ES2199468T3 - Direccionamiento nuclear por medio de proteina h estreptococica. - Google Patents

Abstract

Una estructura artificial de liberación nuclear que comprende: (i) la proteína H o uno de sus derivados que tiene al menos 70 % de homología con la SEQ ID No. 6, que es capaz de dirigirse al núcleo de una célula eucariótica, o un fragmento de cualquiera de ellos que es capaz de dirigirse al núcleo de una célula eucariótica; y conjugado o fusionado con ellos (ii) uno o más de otros componentes seleccionados entre un polipéptido, un ácido nucleico, un fármaco de molécula pequeña o un liposoma, de los cuales se desea el direccionamiento al núcleo de la célula eucariótica.

Description

Direccionamiento nuclear por medio de proteína H estreptocócica.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al direccionamiento al núcleo celular mediante proteínas bacterianas. Se basa en el hallazgo de que la proteína H, que se puede derivar del Streptococcus pyogenes, se dirige a los núcleos de las células eucarióticas, específicamente a los linfocitos. La presente invención se refiere por tanto a estructuras artificiales de direccionamiento al núcleo que comprenden la proteína H o uno de sus fragmentos o derivados, asociados con otro componente del que se desea que se dirija al núcleo. Esta invención se refiere también a los usos de tal direccionamiento al núcleo de dichas estructuras artificiales y a composiciones farmacéuticas que las contienen.

Antecedentes de la invención

La proteína H se puede obtener del Streptococcus pyogenes como se describe en los documentos EP-A-0 371.199 y WO 91/19740. Estas publicaciones proporcionan también la secuencia de aminoácidos de la proteína H procedente del Streptococcus pyogenes y la secuencia del DNA que la codifica. La proteína H tiene un espectro característico de propiedades de unión a inmunoglobulinas, como se describe en el documento EP-A-0 371.199 y también es capaz de unirse a la albúmina (WO 91/19740). En el documento WO 91/19740, se han identificado una serie de regiones dentro de la proteína H, y se han designado como regiones S, A, B, C1, C2, C3 y D. Se ha encontrado que la actividad de unión a la albúmina está localizada en las regiones C y/o D.

Sumario de la invención

Se ha encontrado en la presente invención que la proteína H tiene una propiedad adicional inesperada. Cuando la proteína H biotinilada se incubó con los linfocitos T (células Jurkat) se encontró que la proteína H se dirigía al núcleo celular. El mismo fenómeno se ha observado también en los linfocitos B.

En la célula, se ha encontrado que la proteína H interactúa con la actina y con la nucleofosmina (NPM)/B23, una proteína de la que se conoce que sirve de transporte entre el núcleo y el citoplasma. En el propio núcleo, se ha encontrado que la proteína H interactúa adicionalmente con las proteínas nucleares SET y hnRNP A2/B1, dando como resultado la acumulación nuclear de la proteína H. Se cree que la proteína H atraviesa la membrana celular, se asocia con la nucleofosmina/B23 en el citoplasma y es transportada a través de la membrana nuclear hasta el núcleo, en el que interactúa con las proteínas SET y hnRNP. Como la proteína H interactúa con la actina, el citoesqueleto de la actina puede estar implicado en el transporte de la proteína H desde el interior de la membrana celular hasta el citoplasma, en el que llega a asociarse con NPM/B23. Sin embargo, no se puede descartar la posibilidad de que la proteína H simplemente se difunda a través del citoplasma.

El hallazgo de que la proteína H se dirige hacia el núcleo fue sorprendente a la vista de las propiedades previamente conocidas de la proteína H. Previamente, la proteína H ha sido conocida como una proteína que se une a las inmunoglobulinas, localizada en la superficie de la bacteria Streptococcus, donde protege a la bacteria mediante el bloqueo de la activación del complemento en la superficie celular bacteriana por medio de su interacción con la región Fc de la IgG. Es sorprendente por tanto, que esta proteína se dirija también al núcleo celular, donde puede efectuar una función adicional de virulencia por parte de la bacteria Streptococcus. Por contraste, la proteína A, una molécula de la superficie celular bacteriana, que se une a las inmunoglobulinas, derivada del Staphylococcus aureus, no demostró ninguna acumulación nuclear. Las proteínas A y H son funcionalmente similares porque ambas se unen al mismo sitio de la región Fc de la IgG. El hecho de que la proteína H muestre acumulación nuclear cuando la proteína A no lo hace, es por tanto lo más sorprendente.

Basándose en los hallazgos de esta invención, la proteína H se puede usar para dirigir otras moléculas hacia el núcleo. Por ejemplo, la proteína H se puede usar para dirigir fármacos al núcleo o para dirigir ácidos nucleicos al núcleo, con fines de terapia génica.

Se ha encontrado también en esta invención que la proteína H tiene un efecto citostático cuando se dirige al núcleo. En ciertas situaciones, por ejemplo cuando se administra un fármaco a una célula cancerosa proliferativa con el propósito de tratar el cáncer, este efecto citostático complementará los efectos del fármaco asociado. En otras situaciones, puede ser aconsejable usar fragmentos o derivados de la proteína H que no presentan el efecto citostático pero que sin embargo son capaces de dirigirse al núcleo.

La invención proporciona por consiguiente una estructura artificial de liberación nuclear que comprende:

(i)

la proteína H o uno de sus derivados que tiene al menos 70% de homología con la SEQ ID No. 6, que es capaz de dirigirse al núcleo de una célula eucariótica, o un fragmento de cualquiera de ellos que es capaz de dirigirse al núcleo de una célula eucariótica; y

conjugado o fusionado con ellos

(ii)

uno o más de otros componentes seleccionados entre un polipéptido, un ácido nucleico, un fármaco de molécula pequeña o un liposoma, de los cuales se desea el direccionamiento al núcleo de la célula eucariótica.

La invención proporciona también una composición farmacéutica que comprende la mencionada estructura artificial de liberación nuclear y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La invención proporciona también la mencionada estructura artificial de liberación nuclear para uso en un método de tratamiento de los seres humanos o animales, o para uso en un método de diagnóstico.

La invención proporciona también el uso de la proteína H o uno de sus fragmentos o derivados que es capaz de dirigirse al núcleo de una célula eucariótica, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de los seres humanos o animales, en el que tal estructura artificial se direcciona al núcleo de una célula eucariótica.

La invención proporciona también el uso de tal estructura artificial de liberación nuclear en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades de los seres humanos o animales, en el que la estructura artificial se direcciona al núcleo de una célula eucariótica.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Unión de la proteína H a la superficie de los linfocitos de la sangre periférica humana y a la línea de células T Jurkat humanas, determinada por análisis FACS (separación celular con activación de fluorescencia).

Figura 2. Absorción y acumulación nuclear de la proteína H en las células T Jurkat. Representación de las células T Jurkat incubadas con proteínas A o H, citocentrifugadas y teñidas con FITC-avidina. La proteína H (A, B) muestra acumulación nuclear, y la proteína A (C) no la muestra.

Figura 3. La proteína H interactúa con la nucleofosmina. (A) Resultados por FPLC (cromatografía de líquidos para separación rápida de proteínas) sobre una columna mono-Q de las células T Jurkat digeridas con papaína y solubilizadas. (B) Resultados del conjunto del material 85-87 radiomarcado procedente de (A) que ha sido pasado sobre proteína A-sefarosa (izquierda) y resultados de las fracciones reunidas del pico del ensayo procedentes de la proteína A-sefarosa que han sido sometidas a una columna de proteína H-sefarosa (derecha). (C) Identificación de NPM en el conjunto del material 85-87 procedente de (A). (D) Comparación de los resultados de SDS PAGE de los péptidos NPM traducidos y marcados con ^{35}S-metionina in vitro (izquierda) y de los resultados de SDS PAGE de los mismos péptidos cuando se han aplicado a la proteína H-sefarosa. (E) Cartografía de la región de unión a NPM de la proteína H mediante inhibición competitiva.

Figura 4. Identificación de las proteínas nucleares que interactúan con la proteína H. Geles de SDS-PAGE que identifican a NPM y a las proteínas SET y hnRNP A2/B1.

Figura 5. Análisis de la unión de la proteína H a la nucleofosmina y a las proteínas nucleares. (A) Planos superpuestos de la unión de las proteínas A y H con la NPM inmovilizada (izquierda) o con las proteínas nucleares (derecha), usando espectroscopía de resonancia de plasmones. (B) Inhibición competitiva de la unión de NPM marcada con ^{125}I a la proteína H-sefarosa con diferentes cantidades de NPM sin marcar.

Figura 6. Absorción nuclear y efecto citostático de la proteína H. (A) Geles de SDS-PAGE de células B murinas purificadas incubadas con LPS y proteína H durante 24 horas, teñidas con Coomassie (izquierda) o transferidas a una membrana de PVDF (derecha), siendo explorada la membrana con el material transferido con una sonda de antisuero anti-proteína H, seguido por una sonda de proteína A conjugada con peroxidasa y revelada con ECL. (B) Inhibición de la proliferación de las células B esplénicas murinas en respuesta a las proteínas H y A.

Descripción detallada de la invención Proteína H

En el documento WO 91/19740, la proteína H se caracterizó como poseedora de los siguientes dominios, desde el N-terminal al C-terminal: S, A, B, C1, C2, C3 y D. El dominio S es un péptido señal que, en la naturaleza, se escinde de los restantes dominios antes de que la proteína madura (dominios A, B, C1, C2, C3 y D) sea trasladada a la pared celular bacteriana e insertada dentro de ella.

En los ejemplos que siguen, se usa una versión más corta de la proteína H. Esta carece de los 41 aminoácidos del dominio S del N-terminal y está truncada también en 30 aminoácidos en el C-terminal. Esta versión de la proteína H fue producida en E. Coli. Dicha versión es similar a la versión de la proteína H que, en la naturaleza, es liberada de la superficie celular de la bacteria Streptococcus por la acción de una cisteína-proteasa. La versión liberada por la proteasa también carece del dominio S y también está truncada en el C-terminal. Sin embargo, es ligeramente más corta que la versión producida en E. Coli.

En esta memoria, a menos que se indique otra cosa, el término "proteína H" significa cualquiera entre:

(i) la proteína H que incorpora el péptido señal, como se ha definido en el documento WO 91/19740 y que tiene los dominios S, A, B, C1, C2, C3 y D y una longitud de 376 aminoácidos; o

(ii) la proteína H madura que carece del dominio S y que tiene una longitud de 335 aminoácidos; o

(iii) la proteína H como se produce en E. Coli, que carece del dominio S y que está truncada en 30 aminoácidos en el C-terminal y que tiene una longitud de 305 aminoácidos; o

(iv) la proteína H como se escinde desde la superficie celular del Streptococcus por la cisteína-proteasa, que carece del dominio S y que está truncada en el N-terminal en varios aminoácidos. La longitud exacta de esta versión de la proteína H aún no se conoce, pero su masa molecular da a entender que la truncación en el N-terminal, es del orden de 50 aminoácidos, de tal modo que tiene una longitud de aproximadamente 285 aminoácidos. Por tanto, esta versión de la proteína H puede tener, por ejemplo, una truncación en el N-terminal de 35 a 45, 45 a 50, 50 a 55 o 55 a 65 aminoácidos, lo que le da una longitud de 270 a 280, 280 a 285, 285 a 290 o 290 a 300 aminoácidos, respectivamente.

La secuencia completa de 376 aminoácidos se da más adelante (véase la sección Información de las secuencias) como SEQ ID No. 6, junto con la secuencia de DNA codificante (SEQ ID No. 5). El aminoácido No. 1 representa el inicio del dominio A y los límites de cada región y de cada versión de la proteína H están indicados sobre la secuencia. En otras palabras, el aminoácido No. 1 es el primer aminoácido de la proteína madura (versión (ii) de la proteína H como se ha definido antes). La numeración difiere de la usada en el documento WO 91/19740 en que, en WO 91/19740, el aminoácido No. 1 es el primer aminoácido del dominio S, el cual es un péptido señal que está ausente en la proteína madura.

La proteína H se puede obtener por los métodos descritos en los documentos EP-A-0 371.199 y WO 91/19740, y se puede producir también usando los métodos de \ring{A}kesson et al., 1990; y Frick et al., 1994, en combinación con los métodos descritos en los ejemplos. Cualquiera de las versiones de la proteína H mencionadas antes se puede sintetizar también por medios recombinantes, basados en las secuencias dadas aquí y usando métodos estándar conocidos en la técnica (de los que se dan ejemplos, entre otros, en Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual). Lo mismo se aplica a los fragmentos y derivados de la proteína H como se definen aquí. Similarmente, la proteína H y sus fragmentos/derivados se pueden preparar sintéticamente por los métodos de síntesis de péptidos ya conocidos en la técnica. Esto se aplica especialmente a los fragmentos de la proteína H.

Direccionamiento al núcleo

Basándose en los resultados experimentales presentados aquí, la proteína H es capaz de dirigirse a los núcleos de las células eucarióticas. Se ha demostrado este direccionamiento en los linfocitos T (células Jurkat) y en los linfocitos B (células Bjab).

Para los fines de la invención, la proteína H y sus fragmentos y derivados son capaces de dirigirse a los núcleos de las células eucarióticas. Un experto en la técnica puede determinar si cualquier fragmento o derivado dado es capaz o no de dirigirse de este modo en cualquier tipo de célula dado usando técnicas basadas en las descritas en los ejemplos. Por ejemplo, el fragmento o derivado puede ser biotinilado y después incubado con las células en cuestión. Se puede determinar entonces la distribución intracelular del fragmento o derivado biotinilado, por ejemplo usando FITC-avidina conjuntamente con la microscopía de inmunofluorescencia. Un experto en la técnica debe ser capaz también de crear metodologías adicionales para determinar si la proteína H o uno de sus fragmentos o derivados es capaz o no de dirigirse al núcleo de cualquier tipo de células dado.

La localización nuclear ha sido demostrada en los linfocitos T (células Jurkat) y en los linfocitos B (células Bjab). Preferiblemente, las estructuras artificiales de la invención efectúan el direccionamiento a los linfocitos T y/o a los linfocitos B. No está claro todavía si la proteína H es capaz de dirigirse a los núcleos de todos los tipos de células eucarióticas o si se dirige selectivamente a los núcleos de ciertos tipos de células, o si se dirige hasta cierto punto a los núcleos de todos los tipos de células pero más fuertemente a ciertos tipos de células. Sin embargo, esto puede ser determinado fácilmente por un experto en la técnica como se ha descrito antes.

De acuerdo con la invención, se prefiere que la proteína H y sus fragmentos/derivados sean capaces de interactuar con la nucleofosmina/B23. Se prefiere también que la proteína H y sus fragmentos/derivados sean capaces de interactuar con la actina. Se prefiere también que la proteína H y sus fragmentos/derivados sean capaces de interactuar con la proteína nuclear SET. Se prefiere también que la proteína H y sus fragmentos/derivados sean capaces de interactuar con la proteína nuclear hnRNP A2/B1. Opcionalmente, la proteína H y sus fragmentos/derivados pueden ser capaces de interactuar con otras proteínas citoplásmicas y/o nucleares, por ejemplo, otras hnRNP, o factores de transcripción. Un experto en la técnica puede determinar si un fragmento/derivado dado interactúa o no con cualquiera de las proteínas mencionadas antes usando métodos basados en los descritos en los ejemplos.

Aunque no es todavía seguro si la proteína H es capaz de dirigirse a los núcleos de todos los tipos de células eucarióticas o si se dirige selectivamente a los núcleos de algunos tipos de células, es posible identificar algunos tipos de células preferidos hacia los cuales se pueden usar la proteína H y sus fragmentos/derivados para direccionar a los componentes asociados en estructuras artificiales de liberación nuclear.

Es sabido que la nucleofosmina (NPM)/B23 actúa para transportar proteínas entre el citoplasma y el núcleo. Ella se expresa en todas partes pero se regula por incremento en ciertos tipos de células. En particular, la NPM/B23 es más abundante en las células tumorales y proliferativas que en las células en reposo. Es razonable predecir que las células proliferativas y tumorales, que tienen un mayor conjunto de NPM/B23 disponible, serán más eficaces en el transporte de la proteína H y sus fragmentos o derivados hasta el núcleo. Por tanto, según la invención, se prefiere usar la proteína H y sus fragmentos/derivados para direccionar a los componentes asociados hacia las células en las que NPM/B23 está regulada por incremento.

Los tipos de células preferidos en los que la proteína H y sus fragmentos/derivados se pueden usar para direccionar a los componentes asociados hacia el núcleo incluyen las células tumorales, las células infectadas con virus y las células sanas pero proliferativas que presentan aumento de los niveles de NPM/B23.

Las células infectadas con virus preferidas son las células infectadas por el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), por ejemplo las células T CD4^{+}; o por el virus del papiloma humano (HPV), por ejemplo las células epiteliales del cuello uterino y las células epiteliales de la próstata; o por un rinovirus, por ejemplo las células del epitelio nasal.

Algunos tumores preferidos incluyen en general los tumores que proliferan rápidamente; gliomas y otros tumores del sistema nervioso central tales como neuroblastomas; leucemias; linfomas; tumores pulmonares; sarcomas; tumores de colon tales como carcinomas, por ejemplo, los tumores de colon de bajo grado que han mostrado invasión (Duke III-IV); carcinomas renales dispersos; carcinomas tubáricos, carcinomas gástricos; y carcinomas de próstata.

Además, las estructuras artificiales de la invención se pueden usar para dirigir los agentes terapéuticos a los núcleos de las células implicadas en las enfermedades inflamatorias, ya que las enfermedades inflamatorias comúnmente implican proliferación celular. Los ejemplos de tales enfermedades inflamatorias incluyen artritis, particularmente artritis reumatoide; artritis; condritis; colitis; dermatitis; enteritis; miositis; tendosinovitis; y enfermedades inflamatorias autoinmunes tales como SLE (lupus eritematoso sistémico).

Los fibroblastos son un tipo de célula también preferido en el que el direccionamiento al núcleo se puede conseguir mediante las estructuras artificiales de la invención.

El efecto citostático de la proteína H

Como se describe en los ejemplos, se ha encontrado que la proteína H tiene un efecto citostático sobre los linfocitos B murinos, evitando que proliferen pero sin inducir la apoptosis (muerte celular). No está claro todavía si la proteína H tiene este efecto sobre todos los tipos de células eucarióticas. En situaciones en las que la proteína H y sus fragmentos/derivados se usan para liberar otras moléculas a los núcleos de células proliferativas, especialmente las células tumorales, este efecto citostático parece ser beneficioso. En particular, en el caso de las células tumorales, el evitar que las células proliferen complementará la actividad del componente asociado y ayudará de este modo a combatir el tumor.

En otras situaciones, en las que no es aconsejable evitar la proliferación de las células, se prefiere usar fragmentos/derivados de la proteína H que son capaces de dirigirse al núcleo pero que no presentan el efecto citostático. Un experto en la técnica será capaz de identificar tales fragmentos y derivados preparando los fragmentos/derivados por medios conocidos en la técnica y después ensayando los mismos para determinar si ellos (i) retienen o no la capacidad de direccionamiento al núcleo (véase la "proteína H" anterior); y (ii) presentan o no el efecto citostático, lo que se puede hacer usando técnicas basadas en las que se dan en los ejemplos, verbigracia, exponiendo los fragmentos/derivados a las células proliferativas y observando si éstas continúan o no proliferando.

Fragmentos y derivados de la proteína H

Para los fines de la invención, un derivado de la proteína H consta esencialmente de una de las cuatro secuencias de aminoácidos definidas aquí con respecto a la SEQ ID No. 6 (véanse las secciones tituladas "proteína H" e "información de las secuencias"). Un fragmento de la proteína H es un fragmento de cualquiera de estas cuatro secuencias, o un fragmento de un derivado de cualquiera de estas cuatro secuencias. Tales fragmentos y derivados son capaces de dirigirse a los núcleos de las células eucarióticas como se ha descrito antes en la sección titulada "direccionamiento al núcleo".

En particular, un derivado de la proteína H puede ser una variante alélica o una especie homóloga de la proteína H que está presente en la naturaleza y que es capaz de dirigirse al núcleo de una célula eucariótica de una manera sustancialmente similar a las cuatro versiones de la proteína H de Streptococcus pyogenes, como se han definido aquí. Tales variantes alélicas y especies homólogas se derivarán típicamente de otras bacterias, por ejemplo, otros cocos tales como especies de Staphylococcus o, preferiblemente, Streptococcus.

Las variantes alélicas y especies homólogas se pueden obtener usando métodos conocidos en la técnica, basados en el uso de sondas derivadas de la secuencia codificante de ácido nucleico de Streptococcus pyogenes, como sondas. Por ejemplo, se puede usar una sonda de este tipo para explorar bancos preparados a partir de células bacterianas con el fin de obtener clones que codifican las variantes alélicas o las especies. Los clones se pueden manipular por técnicas convencionales para expresar una proteína que, según la invención, es un derivado de la proteína H. Preferiblemente, según la invención, los derivados de la proteína H tienen al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de homología, con una de las cuatro secuencias de la proteína H definidas aquí con respecto a la SEQ ID No. 6. Más preferiblemente, un derivado tendrá al menos 95% o al menos 99% de homología, con una de estas cuatro secuencias a lo largo de una región de al menos 20, preferiblemente al menos 30, por ejemplo al menos 40, 60 ó 100 o más aminoácidos contiguos. Los métodos para medir la homología de la proteína son bien conocidos en la técnica y deberá ser entendido por los expertos en la técnica que en el presente contexto, la homología se calcula basándose en la identidad de los aminoácidos (algunas veces denominada como "alta homología").

La secuencia de los derivados de la invención puede diferir de la de una de las cuatro secuencias de la proteína H definidas aquí con respecto a la SEQ ID No. 6 en una o más sustituciones de aminoácidos. Por ejemplo, pueden estar presentes 1, 2, 3, 4, 5 a 10, 10 a 20 ó 20 a 30 sustituciones, siempre que el derivado tenga la capacidad de dirigirse al núcleo de una célula eucariótica de una manera sustancialmente similar a la proteína H. Preferiblemente, las sustituciones son conservadoras. Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones conservadoras según la siguiente tabla. Los aminoácidos del mismo bloque de la segunda columna y preferiblemente de la misma línea de la tercera columna pueden ser sustituidos uno por otro de una manera conservadora.

Alifático	No-polar	G A P
		I L V
	Polar-sin carga	C S T M
		N Q
	Polar-con carga	D E
		K R
Aromático		H F W Y

Similarmente, los derivados de la invención pueden presentar una o más deleciones en comparación con cualquiera de las cuatro secuencias de la proteína H definidas aquí con respecto a la SEQ ID No. 6. Cada deleción puede ser la deleción de 1, 2, 3, 4 ó 5 a 10 aminoácidos, por ejemplo.

Similarmente, los derivados de la invención pueden presentar una o más inserciones en comparación con una cualquiera de las cuatro secuencias de la proteína H como se definen aquí con respecto a la SEQ ID No. 6. Cada inserción puede comprender, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 a 10 ó 10 a 20 aminoácidos.

Por ejemplo, pueden estar presentes 1, 2, 3, 4, 5 o más de tales deleciones o inserciones.

Según la invención, los fragmentos de la proteína H y de los derivados como se han definido antes, pueden ser de cualquier longitud y se pueden derivar de cualquier región de la proteína H o de uno de sus derivados, siempre que tengan la capacidad de direccionamiento al núcleo de una célula eucariótica. Por ejemplo, los fragmentos adecuados pueden tener una longitud de 1 a 20 aminoácidos, de 20 a 50 aminoácidos, de 50 a 100 aminoácidos, de 100 a 150 aminoácidos, de 150 a 200 aminoácidos, de 200 a 250 aminoácidos, de 250 a 300 aminoácidos, de 300 a 350 aminoácidos o más de 350 aminoácidos.

Preferiblemente, los fragmentos se derivan de la mayoría de las regiones del N-terminal de la proteína H. Esto es porque se ha encontrado que la región A de la proteína H, y especialmente la región AB (esto es, un fragmento constituido por las regiones A y B) se une a NPM/B23 de una manera similar a la proteína H completa. Se ha encontrado en esta invención que la región AB se une a NPM/B23 más eficientemente que la proteína H completa y que la región A se une también a la proteína H, aunque con menor eficiencia que la proteína H completa. Los experimentos de inhibición dados en los ejemplos (véase la figura 5C) también dan a entender que la región AB puede ser capaz de unirse a las proteínas SET y hnRNP A2/B1.

Esto sugiere que la región A, y preferiblemente la región AB, pueden ser capaces de dirigirse al núcleo. Por tanto, los fragmentos de la invención comprenden preferiblemente la región A, y más preferiblemente la región AB. Opcionalmente, también pueden estar presentes otras regiones de la proteína.

La región AB de la proteína H de Streptococcus pyogenes consta de los aminoácidos 1 a 117 de la SEQ ID No. 6. Preferiblemente, están presentes todos estos 117 aminoácidos. Sin embargo, un experto también será capaz de investigar fragmentos más pequeños de la región AB para determinar si retienen o no la capacidad de dirigirse al núcleo. En particular, se pueden usar las técnicas recombinantes para generar tales fragmentos y se pueden usar técnicas basadas en las que se dan en los ejemplos para determinar si un fragmento dado se dirige o no al núcleo. Por tanto, los fragmentos AB pueden comprender, por ejemplo, 1 a 20, 20 a 50, 50 a 80, 80 a 100 o más de los 117 aminoácidos de la región AB. En tales fragmentos, la región AB puede estar truncada en su N-terminal en, por ejemplo, 1 a 5, 5 a 10, 10 a 20 ó 20 a 50 aminoácidos y/o en su C-terminal en, por ejemplo, 1 a 10, 10 a 20 ó 20 a 50 aminoácidos.

Opcionalmente, los derivados de la invención pueden comprender la proteína H o un fragmento de la proteína H como se define aquí, y se pueden extender en cualquiera de los extremos N-terminal o C-terminal o en ambos por medio de una secuencia de aminoácidos no relacionados. Por ejemplo, tal secuencia puede tener hasta 10, hasta 20, hasta 30, hasta 50 o hasta 100 aminoácidos de longitud, o más larga (la invención proporciona también proteínas de fusión que comprenden la proteína H o uno de sus derivados o fragmentos: véase más adelante).

En las estructuras artificiales de direccionamiento al núcleo de la invención, puede estar presente una marca reveladora que puede estar unida o bien a la proteína H o bien al fragmento/derivado de la proteína H, o a uno de los otros componentes. La marca reveladora puede ser cualquier marca adecuada que permita que el polipéptido sea detectado. Las marcas adecuadas incluyen radioisótopos (por ejemplo, ^{125}I, ^{35}S), una enzima, un anticuerpo, un polinucleótido o un conector tal como biotina.

En las estructuras artificiales de direccionamiento al núcleo de la invención, el componente de proteína H, esto es la proteína H o uno de sus fragmentos o derivados, puede estar presente en una forma puramente de peptidilo. Alternativamente, puede ser modificado químicamente, por ejemplo, con modificaciones post-traducción. Por ejemplo, puede ser glicosilado o puede comprender residuos aminoácidos modificados.

Los fragmentos y derivados de la invención se pueden sintetizar de una manera adecuada. Típicamente, se pueden preparar por medios recombinantes. Sin embargo, cuando es apropiado, se pueden preparar también sintéticamente. Por ejemplo, se pueden preparar usando las técnicas conocidas de síntesis de péptidos. Esto se aplica especialmente a los fragmentos de la proteína H.

Otra consideración es la propiedad de unión a la IgG de la proteína H. En general no es aconsejable que los fragmentos/derivados de la proteína H retengan las propiedades de unión a la IgG. Esto es debido a que la unión a IgG puede llevar a la formación de inmuno-complejos que podrían llevar a efectos secundarios indeseables y/o podrían reducir la capacidad de la proteína H para ejercer un efecto citostático. Por tanto, cuando la estructura artificial de la invención tiene que ser administrada por una vía que permite la oportunidad de formar inmuno-complejos (especialmente la inyección intravenosa), se prefiere que la estructura artificial comprenda un fragmento o derivado que no tenga capacidad de unión a la IgG, o al menos que tenga una capacidad reducida en comparación con la proteína H intacta. El sitio de unión a la IgG tiene alrededor de 20 a 30 aminoácidos de largo y abarca los límites entre las regiones A y B. Por tanto, puede ser aconsejable usar un derivado de la proteína H en el que esta región esté delecionada o mutada de forma que no tenga capacidad, o tenga una capacidad reducida, para unirse a IgG. Naturalmente, cualquiera de tales modificaciones debe ser realizada preferiblemente sin perturbar de forma apreciable el efecto de direccionamiento al núcleo de la invención. Por tanto, se prefiere que tales derivados retengan la capacidad de interactuar con NPM, SET y hnRNP1.

Debe observarse también que la proteína H forma dímeros de forma natural. Los dímeros tienen una mayor capacidad para unirse a IgG que los monómeros de la proteína H aislados. La formación de dímeros se favorece por debajo de 37ºC (esto es, la temperatura normal del cuerpo humano) pero los dímeros son menos estables por encima de 37ºC (véase, por ejemplo, Nilson et al., Biochemistry, 1995, 34, pp 13688-13698). Por tanto, la capacidad de unión a IgG de la proteína H in vivo puede ser realmente más baja que la que indican los experimentos in vitro por debajo de 37ºC. Por esta razón, incluso la proteína H completa no tiene necesariamente una gran capacidad de unión a IgG in vivo suficiente para perturbar el efecto de direccionamiento al núcleo de la invención.

Componentes que se pueden dirigir al núcleo cuando se asocian con la proteína H y sus fragmentos/derivados

En principio, el otro componente de la estructura artificial de liberación nuclear puede ser de cualquier naturaleza, siempre que se desee su direccionamiento al núcleo. Por ejemplo, el otro componente puede ser un ácido nucleico, esto es, un polipéptido, esto es, un DNA o RNA; un polipéptido, esto es, una proteína o un péptido, por ejemplo un antígeno o un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo frente a una proteína nuclear; un fármaco de molécula pequeña; un liposoma, o un marcador detectable.

Por lo que se refiere a los ácidos nucleicos, las propiedades de direccionamiento al núcleo de la proteína H representa un nuevo medio para llevar a cabo la terapia génica liberando DNA o RNA al núcleo. Por tanto, los ácidos nucleicos que codifican una proteína pueden ser liberados al núcleo con vistas a ser expresados en el núcleo. Por ejemplo, el ácido nucleico puede estar contenido dentro de una estructura artificial de ácido nucleico que realiza la integración del ácido nucleico en el genoma de la célula. Alternativamente, el ácido nucleico puede estar contenido dentro de una estructura artificial de ácido nucleico que se destina a ser replicada dentro de la célula sin integración en el genoma celular, por ejemplo dentro del llamado "mini-cromosoma".

Esto evita las dificultades bien conocidas que se asocian con los vectores virales, por ejemplo, el riesgo de una multiplicación viral incontrolada.

La proteína H y sus fragmentos/derivados se pueden usar para direccionar los ácidos nucleicos antisentido al núcleo, con vistas a que formen un dúplex con el RNA producido en el núcleo y a suprimir la expresión de la proteína que dicho RNA codifica. Las estructuras artificiales de la invención se pueden asociar por tanto directamente con el RNA antisentido, o se pueden asociar con una estructura artificial que codifica un RNA antisentido, que se transcribe en el núcleo de la célula.

Cuando las estructuras artificiales de direccionamiento al núcleo, de la invención, se usan para liberar ácidos nucleicos antisentido a las células cancerosas (tumorales), se puede usar RNA antisentido para suprimir la expresión de las proteínas implicadas en el fenotipo canceroso. Por ejemplo, el RNA antisentido se puede usar para suprimir la expresión de las proteínas procedentes de los genes myc, bc12, bc1x o ciclina.

Alternativamente, se pueden usar desde el RNA antisentido hasta el RNA transcrito de un gen HLA-DM. Parece que la nucleofosmina es una diana común en la enfermedad del injerto frente al hospedante después de un transplante. Por tanto, se puede desarrollar en los órganos trasplantados la posible modulación de la expresión de NPM mediante la proteína H o sus derivados, como un medio para reducir la incidencia y gravedad de la enfermedad del injerto frente al hospedante.

El gen HLA-DM está implicado en la carga de péptidos sobre las moléculas MHC clase II, lo que lleva a su presentación como antígenos frente a las células T CD4, y en último lugar, al reconocimiento de los péptidos extraños por las células T. Este fenómeno subyace en la enfermedad del injerto frente al hospedante, ya que el reconocimiento de los péptidos extraños por las células T, es responsable, al menos parcialmente, del rechazo del tejido injertado. En ausencia de HLA-DM, solamente se presenta el péptido clip invariante, que no provoca la reacción hospedante/injerto. Por tanto, el RNA antisentido para HLA-DM puede ser útil para interrumpir el procedimiento por el cual los péptidos extraños se presentan como antígenos por las moléculas MHC clase II, evitando su reconocimiento como antígenos por las células T y evitando de este modo el rechazo del tejido injertado por el tejido hospedante y favoreciendo su tolerancia. Esto es aplicable potencialmente tanto a los aloinjertos (en los que el tejido injertado procede de la misma especie que el tejido hospedante) como a los xenoinjertos (en los que el tejido injertado procede de otra especie).

Por lo que a los fármacos de molécula pequeña se refiere, una posibilidad es usar la proteína H y los fragmentos/derivados de la proteína H para liberar agentes citotóxicos. De este modo, si la proteína H presenta un direccionamiento al núcleo selectivo para las células que tienen mejorada la expresión de B23, particularmente las células tumorales, la proteína H representa una forma de direccionar un agente citotóxico a una célula tumoral, con vistas a matar la célula tumoral.

Otra posibilidad es usar la proteína H y los fragmentos/derivados de la proteína H para liberar péptidos al núcleo. Algunos péptidos preferidos son aquellos que forman quelatos con ciertos iones metálicos, por ejemplo los iones 2+ tales como Zn^{2+}, Mn^{2+} o Mg^{2+}. Muchos enzimas y factores de transcripción del proceso de DNA requieren iones 1- y limitando el aporte de tales iones por quelación se podría reducir la división de las células a las que se direccionan los péptidos. Se espera que esto sea útil en el tratamiento de tumores, en los que la quelación de ciertos iones puede evitar la proliferación de las células tumorales. Por ejemplo, el direccionamiento de péptidos quelantes que forman quelatos con un ion particular inhibirá selectivamente ciertos enzimas y factores de transcripción del proceso de DNA. Si se desea, se puede conseguir también un efecto citotóxico aumentando la cantidad del péptido quelante usado.

Otros péptidos preferidos son los que interactúan con los activadores o co-activadores transcripcionales implicados en la regulación del crecimiento de las células tumorales o en las respuestas inflamatorias, con el objetivo de reducir el crecimiento de las células tumorales o de evitar o reducir la respuesta inflamatoria, respectivamente.

Cuando la proteína H o uno de sus fragmentos o derivados se une a un marcador detectable, se puede usar cualquier marcador adecuado que permita que la estructura artificial sea detectada. Los marcadores adecuados incluyen radioisótopos (por ejemplo, ^{125}I, ^{35}S), una enzima, un anticuerpo, un polinucleótido o un conector tal como biotina. En particular, se prefieren los marcadores que permiten la detección de la estructura artificial por técnicas de imagen. Tales técnicas de imagen se pueden usar en métodos de diagnóstico.

Por tanto, si la proteína H se dirige selectivamente a los núcleos de ciertos tipos de células, se podría usar como un marcador para estos tipos de células. En particular, si la proteína H se dirige selectivamente a los núcleos de ciertas células tumorales, o de ciertas células infectadas por virus, entonces la proteína H o sus fragmentos/derivados pueden ser marcados y usados como un marcador para estos tipos de células. Esto se puede usar para diagnosticar la presencia de tales células. Por tanto, la proteína H o sus fragmentos/derivados adecuadamente marcados se pueden usar para diagnosticar la presencia de células tumorales o de células infectadas por virus, hacia las cuales se dirige selectivamente la proteína H. Una vez que dichas técnicas de imagen revelan que la proteína H o uno de sus fragmentos o derivados se acumula en los núcleos de las células de un tumor dado, o de un tipo de tumor, se puede usar también una estructura artificial adicional de la invención para dirigir los agentes terapéuticos a dicho tumor o tipo de tumor.

En las estructuras artificiales de liberación nuclear de la invención, puede haber un componente que es la proteína H o uno de sus fragmentos o derivados, como se define aquí, y un componente que es otra molécula (esto es, una relación 1:1). Alternativamente, los dos componentes pueden estar presentes en una relación diferente, por ejemplo, 1:2, 1.3, 1:4, 1:5 o más alta; o 5:1 o mayor, 4:1, 3:1, 2:1 ó 1:1. Cuando hay más de un componente asociado con la proteína H, estos componentes pueden ser los mismos o diferentes. Similarmente, puede haber más de una molécula de proteína H y más de una molécula del otro componente, por ejemplo una relación de 2.2, 3:3, 2.3, ó 3:2.

Asociación entre la proteína H y sus fragmentos/derivados y el otro componente(s) de la estructura artificial de liberación nuclear

El otro u otros componentes pueden estar asociados con la proteína H de cualquier manera, siempre que la asociación sea lo suficientemente fuerte para que la proteína H transporte los otros componentes hasta el núcleo. Por tanto, los otros componentes se pueden asociar con la proteína H por cualquier medio conocido en la técnica. Por ejemplo, la asociación puede ser covalente. Alternativamente, la asociación puede ser no-covalente.

Por ejemplo, los otros componentes se pueden conjugar con la proteína H o con un fragmento o derivado de la proteína H. Cuando los otros componentes están unidos covalentemente, esta unión puede realizarse o en el C-terminal o en el N-terminal, o en cualquier lugar entre los dos terminales. En las estructuras artificiales en las que el otro componente es un polipéptido, éste puede ser unido mediante un conector peptídico.

Cuando la proteína H o un fragmento/derivado está asociado no covalentemente con el otro u otros componentes, la asociación puede realizarse, por ejemplo, por medio de interacciones hidrófobas, enlaces de hidrógeno o interacciones electrostáticas.

Cuando el otro componente es un peptidilo natural; por ejemplo, una proteína, un polipéptido o un péptido, puede ser aconsejable producir la estructura artificial como una proteína de fusión entre la proteína H y la segunda proteína. De este modo, se pueden preparar por métodos conocidos en la técnica, una secuencia compuesta del DNA que codifica la proteína H o un fragmento/derivado y del otro componente de peptidilo y a partir de esta secuencia compuesta se puede expresar recombinantemente una proteína de fusión. Opcionalmente, se puede proporcionar entre las dos secuencias codificantes una secuencia conectora de ácido nucleico, de tal modo que en la proteína de fusión expresada está presente una región conectora. Alternativamente, las secuencias codificantes de la proteína H o de un fragmento/derivado de la proteína H se pueden unir directamente juntas en el marco. Las proteínas de fusión se describen a continuación con más detalle.

Proteínas de fusión

En una proteína de fusión de la invención, la proteína H y el otro componente peptidílico pueden estar presentes en cualquier orientación, esto es, la proteína H o uno de sus fragmentos o derivados pueden ser el C-terminal o N-terminal para el otro componente peptidílico. Entre los dos componentes puede estar presente un péptido conector. Típicamente, el conector será flexible, permitiendo el movimiento del componente de proteína H con respecto al otro componente peptidílico. Preferiblemente, el conector no inhibirá la expresión o plegamiento correctos de cualquiera de los dos componentes. Preferiblemente, el conector no será tóxico ni inmunógeno.

Típicamente, el péptido conector comprende aminoácidos que no tienen grupos laterales voluminosos y que por tanto no obstruyen el plegamiento del componente proteínico. Además, se prefiere usar en el conector aminoácidos sin carga. Los aminoácidos preferidos para uso en los conectores incluyen glicina, serina, alanina y treonina.

El péptido conector puede ser de cualquier longitud adecuada que permita el plegamiento correcto de los dos componentes. El conector puede tener de uno a cuatro aminoácidos de longitud. Alternativamente, el conector puede tener de 5 a 10 aminoácidos de longitud, por ejemplo de 10 a 30 aminoácidos o de 15 a 25 aminoácidos de longitud.

Preferiblemente, el conector constará esencialmente de uno o más residuos de glicina y uno o más residuos de serina. Un conector de este tipo se denomina en esta memoria, conector de glicina-serina. El conector puede contener de 1 a 50, típicamente de 5 a 30 o de 10 a 20 residuos de glicina. El conector puede contener de 1 a 50, típicamente de 5 a 30 o de 10 a 20 residuos de serina.

El conector puede estar constituido solamente por residuos de glicina y serina. Un tipo posible de conector de glicina-serina puede comprender la secuencia (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_{n}, n puede ser cualquier número entero de 2 a 10, preferiblemente de 2 a 5, más preferiblemente 3 ó 4, y lo más preferiblemente 3. También pueden ser conectores adecuados otras combinaciones de glicina y serina.

La invención proporciona también secuencias de ácido nucleico, esto es secuencias de DNA y RNA, que codifican las proteínas de fusión de la invención. La invención proporciona también: vectores que comprenden estas secuencias de ácido nucleico; células que contienen tales vectores o secuencias de ácido nucleico; y métodos para producir las proteínas de fusión de la invención, que comprenden la expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión en una célula, y la recuperación de la proteína de fusión así obtenida.

Un experto en la técnica será capaz de generar secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas de fusión por métodos conocidos en la técnica, y será capaz también de generar vectores que comprenden tales secuencias y transformar o transfectar las células con tales vectores con el fin de conseguir la expresión de la proteína de fusión.

Típicamente, en un vector, la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión estará conectada de modo operativo a una secuencia control capaz de proporcionar la expresión de la proteína de fusión en la célula hospedante. El término "conectada de modo operativo" se refiere a una yuxtaposición en la que la secuencia de DNA codificante y la secuencia control están en una relación que permite la expresión de la secuencia codificante bajo el control de la secuencia control. Típicamente, la secuencia control será un promotor.

Opcionalmente, en el vector pueden estar presentes otros componentes, por ejemplo cualquiera de los siguientes: un origen de replicación; un potenciador; un gen marcador seleccionable, típicamente bajo el control de un promotor; una secuencia terminadora; o una secuencia de poliadenilación. Cualquiera de tales componentes debe estar situado de tal forma que esté conectado de modo operativo a la secuencia que codifica la proteína de fusión, esto es, en una posición tal que ejerza el efecto deseado sobre la secuencia codificante.

Aplicaciones médicas de la invención

Las estructuras artificiales de liberación nuclear de la invención se pueden usar para liberar al núcleo componentes como se ha descrito antes, en asociación con la proteína H o con uno de sus fragmentos o derivados. Esto será útil para combatir una serie de enfermedades de los seres humanos o animales.

En particular, como la NPM/B23 se regula por incremento en las células tumorales y proliferativas, las estructuras artificiales de liberación nuclear de la invención serán útiles para combatir enfermedades de células proliferativas, o enfermedades que incluyen la proliferación celular incontrolada. En particular, las estructuras artificiales de liberación nuclear de la invención se pueden usar para liberar componentes a las células tumorales, con lo que se combate el tumor.

A este respecto, es aconsejable usar estructuras artificiales de liberación nuclear de la invención en las que el componente asociado con la proteína H o con uno de sus fragmentos o derivados es un fármaco supresor de tumores o un fármaco citostático. Como se ha indicado antes, el efecto citostático de la proteína H puede complementar el efecto de estos fármacos.

Algunos tumores preferidos para dicha liberación incluyen en general los tumores que proliferan rápidamente; gliomas y otros tumores del sistema nervioso central tales como neuroblastomas; leucemias; linfomas; tumores pulmonares; sarcomas; tumores de colon tales como carcinomas, por ejemplo, los tumores de colon de bajo grado que han mostrado invasión (Duke III-IV); carcinomas renales dispersos; carcinomas tubáricos, carcinomas gástricos; y carcinomas de próstata.

Similarmente, las estructuras artificiales de liberación nuclear de la invención se pueden usar para dirigir fármacos a las células infectadas con virus, combatiendo de este modo la infección viral. Las células infectadas con virus preferidas son las células infectadas por el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), por ejemplo las células T CD4^{+}; o por el virus del papiloma humano (HPV), por ejemplo las células epiteliales del cuello uterino y las células epiteliales de la próstata; o por un rinovirus, por ejemplo las células del epitelio nasal. De este modo, cuando una estructura artificial de liberación nuclear de la invención comprende la proteína H o uno de sus fragmentos o derivados en asociación con un agente antiviral apropiado, la estructura artificial puede combatir la infección de uno de estos virus.

Además, como las enfermedades inflamatorias incluyen a menudo la proliferación celular, las estructuras artificiales de la invención se pueden usar para dirigir los agentes terapéuticos a los núcleos de las células implicadas en las enfermedades inflamatorias, tratando de este modo tales enfermedades. Los ejemplos de tales enfermedades inflamatorias incluyen artritis, particularmente artritis reumatoide; artritis; condritis; colitis; dermatitis; enteritis; miositis; tendosinovitis; y enfermedades inflamatorias autoinmunes tales como SLE (lupus eritematoso sistémico).

También, cuando la estructura artificial de liberación nuclear comprende DNA o RNA, se puede realizar terapia génica. De este modo se puede liberar al núcleo cualquier gen adecuado.

Cuando las estructuras artificiales de direccionamiento al núcleo de la invención se usan para liberar ácidos nucleicos antisentido a las células cancerosas (tumorales) se puede usar RNA antisentido para suprimir la expresión de las proteínas implicadas en el fenotipo canceroso. Por ejemplo, el RNA antisentido se puede usar para suprimir la expresión de las proteínas procedentes de los genes myc, bc12, bc1x o ciclina, combatiendo de este modo el cáncer implicado. Alternativamente, como se ha descrito antes, se pueden usar desde el RNA antisentido hasta el RNA transcrito de un gen HLA-DM, con vistas a combatir la enfermedad del injerto frente al hospedante.

El uso de las estructuras artificiales de direccionamiento al núcleo de la invención en el tratamiento de una enfermedad se puede combinar con otros tratamientos. En particular, cuando se desea el tratamiento de un tumor, se puede combinar o usar en asociación con otros agentes quimioterapéuticos o quimiopreventivos para proporcionar una terapia frente a los tumores. Similarmente, se puede combinar con el uso de otros agentes para el tratamiento de infecciones víricas u otras enfermedades.

Las estructuras artificiales de direccionamiento al núcleo de la invención se pueden usar también en métodos de diagnóstico. Por ejemplo, como se ha descrito antes, la proteína H o uno de sus fragmentos o derivados se puede asociar con un marcador detectable, especialmente un agente de imagen.

Composiciones farmacéuticas

La presente invención proporciona también composiciones farmacéuticas que comprenden una estructura artificial de liberación nuclear según la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Se puede usar cualquier formulación farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, las formulaciones adecuadas pueden incluir soluciones estériles para inyección, acuosas o no acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos, bactericidas, antibióticos y solutos que convierten la formulación en isotónica con los fluidos corporales del paciente a quien se dirigen; y suspensiones estériles acuosas o no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Algunos ingredientes de formulación preferidos incluyen manitol u otro azúcar y/o solución salina tamponada de fosfato (PBS).

Hay que tener en cuenta que en adición a los ingredientes mencionados antes, las formulaciones de esta invención pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica que tienen relación con el tipo de formulación en cuestión.

Información sobre posología

Según la invención, se puede administrar a un paciente cualquier cantidad eficaz, no tóxica de una estructura artificial de liberación nuclear de la invención. La dosis de la estructura artificial de liberación nuclear se puede ajustar de acuerdo con diferentes parámetros, por ejemplo, la naturaleza del componente que se libera al núcleo, la edad, peso y condición del paciente a ser tratado, el modo de administración usado, la enfermedad a ser tratada, la eficacia de la particular estructura artificial de liberación nuclear que se usa para transportar al núcleo el componente asociado y el régimen clínico requerido.

Como guía, parece que 10^{6} linfocitos B acumulan alrededor de 1 ng a 10 ng de proteína H en sus núcleos.

Esto sugiere que la cantidad de la estructura artificial de liberación nuclear administrada puede ser tal que la dosis comprende de 10^{-10} a 10^{-9} de proteína H o de uno de sus fragmentos o derivados por célula a la que se va a administrar la estructura artificial, por ejemplo de 10^{-14} g a 10^{-8} g, por ejemplo alrededor de 10^{-14} g, 10^{-13} g, 10^{-12} g, 10^{-11} g, 10^{-10} g, 10^{-9} g o 10^{-8} g por célula. La cantidad de proteína H o de uno de sus fragmentos o derivados depende por tanto de qué células son a las que se desea administrar la estructura artificial y cuántas hay de estas células. La cantidad total de la estructura artificial administrada depende también del tamaño del componente o componentes asociados con la proteína H o el fragmento/derivado.

Por ejemplo, una dosis típica de una estructura artificial de liberación nuclear de la invención puede contener de 1 a 1000 \mug de proteína H o de uno de sus fragmentos o derivados, por ejemplo 1 a 10 \mug, 10 a 100 \mug o 100 a 1000 \mug.

Estas dosis se indican solamente como una guía ya que un médico general experto será capaz de determinar fácilmente la dosis más apropiada para cualquier particular paciente y enfermedad.

Similarmente, el médico general experto será capaz de determinar la apropiada pauta posológica, que variará de acuerdo con los factores dados antes con respecto a las cantidades de dosis. Sin embargo, se contemplan dosis individuales y dosis múltiples dispersadas a lo largo de días, semanas o meses.

Vías de administración

Las estructuras artificiales de liberación nuclear de la invención se pueden formular para administración clínica mezclándolas con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, como se ha descrito antes. Por ejemplo, se pueden formular para administración tópica, parenteral, intravenosa, intramuscular o transdérmica. Naturalmente, la vía de administración debe ser adaptada a la enfermedad concreta a ser tratada.

Por ejemplo, cuando se usa en la estructura artificial la proteína H completa o un fragmento/derivado que comprende el sitio de unión a IgG, puede no ser aconsejable inyectar la proteína o el fragmento/derivado intravenosamente, ya que esto puede llevar a la formulación de inmunocomplejos con la IgG. En estas situaciones, se prefieren otros medios de administración, por ejemplo, administración directa de la estructura artificial al sitio en que se necesita. Por ejemplo, en el caso de un tumor, es aconsejable inyectar la proteína o el fragmento/derivado directamente al tumor. Sin embargo, como se ha indicado antes, incluso la capacidad de unión a IgG de la proteína H completa no es necesariamente suficiente para interrumpir el efecto de direccionamiento al núcleo de la invención.

Ejemplo

El siguiente ejemplo ilustra la invención.

Sumario

Algunas cepas del patógeno humano Streptococcus pyogenes expresan una proteína de superficie llamada proteína H, que se libera de la superficie estreptocócica mediante una cisteína-proteinasa producida por la bacteria. En esta invención se ha encontrado que la proteína H soluble se une a la superficie de los linfocitos y granulocitos. La molécula es absorbida por los linfocitos y transportada al núcleo a través de una ruta intracelular previamente desconocida. En el citoplasma, se ha encontrado que la proteína H se une a la actina mientras que cuando las proteínas se solubilizan por la papaína desde las fracciones de membranas, se ha encontrado que la proteína H interactúa con la nucleofosmina/B23, una proteína de la que se conoce que sirve de transporte entre el núcleo y el citoplasma. En el núcleo, la proteína H se disocia de la nucleofosmina/B23 y en su lugar forma complejos con las proteínas nucleares SET y hnRNP A2/B1, dando como resultado la acumulación nuclear de la proteína H y un efecto citostático.

Procedimientos experimentales Cepas bacterianas, proteínas, expresión bacteriana, traducción in vitro, marcado de proteínas, acoplamiento de proteínas a sefarosa

Se usó el grupo estreptocócico A cepa AP1 de serotipo M1 (\ring{A}kesson et al., 1994). Han sido descritos, la proteína H recombinante y los fragmentos peptídicos correspondientes a las regiones AB y A de la proteína H (\ring{A}kesson et al., 1990; Frick et al., 1994). Para la generación de la NPM traducida in vitro, se preparó RNA a partir de células T Jurkat usando RNazol B (Tel-Test Inc., Friendswood, USA) según las recomendaciones del fabricante. Se realizó la síntesis del cDNA por incubación de 5 \mug de RNA con 1x de tampón RT (Gibco BRL), dNTP 1 mM, DTT 10 mM, 0,1 mg de BSA por ml, poli-dT_{18} 4,5 \muM, 20 U de inhibidor de RNasa (Boehringer Mannheim) y 200 U de transcriptasa inversa M-MLV (Gibco BRL) en un volumen final de 50 \mul para 37ºC durante 1 hora. Se amplificó la NPM por PCR usando el cebador 5' que contiene un sitio NarI

5'-GCAGGGCGCCATGGAAGATTCGATGGACAT-3' (SEQ ID No. 1) y

el cebador inverso 3'

5'-CAGGAATTCTTATTAAAGAGACTTCCTCCACTGCC-3' (SEQ ID No. 2) que contiene un sitio EcoRI. Para la generación de fragmentos peptídicos de NPM por traducción in vitro se usaron dos oligonucleótidos adicionales para la amplificación por PCR: el péptido de NH_{2}-terminal se generó con el cebador inverso

5'-CAGGAATTCTTATTAGCTACCACCTCCAGGG-3' (SEQ ID No. 3) y

el cebador

5'-TTGATGAAGGTTCCACAGAAAAAAGTAAAACTTGCTG-3' (SEQ ID No. 4) se usó para el péptido de COOH-terminal. Los productos de la PCR se hicieron romos y se cortaron con EcoRI, mientras que el vector pGem-3Z se cortó con HincII/EcoRI, y se ligaron ambos. La traducción in vitro se hizo usando TNT Coupled Reticulocyte Lysate Systems (SDS, Falkenberg, Sweden) según las recomendaciones del fabricante. La proteína A recombinante se compró de Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden, y la actina de corazón porcino era de Sigma (MO, USA). Se marcó la proteína H con ^{125}I usando el reactivo de Bolton y Hunter (Amersham, UK). Las fracciones proteínicas 85-87 se purificaron con FPLC, se concentraron en un concentrador Amicon centricon (Amicon Inc., Beverley, MA), y se marcaron con ^{125}I usando el método de la cloramina T (Greenwood et al., 1963). El ^{125}I era de Nordion Int. Co. (Canadá). Se dializó la proteína H frente a NaHCO_{3} 0,1 M, pH 8,3 + NaCl 0,5 M, y se acopló a sefarosa 4B activada con CNBr (Pharmacia Biotech) como se ha descrito previamente (Frick et al., 1995).

Electroforesis y análisis por transferencia Western

Se realizó la SDS-PAGE como ha sido descrito por Laemmli (1970) usando una concentración total de poliacrilamida de 10% o 13,6% y 3,3% de reticulación. Se hirvieron las muestras durante 3 minutos en un tampón que contenía 2% de SDS y 5% de mercaptoetanol. Se fijaron los geles con una mezcla de ácido acético al 7% y etanol al 10%, se secaron y se autorradiografiaron. Los marcadores del peso molecular eran de Sigma. Los geles se tiñeron con azul Coomassie. Las fracciones proteínicas se aplicaron a membranas PVDF (Inmobilon, Millipore, Bedford, MA, USA) usando un sistema Milliblot-D (Millipore). Se bloquearon las membranas a temperatura ambiente durante 1 hora en VBS (veronal 10 mM, NaCl 0,15 M pH 7,4) que contenía Tween-20 al 0,25% y gelatina al 0,25%. Después de incubación a temperatura ambiente durante 3 h con proteína radiomarcada en VBS que contenía gelatina al 0,1%, se lavaron las membranas cuatro veces con NaCl 1,0 M, EDTA 10 mM, pH 7,7, Tween-20 al 0,25% y gelatina al 0,25%. Se secaron los filtros con aire y se autorradiografiaron a -70ºC usando películas Kodak X-Omat AR y pantallas de intensidad regular Kodak X-Omat,

Células y preparación de proteínas a partir de las fracciones de membranas de la línea de células Jurkat

Para el análisis por citometría de flujo, linfocitos de sangre periférica humana (PBL) procedentes de voluntarios sanos se agotaron de eritrocitos y se prepararon por separación de Ficoll (Pharmacia Biotech). Las células Jurkat, una línea de células T humanas, se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con FCS al 7,5% y piruvato de sodio 20 mM. Se realizaron preparaciones de membranas en frío (0-4ºC). Se homogenizaron 10^{6} células Jurkat en tampón de homogenización (Tris-HCl 0,05 M pH 7,5, sacarosa 0,25 M, MgCl_{2} 0,005 M, KCl 0,025 M) seguido por centrifugación a 1000 x g durante 10 min. Se centrifugó adicionalmente el sobrenadante a 105000 x g durante 45 min. Se conservó este sobrenadante y se usó como una fracción citoplásmica mientras que el sedimento obtenido se solubilizó en 4 ml de Tris-HCl 0,01 M pH 8,0. Se determinó el contenido proteínico con el reactivo de ensayo de proteínas Coomassie (Pierce, Boule Diagnostics AB, Huddinge, Sweden). Después de adición de 0,2 mg de papaína (Sigma) por mg de solución de proteína, y L-cisteína (Sigma) hasta una concentración final 4 mM, se incubó la mezcla a 37ºC durante 45 minutos. Para terminar la reacción, se añadieron 4 ml de Tris-HCl 0,01 M pH 8,0 enfriado con hielo y yodacetamida (Sigma) hasta una concentración final 6 mM, seguido por centrifugación durante 1 hora a 105000 x g. Se separó la papaína del sobrenadante por cromatografía sobre DEAE Sephadex A-50 (Pharmacia Biotech) equilibrada con Tris-HCl 20 mM pH 8,0. Se lavó la columna con 5 volúmenes de Tris-HCl 20 mM pH 8,0, y se eluyó el material con 3 volúmenes de NaCl 0,5 M en este tampón seguido por diálisis frente a Tris-HCl 20 mM pH 8,0. Para el fraccionamiento de las proteínas de membranas digeridas con papaína, se cargó la solución sobre una columna de cambio iónico (Mono-Q, Pharmacia Biotech) montada sobre un cromatógrafo de líquidos de media presión (FPLC, Pharmacia Biotech). Se realizó la elución con 70 ml en gradiente lineal de sal (NaCl de 0 a 1 M en Tris-HCl 20 mM pH 8,0). Se recogieron fracciones de 0,5 ml. Se aislaron las células B esplénicas murinas de ratones Balb/c como se ha descrito previamente (Axcrona et al., 1995). Se pusieron en placas de 96 pocillos los linfocitos a 3 x 10^{5}/ml. Se activaron las células B con LPS (25 \mug/ml, Difco) y se incubaron con proteínas H y A a las concentraciones indicadas. Se añadió 1 \muCi de [3H]timidina por pocillo durante las 4 últimas horas de un periodo de 40 horas de cultivo, se recogieron las células y se prepararon para el recuento por centelleo. Los valores son la media \pm SD de duplicados. Para la preparación de extractos nucleares y citoplásmicos de las células B murinas, se activaron las células durante 24 horas a 3,8 x 10^{6} células/ml con LPS (25 \mug/ml) y proteína H a 100 \mug/ml.

Preparación de extractos nucleares de las células T Jurkat y de las células B murinas

Se aislaron los núcleos de las células Jurkat como ha sido descrito por Mirkovitch et al., 1984. Se resuspendieron las preparaciones de los núcleos en 100 \mul de tampón A (tampón Hepes 50 mM, KCl 50 mM, EDTA 0,1 mM, PMSF 1 mM, DTT 1 mM, glicerol al 10%) y se añadió tampón A adicional hasta un volumen final de 162 \mul. Se añadieron 13 \mul de (NH_{4})_{2}SO_{4} 4 M para llevar la concentración final hasta 0,3 M. Se sacudieron las células durante 30 minutos y se transfirió el material viscoso a un tubo de 0,2 ml de TLA-100 (Beckmann), seguido por centrifugación a 10^{5} rpm durante 10 minutos. Se transfirieron 125 \mul del sobrenadante a un segundo tubo de TLA-100, se añadieron 75 \mul de (NH_{4})_{2}SO_{4} 4 M para aumentar la concentración final hasta 1,5 M. Se centrifugó la solución a 50000 rpm durante 5 minutos. Se separó el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en 100 \mul de tampón A. Los extractos o se usaron inmediatamente o se conservaron a -80ºC.

Cromatografía de afinidad, ensayo de unión competitiva, y espectroscopía de resonancia de plasmones

Las fracciones 85-87 reunidas marcadas con ^{125}I procedentes de Mono-Q y los péptidos de NPM traducidos in vitro se aplicaron sobre una columna de proteína A-sefarosa (Pharmacia Biotech) y las fracciones totales se hicieron pasar por una columna de proteína H-sefarosa. Se lavó ampliamente la columna con PBSAT (PBSA + Tween-20 al 0,05%). Se eluyeron las proteínas unidas con KSCN 3 M y se midió la radiactividad de las fracciones en un contador gamma. Se analizaron también las fracciones por SDS-PAGE. Los ensayos de unión competitiva se realizaron como se ha publicado (\ring{A}kerström and Björck, 1989). Se determinaron los datos cinéticos de la unión por espectroscopía de resonancia de plasmones de superficie usando un sistema BIACORE X (Biacore AB, Uppsala, Sweden). La actina y los extractos nucleares purificados sobre la proteína H-sefarosa se inmovilizaron sobre CM5 sensor chips, grado investigación, en acetato de sodio 10 mM a pH 4,0 y 4,5, respectivamente, usando el kit de acoplamiento de la amina suministrado por el fabricante, mientras que la NPM biotinilada se acopló a CM5 sensor chips preacoplados con avidina (Biacore). Todas las medidas fueron realizadas en PBST. Los análisis se realizaron a 25ºC y a un caudal de 10 \mul/min. Para calcular las constantes de disociación y de afinidad, se aplicaron 35 \mul de la proteína H o de las proteínas A, H o actina en diluciones seriadas (2n; empezando a 600 \mug/ml). Se regeneraron las superficies con 35 \mul de KSCN 1 M a un caudal de 10 \mul/min. Los datos cinéticos se analizaron mediante el programa BIAevaluation 2.2 (Biacore).

Análisis de la secuencia de aminoácidos

Se separaron las proteínas por SDS-PAGE y se tiñeron con azul Coomassie. Se cortaron las bandas de proteínas y se digirieron en matriz usando tripsina. Se separaron los fragmentos peptídicos por HPLC de fase inversa (Vydac 218TP, diámetro interno 1,6 x 250 mm) y se analizaron alícuotas mediante degradación de Edman automatizada usando un secuenciador modelo 477A conectado a un analizador PHT en línea modelo 120A (Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany) y por análisis de masas usando ácido ciano-4-hidroxicinámico como una matriz sobre un espectrómetro de masas Yoyager-DE MALDITOF (Perseptive Biosystems, Wiesbaden, Germany) (Herrmann et al., 1996; Herwald et al., 1996). Para investigar la homología de la secuencia se usó el Blast network server at the National Center for Biotechnology Information (Altschul et al., 1990).

Anticuerpos, análisis por citometría de flujo y por microscopía de fluorescencia

Para el análisis por citometría de flujo de los PBL humanos, se usaron anticuerpos de ratón anti- CD3, CD4, HLA-DP/DQ/DR (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) y CD8 (Dako Patts, Gentofte, Denmark) humanos. Como control positivo y negativo para las células T Jurkat, se usó un conjunto de control isotipo de un FITC-\gamma1, PE-\gamma2 y anti-CD45 PerCP (Becton Dickinson) de anticuerpos marcados, en el que los anticuerpos \gamma1/\gamma2 eran anticuerpos inespecíficos conjugados con fluorocromo. Las proteínas H y A fueron biotiniladas como se ha descrito previamente (Axcrona et al., 1995) y se usaron juntamente con la avidina acoplada a FITC (Sigma). Se detectaron anticuerpos de ratón anti- HLA-DP/DQ/DR humanos con un anticuerpo de cabra anti-ratón acoplado a FITC (Becton Dickinson). Se realizó un análisis FACS sobre un citómetro de flujo Becton Dickinson FACSort (Becton Dickinson). Cada mancha de transferencia y cada histograma representan el análisis de 10^{4}células en cada ventana. Para la microscopía de fluorescencia se incubaron 0,5 x 10^{6}células Jurkat con 20 \mug de proteínas biotiniladas en medio de cultivo durante 30 minutos sobre hielo en una placa de fondo plano de 96 pocillos. Se lavaron las células una vez, seguido por la incubación continuada en una cámara de cultivo a 37ºC durante los tiempos indicados. Se lavaron las células dos veces en 4 ml de PBS, se recogieron en 400 \mul de PBS, se centrifugaron sobre portas en una citocentrífuga (Shandon, Cytospin 2) a 550 RPM durante 3 minutos. Después de incubación con avidina acoplada a FITC (Sigma), se examinaron las células en un microscopio de fluorescencia (Leica Aristoplan) y se fotografiaron.

Procedimientos experimentales que usan anticuerpos anti-proteína H o anti-NPM Preparación de los fragmentos F(ab')_{2} anti-proteína H

Se aplicó antisuero anti-proteína H a una columna de proteína G-sefarosa. Se lavó ampliamente la columna con PBS y la IgG unida se eluyó con glicina 0,1 M-HCl pH 2,0. La IgG eluída se dializó frente a tampón de acetato pH 4,5 (CH_{3}COONa 70 mM–HCl 50 mM) seguido por la escisión proteolítica con pepsina (la relación proteína:pepsina era 100:1) durante 21 horas a 37ºC. Se terminó la reacción elevando el pH de la solución a 7,5 con Tris 1 M y se separó la IgG no escindida sometiendo el material a cromatografía de afinidad usando proteína G-sefarosa. El material no unido correspondiente a los fragmentos F(ab')_{2} policlonales anti-proteína H, se recogió y se dializó frente a PBS. El acoplamiento de los fragmentos F(ab')_{2} a sefarosa 4B (Pharmacia Biotech) se realizó según las recomendaciones del fabricante.

Clonación y expresión de la nucleofosmina (NPM)

Para la expresión en E. Coli, se amplificó la NPM por PCR usando el cebador 5' que contiene un sitio EcoRI

5'-GCAGGAATTCATGGAAGATTCGATGGACAT-3' (SEQ ID No. 7) y

el cebador inverso 3'

5'-ATAGCGGCCGCTTATTAAAGAGACTTCCTC-3' (SEQ ID No. 8) que contiene un sitio NotI. Se clonó el DNA en el vector de expresión procariótico pGEX-6p-1 (Pharmacia Biotech) usando los sitios EcoRI y NotI. La NPM recombinante fusionada con la glutatión S-transferasa (GST) se expresó y purificó según las recomendaciones del fabricante. Después de purificación sobre glutatión-sefarosa, se separó la marca de GST usando PreScission™ Protease (Pharmacia Biotech). A partir de 1 litro del cultivo de una noche, se consiguió aproximadamente 1 mg de NPM pura. Los anticuerpos frente a NPM se obtuvieron en conejos.

Preparación de extractos citoplásmicos y nucleares a partir de células T Jurkat y células Detroit

Células T Jurkat y células epiteliales humanas de la faringe (carcinoma) Detroit 562 (ATCC CCL 138), incubadas con diferentes proteínas, se lavaron cinco veces con PBS, se resuspendieron en tampón A (Hepes 10 mM, KCl 15 mM, MgCl_{2} 2 mM, DTT 1 mM, EDTA 0,1 mM, PMSF 1 mM, 1 \mug de antipain/ml, 0,5 \mug de leupeptina/ml) y se lisaron las membranas celulares usando NP-40 al 0,2%. Las fracciones citoplásmicas se recogieron después de centrifugación a 1000 x g durante 10 min y los sedimentos nucleares se lavaron dos veces con PBS y se resuspendieron en 100 \mul de tampón B (tampón Hepes 50 mM, KCl 50 mM, EDTA 0,1 mM, PMSF 1 mM, DTT 1 mM, glicerol al 10%). Se añadió tampón B adicional hasta un volumen final de 162 \mul y se añadieron 13 \mul de (NH_{4})_{2}SO_{4} 4 M para llevar la concentración final hasta 0,3 M. Se sacudieron los núcleos resuspendidos durante 30 minutos a 4ºC y el material viscoso se transfirió a un tubo de 0,2 ml de TLA-100 (Beckmann), seguido por centrifugación a 350000 x g durante 10 minutos. Se recogieron los sobrenadantes correspondientes a las fracciones nucleares y ambas fracciones, las citoplásmicas y las nucleares se sometieron a inmunoprecipitación.

Inmunoprecipitación

Los extractos preparados a partir de las células Jurkat, incubadas con proteína H o proteína L (150 \mug) durante 16 horas a 37ºC, se inmunoprecipitaron usando anticuerpos policlonales frente a la proteína H o frente a la proteína L, 2 \mul respectivamente, durante 2 horas a 4ºC. Se añadieron 40 \mul de proteína A-sefarosa y se continuó la incubación durante 16 horas a 4ºC. Los extractos procedentes de las células Detroit incubadas con proteína H se inmunoprecipitaron de forma similar.

Alternativamente, los extractos de las células Jurkat incubadas con proteína H (150 \mug) durante diferentes periodos de tiempo a 37ºC, se preclarificaron con 50 \mul de glicina-sefarosa, durante 2 horas a 4ºC, seguido por la inmunoprecipitación usando (F(ab')_{2} policlonales anti-proteína H)-sefarosa (100 \mul) durante 16 horas a 4ºC.

Los sedimentos de sefarosa se lavaron entonces tres veces con PBS, se hirvieron durante 3 min en tampón que contenía 2% de SDS y 5% de 2-mercaptoetanol seguido por centrifugación a 8000 x g durante 5 minutos. Se recogieron los sobrenadantes y se sometieron a SDS-PAGE y análisis de transferencia Western. Las membranas se bloquearon a 37ºC en PBST (PBS + Tween-20 al 0,05%) que contenía 5% de leche desnatada y se exploraron con sondas de anticuerpos policlonales seguidas por sondas de proteína A conjugada con peroxidasa y se revelaron con ECL.

Resultados La proteína H interactúa con los linfocitos y granulocitos humanos

La proteína H se libera de la superficie estreptocócica a través de la acción de una cisteína-proteinasa producida por la bacteria (Berge and Björck, 1995). El fragmento de la proteína H producido por E. Coli usado en este estudio es similar en tamaño al fragmento liberado por la enzima estreptocócica, y en los siguientes ejemplos la proteína H se refiere a este fragmento truncado en el COOH-terminal expresado por E. Coli y purificado desde E. Coli. Se analizó con citometría de flujo la interacción de la proteína H con la superficie de las células T y los granulocitos. Los linfocitos de la sangre periférica humana se incubaron con la proteína H y la mayoría (>90%) de las células CD3^{+}, CD4^{+} y CD8^{+} se unieron a la proteína H (Figura 1A). Cuando se analizó la unión de la proteína H a las células dentro de la ventana (gate) de los granulocitos, la proteína H también había teñido estas células de modo brillante (Figura 1A). La proteína H se une a IgGFc (Frick et al., 1994) y los trabajos anteriores han indicado también afinidad para los antígenos humanos MHC II (\ring{A}kesson et al., 1994). La línea de células T Jurkat humanas se eligió por tanto para los experimentos subsiguientes ya que la expresión de MHC II en estas células podría ser excluida con la citometría de flujo. Se encontró que más del 97% de las células T Jurkat eran proteína H^{+} en comparación con la base de FITC-avidina. Además, como se muestra en la Figura 1B, las células Jurkat se tiñeron por anti-CD45 pero no con los mAb de ratón FITC-\gamma1/PE-\gamma2.

La proteína H es absorbida por los linfocitos y acumulada en el núcleo

La proteína H biotinilada se incubó con células Jurkat durante diferentes tiempos. Después de la incubación, se citocentrifugaron las células, se fijaron, y se añadió avidina acoplada a FITC. Como se demuestra por la microscopía de inmunofluorescencia (Figura 2), la proteína H se acumuló gradualmente en los núcleos, y después de 8 horas el 80% de los núcleos presentaron tinción. Por contraste, se detectó la tinción citoplásmica pero sin ningún marcado de los núcleos cuando las células Jurkat se incubaron con la proteína A biotinilada (Figura 2C). Similarmente a la proteína H, la proteína A de Staphylococcus aureus es una molécula de la superficie bacteriana que se une a la IgGFc. Trabajos anteriores han demostrado que la proteína H se une a las células B murinas y humanas (Axcrona et al., 1995) y como en el caso de las células Jurkat, la proteína H era direccionada a los núcleos de la línea de células B humanas Bjab, mientras que la proteína A no mostró ninguna acumulación nuclear.

La proteína H es absorbida por los linfocitos y por las células epiteliales

Se realizaron estudios adicionales usando anticuerpos anti proteína H. Se incubaron separadamente 5 x 10^{6} células Jurkat con 150 \mug de proteína H o de proteína L durante 16 horas. Se prepararon extractos citoplásmicos y nucleares y se realizó la inmunoprecipitación usando anticuerpos policlonales frente a las proteínas H y L, respectivamente, seguidos por la adición de proteína A-sefarosa. Los materiales precipitados se ensayaron por SDS-PAGE y se transfirieron a membranas PVDF. Se exploraron las membranas con sondas de anticuerpos policlonales frente a las proteínas H y L, respectivamente, seguido por sondas de proteína A conjugada con peroxidasa y se revelaron con ECL. La proteína H fue absorbida por las células y se pudo detectar en ambos extractos, citoplásmicos y nucleares, mientras que la proteína L no fue absorbida por las células (no se muestra). Las células epiteliales (Detroit 562) se incubaron también con la proteína H (150 \mug) y los extractos preparados a partir de estas células se inmunoprecipitaron como se ha descrito antes. La proteína H fue absorbida por las células Detroit, aunque se detectó una cantidad menor de proteína en los extractos nucleares.

La proteína H interactúa con la nucleofosmina/B23 y la actina

Para identificar a las proteínas que interactúan con la proteína H y median en su absorción, las preparaciones de membranas obtenidas por fraccionamiento subcelular de las células Jurkat se trataron con un detergente (NP-40). Sin embargo, no se pudo detectar en este material solubilizado ninguna proteína unida a la proteína H ni antes ni después de la purificación por cromatografía de cambio iónico, filtración en gel o cromatografía de afinidad sobre proteína H-sefarosa. Para liberar los péptidos solubles en agua procedentes de las preparaciones de membranas de las células Jurkat, se usó papaína. Se separaron los péptidos solubilizados por cromatografía de cambio iónico y las fracciones se eluyeron por un gradiente lineal de cloruro de sodio (Figura 3A). Se aplicaron las fracciones en ranura a membranas de PVDF y se exploraron con una sonda de proteína H radiomarcada. Las fracciones 85-87 reaccionaron con la sonda, y fueron reunidas. Una porción (20 ml) se marcó con ^{125}I y se sometió a cromatografía de afinidad sobre proteína A-sefarosa (Figura 3B). Los péptidos marcados no mostraron afinidad para la proteína A pero cuando las fracciones del ensayo procedentes de la proteína A-sefarosa se aplicaron a la proteína H-sefarosa, más del 70% de la radiactividad resultó unida y fue eluída con KSCN 3 M (Figura 3B). Cuando se analizó por SDS-PAGE y autorradiografía, este material (pico II) contenía dos bandas principales de 18 y 54 kDa, respectivamente. El material de todo el ensayo (pico I) dio origen a una única banda con una masa molecular de aproximadamente 16 kDa. El material del conjunto 85-87 no marcado, se purificó entonces sobre proteína H-sefarosa seguido por SDS-PAGE. Después de la tinción, las bandas de 18 y 54 kDa (véase la Figura 3C) se cortaron y separaron del gel, se digirieron con tripsina y se separaron por HPLC. Las secuencias de aminoácidos mostradas en la Figura 3C se pudieron determinar a partir de los picos de HPLC y se pudo demostrar que ambas bandas contenían nucleofosmina/B23 (NPM), una proteína de la que se conoce que sirve de transporte entre el citoplasma y el núcleo (Borer et al., 1989). La NPM monomérica tiene una masa molecular de 32 kDa pero se sabe que la proteína forma oligómeros (Schmidt-Zachmann et al., 1987; Herrera et al., 1996), que incluyen también dímeros de 70 kDa en condiciones desnaturalizantes (véase Umekawa et al., 1993 y la Figura 3D). Por tanto la banda de 54 kDa probablemente consta de dímeros de los fragmentos de NPM generados por la escisión con papaína mientras que los fragmentos de 18 kDa no forman multímeros en SDS-PAGE. La NPM intacta y dos fragmentos de NPM que cubren las mitades de NPM del NH_{2}-terminal y del COOH-terminal, respectivamente, fueron generados por PCR y traducción in vitro. Estos péptidos marcados con ^{35}S-metionina se separaron por SDS-PAGE seguido por autorradiografía (Figura 3D, izquierda). Como se ha mencionado antes, la NPM tiene una tendencia a formar dímeros-oligómeros (Schmidt-Zachmann et al., 1987; Umekawa et al., 1993; Herrera et al., 1996). Esta propiedad es evidente para la molécula intacta dando origen a bandas de 35 y 70 kDa que corresponden a monómeros y dímeros. En el caso del fragmento del NH_{2}-terminal con una masa molecular aparente de 18 kDa, se ve una banda que corresponde a un trímero de 54 kDa, mientras que no hay oligómeros claros en la pista 3 cuando se ensayó el fragmento del COOH-terminal. Esto está de acuerdo con las observaciones previas que demuestran que la parte del COOH-terminal de la NPM no es esencial para la oligomerización (Herrera et al., 1996). Cuando los tres péptidos de NPM se sometieron a purificación de afinidad sobre proteína H-sefarosa, la NPM intacta y el fragmento del NH_{2}-terminal se unieron a la proteína H. Sin embargo, el fragmento del COOH-terminal no demostró afinidad para la proteína H-sefarosa (Figura 3D, derecha). Estos resultados y el hecho de que el fragmento de NPM del NH_{2}-terminal de 18 kDa, debido a la papaína, mostrado en la Figura 3C, también tiene afinidad para la proteína H, señalan la unión de la proteína H a la parte del NH_{2}-terminal de NPM. Como la región del COOH-terminal de NPM contiene las señales esenciales para su localización hacia el nucleolo (Wang et al., 1993), la unión de la proteína H no debe interferir con el direccionamiento de la NPM.

Usando los fragmentos de proteína H en experimentos de unión competitiva se identificó la región de la proteína H que interactúa con NPM. Se inmovilizó la proteína H sobre sefarosa y se añadió NPM radiomarcada (conjunto 85-87). El 80-90 por ciento de la radiactividad se unió a la sefarosa. Como se demuestra en la Figura 3E esta unión fue inhibida por la proteína H no marcada y por los fragmentos A y AB de la proteína H, mientras que el efecto de la proteína A estuvo en el nivel de base también a alta concentración. La inhibición con el fragmento AB del NH_{2}-terminal, que es un inhibidor aún más eficaz que la proteína H intacta, representa la unión de NPM a esta región.

El material de membrana sometido a digestión con papaína se obtuvo por un procedimiento de centrifugación de dos etapas en el que el sobrenadante que sigue a la centrifugación final a 105000 g representa una fracción citoplásmica. También este material fue sometido a cromatografía de afinidad sobre proteína H-sefarosa. Se eluyó una banda dominante con una masa molecular aparente de 40 kDa, y la secuenciación de aminoácidos en el NH_{2}-terminal estableció que la banda era actina.

La nucleofosmina es co-precipitada con la proteína H

Se incubaron 1 x 10^{6} células Jurkat con proteína H (150 \mug) durante diferentes tiempos y con el fin de analizar si la nucleofosmina puede ser coprecipitada con la proteína H, se prepararon extractos nucleares. Los extractos se preclarificaron con glicina-sefarosa y se inmunoprecipitaron usando (F(ab')_{2} anti-proteína H)-sefarosa. Los materiales precipitados se ensayaron en SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de PVDF. Se exploró la membrana con sondas de anticuerpos policlonales frente a la nucleofosmina recombinante, seguido por sondas de proteína A conjugada con peroxidasa y se reveló con ECL. Se pudo detectar la nucleofosmina en los extractos nucleares. Por tanto, la nucleofosmina pudo ser coprecipitada usando los anticuerpos frente a la proteína H lo que demuestra una interacción in vivo entre la nucleofosmina y la proteína H.

Identificación de proteínas nucleares que interactúan con la proteína H

A diferencia de la tinción nuclear homogénea vista con la proteína H, los anticuerpos anti-NPM detectan una acumulación granular de NPM en los nucleolos (Borer et al., 1989). Para investigar si la proteína H después de la entrada en el núcleo, presumiblemente junto con la NPM, interactúa o no con las proteínas nucleares, los extractos nucleares procedentes de las células Jurkat se hicieron pasar sobre proteína H-sefarosa. Se eluyeron varias bandas (véase la Figura 4, TINCIÓN, pista 2) pero cuando se exploraron con una sonda de proteína H radiomarcada, solamente tres reaccionaron con la sonda (Figura 4, TRANSFERENCIA, pista 2). Estas bandas tienen masas moleculares aparentes de 39, 42 y 80 kDa, respectivamente. Las bandas de 39 y 80 kDa (I y III, respectivamente) se identificaron por microsecuenciación como de la proteína SET. Esta proteína se describió inicialmente como un producto oncogénico fusionado a una proteína llamada CAN (véase Lindern et al., 1992). Tres fragmentos trípticos de cada una de las bandas de 39 y 80 kDa se sometieron a secuenciación del NH_{2}-terminal y todas las secuencias se relacionaron con la proteína SET (Figura 4, sección inferior). Este hecho y la masa molecular de la banda de 80 kDa, dan a entender que ésta representa un dímero de SET. La secuencia de aminoácidos de la banda de 42 kDa (banda II, Figura 4), identificó que esta banda era la proteína ribonuclear nuclear heterogénea (hnRNP) A2/B1, un miembro de la familia hnRNP (Dreyfuss et al., 1993).

Análisis adicionales y comparación entre las interacciones de la proteína H con actina, NPM y las proteínas nucleares

Para analizar en más detalle las interacciones entre la proteína H y las diferentes proteínas intracelulares, se utilizó la espectroscopía de resonancia de plasmones. En estos experimentos se aplicaron diferentes cantidades de la proteína H y se dejó que interactuaran con la actina inmovilizada, NPM o con las proteínas nucleares inmovilizadas que se unen a la proteína H, hasta el nivel de saturación (Figura 5A). La NPM usada en estos experimentos corresponde al material mostrado en la Figura 3C, y para crear una situación experimental similar a las condiciones in vivo, se usó una mezcla de las proteínas nucleares que interactúan con la proteína H tanto para la espectroscopía de plasmones como para los experimentos de unión competitiva (véase la Figura 4, TINCIÓN, pista 2).

La Figura 5A muestra los sensogramas típicos de las interacciones entre proteína H-actina, proteína H-NPM y proteína H-proteínas nucleares. Basándose en estos experimentos, se calcularon las tasas de disociación y asociación y se usaron para determinar las constantes de asociación y disociación (Figura 5B). Los datos demuestran que la proteína H tiene alta afinidad por la actina pero también se disocia fácilmente desde el complejo, y que la proteína H tiene una tasa de asociación más alta y una tasa de disociación considerablemente más baja para las proteínas nucleares en comparación con la NPM. También, los experimentos de unión competitiva en los que la NPM y las proteínas nucleares compiten simultáneamente por la unión de la proteína H, demostraron que las proteínas nucleares sin marcar inhibieron mas eficientemente la interacción entre la NPM radiomarcada y la proteína H-sefarosa, que la propia NPM sin marcar. Por contraste, la actina no interfirió con la unión de NPM-proteína H (Figura 5C) y tampoco interactuó la actina con la NPM inmovilizada (Figura 5A, sección media). En ninguno de estos experimentos la proteína A estafilocócica demostró afinidad por la actina, NPM o las proteínas nucleares (Figura 5, A y C). En resumen, los datos sobre la cinética de la unión proporcionan una explicación de la liberación de la proteína H a partir de su complejo con NPM, y su acumulación nuclear como resultado de la unión a las proteínas nucleares SET y hnRNP A2/B1.

La proteína H soluble tiene un efecto citostático sobre las células B murinas

La interacción con la proteína SET, un factor putativo de transcripción y producto oncogénico, y hnRNP A2/B1, una molécula que participa en el proceso del mRNA, dio a entender que la proteína H puede interferir con diferentes funciones celulares y que las células metabólicamente activas pueden ser particularmente sensibles a la proteína H. Se ha demostrado que la proteína H interactúa también con los linfocitos murinos (Axcrona et al., 1995), y por tanto se investigó el efecto de la proteína H sobre la proliferación de estas células. Inicialmente se investigó si la proteína H cuando se añade a las células B murinas estimuladas por LPS, era o no transportada al núcleo, y los experimentos de transferencia Western demostraron que esto era lo que ocurría (Figura 6A). No hay ninguna indicación de que la proteína H se degrade en su camino desde el exterior de la célula hasta dentro del núcleo. Por tanto, la masa molecular de la proteína H identificada en el medio, en el citoplasma y en el núcleo es muy similar si no es idéntica. Como un control, se incubó una membrana de PVDF idéntica a la de la Figura 6A con suero pre-inmune seguido por proteína A conjugada con peroxidasa. No se obtuvieron señales. Después de 24 horas de incubación con la proteína H, el citoplasma contenía 1,4 y el núcleo 2,4 ng de la proteína H por 10^{6} células B. Además, la adición de la proteína H a las células B estimuladas por LPS, inhibió la proliferación medida como absorción de [^{3}H]Tdr en una forma dependiente de la dosis (Figura 6B). Se registró una inhibición del 50 por ciento en la concentración más alta de proteína H ensayada (50 \mug/ml). Como se determina por la morfología y escala del DNA, la proteína H no indujo la apoptosis en las células B estimuladas por LPS.

Leyendas de las figuras Figura 1 Unión de la proteína H a la superficie de los linfocitos de la sangre periférica humana y a la línea de células T Jurkat humanas, determinada por análisis FACS

(A) Tinción de las células T con CD3, CD4, y CD8 frente a la proteína H. Se separaron los granulocitos en una ventana con dispersión lateral/dispersión frontal y se tiñeron con proteína H. (B) Las células T Jurkat se tiñeron con proteína H y CD45. La tinción base se muestra con FITC-avidina y CD3 sobre la ventana de las células de granulocitos y con los anticuerpos FITC-g1/PE-g2 sobre las células Jurkat.

Figura 2 Absorción y acumulación nuclear de la proteína H en las células T Jurkat

Las células T Jurkat se incubaron con proteínas H o A biotiniladas, se citocentrifugaron y se tiñeron con avidina acoplada a FITC. (A) Incubación con proteína H durante cuatro horas y (B) durante ocho horas. (C) Incubación con proteína A durante ocho horas.

Figura 3 La proteína H interactúa con la nucleofosmina

(A) Las preparaciones de membranas de las células T Jurkat se digirieron con papaína y los péptidos solubilizados se sometieron a FPLC sobre una columna Mono-Q. Las fracciones (0,5 ml) eluídas con un gradiente lineal de NaCl se analizaron en cuanto a la actividad de unión a la proteína H en un ensayo de unión en ranura, y se hicieron reaccionar las fracciones 85-87 con la proteína H radiomarcada. (B) El conjunto del material 85-87 radiomarcado se hizo pasar sobre la proteína A-sefarosa sin que mostrara afinidad (izquierda). En la sección derecha las fracciones reunidas del pico del ensayo procedentes de la proteína A-sefarosa se sometieron a una columna de proteína H-sefarosa. (C) Las fracciones del pico de los picos I y II procedentes de proteína H-sefarosa se separaron por SDS PAGE (gel al 10%), seguido por autorradiografía. El conjunto del material 85-87 sin marcar fue tratado en paralelo. Se tiñó este gel y se cortaron las bandas marcadas por las flechas. Se digirieron los péptidos de las bandas con tripsina y los fragmentos trípticos se separaron por HPLC. Las secuencias del NH_{2}-terminal se pudieron determinar a partir de un pico de HPLC de cada una de las dos bandas. Estas secuencias establecieron que ambas bandas contenían NPM. Los números indican las posiciones de los residuos de aminoácidos en las secuencias de NPM. (D) Los péptidos NPM traducidos y marcados con ^{35}S-metionina in vitro se separaron por SDS PAGE (13,6% gel). Se secó el gel y se sometió a autorradiografía (izquierda). El número de la pista corresponde al ensayo del péptido y los péptidos se muestran esquemáticamente en la parte inferior de la figura. En el péptido 3 de COOH-terminal, X indica las señales putativas de localización nuclear. Los tres péptidos radiomarcados se aplicaron de forma separada a la proteína H-sefarosa. Después de un extenso lavado, el material unido se eluyó con KSCN 3 M, se dializó frente a PBS, se concentró y se ensayó por SDS PAGE. Se secó el gel y se sometió a autorradiografía (derecha). (E) Cartografía de la región de unión a NPM de la proteína H mediante inhibición competitiva. La unión de la NPM marcada con ^{125}I a la proteína H inmovilizada sobre sefarosa fue inhibida con diferentes cantidades de proteína H intacta, fragmentos AB y A de la proteína H, o proteína A, sin marcar.

Figura 4 Identificación de las proteínas nucleares que interactúan con la proteína H

Se preparó un extracto nuclear a partir de las células T Jurkat (pista 1). Se preclarificó el extracto con glicina-sefarosa seguido por incubación con proteína H-sefarosa. Después de un extenso lavado, las proteínas unidas a la proteína H-sefarosa se eluyeron con KSCN 3 M, se dializaron frente a PBS, y se separaron por SDS PAGE (pista 2). Se utilizaron simultáneamente dos geles idénticos (10%); uno fue teñido con azul Coomassie (TINCIÓN), uno fue transferido sobre una membrana de PVDF y fue explorado con una sonda de proteína H marcada con ^{125}I (TRANSFERENCIA). El material que corresponde a las tres bandas indicadas se sometió a digestión con tripsina, a HPLC y a secuenciación del NH_{2}-terminal. Se obtuvieron tres secuencias de cada una de las bandas I y III, que muestran identidad con la proteína SET. La banda II dio origen a dos secuencias encontradas en hnRNP A2/B1. Las secuencias se muestran en la parte inferior de la figura y los números indican dónde se encuentran residuos homólogos en las proteínas SET y hnRNP A2/B1.

Figura 5 Análisis de la unión de la proteína H a la nucleofosmina y a las proteínas nucleares

(A) Planos superpuestos de la unión de las proteínas H y A con la actina inmovilizada (izquierda), NPM (medio) o con las proteínas nucleares (derecha) usando espectroscopía de resonancia de plasmones. Se aplicaron concentraciones crecientes de proteína H durante 3 min, cada una de ellas durante la fase de asociación. Se midió la disociación de las proteínas unidas (expresada en unidades de resonancia, RU) después de la inyección del tampón solo.

Las tasas de afinidad y las constantes de disociación para las interacciones entre la proteína H y la actina, NPM inmovilizada o proteínas nucleares son como sigue (los valores son la media \pm la desviación estándar de tres experimentos).

	Actina-proteína H	NPM-proteína H	Proteínas nucleares-proteína H
Tasa de asociación	2,5 \pm 0,1	6,7 \pm 0,82	1,7 \pm 0,5
(10^{3} x s^{-1}M^{-1})
Tasa de disociación	150 \pm 6,6	190 \pm 2,9	6,7 \pm 0,6
(10^{5} x s^{-1})
Constante de asociación	1,7 \pm 0,2	3,6 \pm 0,5	26,2 \pm 9,2
(10^{6} x M^{-1})
Constante de disociación	60,0 \pm 5,7	28,6 \pm 3,7	4,4 \pm 1,7
(10^{-8} x M)

(B) Inhibición competitiva de la unión de NPM marcada con ^{125}I a la proteína H-sefarosa con diferentes cantidades de NPM, proteínas nucleares, proteína A o actina, sin marcar.

Figura 6 Absorción nuclear y efecto citostático de la proteína H

(A) 7 x 10^{7} células B murinas purificadas se incubaron con LPS y proteína H durante 24 horas. Se ensayaron sobre SDS-PAGE, el medio (1), el material citoplásmico (2), el extracto nuclear (3), y la proteína H (4) y se tiñeron con Coomassie (izquierda) o se transfirieron a una membrana de PVDF (derecha). Se exploró la membrana con el material transferido con una sonda de antisuero anti-proteína H, seguido por una sonda de proteína A conjugada con peroxidasa y se reveló con ECL. (B) Inhibición de la proliferación de las células B esplénicas murinas en respuesta a las proteínas H y A.

Información de las secuencias

A continuación se dan las secuencias de cDNA (SEQ ID No. 5) y de aminoácidos (SEQ ID No. 6) de la proteína H. Están marcados los límites de las regiones S, A, C1, C2, C3 y D, ya que son los N-terminales de las formas alternativas de la proteína H.

1

2

200

3

Referencias

\ring{A}kerström, B., and Björck, L. (1989). Protein L: an immunoglobulin light chain-binding bacterial protein. Characterization of binding and physicochemical properties. J. Biol. Chem. 264, 19740-19746.

\ring{A}kesson, P., Cooney, J., Kishimoto, F., and Björck, L. (1990). Protein H-a novel IgG binding bacterial protein. Mol. Immunol. 27, 523-531.

\ring{A}kesson, P., Schmidt, K.-H., Cooney, J., and Björck, L. (1994). M1 protein and protein H: IgGFc and albumin-binding streptococcal surface proteins encoded by adjacent genes. Biochem. J. 300, 877-886.

Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W., and Lipman, D.J. (1990). Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215, 403-410.

Axcrona, K., Björck, L., and Leanderson, T. (1995). Multiple ligand interactions for bacterial immunoglobulin-binding proteins on human and murine cells of the hematopoetic lineage. Scand. J. Immunol. 42, 359-367.

Berge, A., and Björck, L. (1995). Streptococcal cysteine proteinase releases biologically active fragments of streptococcal surface proteins. J. Biol. Chem. 270, 9862-9867.

Borer, R.A., Lehner, C.F., Eppenberger, H.M., and Nigg, E.A. (1989). Major nucleolar proteins shuttle between nucleus and cytoplasm. Cell 56, 379-390.

Dreyfuss, G., Matunis, M.J., Pinol-Roma, S., and Burd, C.G. (1993). hnRNP proteins and the biogenesis of mRNA. Ann. Rev. Biochem. 62, 289-321.

Frick, I.-M., \ring{A}kesson, P., Cooney, J., Sjöbring, V., Schmidt, K.-H., Gomí, H., Hattorí, S., Tagawa, C., Kishimoto, F., and Björck, L. (1994). Protein H-a surface protein of Streptococcus pyogenes with separate binding sites for IgG and albumin. Mol. Microbiol. 12, 143-151.

Frick, I.-M., Crossin, K.L., Edelman, G.M., and Björck, L. (1995). Protein H-a bacterial surface protein with affinity for both immunoglobulin and fibronectin type III domains. EMBO J. 14, 1674-1679.

Herrera, J.E., Correia J.J., Jones, A.E., and Olson, M.O.J. (1996). Sedimentation analyses of the salt-and divalent metal ion-induced oligomerization of nucleolar protein B23. Biochemistry 35, 2668-2673.

Herrmann, C., Volknandt, W., Wittich, B., Kellner, R., and Zimmermann, H. (1996). The major vault protein (MVP100) is contained in cholinergic nerve terminals of electric ray electric organ. J. Biol. Chem. 271, 13908-13915.

Herwald, H., Collin, M., Mller-Esterl, W., and Björck, L. (1996). Streptococcal cysteine proteinase releases kinins: a novel virulence mechanism. J. Exp. Med. 184, 665-673.

Herwald, H., Dedio, J., Kellner, R., Loos, M., and Mÿller-Esterl, W. (1996). Isolation and characterization of the kininogen-pindfng protein p33 from endothelial cells. Identity with the gC1q receptor. J. Biol. Chem. 271, 13040-13047.

Holm, S.E., Norrby, A., Bergholm, A.M., and Norgren, M. (1992). Aspects of pathogenesis of serious group A streptococcal infections in Sweden, 1988-1989. J. Infect. Dis. 166, 31-37.

Mirkovitch, J., Mirault, M.E., and Laemmli, U.K. (1984). Organization of the higher order chromatin loop: specific DNA attachment sites on nuclear scaffold. Cell 39, 223-232.

Schmidt-Zachmann, M., Hÿgle-Dörr, B., and Franke, W.W. (1987). A constitutive nucleolar protein identified as a member of the nucleoplasmin family. EMBO J. 6, 1881-1890.

Umekawa, H., Chang, J.-H., Correia, J.J., Wang, D., Wingfield, P.T., and Olson, M.O.J. (1993). Nucleolar protein B23: bacterial expression, purification, oligomerization and secondary structures of two isoforms. Cell. Mol. Biol. Res. 39, 635-645.

v. Lindern, M., v. Baal, S., Wiegant, J., Raap, A., Hagemeijer, A., and Grosveld, G. (1992). Can, a putative oncogene associated with myeloid leukemogenesis, may be activated by fusion of its 3' half to different genes: characterization of the set gene. Mol. Cell. Biol. 12, 3346-3355.

Wang, D., Umekawa, H., and Olson, M.O.J. (1993). Expression and subcellular locations of two forms of nucleolar protein B23 in rat tissues and cells. Cell. Mol. Biol. Res. 39, 33-42.

\newpage

Wang, D., Baumann, A., Szebeni, A., and Olson, M.O.J. (1994). The nucleic acid binding activity of nucleolar protein B23.1 resides in its carboxyl-terminal end. J. Biol. Chem. 269, 30994-30998.

Claims (17)

1. Una estructura artificial de liberación nuclear que comprende:

(i)

la proteína H o uno de sus derivados que tiene al menos 70% de homología con la SEQ ID No. 6, que es capaz de dirigirse al núcleo de una célula eucariótica, o un fragmento de cualquiera de ellos que es capaz de dirigirse al núcleo de una célula eucariótica; y

conjugado o fusionado con ellos

(ii)

uno o más de otros componentes seleccionados entre un polipéptido, un ácido nucleico, un fármaco de molécula pequeña o un liposoma, de los cuales se desea el direccionamiento al núcleo de la célula eucariótica.

2. Una estructura artificial de liberación nuclear según la reivindicación 1, en la que el fragmento o derivado de la proteína H comprende:

(a)

la región A de la proteína H;

(b)

la región AB de la proteína H, o

(c)

un fragmento o derivado de (a) o (b) que es capaz de dirigirse al núcleo de una célula eucariótica.

3. Una estructura artificial de liberación nuclear según las reivindicaciones 1 ó 2, que comprende, como componente (i), un fragmento o derivado de la proteína H que es capaz de dirigirse al núcleo de una célula eucariótica pero que no tiene un efecto citostático sobre la célula.

4. Una estructura artificial de liberación nuclear según las reivindicaciones 1, 2 ó 3, en la que el componente (ii) es un polipéptido y la estructura artificial está en la forma de una proteína de fusión.

5. Una estructura artificial de liberación nuclear según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que los componentes (i) y (ii) están asociados covalentemente.

6. Una composición farmacéutica que comprende una estructura artificial de liberación nuclear como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

7. Una estructura artificial de liberación nuclear como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para uso en un método de tratamiento de los seres humanos o animales, o para uso en un método de diagnóstico.

8. El uso de la proteína H o de uno de sus fragmentos o derivados que es capaz de dirigirse al núcleo de una célula eucariótica, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de los seres humanos o animales, en el que una estructura artificial como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, se direcciona al núcleo de una célula eucariótica.

9. El uso de una estructura artificial de liberación nuclear como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades de los seres humanos o animales, en el que la estructura artificial se direcciona al núcleo de una célula eucariótica.

10. El uso según las reivindicaciones 8 ó 9, en el que la estructura artificial se direcciona al núcleo de una célula en la que la nucleofosmina (NPM)/B23 se regulada por incremento.

11. El uso según las reivindicaciones 8, 9 ó 10, en el que el componente (i) de la estructura artificial interactúa con actina, NPM/B23, proteína SET o hnRNP A2/B1.

12. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el que la célula es una célula tumoral o una célula proliferativa, una célula infectada por virus o un linfocito.

13. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en el que el componente (ii) de la estructura artificial es un ácido nucleico que codifica una proteína, y por direccionamiento al núcleo efectúa una terapia génica de la célula.

14. Una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión según la reivindicación 4.

15. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 14.

16. Una célula que comprende una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 14 o un vector según la reivindicación 15.

\newpage

17. Un método para producir una proteína de fusión según la reivindicación 4, que comprende expresar una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 14 en una célula, y recuperar la proteína de fusión así obtenida.