCR1-3/cys (peso molecular aparente 22000) a un peso molecular ligeramente más alto (24000), lo que se corresponde con la adición de reactivo MSWP en una relación molar 1:1. El producto de reacción se formuló por intercambio de tampón a PBS/50 mg por ml de manita/L-arginina.HCl 0,1 M, ajustado a pH 7, con ácido clorhídrico. El producto tenía una concentración de proteína de 2,3 mg/ml, basado en A280 y un coeficiente molar de extinción de 30000. El producto presentaba actividad anti-hemolítica en ensayos hemolíticos in vitro de camino clásico (IH50 = 0,3 nM) y camino alternativo (IC50 = 100 nM). Detalles de los dos ensayos hemolíticos han sido descritos previamente y se dan en Métodos generales.

d)

Más purificación y formulación inicial en tampón PBS/manita/arginina

Se diluyó la proteína diana (63 mg) sintetizada de manera similar a la descrita en el anterior c), pero sin intercambio de tampón, 20 veces (volumen total 700 ml) en fosfato de sodio 0,1 M//sulfato de amonio 1 M, pH 7,0. Se mezcló entonces la solución diluida, de manera discontinua, a 4ºC con 35 g de Macroprep Metil, secado por succión y después se vertió directamente en columna de cristal y se reveló la matriz como una cromatografía normal. Se lavó la matriz con fosfato de sodio 0,1 M/sulfato de amonio 1 M, pH 7,0, hasta que se estabilizó la línea de referencia y después se eluyó la proteína diana utilizando etanolamina 0,3 M. Se recogió el pico A280 que contenía la proteína e, inmediatamente, se intercambió de tampón ácido empleando Sephadex G25 a PBS/manita 50 mg por ml (Farmacopea EEUU)/ L-arginina 0,1 M (Farmacopea EEUU), se ajustó el pH a 7 con ácido clorhídrico. El producto tenía una concentración de proteína de 0,3 mg/ml, basado en A280 y un coeficiente molar de extinción de 30000. La fracción Vo de la columna G25 se acumuló con un producto similar y se ultrafiltró (membrana YM10; Amicon) a un concentrado de aproximadamente 15 veces. El retentato se hizo pasar entonces a través de un filtro de 0,2 micras (Sartorius, NMWL) y el filtrato se dividió en partes alícuotas y se congeló. Este material se consideró como el producto. El producto tenía una concentración de proteína de 4,0 mg/ml, basado en A280 y un coeficiente molar de extinción de 30000. La pureza determinada por SDS PAGE no reducido seguido de teñido para proteína utilizando Azul Brillante Coomassie mostró que aproximadamente el 95% de la proteína que podía teñirse tenía un peso molecular aparente de aproximadamente 23000, siendo esta proteina diana modificada. Los contaminantes visibles incluían dímero de proteína, con un peso molecular aparente de aproximadamente 37000, y proteína sin modificar con un peso molecular aparente de aproximadamente 21000. El producto presentaba actividad antihemolítica en ensayos hemolíticos in vitro por el camino clásico (IH50 = 0,1 nM) y camino alternativo (IC50 = 100 nM). Los detalles de los dos ensayos hemolíticos se han descrito previamente y se dan en los Métodos generales.

Ejemplo 4 Formulación del inhibidor del complemento del Ejemplo 1 en solución Soltran de perfusión de riñón

El material preparado como se ha descrito en el Ejemplo 1b) anterior se liofilizó desde tampón PBS/manita/ arginina descrito en el Ejemplo 3d anterior. Se re-disolvió al volumen original en agua y después se diluyó en perfusato de Soltran dando lugar a una solución con una concentración de aproximadamente 200 \mug/ml (\sim8 \muM). La solución se utilizó inmediatamente.

Ejemplo 5 Formulación del inhibidor de complemento del Ejemplo 3 en solución Soltran de perfusión de riñón

El material preparado como se ha descrito en el Ejemplo 3c anterior (0,01 ml) se diluyó en perfusato de Soltran (0,99 ml). Se obtuvo con ello una solución con una concentración de aproximadamente 0,2 mg/ml (0,87\muM). La solución se almacenó entonces congelada a -40ºC. Cinco días después se descongeló y se ensayó en un ensayo hemolítico por el camino clásico (Método general No. 3); Presentaba un IH50 de 0,2 nM, lo que indicaba que había retenido la actividad completa.

Ejemplo 6 Método para la perfusión de un riñón con inhibidores del complemento de la invención

Se aisló un riñón de rata donante y se extrajo del animal utilizando procedimientos anestésicos y quirúrgicos convencionales. El órgano se extrajo con la arteria renal completa y una porción de la aorta intacta pero ligada al extremo anterior. Se cortó la vena renal a un punto apropiado para el subsiguiente proceso de transplante. Se administraron entonces inhibidores del complemento diluidos en soluciones vehículo como se ha descrito antes (aproximadamente 2 ml) a través del órgano aislado por inyección lenta en el lumen de la aorta. Se tuvo cuidado de evitar la introducción de burbujas de aire en la vasculatura del órgano durante el proceso. Las soluciones administradas de esta forma perfunden el hígado y emergen desde la vena renal.

Ejemplo 7 Método para el transplante de riñones y evaluación experimental de retención de inhibidores del complemento por inmunofluorescencia

Se extirpó el riñon de una rata receptora y se colocó en su lugar el riñón de la donante preparado como en el Ejemplo 6. El segmento de aorta utilizado para poder hacer la perfusión del órgano se separó y se cortó la arteria renal a una longitud apropiada. La arteria, vena y uréter de donante y receptora se unieron entonces extremo con extremo por técnicas quirúrgicas microvasculares convencionales, retornando el flujo de sangre al órgano de la donante y permitiendo el drenaje de orina. Para evaluar la retención de inhibidores del complemento dentro del órgano, los órganos transplantados perfundidos se extrajeron en varios puntos de tiempo post-transplante y se congelaron inmediatamente a -196ºC. Se prepararon secciones congeladas de 4 \mum de grueso de tales tejidos y se incubaron a 4ºC durante 1 hora con los volúmenes apropiados de un anticuerpo monoclonal murínico con marcador fluorescente (3E10 conjugado a C-3 a 0,47 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato) elicitado frente a las 3 primeras repeticiones cortas de coincidencia expresadas bacterianamente de CR1 humano. La fotomicrografía de secciones bajo luz ultravioleta reveló que la exposición de riñones de rata a compuestos tales como los del Ejemplo 3 anterior y el Ejemplo 8 de WO 98/02454 daba por resultado delineación inmunofluorescente de las estructuras vasculares y parenquimales del órgano y que este marcado persistía cuando los riñones se transplantaron a animales receptores.

Ejemplo 8 Método para el transplante de riñones y evaluación experimental del efecto de inhibidores del complemento en la primera semana post-transplante

Se extirpó el riñón de una rata receptora y se puso en su lugar el riñón de donante preparado como en el Ejemplo 6. Se separó el segmento de aorta utilizado para permitir la perfusión del órgano y se cortó la arteria renal a una longitud apropiada. La arteria, vena y uréter de donante y receptora se unieron entonces extremo con extremo por técnicas quirúrgicas microvasculares convencionales volviendo el flujo de sangre al órgano de la donante y permitiendo el drenado de orina. Para evaluar el efecto de los compuestos como en el Ejemplo 1 anterior dentro del órgano, se extrajeron los órganos transplantados perfundidos en varios puntos de tiempo post-transplante, porciones de los cuales se congelaron a -196ºC o se fijaron en una solución de formaldehido al 4% en solución salina. Se tiñeron secciones de tejidos congelados de 4\mum de grueso con un anticuerpo de neoantígeno C5b-9 anti-rata de ratón (cortesía del Dr. W. Couser, Universidad de Washington, Seattle, EEUU; publicado en Nangaku M. Pippin J. Couser WG. Journal of American Society of Nephrology, 10(11):2323-31, nov 1999) y se visualizó con un conjugado de anticuerpo Ig anti-ratón para FITC (Dako) Se trataron tejidos fijados con formaldehido/solución salina y se embebieron en bloques de cera de parafina utilizando métodos convencionales. Se tiñeron secciones de estos tejidos de 2 \mum de grueso con hematoxilina y eosina, y tintura de Schiffs de ácido peryódico empleando métodos convencionales ("Teoría y Práctica de técnicas histológicas", Ed. John D. Bancroft y Alan Stevens, 3ª Edición, Churchill Livingstone, Londres, 1990). Este teñido reveló la evidencia histopatlógica de que órganos perfundidos con el compuesto del Ejemplo 1 a una concentración de 40 microgramos/ml y utilizando el método de perfusión del Ejemplo 6 y el método de transplante del Ejemplo 7, anteriores, habían reducido la activación del complemento y reducido la lesión de tejido comparado con órganos no perfundidos con inhibidores de activación del complemento insertados dirigidamente a membrana. Las muestras de sangre tomadas de la punta de la cola de animales receptores de riñones de donadores, perfundidos y transplantados se analizaron cada día post-transplante en cuanto a contenido de nitrógeno de urea como marcador de función renal utilizando un estuche de equipo (kit) comercialmente disponible (Sigma, Reino Unido). Los datos de análisis de estas muestras llevaron a la evidencia de que los órganos perfundidos con el compuesto del Ejemplo 1 habían mejorado su función renal post-transplante durante la primera semana post-transplante.

Ejemplo 9 Método para el transplante de riñones y evaluación experimental del efecto de inhibidores de complemento a lo largo de 20 semanas post-transplante

Se extirpó el primer riñón de una rata receptora y se colocó en su lugar el riñón de la donante preparado como en el Ejemplo 6. El segmento de aorta utilizado para permitir la perfusión del órgano se separó y la arteria renal se cortó a una longitud apropiada. La arteria, vena y uréter de donante y receptora se unieron entonces extremo con extremo por técnicas quirúrgicas microvasculares convencionales, retornando el flujo de sangre al órgano de la donante y permitiendo el drenado de orina. Siete días después del transplante primario, se extrajo el primer riñón de la rata receptora volviendo así a la receptora dependiente de la función renal del órgano de ensayo transplantado. Para evaluar el efecto del compuesto del Ejemplo 1 dentro del órgano, se extrajeron, a las 20 semanas post-transplante, los órganos perfundidos transplantados, porciones de los cuales se fijaron en una solución de formaldehido al 4% en solución salina. Los tejidos fijados en formaldehido/solución salina se trataron y embebieron en bloques de cera de parafina utilizando métodos convencionales. Se tiñeron secciones de estos tejidos de 2 \mum de grueso con hematoxilina y eosina y tintura de Schiffs de ácido peryódico utilizando los métodos convencionales indicados en el Ejemplo 8. Estos teñidos revelaron evidencia histopatológica de que los órganos perfundidos con el compuesto del Ejemplo 1 y transplantados como en los Ejemplos 6 y 7 anteriores tenían lesiones de tejido reducidas comparanrlo con los órganos perfundidos con una solución que carece de inhibidor del complemento insertado dirigidamente en la membrana. Las muestras de sangre tomadas de las receptoras de riñones de donantes perfundidos y transplantados a intervalos de tiempo regulares a lo largo de 20 semanas post-transplante se analizaron en cuanto a contenido de nitrógeno de urea como marcador de función renal utilizando un estuche de equipo (kit) comercial (Sigma Reino Unido). Los datos de análisis de tales muestras mostraron la evidencia de que los órganos perfundidos con el compuesto del Ejemplo 1 habían mejorado la función renal post transplante a lo largo de 20 semanas post-transplante.

Información de secuencias

NOTA: La numeración de aminoácidos mostrada a continuación para las construcciones SCR (SEQ ID Nos. 1 a 2) supone que la metionina de terminal en N (utilizada para expresión de E. coli) es M1. Esto contrasta con la numeración en los Ejemplos donde se utiliza MO. Por tanto, para la numeración de las secuencias mostrada después, hay que deducir "1" de la numeración para hacer corresponder con los Ejemplos.

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID No.: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 215 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: amino ácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLECULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: terminal N

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID No. 1:

\vskip1.000000\baselineskip

1

2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID No. 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERISTICAS DE SECUENCIA.

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 218 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLECULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: terminal en N

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID No. 2

\vskip1.000000\baselineskip

3

4

\vskip1.000000\baselineskip

(SEQ ID No. 3)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

N-(Miristoil)-Gly-Ser-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro-Gly-Leu-Ser-Ser-Arg-Leu-Asp-Ala-(S-2-tiio-piridil-Cys-NH_{2}

\vskip1.000000\baselineskip

(SEQ ID No. 4)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

Gly-Ser-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro-Gly-Leu-Ser-Ser-Arg-Leu-Asp-Ala-Cys-NH_{2}

\vskip1.000000\baselineskip

(SEQ ID No. 5)

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Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro

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(SEQ ID No. 6)

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Leu-Ser-Ser-Arg-Leu-Asp-Ala

Claims (11)

1. Una preparación de prevención de lesión de reperfusión isquémica para perfusión de un órgano antes del transplante o almacenamiento del órgano que comprende:

un derivado soluble de un polipéptido soluble, comprendiendo el citado derivado dos o más elementos de unión a membrana heterólogos con baja afinidad a membrana asociados covalentemente con el polipéptido elementos que son capaces de interactuar, independientemente y con aditividad termodinámica, con componentes de membranas del órgano expuesto a fluidos de perfusión extracelulares; y

una solución de inundado de almacenamiento fisiológicamente aceptable, donde el citado derivado consiste en un fragmento de CRI (las tres Primeras Repeticiones de Coincidencia Cortas, SCRI-3) conjugado a miristoilo y una secuencia de aminoácidos básicos, como SEQ ID No. 1; y la citada solución de inundado de almacenamiento fisiológicamente aceptable es Soltran, que contiene los siguientes constituyentes por 1 litro de solución, citrato de potasio (8,6 g), citrato de sodio (8,2 g), manita (33,8 g) sulfato de magnesio (10,0 g) y tiene un pH de 7,1 y una osmolaridad de 486 mOsm/l.

2. Una preparación según la reivindicación 1 donde el polipéptido tiene actividad inmunoreguladora.

3. Una preparación según la reivindicación 1 o la 2 donde el polipéptido tiene actividad inhibidora del complemento.

4. Una preparación según la reivindicación 1 donde el polipéptido tiene actividad anticoagulante o antitrombótica.

5. Una preparación según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde el derivado se disuelve en la solución de almacenamiento.

6. Un método para producir una preparación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende.

expresión de ADN que codifica la porción del polipéptido del derivado en una célula huésped recombinante; que modifica post-traduccionalmente el polipéptido para introducir químicamente los elementos de unión a membrana para formar el derivado;

recuperación de los derivados; y

mezclado de los derivados con la solución de almacenamiento de inundación.

7. Un método según la reivindicación 6 que comprende además:

preparación de un vector de expresión replicable capaz, en la célula huésped recombinante, de expresar el ADN que codifica el polipéptido;

transformación de la célula huésped recombinante con el vector; y

cultivo de la célula huésped transformada bajo condiciones que permiten la expresión de polímero de ADN para producir el polipéptido,

8. Un método para producir una preparación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende la mezcla del derivado con la solución de inundación de almacenamiento.

9. Un método para preparar un órgano in vitro antes del transplante o almacenamiento del órgano que comprende:

hacer una preparación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y perfundir el órgano con la preparación.

10. Utilización de una preparación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en la manufactura de un agente para preparación de un órgano antes de su transplante o almacenamiento.

11. Utilización de una preparación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en la manufactura de un agente para la prevención, tratamiento o mejora de una lesión de reperfusión isquémica asociada con inflamación o activación del complemento inapropiada de un órgano, antes, durante o después del almacenamiento o antes o durante el transplante.