ES2351993T3 - Inmunosupresión mediante chaperonina 10. - Google Patents
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Abstract
Una composición farmacéutica que comprende: una cantidad farmacéuticamente eficaz de chaperonina 10 con la secuencia de aminoácidos recogida en SEQ ID NO:1, y un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Description
Inmunosupresión mediante chaperonina 10.
Esta invención se refiere a una composición
farmacéutica que comprende: una cantidad farmacéuticamente eficaz de
chaperonina 10 con la secuencia de aminoácidos recogida en SEQ ID
NO:1, y un vehículo excipiente o diluyente farmacéuticamente
aceptable.
La enfermedad de injerto frente a hospedante
(GVHD - siglas en inglés) es un estado que puede desarrollarse
cuando se han introducido en un individuo células inmunológicamente
competentes, por ejemplo durante el trasplante de médula ósea o de
células madre. La GVHD se refiere al proceso inmunológico en el que
las células recientemente trasplantadas despliegan una respuesta de
rechazo contra el tejido hospedante. La GVHD puede desarrollarse
después del trasplante o la transfusión de tejido de la médula ósea,
células madre hematopoyéticas, productos de la sangre no irradiados
y órganos sólidos que contienen tejido linfoide.
Existen dos tipos de GVHD, la aguda y la
crónica. La GVHD aguda se desarrolla en el espacio de los tres
primeros meses tras el trasplante, y los síntomas clínicos incluyen
dermatitis, enteritis y hepatitis. La GVHD crónica se desarrolla,
habitualmente, tres meses después del trasplante y es un síndrome
autoinmune que afecta a múltiples órganos y tejidos, tales como la
piel, tracto gastrointestinal y el hígado.
Células T donantes son las responsables de
provocar el desarrollo de la GVHD. Células T donantes reconocen los
antígenos de las células hospedantes como extraños y responden
proliferando y liberando citoquinas que, a su vez, pueden activar a
células del sistema inmune innato.
El trasplante alogeneico de la médula ósea o el
trasplante de células hematopoyéticas sigue siendo la terapia
curativa más eficaz para el tratamiento de malignidades
hematológicas, tales como leucemia, mieloma, linfoma y anemia
aplástica. La GVHD aguda grave es la causa principal de la
mortalidad y la morbidez durante el trasplante de la médula ósea. La
GVHD crónica también puede dar como resultado la muerte, y los
supervivientes están a menudo gravemente discapacitados.
Fármacos inmunosupresores juegan un gran papel
en la prevención, el tratamiento terapéutico y el control de la GVHD
aguda y crónica. Los fármacos se pueden administrar al paciente
antes y después del trasplante. Los fármacos actuales utilizados en
el tratamiento terapéutico de la GVHD incluyen ciclosporina,
metotrexato, tacrolimus, sacrolimus, micofenolato de mofetilo y
esteroides. Los regímenes de inmunosupresión implican, a menudo, la
administración de una combinación de fármacos para el efecto
máximo.
Chaperonina 10 (cpn 10) está presente en una
diversidad de organismos, desde bacterias a seres humanos, y es un
miembro de la familia de proteínas de choque térmico (chaperonas)
que se encuentran entre las proteínas más evolutivamente estables
que existen. Las moléculas de chaperona están implicadas en el
plegamiento post-traducción, la fijación como
objetivo y la reunión de otras proteínas (Hartman et al.,
1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 89, 3394-8), pero
no forman parte, por sí mismas, de la estructura reunida final
(Ellis et al., 1991, Annu. Rev. Biochem. 60,
321-47). Estas proteínas juegan papeles esenciales
en las células normales, pero su producción está suprarregulada
durante el estrés celular (p. ej. disrupción metabólica, infección,
inflamación, transformación).
Inesperadamente, se descubrió que chaperonina 10
tiene la misma secuencia de aminoácidos que el factor temprano del
embarazo (EPF - siglas en inglés) (Morton et al., publicación
internacional WO 95/15338). El EPF es una sustancia asociada al
embarazo que aparece en el suero materno en el espacio de
6-24 h tras la fertilización (Morton et al.,
1974, Nature 249; 459-460 y Morton et al.,
1976. Proc. R. Soc. Lond., 193; 413-9). Está
presente durante al menos la primera mitad del embarazo y es
esencial para el desarrollo continuado y la supervivencia del
embrión (Morton et al., 1987, Current Topics in Developmental
Biology 23; 73-92). Resulta ahora claro que el EPF
tiene muchas funciones fisiológicas y su producción no está
confinada al embarazo.
Se ha informado que el EPF puede actuar como un
inmunosupresor, liberar factores supresores a partir de linfocitos
(Rolfe et al., 1988, Clin. Exp. Immunol. 73,
219-225) y aumentar las propiedades inhibidoras de
la roseta de un suero inmunosupresor anti-linfocitos
(Morton et al., 1974 y 1976, véase antes). El EPF puede
suprimir la reacción de hipersensibilidad de tipo retardado a
trinitroclorobenceno en ratones (Noonan et al., 1979, Nature,
278, 649-51), suprimir la proliferación de
linfocitos inducida por mitógenos
(Athanasas-Platsis, 1993, Tésis de Doctorado,
Universidad de Queensland) y suprimir la producción de
IFN-\gamma mediante células T CD4+.
Sin embargo, no ha habido evidencia directa
alguna en cuanto a si el EPF o cpn10 pueden tener un potencial como
un agente inmunosupresor en los trasplantes y, en particular, en la
prevención de la GVHD. Chaperonina 60, una proteína de choque
térmico relacionada, que también puede actuar como un
inmunosupresor, no ha demostrado poseer efectos terapéuticos algunos
en la GVHD. De hecho, la técnica anterior enseña que proteínas de
choque térmico pueden tener efectos adversos sobre el trasplante
(Ogita et al., 2000, Transplantation, 69,
2273-2277).
El documento WO 95/15338 describe una
chaperonina 10 recombinante y su uso para tratar injerto de piel en
ratas y en ratones in vivo, con el fin de prolongar la
supervivencia de los injertos y de reducir el rechazo de los
injertos trasplantados.
Morton H et al., muestran el uso de cpn
10 recombinante (factor temprano del embarazo (EPF)) in vivo
como un medicamento testado en ratas en cuanto a su papel en la
prolongación de los tiempos de supervivencia de injertos de piel
(Morton H et al., "Production of a recombinant form of
early pregnancy factor that can prolong allogeneic skin graft
survival time in rats". IMMUNOLOGY AND CELL BIOLOGY, vol. 78, nº
6, diciembre de 2000 (12-2000), páginas
603-607).
Los autores de esta invención han reconocido que
los fármacos inmunosupresores, actualmente utilizados para el
tratamiento terapéutico y el control de la GVHD tienen los
siguientes defectos importantes:
- (i)
- inducen efectos secundarios graves, por ejemplo hipertensión que puede requerir una medicación adicional para el control, nefrotoxicidad, que se produce en hasta el 40% de pacientes y, con frecuencia, fuerza al doctor a administrar dosis sub-óptimas del fármaco para limitar la toxicidad, efectos del SNC, tales como tremor, dolor de cabeza, depresión, paraestesia, visión borrosa, crisis, riesgo incrementado de infecciones bacterianas, fúngicas o virales, riesgo incrementado de cáncer, en particular cáncer de piel, pérdida del apetito, náuseas y un crecimiento incrementado del pelo;
- (ii)
- la GVHD es resistente a los fármacos en un importante porcentaje de pacientes y se requiere una terapia con fármacos de combinación;
- (iii)
- los fármacos son muy costosos; y
- (iv)
- los fármacos han demostrado interacciones adversas con otros fármacos terapéuticos, tales como antibióticos, NSAIDs (siglas inglesas de fármacos anti-inflamatorios no esteroides), anti-epilépticos y anti-hongos, inmunizaciones tales como rubéola y polio, y alimentos naturales, tales como pomelos (en el caso de ciclosporina).
Por lo tanto, existe una enorme demanda del
desarrollo de un nuevo fármaco para tratar y controlar la GVHD que
tenga menos efectos secundarios que los tratamientos actualmente
disponibles y que sea más eficaz en pacientes que muestren una
resistencia a los actuales fármacos en el mercado.
Los autores de la presente invención han
descubierto, de forma inesperada, que cpn 10 posee un enorme
potencial clínico como una nueva terapia en el tratamiento y control
de la GVHD.
En esta memoria se describe el uso de cpn 10 en
el trasplante, en particular para el tratamiento y/o la prevención
de la enfermedad de injerto frente a hospedante.
También se describe la administración de cpn 10
a un animal donante y/o receptor o células, tejidos u órganos
derivados del donante, así como el tratamiento del animal tanto
donante como receptor.
Por lo tanto, en un primer aspecto, un método
para tratar, de modo terapéutico o profiláctico, la enfermedad de
injerto frente a hospedante (GVHD) incluye las etapas de:
- (i)
- administrar una cantidad farmacéuticamente eficaz de chaperonina 10 (cpn 10) o un derivado de cpn 10 a un animal donante o célula, órgano o tejido obtenido del mismo; y
- (ii)
- administrar a un animal receptor una cantidad farmacéuticamente eficaz de cpn 10 o un derivado de cpn 10 para, con ello, retrasar, mejorar, suprimir o reducir de otro modo uno o más síntomas de la GVHD tras el trasplante de la una o más células, tejidos u órganos al animal receptor.
Preferiblemente, la cantidad farmacéuticamente
eficaz de cpn 10 o un derivado de cpn 10 se administra a un animal
receptor tanto antes como después de la etapa (ii).
Preferiblemente, la cantidad farmacéuticamente
eficaz de cpn 10 o derivado de cpn 10 administrada a un animal se
encuentra en el intervalo de 0,1-100 mg por kg/peso
corporal. Más preferiblemente, se encuentra dentro del intervalo de
0,1-10 mg por kg/peso corporal.
Preferiblemente, el animal es un mamífero.
Preferiblemente, el mamífero es un ser
humano.
De manera adecuada, la célula, tejido u órgano
es la médula ósea o se deriva de la médula ósea.
De manera adecuada, el método para tratar de un
modo terapéutico o profiláctico la GVHD incluye, además, la etapa de
administrar a dicho animal donante y/o a dicho animal receptor al
menos otro agente inmunosupresor, seleccionado del grupo que
consiste en ciclosporina, tacrolimus, sirolimus, micofenolato de
mofetilo y metotrexato.
De manera adecuada, el método para tratar de un
modo terapéutico o profiláctico la GVHD incluye, además, la etapa de
administrar un esteroide a dicho animal donante y/o a dicho animal
receptor.
En un segundo aspecto, un método para inhibir,
suprimir o reducir de otro modo la producción de TNF\alpha en un
animal incluye la etapa de administrar a dicho animal una cantidad
farmacéuticamente eficaz de cpn 10 o derivado de cpn 10 para, con
ello, inhibir, suprimir o reducir de otro modo la producción de
TNF\alpha en dicho animal.
Preferiblemente, el animal es un mamífero,
Preferiblemente, el mamífero es un ser
humano.
De acuerdo con este aspecto, también se describe
un método para inhibir, suprimir o reducir de otro modo la
producción de TNF\alpha por parte de una o más células, tejidos u
órganos obtenidos de un animal, que incluye la etapa de administrar
a dichas células, tejidos u órganos una cantidad farmacéuticamente
eficaz de cpn 10 o derivado de cpn 10 para, con ello, inhibir la
producción de TNF\alpha por parte de dicho animal.
En un tercer aspecto, en esta memoria se
describe un método para inducir, aumentar o incrementar de otro modo
la producción de IL-10 en un animal, que incluye la
etapa de administrar a dicho animal una cantidad farmacéuticamente
eficaz de cpn 10 o un derivado de cpn 10 para, con ello, inducir,
aumentar o incrementar de otro modo la producción de
IL-10 en dicho animal.
Preferiblemente, el animal es un mamífero.
Preferiblemente, el mamífero es un ser
humano.
De acuerdo con este aspecto, un método de
inducir, aumentar o incrementar de otro modo la producción de
IL-10 por parte de una o más células, tejidos u
órganos obtenidos de un animal incluye la etapa de administrar a
dichas células, tejidos u órganos una cantidad farmacéuticamente
eficaz de cpn 10 o un derivado de cpn 10 para, con ello, inducir la
producción de IL-10 en dicho animal.
La presente invención se refiere a una
composición farmacéutica para uso de acuerdo con el método de
cualquiera de los aspectos antes mencionados, que comprende una
cantidad farmacéuticamente eficaz de chaperonina (cpn 10) que tiene
la secuencia de aminoácidos recogida en SEQ ID NO:1, y un vehículo,
excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.
El al menos otro agente inmunosupresor es un
fármaco inmunosupresor o un anticuerpo especifico dirigido contra
linfocitos B o T o receptores de la superficie que median en su
activación.
Preferiblemente, el fármaco inmunosupresor es
uno cualquiera de ciclosporina, tacrolimus, sirolimus, micofenolato
de mofetilo y metotrexato.
En un aspecto adicional, se describe una
composición farmacéutica del cuarto aspecto que comprende, además,
un esteroide.
Preferiblemente, dicha proteína cpn 10 tiene una
secuencia de aminoácidos recogida en la Fig. 1. (SEQ ID NO:1).
A lo largo de esta memoria descriptiva,
"comprenden", "comprende" y "que comprenden" se
utilizan de forma inclusiva más que exclusiva, y se entenderá que
implican la inducción de un número entero o grupos de números
enteros establecidos pero no la exclusión de cualquier otro número
entero o grupo de números enteros.
Fig. 1: La secuencia de aminoácidos de la
proteína cpn 10 (SEQ ID NO:1).
Fig. 2: El efecto del tratamiento in vivo
con cpn 10 sobre las respuestas proinflamatorias, inducidas por LPS
y aloantígenos, de macrófagos peritoneales de ratones y sobre la
diferenciación de células T.
Fig. 3: Supervivencia de ratones después del
trasplante de la médula ósea y el tratamiento
post-trasplante de cpn 10. En el periodo
post-trasplante (días 0 a 21) se inyectó a los
animales, por vía subcutánea, vehículo (grupo singeneico, n = 8 y
grupo control alogeneico n = 10) o cpn 10 (10 y 100
\mug/animal/día: cpn 10, 10 \mug/día alogeneico, n = 10 y cpn 10
100 \mug/día alogeneico n = 10). B. Puntuaciones clínicas de la
GVHD en ratones representadas a lo largo del tiempo
(0-45 días; ** P< 0,01).
Fig.4: Supervivencia de ratones después del
trasplante de la médula ósea y del tratamiento
pre-trasplante de cpn 10. Ratones receptores y
donantes fueron tratados durante 5 días antes del trasplante con
inyecciones subcutáneas de cpn 10 (100 \mug/día) o diluyente
control. Se formaron entonces cinco grupos de animales: Grupo 1:
control singeneico (n = 8) representaba B6D2F1 trasplantado con
B6D2F1 singeneico de la médula ósea y células T; Grupo 2: control
alogeneico (n =10) consistía en receptores B6D2F1
pre-tratados con diluyente, a los que se les
trasplantaron células de donantes B6 pre-tratados
con diluyente; Grupo 3: ratones B6D2F1 receptores alogeneicos
pre-tratados (n=10), ratones B6D2F1 receptores
fueron tratados antes del trasplante con cpn 10 y se les
trasplantaron células donantes B6 pre-tratadas con
vehículo; Grupo 4: ratones B6D2F1 receptores
pre-tratados con diluyentes solamente que recibieron
un trasplante de donantes B6 pre-tratados con cpn 10
(alogeneico: donante pre-tratado, n = 10); y Grupo
5: tanto ratones receptores B6D2F1 como donantes B6 fueron
pre-tratados con cpn 10 antes del trasplante
(alogeneico: pre-tratados con receptor y donante, n
= 10). (*P < 0,01 frente al control alogeneico). B. Puntuaciones
clínicas de la GVHD en ratones representadas a lo largo del tiempo
(0-30 días; ***P < 0,001).
Los autores de la invención han demostrado que
cpn 10 tiene una actividad inmunosupresora importante en el modelo
de trasplante en ratón in vivo y que el tratamiento con cpn
10 aumenta la tasa de supervivencia de ratones que padecen la GVHD.
Esta es la primera demostración de los efectos inmunosupresores
beneficiosos de cpn 10 y de las tasas incrementadas de supervivencia
en un modelo de GVHD in vivo.
La eficacia del tratamiento con cpn 10 se
incrementa si tanto los animales donantes como receptores son
tratados con cpn 10 antes del proceso de trasplante. Se demuestra
también que cpn 10 inhibe la secreción de TNF\alpha mediada por
lipopolisacáridos y fomenta la producción de IL-10
en macrófagos de ratón. IL-10 es una potente
citoquina inmunosupresora, que es un poderoso inhibidor de
respuestas inmunes adaptativas innatas a LPS.
La GVHD aguda tras un trasplante de médula ósea
(BMT - siglas en inglés) alogeneico es una enfermedad mediada por
células T, en la que células T donantes reconocen antígenos del
hospedante dispares y se diferencian de una manera Th1 dominante.
Las citoquinas Th1 derivadas de células T resultantes ceban células
mononucleares donantes que liberan cantidades citopáticas de
citoquinas inflamatorias (p. ej. TNF\alpha) cuando entran en
contacto con un lipopolisacárido (LPS). El LPS escapa a través de la
mucosa gastrointestinal que está lesionada por la GVHD y por la
radiación precedente. Por lo tanto, TNF\alpha, junto con la
producción desregulada de citoquinas citotóxicas, induce la
apoptosis en el tejido hospedante. La mortalidad por GVHD en modelos
de BMT es evitada mediante la inmunosupresión dirigida a células T,
particularmente por agentes que inhiben la generación de
IL-2.
La presente descripción queda ejemplificada con
respecto al trasplante de médula ósea. Sin embargo, se apreciará que
el concepto es aplicable a otras células, tejidos y órganos que
incluyan células inmuno-competentes, capaces de
iniciar una respuesta inmune en el hospedante. Ejemplos no
limitantes de células, tejidos y órganos de este tipo incluyen el
hígado, pulmón, corazón, riñón y células madre y progenitoras.
La descripción, según se describe en esta
memoria, puede ser ampliamente aplicable a cualquier animal, pero
está particularmente dirigida a mamíferos y, de preferencia, seres
humanos. Por ejemplo, puede dirigirse a un trasplante en ganado,
animales domésticos, animales de laboratorio y animales para
espectáculos (por ejemplo, caballos de carreras y camellos).
Para los fines de esta memoria descriptiva, por
"aislado" se quiere dar a entender material que ha sido
separado de su estado natural o ha sido sometido de otra manera a
una manipulación humana. El material aislado puede estar sustancial
o esencialmente exento de componentes que normalmente le acompañan
en su estado natural, o puede ser manipulado con el fin de estar en
un estado artificial junto con componentes que normalmente lo
acompañan en su estado natural. El material aislado puede estar en
una forma nativa, química, sintética o recombinante.
Por "proteína" se quiere dar a entender un
polímero de aminoácidos. Los aminoácidos pueden ser aminoácidos
naturales o no naturales, D- y L-aminoácidos, según
son bien entendidos en la técnica.
Un "péptido" es una proteína que no
tiene más de cincuenta (50) aminoácidos.
Un "polipéptido" es una proteína que
tiene más de cincuenta (50) aminoácidos.
La expresión "ácido nucleico", tal
como se utiliza en esta memoria, designa ARNm, ARN, ARNc, ARNi y ADN
de cadena sencilla o doble, incluido ADNc y ADN genómico.
Por "agente inmunosupresor" se
quiere dar a entender un agente que puede suprimir de manera
profiláctica o terapéutica una respuesta autoinmune o inmune contra
una célula, tejido u órgano alogeneico o xenogeneico trasplantado, o
suprimir la enfermedad de injerto frente a hospedante.
Preferiblemente, la cantidad farmacéuticamente
eficaz de cpn 10 administrada a un individuo se encuentra en el
intervalo de 0,1-100 mg.
\newpage
Más preferiblemente, la cantidad
farmacéuticamente eficaz de cpn 10 administrada a un individuo se
encuentra en el intervalo de 0,1-10 mg.
Se apreciará por parte de la persona experta que
las cantidades farmacéuticamente eficaces antes mencionadas se
calculan en términos de un ser humano típico de 70 kg de peso. Por
consiguiente, las dosis pueden variar en función del peso, la edad,
el sexo, la salud general, la forma física del individuo y de
cualesquiera otros tratamientos a los que está siendo sometido el
individuo. Además de ello, la cantidad de cpn 10 administrada será
independiente de la frecuencia y del tiempo de administración.
También se apreciará que las cantidades
farmacéuticamente eficaces de cpn 10 antes mencionadas se pueden
administrar a animales, por ejemplo animales domésticos y ganado.
Las dosis variarán en función del peso y tipo de animal, como
resultará evidente para los expertos en la técnica.
La cpn 10 administrada a un ser humano u otro
animal puede ser cualquier forma de cpn 10 aislada, incluida, pero
no limitada a cpn 10 recombinante (SEQ ID NO.1), cpn 10 nativa, cpn
10 pegilada, cpn 10-GSM recombinante o cualquier
otra proteína derivada de cpn 10.
Secuencias de nucleótidos y aminoácidos de cpn
10 adecuadas son bien conocidas en la técnica, a pesar de que, por
conveniencia, la persona experta es remitida a la siguiente
secuencia de cpn 10 de mamíferos
- (i)
- cpn 10 humana (NCBI nº de acceso de entrada U07550; Chen et al., 1994, Biochim. Biophys. Acta, 1219, 189-190);
- (ii)
- cpn 10 de ratón (NCBI nº de acceso de entrada U09659; Dickson et al., 1994, J. Biol. Chem., 269, 26858-864); y
- (iii)
- cpn 10 de rata (NCBI nº de acceso de entrada X71429; Ryan et al., 1994, FEBS Lett, 337, 152-156).
Tanto el donante como el receptor pueden ser
tratados con cpn 10 antes del proceso de trasplante.
Preferiblemente, el donante se ve sometido a un
tratamiento con cpn 10 durante no más de 7 días antes del proceso de
trasplante. Más preferiblemente, el donante se ve sometido a un
tratamiento con cpn 10 durante 2 a 5 días antes del proceso de
trasplante.
Preferiblemente, el receptor se ve sometido a un
tratamiento con cpn 10 durante no más de 7 días antes del proceso de
trasplante y durante no más de 90 días después del proceso. Más
preferiblemente, el receptor se ve sometido a un tratamiento con cpn
10 durante 2 a 5 días antes del proceso de trasplante y durante no
más de 60 días después del proceso. Incluso más preferiblemente, el
receptor se ve sometido a un tratamiento con cpn 10 durante 2 a 5
días antes del proceso de trasplante y durante 10 a 30 días después
del proceso.
Tal como se utiliza en esta memoria, proteínas
"derivadas" de la memoria descriptiva son proteínas
tales como proteínas cpn 10 que han sido alteradas, por ejemplo por
conjugación o formación de complejo con otros restos químicos o
mediante técnicas de modificación post-traducción
según se entiende en la técnica, incluidas proteínas del
participante en la fusión.
Otros derivados contemplados por la descripción
incluyen, pero no se limitan a la pegilación, modificación a cadenas
laterales, incorporación de aminoácidos no naturales y/o sus
derivados durante la síntesis de péptidos, polipéptidos o proteínas,
y el uso de reticuladores y de otros métodos que imponen
limitaciones conformacionales a los polipéptidos, fragmentos y
variantes de la descripción. Ejemplos de modificaciones de la cadena
lateral contempladas por la presente descripción incluyen
modificaciones de grupos amino, tales como mediante acilación con
anhídrido acético; acilación de grupos amino con anhídrido succínico
y anhídrido tetrahidroftálico; amidinación con acetemidato de
metilo; carbomoilación de grupos amino con cianato; piridoxilación
de lisina con piridoxal-5-fosfato,
seguido de reducción con NaBH_{4}; alquilación reductora mediante
reacción con un aldehído, seguido de reducción con NaBH_{4} y
trinitrobencilación de grupos amino con ácido
2,4,6-trinitrobenceno-sulfónico
(TNBS - siglas en inglés).
El grupo carboxilo se puede modificar mediante
activación con carbodiimida a través de la formación de
O-acilisourea, seguido de la subsiguiente
derivatización, a modo de ejemplo, en una correspondiente amida.
El grupo guanidina de los residuos arginina se
puede modificar mediante formación de productos de condensación
heterocíclicos con reactivos tales como
2,3-butanodiona, fenilglioxal y glioxal.
Los grupos sulfhidrílo se pueden modificar por
métodos tales como oxidación con ácido perfórmico en ácido cisteico;
formación de derivados de mercurio utilizando ácido
4-cloromercurilfenilsulfónico,
4-cloromercuribenzoato;
2-cloromercuri-4-nitrofenol,
cloruro de fenilmercurio y otros compuestos de mercurio; formación
de disulfuros mixtos con otros compuestos de tiol; reacción con
maleimida, anhídrido maleico u otra maleimida sustituida;
carboximetilación con ácido yodoacético o yodoacetamida; y
carbamoilación con cianato a pH alcalino.
\newpage
Residuos de triptófano se pueden modificar, por
ejemplo, mediante alquilación del anillo indol con bromuro de
2-hidroxi-5-nitrobencilo
o haluros de sulfonilo o mediante oxidación con
N-bromosuccinimida.
Los residuos de tirosina se pueden modificar
mediante nitración con tetranitrometano para formar un derivado de
3-nitrotirosina.
El anillo de imidazol de un residuo histidina se
puede modificar mediante N-carboetoxilación con
pirocarbonato de dietilo o mediante alquilación con derivados del
ácido yodoacético.
Ejemplos de incorporar aminoácidos no naturales
y derivados durante la síntesis de los péptidos incluyen, pero no se
limitan al uso de ácido
4-amino-butírico, ácido
6-aminohexanoico, ácido
4-amino-3-hidroxi-5-fenilpentanoico,
ácido
4-amino-3-hidroxi-6-metilheptanoico,
t-butilglicina, norleucina, norvalina,
fenilglicina, ornitina, sarcosina,
2-tienil-alanina y/o isómeros D de
aminoácidos.
Los derivados también pueden incluir
participantes en la fusión y etiquetas de epitopos. Ejemplos bien
conocidos de participantes en la fusión incluyen, pero no se limitan
a glutation-S-transferasa (GST), la
porción Fe de IgG humana, proteína de unión a maltosa (MBP - siglas
en inglés) y hexahistidina (HIS_{6}) que son particularmente
útiles para el aislamiento de la proteína de fusión mediante
cromatografía de afinidad. Para los fines de la purificación de los
polipéptidos de fusión mediante cromatografía de afinidad, matrices
relevantes para la cromatografía de afinidad son resinas conjugadas
con glutation, amilasa y níquel o cobalto, respectivamente. Muchas
matrices de este tipo están disponibles en forma de un "kit",
tal como el sistema QIAexpress^{TM} (Qiagen) útil con
participantes en la fusión (HIS_{6}) y el sistema de purificación
de GST de Pharmacia.
Un ejemplo particular de un participante en la
fusión es GST tal como se describe en Ryan et al. (véase
antes). En algunos casos, los participantes en la fusión también
tienen sitios de escisión de proteasas, tales como para el factor
X_{a} o trombina, que permiten a la proteasa relevante que digiera
parcialmente el polipéptido de fusión de la invención y, con ello,
libere el polipéptido recombinante de la invención a partir de ella.
El polipéptido liberado se puede después aislar del participante en
la fusión mediante subsiguiente separación cromatográfica. Tras la
escisión de GST-cpn 10 se produce, por ejemplo, el
derivado GSM-proteína cpn 10.
Participantes en la fusión de acuerdo con la
memoria descriptiva incluyen también, dentro de su alcance,
"etiquetas de epítopos" que habitualmente son secuencias
cortas de péptidos para las que está disponible un anticuerpo
especifico. Ejemplos bien conocidos de etiquetas de epitopos para
las que están fácilmente disponibles anticuerpos monoclonales
específicos incluyen c-myc, hemaglutinina y
etiquetas FLAG.
Proteínas cpn 10 de la memoria descriptiva
(incluidos fragmentos, variantes, derivados y homólogos) se pueden
preparar por cualquier proceso adecuado conocido por los expertos en
la técnica, que incluyen la síntesis química y expresión
recombinante.
Preferiblemente, cpn 10 es cpn 10
recombinante.
Por ejemplo, la proteína cpn 10 recombinante se
puede preparar mediante un proceso que incluye las etapas de:
- (i)
- preparar una construcción de expresión que comprende un ácido nucleico aislado que codifica cpn 10, operativamente enlazada a uno o más secuencias de nucleótidos reguladoras en un vector de expresión;
- (ii)
- transfectar o transformar una célula hospedante adecuada con la construcción de expresión; y
- (iii)
- expresar la proteína recombinante en dicha célula hospedante.
Un "vector de expresión" puede ser
un vector extracromosómico autorreplicante, tal como un plásmido, o
un vector que se integra en un genoma hospedante.
Por "operativamente enlazada" se
quiere dar a entender que dicha o dichas secuencias de nucleótidos
reguladoras están situadas con relación al ácido nucleico
recombinante de la invención para iniciar, regular o controlar de
otro modo la transcripción.
Secuencias de nucleótidos reguladoras serán
generalmente apropiadas para la célula hospedante utilizada para la
expresión. En la técnica se conocen numerosos tipos de vectores de
expresión apropiados y secuencias reguladoras adecuadas para una
diversidad de células hospedantes. Típicamente, dicha una o más
secuencias de nucleótidos reguladoras pueden incluir pero no se
limitan a secuencias de promotor, secuencias conductoras o de señal,
sitios de unión a ribosomas, secuencias de comienzo y terminación de
la transcripción, secuencias de comienzo y terminación de la
traducción, secuencias de donante/aceptor de corte y empalme y
secuencias de reforzador o activador.
Están contemplados por la invención promotores
constitutivos inducibles, según se conocen en la técnica, e
incluyen, por ejemplo, promotores represibles por tetraciclina e
inducibles por metalotionina. Los promotores pueden ser promotores
que se producen de forma natural o promotores híbridos que combinan
elementos de más de un promotor.
En una realización preferida, el vector de
expresión contiene un gen marcador seleccionable para permitir la
selección de células hospedantes transformadas. Genes marcadores
seleccionables son bien conocidos en la técnica y variarán con la
célula hospedante utilizada.
Células hospedantes adecuadas para la expresión
pueden ser procarióticas o eucarióticas, tales como Escherichia
coli (por ejemplo DH5\alpha), células de levaduras, células
SF9 utilizadas con un sistema de expresión de baculovirus, células
CHO, células COS, CV-1 y 293, sin limitación a
ellas.
La proteína cpn 10 recombinante puede prepararse
convenientemente por una persona experta en la técnica utilizando
protocolos convencionales, según se describe, por ejemplo en
Sambrook et al., MOLECULAR CLONING. A Laboratory Manual (Cold
Spring Harbor Press, 1989), en particular en las Secciones 16 y 17;
CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, compiladores Ausubel et
al., (John Wiley & Sons, Inc. 1995-1999), en
particular los Capítulos 10 y 16; y CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN
SCIENCE, compiladores Coligan et al., (John Wiley & Sons,
Inc. 1995-1999), en particular en los Capítulos 1, 5
y 6.
En el documento WO 95/15338 se proporciona un
ejemplo para la producción y purificación de cpn 10 sintética
recombinante utilizando el sistema pGEX. Para producir la cpn 10
(SEQ ID NO:1) se utilizó un sistema de expresión bacteriano de alto
rendimiento, del que se sabe que produce cpn 10 activa (Ryan et
al., véase antes) utilizada en los experimentos descritos en
esta memoria.
La memoria descriptiva proporciona un uso de cpn
10 par el tratamiento terapéutico de enfermedades o estados médicos
provocados por el trasplante de células, tejidos u órganos, en
particular la GVHD.
La invención proporciona composiciones
farmacéuticas que comprenden cpn 10 que tiene la secuencia de
aminoácidos recogida en SEQ ID NO:1.
De manera adecuada, la composición farmacéutica
comprende un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente
aceptable, apropiado.
De manera adecuada, la composición farmacéutica
comprende cpn 10, un vehículo, diluyente o excipiente
farmacéuticamente aceptable y al menos otro agente inmunosupresor.
Preferiblemente, el otro agente inmunosupresor es un fármaco
inmunosupresor o un anticuerpo especifico dirigido contra linfocitos
B o T o receptores en superficie que median en su activación. Más
preferiblemente, el agente inmunosupresor es uno cualquiera de
ciclosporina, tacrolimus, sirolimus, micofenolato de mofetilo y
metotrexato. La composición farmacéutica también puede comprender un
esteroide.
Por "vehículo, diluyente o excipiente
farmacéuticamente aceptable" se quiere dar a entender un
material de carga sólido o líquido, diluyente o sustancia
encapsulante que se puede utilizar de manera segura en la
administración sistémica. Dependiendo de la vía particular de
administración, se puede utilizar una diversidad de vehículos, bien
conocidos en la técnica. Estos vehículos pueden seleccionarse de un
grupo que incluye azúcares, almidones, celulosa y sus derivados,
malta, gelatina, talco, sulfato de calcio, aceites vegetales,
aceites sintéticos polioles, ácido algínico, soluciones tamponadas
con fosfato, emulsionantes, solución salina isotónica y sales, tales
como sales de ácidos minerales, incluidos hidrocloruros, bromuros y
sulfatos, ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos y
malonatos, y agua apirógena.
Una útil referencia que describe vehículos,
diluyentes y excipientes farmacéuticamente aceptables es Remington's
Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. N. J. USA, 1991).
Se puede emplear cualquier vía de administración
segura para proporcionar a un paciente la composición de la
descripción. Por ejemplo, se pueden emplear las vías oral, rectal,
parenteral, sublingual, bucal, intravenosa,
intra-articular, intra-muscular,
intra-dermal, subcutánea, por inhalación,
infraocular, intraperitoneal, intracerebroventricular, transdermal y
similares. La inyección intra-muscular y subcutánea
es apropiada, por ejemplo, para la administración de composiciones
inmunogénicas, vacunas y vacunas de ADN.
Formas de dosificación incluyen comprimidos,
dispersiones, suspensiones, inyecciones, soluciones, jarabes,
trociscos, cápsulas, supositorios, aerosoles, parches transdermales
y similares. Estas formas de dosificación pueden también incluir la
inyección o el implante de dispositivos de liberación controlada,
diseñados específicamente para este fin u otras formas de implantes
modificados para actuar adicionalmente de esta manera. La liberación
controlada del agente terapéutico puede efectuarse revistiendo al
mismo, por ejemplo, con polímeros hidrófobos que incluyen resinas
acrílicas, ceras, alcoholes alifáticos superiores, ácido poliláctico
y poliglicólico y determinados derivados de celulosa, tales como
hidroxipropilmeti-celulosa. Además, la liberación
controlada se puede efectuar utilizando otras matrices polímeras,
liposomas y/o microesferas.
\global\parskip0.930000\baselineskip
Las composiciones anteriores se pueden
administrar de una manera compatible con la formulación de
dosificación y en una cantidad tal que sea farmacéuticamente eficaz.
La dosis administrada a un paciente, en el contexto de la presente
invención, debería ser suficiente para influir en una respuesta
beneficiosa en un paciente a lo largo de un periodo de tiempo
apropiado. La cantidad de agente o agentes a administrar dependerá
del sujeto a tratar, incluida la edad, el sexo, el peso y estado
general de salud del mismo, factores que dependerán del juicio del
médico.
Con el fin de que la presente memoria
descriptiva sea comprendida más fácilmente y puesta en práctica, se
remite a la persona experta a los siguientes ejemplos no
limitantes.
Ratones fueron trasplantados de acuerdo con un
protocolo convencional según se describe en Hill et al.,
1997, Blood, 90, 3204-3213, y Hill et al.,
1999, J. Clin. Invest., 104, 459-467. El día 0,
ratones B6D2F1 recibieron una irradiación corporal total (TBI -
siglas en inglés, fuente de 137Cs) en dos dosis separadas por tres
horas para minimizar la toxicidad gastrointestinal. 5 x 10^{6}
células de la médula ósea y 2 x 10^{6} células T donantes
esplénicas purificadas con lana de nilón, procedentes de ratones B6
(alogénicos) o ratones B6D2F1 (singenéicos) se resuspendieron en
0,25 ml de medio L-15 de Leibovitz y se inyectaron
por vía intravenosa en los receptores irradiados.
Células
XL-1-Blue de E. coli se
transformaron con cpn 10 utilizando el vector de expresión pPL550 y
se desarrollaron a 37ºC. Se indujo a las células en desarrollo
exponencial que expresaran las proteínas mediante un incremento en
la temperatura hasta 42ºC durante 4 h. Las células se sedimentaron,
se resuspendieron en 30 ml de TrisHCl 0,025 M pH 8,0 y se
almacenaron a -30ºC.
Se descongeló un sedimento de células procedente
de un cultivo de 1 L, las células se Usaron con lisozima (100
\mug/ml; 15 min a 37ºC), seguido de tratamiento mediante
ultrasonidos (5 x 10 s, 4ºC) y el desecho celular se separó mediante
centrifugación (30 min, 4ºC, 48 384 x g).
La cpn 10 se purificó del lisado clarificado
mediante intercambio de iones y cromatografía de interacción
hidrofóbica. La proteína se identificó en fracciones de la columna
como una banda de \sim 10 kDa utilizando SDS-PAGE
en geles de Tris-tricina al 10-20%
(100 x 100 x 1 mm, Novex).
El lisado se aplicó a una columna de 200 ml de
Macroprep HighQ (BIO-RAD) utilizando TrisHCl 0,025 M
pH 8,0 como tampón de corrida a un caudal de 8 ml/min. La fracción
no ligada se retuvo y el pH se ajustó a 6,8. La muestra se aplicó a
un cartucho EconoPac S de 5 ml (BIO-RAD) utilizando
tampón fosfato de sodio 0,025 M pH 6,8 como tampón de corrida a un
caudal de 2 ml/min. La columna se eluyó con un gradiente de NaCl 0
\rightarrow 1 M en tampón fosfato de sodio 0,025 M pH 6,8,
aplicado a lo largo de 30 min a razón de 2 ml/min.
Las fracciones con contenido en cpn 10 se
agruparon y se añadió un volumen igual de
(NH_{4})_{2}SO_{4} 3 M en tampón fosfato de sodio 0,05
M, pH 6,8. La muestra se aplicó a un cartucho de intercambio iónico
de alta capacidad HIC EconoPac Methyl de 5 ml utilizando
(NH_{4})_{2}SO_{4} 1,5 M en tampón fosfato de sodio
0,05 M, pH 6,8 como tampón de corrida a un caudal de 2 ml/min. La
columna se eluyó con un gradiente de (NH_{4})_{2}SO_{4}
1,5 \rightarrow 0 M en tampón fosfato de sodio 0,05 M, pH 6,8
aplicado a lo largo de 15 min a razón de 2 ml/min.
Las fracciones que contenían cpn 10 se
agruparon, dializaron frente a solución salina durante una noche, se
dispensaron en partes alícuotas apropiadas y se almacenaron a
-30ºC.
Cpn 10 humana recombinante se diluyó en PBS
antes de la inyección. A ratones se les inyectó por vía subcutánea
cpn 10 cada día (10 \mug/dosis ó 100 \mug/dosis) antes o después
del BMT, según se describe. Ratones procedentes de los grupos
control recibieron solamente inyección de diluyente.
El grado de GVHD sistémica se evaluó mediante
supervivencia y mediante un sistema de puntuación que suma los
cambios en cinco parámetros clínicos: pérdida de peso, postura
(joroba), actividad, textura del pelaje e integridad de la piel
(Indice máximo = 10) (Cooke et al., 1996, Blood, 88,
3230-3239; Hill et al., 1999, J. Clin.
Invest., 104 459-467). A ratones individuales se les
etiquetó la oreja y se les clasificó semanalmente de 0 a 2 para cada
criterio. Animales con una GVHD clínica grave (puntuaciones > 6)
fueron sacrificados de acuerdo con las directrices éticas, y se
consideró el día de la muerte como el día siguiente.
Se representaron curvas de supervivencia
utilizando las estimaciones de Kaplan-Meier y se
compararon mediante análisis de log-rango. Se
utilizó el test de Mann Whitney-U para el análisis
estadístico de las puntuaciones clínicas. P < 0,05 fue
considerado estadísticamente diferente.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se llevaron a cabo experimentos in vitro
para determinar el efecto de cpn 10 en una población de células
fisiológicas.
Ratones C57BL/6 hembras (B6,
H-2^{b}, Ly-5.2^{+}), B6
Ptprc^{a} Ly-5^{a} (H-2^{b},
Ly-5.1^{+}) y B6D2F1 (H-2^{b/d},
Ly-5.2^{+}) se adquirieron del Australian Research
Centre (Perth, Australia del Oeste, Australia). Ratones C57BL/6
IL-10^{-/-} (B6, H-2^{b},
Ly-5.2^{+}) fueron suministrados por la
Universidad Nacional de Australia (Canberra, Australia). La edad de
los ratones utilizados como receptores del trasplante oscilaba entre
8 y 14 semanas. Los ratones se alojaron en jaulas
micro-aislantes esterilizadas y recibieron agua en
autoclave acidificada (pH 2,5) y pienso normal durante las dos
primeras semanas post-trasplante.
Se realizó un trasplante a ratones de acuerdo
con un protocolo convencional (Hill et al., 1997, véase
antes). En síntesis, el día 1, ratones B6D2F1 recibieron una
radiación corporal total de 1300 cGy (fuente de ^{137}Cs a razón
de 108 cGy/min), dividida en dos dosis separadas por 3 horas para
minimizar la toxicidad gastrointestinal. Células de la médula ósea
del donante (5 x 10^{6} por animal) y células T esplénicas (3 x
10^{6} por animal) se resuspendieron en 0,25 ml de medio
L-15 de Leibovitiz (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) y
se inyectaron por vía intravenosa en los receptores. La
supervivencia se vigiló diariamente y las puntuaciones clínicas de
la GVHD se midieron semanalmente. Cpn 10 o diluyente control se
inyectó por vía subcutánea a dosis de 100 \mug por animal. El
grado de GVHD sistémica se evaluó según se describe antes.
Los medios de cultivo utilizados a lo largo del
experimento eran FCS al 10%/IMDM (JRH Biosciences, Lenexa, KS)
suplementado con 50 unidades/ml de penicilina, 50 \mug/ml de
estreptomicina, L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio
1 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM,
\beta-mercaptoetanol 0,02 mM y HEPES 10 mM. Los
experimentos se realizaron a pH 7,75 y a 37ºC en una incubadora
humidificada, suplementada con 5% de CO_{2}.
Para los experimentos de estimulación de LPS
in vitro, macrófagos o esplenocitos peritoneales se
estimularon con concentraciones clasificadas de LPS, TNF\alpha e
IL-10 determinadas en sobrenadantes de cultivo a las
5 horas y 48 horas, respectivamente. Para los experimentos de
alo-antígenos in vitro, células T C57BL/6
purificadas se cultivaron en placas de 96 pocillos (Becton
Dickinson, Franklin Lakes, NJ) con 10^{5} macrófagos peritoneales
B6D2F1 irradiados (2000 cGy) (MLC primario) y los sobrenadantes se
recolectaron a las 72 horas. Después, los cultivos se pulsaron con
^{3}H-timidina (1 \muCi por pocillo) y la
proliferación se determinó 16 h más tarde en un lector 1205
Betaplate (Wallac, Turku, Finlandia). Para la estimulación de
mitógenos in vitro células T C57BL/6 purificadas se
cultivaron en placas de 96 pocillos de fondo plano,
pre-revestidas con CD3 y CD28 monoclonales a unas
concentraciones finales de 10 \mug/ml. Los sobrenadantes se
recolectaron a las 48 horas y se pulsaron con
^{3}H-timidina (1 \muCi por pocillo). La
proliferación se determinó 16 h más tarde.
Los anticuerpos utilizados en los ensayos de
IFN\gamma, IL-10, IL-4 y
TNF\alpha se adquirieron de PharMingen (San Diego, CA) y los
ensayos se realizaron de acuerdo con el protocolo del fabricante. En
síntesis, se diluyeron muestras a razón de 1:3 a 1:24 y las
citoquinas se capturaron mediante anticuerpo monoclonal (mAb)
primario especifico y se detectaron mediante mAbs secundarios
marcados con biotina. Los ensayos marcados con biotina se
desarrollaron con estreptavidina y sustrato (Kirkegaard y Perry
Laboratories, Gaithersburg, MD). Las placas se leyeron a 450 nm
utilizando el lector de microplacas Spectraflour Plus (Tecan,
Durham, NC). Se utilizaron citoquinas recombinantes (PharMingen)
como patrones para los ensayos ELISA. Las muestras y los patrones se
desarrollaron por duplicado, y la sensibilidad de los ensayos era
0,063 U/ml para IFN\gamma y 15 pg/ml para IL-10,
IL-4 y TNF\alpha.
La administración in vivo de cpn 10
redujo la capacidad de macrófagos peritoneales de producir
TNF\alpha (Fig. 2A). Ratones B6 (n=3) fueron tratados durante 5
días con cpn 10 (100 \mug, una vez al día) (cpn 10+) o diluyente
control (cpn 10-). Los macrófagos peritoneales se recolectaron
mediante lavado peritoneal el día 6 y se agruparon en el grupo de
tratamiento a partir de animales individuales. Las células se
extendieron en placas a razón de 2 x 10^{5}/pocillo en ausencia
(no mostrada) o presencia de LPS (1 \mug/ml). Los sobrenadantes
del cultivo se recolectaron a las 5 horas y los niveles de
TNF\alpha (pg/ml) se evaluaron mediante ELISA. Los resultados se
normalizan a la producción por cada 10^{5} macrófagos, basado en
la tinción con CD11b. La Fig 2A muestra datos de dos experimentos
idénticos. La secreción inducida por LPS de TNF\alpha se redujo en
un 40% a partir de estas células.
\newpage
El tratamiento in vivo con cpn 10 aumentó
la producción de IL-10 a partir de esplenocitos
(Fig. 2B). Ratones B6 fueron tratados con cpn 10 o diluyente control
según se describe antes. Los esplenocitos se recolectaron el día 6 y
se agruparon en un grupo de tratamiento a partir de animales
individuales antes del cultivo a razón de 5 x 10^{5}/pocillo en
ausencia (no mostrada) o presencia de LPS (10 \mug/ml). Los
sobrenadantes del cultivo se recolectaron a las 48 horas y los
niveles de IL-10 (pg/ml) se determinaron mediante
ELISA. Los datos procedentes de dos experimentos idénticos se
muestran en la Fig. 2B. En comparación con animales control se
observó una producción significativamente incrementada de
IL-10.
El tratamiento in vivo con cpn 10 indujo
la producción de TNF\alpha a partir de macrófagos peritoneales
IL10^{-/-} (Fig. 2C). Ratones B6 IL10^{-/-} fueron tratados con
cpn 10 o diluyente control y los macrófagos peritoneales se
recolectaron mediante lavado peritoneal el día 6 y se agruparon en
el grupo de tratamiento a partir de animales individuales. Después
de 5 horas de cultivo en ausencia (LPS 0) o presencia LPS (0,1, 1 y
10 \mug/ml) se determinó la cantidad de TNF\alpha en los
sobrenadantes del cultivo. La reducción en la producción de
TNF\alpha inducida por LPS, mediada por cpn 10 (Fig. 2A), no
requiere IL-10, dado que se observaron reducciones
similares en la secreción de TNF\alpha cuando macrófagos
peritoneales procedentes de ratones IL-10^{-/-}
tratados con cpn 10 fueron estimulados con LPS in vitro. Así,
la secreción reducida de TNF\alpha y la producción incrementada de
IL-10 parecen ser consecuencias independientes del
tratamiento con cpn 10.
El tratamiento con cpn 10 no parecía afectar a
la secreción de IFN\gamma o IL-4 de células T.
Informes previos han sugerido que cpn 10 puede inhibir la
proliferación de células T en respuesta a mitógenos (Morton H. 1998
Immunol. Cell Biol., 76, 483-496). Respuestas
inmunes de Th1 se caracterizan, habitualmente, por citoquinas
pro-inflamatorias tales como TNF\alpha e
IFN\gamma. Las respuestas de Th2 implican una secreción de
IL-4 e IL-10, y las respuestas de
células T reguladores (Treg) se caracterizan por una producción de
IL-10 y TGF\beta. Dado que las respuestas de Th2 y
Treg suprimen la proliferación y las respuestas de Th1 suprimen la
producción de citoquinas, se investigó la capacidad de cpn 10 de
influir en la diferenciación de células T.
La administración in vivo de cpn 10 no
afectó a la respuesta proliferativa de linfocitos T a aloantígenos
(Fig. 2D). Ratones B6 (n=3) fueron tratados con inyecciones diarias
de cpn 10 o diluyente control. Las poblaciones de células T
derivadas de esplenocitos fueron estimuladas in vitro con
esplenocitos alogénicos durante 7 días en un cultivo mixto de
linfocitos (MLC - siglas en inglés). Células T purificadas (0,5 x
10^{5}, 1 x 10^{5} y 2 x 10^{5}/pocillo) fueron estimuladas
con macrófagos peritoneales B6D2F1 alogénicos irradiados (0,5 x
10^{5}/pocillo) y la proliferación se midió a las 72 horas a
través del ensayo de incorporación de
^{3}[H]-timidina estándar. Los valores
registrados en la Fig. 2D representan la media \pm SE (error
típico) de pocillos por triplicado. La proliferación de células T
dentro de estos CMLs no difería significativamente entre animales
tratados con cpn 10 y control, lo que indica que cpn 10 no es un
regulador del crecimiento de células T.
Las Figs 2E-G muestran los
efectos de la administración in vivo de cpn 10 sobre la
diferenciación de células T. Animales B6 fueron tratados in
vivo con cpn 10 según se describe antes. Células T (2 x
10^{6}/pocillo) procedentes de animales tratados con cpn 10 y
tratados con vehículo se estimularon en el cultivo durante 7 días
con esplenocitos B6D2F1 alogénicos irradiados (3 x 10^{6}/pocillo)
(cultivo mixto de linfocitos primarios). El día 7 se recogieron
células T y se re-estimularon con anticuerpos unidos
a la placa contra CD3 y CD28 que estimulan células T. Los
sobrenadantes del cultivo se recolectaron a las 24 horas y se
determinaron mediante ELISA las concentraciones de IFN\gamma,
IL-4 e IL-10. Los valores de la
concentración en las Figs 4E-G representan la media
\pm SE por triplicado.
Ni la secreción de IL-4 en
células T (Fig 2E) ni la secreción de IFN\gamma (Fig. 2F) diferían
de manera significativa entre animales tratados con cpn 10 y
animales control, sugiriendo que cpn 10 no influye en el equilibrio
de Th1/Th2.
En contraposición, la secreción de
IL-10 en células T se habla elevado
significativamente (Fig. 2G). También se observó una elevación
similar en la secreción de IL-10 cuando el
tratamiento con cpn 10 se llevó a cabo in vitro durante el
cultivo de células (MLC) más que in vivo, y la proliferación,
IFN\gamma e IL-4 no se vieron de nuevo afectadas
(datos no mostrados). Estos datos indican que cpn 10 puede reforzar
la producción de IL-10 en respuesta a la
estimulación con LPS y aloantígeno, y sugiere que la producción de
IL-10 reforzada por cpn 10 puede ser debida, en
parte, a IL-10 derivada de células T.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevaron a cabo experimentos in vivo
para investigar si la administración de cpn 10 en el periodo
pre-trasplante podía prevenir la GVHD.
Células de la médula ósea (5 x 10^{6}/animal)
y células T purificadas (descritas anteriormente) procedentes de
ratones B6 donantes fueron trasplantadas en ratones receptores
B6D2F1 (grupos alogeneicos) letalmente irradiados (1100 cGy). Los
receptores B6D2F1 en el grupo control singeneico recibieron dosis
iguales de médula ósea de B6D2F1 y células T. En el periodo
post-trasplante (días 0 a 21) se inyectó a los
animales, por vía subcutánea, vehículo (grupo singenéico, n = 8 y
grupo control alogenéico, n = 10) o cpn10 (10 y 100
\mug/animal/día: cpn10 10 \mug/día alogenéico, n = 10 y cpn10
100 \mug/día alogenéico n = 10). Se determinaron las puntuaciones
clínicas de la GVHD (según se describe antes) como una medida de la
gravedad de la GVHD en los animales supervivientes. Se observó una
GVHD clínicamente más leve los días 14 y 21 en animales alogenéicos
a los que se inyectaron 100 \mug/día de cpn10, en comparación con
los control alogenéicos tratados con vehículo (**p < 0,01). No
hubo diferencia significativa alguna en el porcentaje de
supervivencia entre grupos alogenéicos inyectados con vehículo e
inyectados con cpn10. La Fig. 3 muestra las curvas de supervivencia
de ratones mediante análisis de Kaplan-Meier.
La administración de cpn10 después del
trasplante de médula ósea (BMT) fracasó en prevenir la mortalidad
por GVHD y solamente redujo brevemente la morbidez según se
determina mediante puntuaciones clínicas de la GVHD (Fig. 3B). Se
observó una GVHD clínicamente más leve el día 14 y el día 21 en
animales alogenéicos a los que se inyectaron 100 \mug/día de cpn10
en comparación con el control alogenéico tratado con vehículo (**p
< 0,01).
Ratones B6D2F1 receptores y B6 donantes fueron
tratados durante 5 días pre-trasplante con cpn10
(100 \mug/día/vía subcutánea) o diluyente control. Células de la
médula ósea (5 x 106/animal) y células T (3 x 10^{6}/animal)
recolectadas el día 6 de ratones donantes B6 fueron trasplantadas en
receptores B6D2F1 letalmente irradiados. Se formaron cinco grupos de
receptores:
Grupo 1: control singenéico (n=8) representaba a
B6D2F1 trasplantados con células de la médula ósea de B6D2F1
singenéicas y células T.
Grupo 2: el control alogenéico (n= 10) consistía
en receptores B6D2F1 pre-tratados con diluyente, a
los que se trasplantaron células procedentes de donantes B6
pre-tratados con diluyente.
Grupo 3: ratones pre-tratados
con receptores alogenéicos (n =10) y ratones B6D2F1 receptores
fueron tratados pre-trasplante con cpn10 y se les
trasplantaron células donantes B6 pre-tratadas con
vehículo.
Grupo 4: ratones B6D2F1 receptores
pre-tratados con diluyente solamente que recibieron
el trasplante de donantes B6 pre-tratados con cpn10
(donante alogénico pre-tratado n = 10).
Grupo 5: tanto ratones receptores B6D2F1 como
ratones donantes B6 fueron pre-tratados con cpn10
antes del trasplante (receptor alogenéico y
pre-tratado con donante, n= 10).
Las puntuaciones clínicas de la GVHD según se
describe antes se determinaron como una medida de la gravedad de la
GVHD en los animales supervivientes.
Se observaron puntuaciones clínicas
significativamente menores el día 7 en el grupo 5 (tanto receptores
como donantes pre-tratados con cpn10 antes del
trasplante), en comparación con el grupo control alogenéico (Fig 4B;
***p< 0,001). La Fig.4 muestra las curvas de supervivencia de
ratones mediante análisis de Kaplan-Meier.
La administración de cpn10 a donantes y
receptores del trasplante durante 5 días antes del trasplante
retardó significativamente la mortalidad por GVHD (*P < 0,01
frente al control alogenéico). Además, la gravedad de la GVHD, según
se determina por la puntuación clínica, también se redujo en una
fase temprana después de la BMT. La capacidad de cpn10 por demorar
la mortalidad de GVHD cuando se administraba antes a BMT es
consistente con el efecto anti-inflamatorio descrito
en esta memoria, es decir una limitación de la producción de
TNF\alpha (Hill et al., 1998, J. Clin. Invest., 102,
115-123; Hill et al., 1997, véase antes). El
fracaso de la administración de cpn10 después de BMT para prevenir
el desarrollo de la GVHD es consistente con una ausencia del efecto
sobre la activación de células T y diferenciación a las dosis y la
planificación utilizada en este Ejemplo, según se caracterizó en la
Fig. 3.
El acondicionamiento del trasplante (irradiación
letal) en estos modelos establece un proceso de la lesión del tracto
gastrointestinal (GI) progresiva, una fuga de LPS y una generación
de citoquinas inflamatorias que, a su vez, induce una lesión
adicional del tracto GI y, de esta forma, el proceso continúa en
forma de un bucle de retroalimentación positivo. El proceso se puede
interrumpir mediante agentes farmacológicos que protegen al
intestino de una lesión por radiación (tal como
IL-11 y el factor de crecimiento de queratinocitos;
Krijanovski et al., 1999, Blood, 94,
825-831), dirigen antagonistas de LPS (Cooke et
al., 2001, J. Clin. Invest., 107, 1581-1589) o
inhibidores de TNF\alpha propiamente dichos (Hill et al.,
1997, véase antes). Sin embargo, estos agentes tienden a demorar más
que a prevenir la GVHD, a menos que se neutralice por completo
TNF\alpha o que existan efectos adicionales sobre la activación y
diferenciación de células T. Así, la demora en la mortalidad por
GVHD mediante la administración de cpn10 es consistente con una
limitación de la señalización de LPS y de la subsiguiente producción
de TNF\alpha en una fase temprana después de BMT, pero también un
fracaso de impactar sobre la función de células T alorreactiva
subsiguiente.
Por lo tanto, cpn10 tiene el potencial de
convertirse en un importante fármaco terapéutico en el tratamiento
de la GVHD. La eficacia incrementada en el tratamiento de la GVHD
observada cuando se administra cpn10 tanto a donantes como a
receptores antes del proceso de trasplante es consistente con el
hecho de que TNF\alpha procede de fuentes tanto de tejido como de
órganos en el periodo de post-trasplante (Cooke
et al., 2000, J. Immunol., 165, 6612-6619;
Speiser et al., 1997, J. Immunol. 158,
5185-5190).
Además, cpn10 puede ser útil en el tratamiento
de la GVHD en combinación con agentes inmunosupresores tradicionales
que limitan la respuesta inmune adaptiva secundaria.
A lo largo de la memoria descriptiva, el
objetivo ha sido describir las realizaciones preferidas, sin limitar
la memoria descriptiva a una realización cualquiera o colección
especifica de características. Por lo tanto, se apreciará por parte
de los expertos en la técnica que, a la vista de la presente
descripción, se pueden realizar diversas modificaciones y cambios en
las realizaciones particulares ejemplificadas, sin apartarse del
alcance de la memoria descriptiva.
Claims (4)
1. Una composición farmacéutica que comprende:
una cantidad farmacéuticamente eficaz de chaperonina 10 con la
secuencia de aminoácidos recogida en SEQ ID NO:1, y un vehículo,
excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.
2. La composición farmacéutica de la
reivindicación 1, que comprende, además, al menos otro agente
inmunosupresor.
3. La composición farmacéutica de la
reivindicación 2, en la que el otro agente inmunosupresor se
selecciona del grupo que consiste en ciclosporina, tacrolimus,
sirolimus, micofenolato de mofetilo y metotrexato.
4. Un polipéptido aislado que contiene la
secuencia de aminoácidos recogida en SEQ ID NO:1.
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