PT1569679E - Imunossupressão com chaperonina 10 - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "IMUNOSSUPRESSÃO COM CHAPERONINA 10"

DOMÍNIO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo: uma quantidade farmaceuticamente eficaz de chaperonina 10 com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 e um transportador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.

CONTEXTO DA INVENÇÃO A doença enxerto versus hospedeiro (GVHD) é um estado que se pode desenvolver quando células imunologicamente competentes foram introduzidas num indivíduo, por exemplo, durante transplantação de medula óssea ou células estaminais. A GVHD refere-se ao processo imunológico pelo qual as células transplantadas de novo montam uma resposta de rejeição contra tecido-hospedeiro. A GVHD pode desenvolver-se após a transplantação ou transfusão de tecido da medula óssea, células estaminais hematopoiéticas, produtos sanguíneos não irradiados e órgãos sólidos contendo tecido linfóide. Há dois tipos de GVHD, agudo e crónico. A GVHD aguda desenvolve-se nos primeiros três meses após a transplantação, e sintomas clínicos incluem dermatite, enterite e hepatite. A GVHD crónica desenvolve-se habitualmente três meses após a transplantação e é uma síndroma autoimune que afecta múltiplos órgãos e tecidos, como a pele, tracto GI e fígado. 2 Células T dadoras são responsáveis pelo desencadeamento do desenvolvimento de GVHD. Células T dadoras reconhecem os antigenes de células-hospedeiro como estranhos e respondem por proliferação e libertação de citoquinas, que, por sua vez, podem activar células do sistema imunológico inato. A transplantação de medula óssea ou transplantação de células hematopoiéticas alogeneicas continua a ser a terapia curativa mais eficaz para o tratamento de malignidades hematológicas, como leucemia, mieloma, linfoma e anemia aplástica. A GVHD aguda grave é a causa principal de mortalidade e morbidez durante transplantação de medula óssea. A GVHD crónica também pode conduzir à morte, e os sobreviventes ficam muitas vezes gravemente incapacitados.

Os fármacos imunossupressores desempenham um grande papel na prevenção, tratamento terapêutico e gestão de GVHD aguda e crónica. Os fármacos podem ser administrados ao paciente antes e após o transplante. Fármacos correntes usados no tratamento terapêutico de GVHD incluem ciclosporina, metotrexato, tacrolimus, sacrolimus, micofenolato de mofetil e esteróides. Os regimes de imunossupressão envolvem muitas vezes a administração de uma combinação de fármacos para se obter um efeito máximo. A chaperonina 10 (cpnlO) está presente numa variedade de organismos, desde bactérias até humanos, e é um membro da família de proteínas de choque térmico ("chaperones") que se encontram entre as proteínas mais estáveis do ponto de vista evolutivo que existem. As moléculas de "chaperones" estão envolvidas no dobramento pós-tradução, direccionamento e reunião de outras proteínas (Hartman et 3 al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, £39_, 3394-8), mas em si mesmas não fazem parte da estrutura reunida final (Ellis et al., 1991, Annu. Rev. Biochem. 6_0, 321-47). Estas proteínas desempenham papéis essenciais em células normais, mas a sua produção é regulada de modo positivo durante "stress" celular (por exemplo, destruição metabólica, infecção, inflamação, transformação).

Foi inesperadamente descoberto que a chaperonina 10 tem a mesma sequência de aminoácidos do Factor do Início da Gravidez (EPF) (Morton et al., Publicação Internacional WO 95/15338). O EPF é uma substância associada à gravidez que aparece no soro materno num periodo de 6-24 horas da fertilização (Morton et al., 1974, Nature, 249; 459-460, e Morton et al., 1976, Proc. R. Soc. Lond., 193; 413-9). Está presente durante pelo menos a primeira metade da gravidez e é essencial para o crescimento e sobrevivência embrionários continuados (Morton et al., 1987, Current Topics in Developmental Biology 23_; 73-92) . É agora claro que o EPF tem muitas funções fisiológicas e a sua produção não está confinada à gravidez.

Foi relatado que o EPF pode actuar como imunossupressor, libertar factores supressores de linfócitos (Rolfe et al., 1988, Clin. Exp. Immunol. ]3_, 219-225) e aumentar as propriedades inibidoras de rosetas de um soro antilinfocitário imunossupressor (Morton et al., 1974 e 1976, supra) . O EPF pode suprimir a reacção de hipersensibilidade do tipo retardado ao trinitrocloro-benzeno em ratinhos (Noonan et al., 1979, Nature, 278, 649-51), suprimir a proliferação de linfócitos induzida por mitogenes (Athanasas-Platsis, 1993, tese de Doutoramento, 4

The University of Queensland) e suprimir a produção de IFN-γ por células T CD4+.

No entanto, não houve nenhuma evidência directa de o EPF ou cpnlO poderem ter potencial como agente imunossupressor em transplantação e, em particular, na prevenção de GVHD. Não foi mostrado que a chaperonina 60, uma proteina de choque térmico relacionada, que também pode actuar como imunossupressor, possua quaisquer efeitos terapêuticos em GVHD. De facto, a técnica anterior ensina que proteínas de choque térmico podem ter efeitos adversos em transplantação (Ogita et al., 2000, Transplantation, 69_, 2273-2277) . O documento WO 95/15338 divulga uma Chaperonina 10 recombinante e a sua utilização no tratamento de enxertos de pele em ratos e ratinhos in vivo, de modo a prolongar a sobrevivência dos enxertos e reduzir a rejeição dos enxertos transplantados.

Morton H et al. apresentam a utilização de cpnlO recombinante (factor do início da gravidez (EPF)) in vivo como medicamento testado em ratos pelo seu papel no prolongamento de tempos de sobrevivência de enxertos de pele alogénicos (Morton H et al., "Production of a recombinant form of early pregnancy factor that can prolong allogeneic skin graft survival time in rats". IMMUNOLOGY AND CELL BIOLOGY, volume 78, n° 6, Dezembro de 2000 (12- 2000), páginas 603-607).

OBJECTIVO DA INVENÇÃO

Os presentes inventores aperceberam-se de que os fármacos imunossupressores presentemente utilizados no tratamento 5 terapêutico e gestão de GVHD têm as seguintes desvantagens importantes: (i) induzem efeitos secundários graves, por exemplo, hipertensão que pode requerer medicação adicional para controlo, nefrotoxicidade que ocorre em até 40% dos pacientes e frequentemente força o médico a administrar doses sub-óptimas do fármaco, para limitar a toxicidade, efeitos no SNC, como tremuras, dores de cabeça, depressão, parestesia, visão enevoada e crises, risco aumentado de infecções bacterianas, fúngicas ou virais, risco aumentado de cancro, particularmente cancro da pele, perda de apetite, náuseas e crescimento aumentado de pêlos; (ii) a GVHD é resistente aos fármacos numa percentagem significativa de pacientes, sendo requerida terapia de combinação de fármacos; (iii) os fármacos são muito dispendiosos, e (iv) os fármacos demonstraram interacções adversas com outros fármacos terapêuticos, como antibióticos, NSAIDs, antiepilépticos e antifúngicos, imunizações, como contra rubéola e poliomielite, e alimentos naturais, como toranja (no caso da ciclosporina).

Em consequência, é muito necessário o desenvolvimento de um novo fármaco para tratar e gerir GVHD com menos efeitos secundários efeitos secundários do que os tratamentos correntemente disponíveis e que seja mais eficaz em pacientes que exibem resistência aos fármacos presentemente comercializados. 6

Os presentes inventores descobriram inesperadamente que a cpnlO possui enorme potencial clinico como nova terapia no tratamento e gestão de GVHD.

RESUMO DA INVENÇÃO E descrita aqui a utilização de cpnlO em transplantação e, em particular, no tratamento e/ou prevenção de doença de enxerto versus hospedeiro.

Também é descrita a administração de cpnlO a um animal dador e/ou receptor, ou a células, tecidos ou órgãos derivados do dador, bem como o tratamento do animal dador e do receptor.

Em consequência, num primeiro aspecto, um método de tratamento terapêutico ou profiláctico de doença de enxerto versus hospedeiro (GVHD) inclui os passos seguintes: (i) administrar uma quantidade farmaceuticamente eficaz de chaperonina 10 (cpnlO), ou um derivado da cpnlO, a um animal dador ou célula, órgão ou tecido dele obtido, e (ii) administrar a um animal receptor uma quantidade farmaceuticamente eficaz de cpnlO, ou derivado da cpnlO, para desse modo retardar, melhorar, suprimir ou então reduzir um ou mais sintomas de GVHD após transplantação da uma ou mais células, tecidos ou órgãos para o animal receptor.

Preferivelmente, a quantidade farmaceuticamente eficaz de cpnlO, ou um derivado da cpnlO, é administrada a um animal receptor antes e após o passo (ii). 7

Preferivelmente, a quantidade farmaceuticamente eficaz de cpnlO, ou um derivado da cpnlO, administrada a um animal situa-se no intervalo de 0,1-100 mg por kg/peso do corpo. Mais preferivelmente, situa-se no intervalo de 0,1-10 mg por kg/peso do corpo.

Preferivelmente, o animal é um mamifero.

Preferivelmente, o mamifero é um humano.

Adequadamente, a célula, tecido ou órgão consiste em medula óssea ou é derivado de medula óssea.

Adequadamente, o método de tratamento terapêutico ou profiláctico de GVHD também inclui o passo de administrar a esse animal dador e/ou a esse animal receptor pelo menos outro agente imunossupressor seleccionado do grupo que consiste em ciclosporina, tacrolimus, sirolimus, micofenolato de mofetil e metotrexato.

Adequadamente, o método de tratamento terapêutico ou profiláctico de GVHD também inclui o passo de administrar um esteróide a esse animal dador e/ou a esse animal receptor.

Num segundo aspecto, um método para inibir, suprimir ou então reduzir a produção de TNFa num animal inclui o passo de administrar a esse animal uma quantidade farmaceuticamente eficaz de cpnlO, ou derivado da cpnlO, para assim inibir, suprimir ou então reduzir a produção de TNFa no referido mamífero.

Preferivelmente, o animal é um mamífero. 8

Preferivelmente, o mamífero é um humano.

De acordo com este aspecto, também é descrito um método para inibir, suprimir ou então reduzir a produção de TNFa por uma ou mais células, tecidos ou órgãos obtidos de um animal, que inclui o passo de administrar a essas células, tecidos ou órgãos uma quantidade farmaceuticamente eficaz de cpnlO, ou derivado da cpnlO, para assim inibir a produção de TNFa pelo referido animal.

Num terceiro aspecto, é descrito aqui um método para induzir, ampliar ou então aumentar a produção de IL-10 num animal, que inclui o passo de administrar ao referido animal uma quantidade farmaceuticamente eficaz de cpnlO, ou derivado da cpnlO, para assim induzir, ampliar ou então aumentar a produção de IL-10 nesse animal.

Preferivelmente, o animal é um mamífero.

Preferivelmente, o mamífero é um humano.

De acordo com este aspecto, um método para induzir, ampliar ou então aumentar a produção de TNFa por uma ou mais células, tecidos ou órgãos obtidos de um animal inclui o passo de administrar a essas células, tecidos ou órgãos uma quantidade farmaceuticamente eficaz de cpnlO, ou derivado da cpnlO, para assim induzir a produção de IL-10 por esse animal. A presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade farmaceuticamente eficaz de chaperonina 10 (cpnlO) com a sequência de aminoácidos 9 apresentada na SEQ ID NO: 1 e um transportador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável. 0 pelo menos um outro agente imunossupressor é um fármaco imunossupressor ou um anticorpo especifico dirigido contra linfócitos B ou T, ou receptores da superfície que medeiam a sua activação.

Preferivelmente, o fármaco imunossupressor é qualquer um de entre ciclosporina, tacrolimus, sirolimus, micofenolato de mofetil e metotrexato.

Noutro aspecto é descrita uma composição farmacêutica do quarto aspecto que também compreende um esteróide.

Preferivelmente, essa proteína cpnlO tem uma sequência de aminoácidos apresentada na FIG. 1 (SEQ ID NO: 1).

Ao longo desta especificação, "compreendem", "compreende" e "compreendendo" são usados de modo inclusivo e não exclusivo, entendendo-se que implicam a inclusão de um inteiro ou grupo de inteiros relatados mas não a exclusão de qualquer outro inteiro ou grupo de inteiros.

DESCRIÇÃO BREVE DAS FIGURAS

FIG. 1: A sequência de aminoácidos da proteína cpnlO (SEQ ID NO: 1). FIG. 2: 0 efeito do tratamento com cpnlO in vivo em respostas pró-inflamatórias induzidas por LPS e aloantigenes de macrófagos peritoneais de ratinhos e na diferenciação de células T. 10 FIG. 3: Sobrevivência de ratinhos após transplantação de medula óssea e tratamento pós-transplante com cpnlO. No periodo pós-transplante (dia 0 até 21), os animais foram injectados subcutaneamente com veiculo (singeneico, n=8, e grupo de controlo alogeneico, n=10) ou cpnlO (10 e 100 pg/animal/dia: cpnlO 10 pg/dia alogeneico, n=10, e cpnlO 100 pg/dia alogeneico, n=10). B. Pontuações clinicas de GVHD em ratinhos representadas graficamente ao longo do tempo (0-45 dias; **P <0,01) . FIG. 4: Sobrevivência de ratinhos após transplantação de medula óssea e tratamento pré-transplante com cpnlO. Ratinhos receptores e dadores foram tratados durante 5 dias pré-transplante com injecções subcutâneas de cpnlO (100 pg/dia) ou diluente de controlo. Formaram-se então cinco grupos de animais: Grupo 1: Controlo singeneico (n=8) representou B6D2F1 transplantado com medula óssea B6D2F1 e células T singeneicas; Grupo 2: Controlo alogeneico (n=10) consistiu em receptores B6D2F1 pré-tratados com diluente transplantados com células de dadores B6 pré-tratados com diluente; Grupo 3: Receptor alogeneico pré-tratado (n=10), ratinhos B6D2F1 receptores foram tratados pré-transplante com cpnlO e foram transplantados com células dadoras B6 pré-tratadas com veiculo; Grupo 4: Ratinhos B6D2F1 receptores pré-tratados apenas com diluente que receberam transplante de dadores B6 pré-tratados com cpnlO (alogeneico: dador pré- 11 tratado, n=10), e Grupo 5: Ratinhos receptores B6D2F1 e dadores B6 foram pré-tratados com cpnlO antes da transplantação (alogeneico: receptor e dador pré-tratados, n=10). (*P <0,01 versus controlo alogeneico.) B. Pontuações clinicas de GVHD em ratinhos representadas graficamente ao longo do tempo (0-30 dias; ***p <0,001).

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA

Os inventores demonstraram que a cpnlO tem actividade imunossupressora significativa num modelo de transplantação de ratinho in vivo e que o tratamento com cpnlO aumenta a taxa de sobrevivência de ratinhos que sofrem de GVHD. Esta é a primeira demonstração dos efeitos imunossupressores benéficos da cpnlO e taxas de sobrevivência aumentadas num modelo de GVHD in vivo. A eficácia do tratamento com cpnlO é aumentada se ambos os animais dador e receptor forem tratados com cpnlO antes do procedimento de transplantação. Também é demonstrado que a cpnlO inibe a secreção de TNFa mediada por lipopolissacárido e promove a produção de IL-10 em macrófagos de ratinho. A IL-10 é uma citoquina imunossupressora potente que é um inibidor poderoso de respostas imunológicas adaptáveis e inatas a LPS. A GVHD aguda após transplantação de medula óssea (BMT) alogeneica é uma doença mediada por células T na qual células T dadoras reconhecem antigenes dispares do hospedeiro e diferenciam-se de um modo dominante Thl. As citoquinas Thl resultantes derivadas de células T induzem células mononucleares dadoras que libertam quantidades 12 citopáticas de citoquinas inflamatórias (por exemplo, TNFa) quando entram em contacto com lipopolissacárido (LPS). 0 LPS sofre fugas através da mucosa gastrointestinal que está danificada pela GVHD e pela radiação precedente. Em consequência, o TNFa, em conjunto com a produção desregulada de citoquinas citotóxicas, induz apoptose em tecido-hospedeiro. A mortalidade devida a GVHD em modelos de BMT é prevenida por imunossupressão dirigida a células T, particularmente por agentes que inibem a geração de IL-2. A presente divulgação é exemplificada relativamente a transplantação de medula óssea. No entanto, será apreciado que o conceito é aplicável a outras células, tecidos e órgãos que incluem células imunocompetentes capazes de iniciar uma resposta imunológica no hospedeiro. Exemplos não limitadores dessas células, tecidos e órgãos incluem figado, pulmão, coração, rim e células estaminais e progenitoras. A divulgação descrita aqui pode ser amplamente aplicável a qualquer animal, mas é particularmente dirigida a mamíferos e preferivelmente humanos. Por exemplo, pode ser dirigida a uma transplantação em gado, animais domésticos, animais de laboratório e animais de competição (por exemplo, cavalos de corrida e camelos).

Para fins desta especificação, por "isolado" pretende-se significar material que foi removido do seu estado natural ou então foi sujeito a manipulação humana. 0 material isolado pode estar substancial ou essencialmente livre de componentes que normalmente o acompanham no seu estado natural, ou pode ser manipulado de modo a estar num estado 13 artificial juntamente com componentes que normalmente o acompanham no seu estado natural. Material isolado pode estar em forma nativa, de sintese quimica ou recombinante.

Por "proteína" pretende-se significar um polímero de aminoácidos. Os aminoácidos podem ser aminoácidos naturais ou não naturais, D- e L-aminoácidos, como é bem entendido na área.

Um "péptido" é uma proteína com não mais de cinquenta (50) aminoácidos.

Um "polipéptido” é uma proteína com mais de cinquenta (50) aminoácidos. O termo "ácido nucleico", tal como é usado aqui, designa mRNA, RN A, cRNA, RNAi e DNA de fi lamentação simples ou dupla, inclusive cDNA e DNA genómico.

Por "agente imunossupressor" pretende-se designar um agente que pode suprimir, de modo profiláctico ou terapêutico, uma resposta autoimune ou imunológica contra uma célula, tecido ou órgão transplantado alogeneico ou xenogeneico, ou para suprimir doença de enxerto versus hospedeiro.

Preferivelmente, a quantidade farmaceuticamente eficaz de cpnlO administrada a um indivíduo situa-se no intervalo de 0,1-100 mg.

Mais preferivelmente, a quantidade farmaceuticamente eficaz de cpnlO administrada a um indivíduo situa-se no intervalo de 0,1-10 mg. 14 0 profissional apreciará que as quantidades farmaceuticamente eficazes acima mencionadas são calculadas em termos de um ser humano tipico de 70 kg. Em conformidade, as doses podem variar, dependendo do peso, idade, sexo, estado geral de saúde e boa condição fisica do indivíduo e quaisquer outros tratamentos a que o indivíduo esteja a ser sujeito. Além disso, a quantidade de cpnlO administrada será interdependente da frequência e calendarização da administração.

Também será apreciado que as quantidades farmaceuticamente eficazes acima mencionadas de cpnlO podem ser administradas a animais, por exemplo, animais domésticos e gado. As doses irão variar, dependendo do peso e tipo de animal, como será claro para os profissionais. A cpnlO administrada a um humano ou outro animal pode ser qualquer forma de cpnlO isolada, incluindo mas não se limitando a cpnlO recombinante (SEQ ID NO: 1), cpnlO nativa, cpnlO peguilada, cpnlO-GSM recombinante ou qualquer outra proteína derivada da cpnlO.

Sequências de nucleótidos e aminoácidos adequadas da cpnlO são bem conhecidas na área, apesar de se referir, por conveniência e para o profissional, as seguintes sequências cpnlO de mamífero: (i) cpnlO humana (N° de Acesso do NCBI Entrez U07550; Chen et al., 1994, Biochim. Biophys. Acta, 1219, 189-190); (ii) cpnlO de ratinho (N° de Acesso do NCBI Entrez U09659; Dickson et al., 1994, J. Biol. Chem., 269, 26858-864), e 15 (iii) cpnlO de rato (N° de Acesso do NCBI Entrez X71429; Ryan et al., 1994, FEBS Lett., 337, 152-156) . O dador e o receptor podem ser tratados com cpnlO antes do procedimento de transplantação.

Preferivelmente, o dador é submetido a tratamento com cpnlO durante não mais do que 7 dias antes do procedimento de transplantação. Mais preferivelmente, o dador é submetido a tratamento com cpnlO durante 2 até 5 dias antes do procedimento de transplantação.

Preferivelmente, o receptor é submetido a tratamento com cpnlO durante não mais do que 7 dias antes do procedimento de transplantação e não mais do que 90 dias após o procedimento. Mais preferivelmente, o receptor é submetido a tratamento com cpnlO durante 2 até 5 dias antes do procedimento de transplantação e não mais do que 60 dias após o procedimento. Ainda mais preferivelmente, o receptor é submetido a tratamento com cpnlO durante 2 até 5 dias antes do procedimento de transplantação e 10 até 30 dias após o procedimento.

Tal como usado aqui, proteínas "derivadas" da especificação são proteínas, como proteínas cpnlO, que foram alteradas, por exemplo, por conjugação ou complexação com outras fracções químicas ou por técnicas de modificação pós-tradução, como será entendido na área, inclusive proteínas parceiras de fusão.

Outros derivados contemplados pela divulgação incluem mas não estão limitados a peguilação, modificação de cadeias 16 laterais, incorporação de aminoácidos não naturais e/ou seus derivados durante a síntese de péptidos, polipéptidos ou proteínas e a utilização de agentes de reticulação e outros métodos que impõem restrições conformacionais nos polipéptidos, fragmentos e variantes da divulgação. Exemplos de modificações de cadeias laterais contempladas pela presente divulgação incluem modificações de grupos amino, tais como por acilação com anidrido acético; acilação de grupos amino com anidrido succínico e anidrido tetra-hidroftálico; amidinação com acetimidato de metilo; carbamoílação de grupos amina com cianato; piridoxilação de lisina com piridoxal-5-fosfato seguida de redução com NaBH4; alquilação redutora por reacção com um aldeído seguida de redução com NaBH4, e trinitrobenzilação de grupos amino com ácido 2,4,6-trinitrobenzenossulfónico (TNBS) . 0 grupo carboxilo pode ser modificado por activação por carbodiimida via formação de O-acilisoureia seguida de derivatização subsequente, a título exemplificativo, numa amida correspondente. O grupo guanidina de resíduos arginina pode ser modificado por formação de produtos de condensação heterocíclicos com reagentes tais como 2,3-butanodiona, fenilglioxal e glioxal.

Grupos sulfidrilo podem ser modificados por métodos tais como oxidação de ácido perfórmico em ácido cisteico; formação de derivados mercuriais usando ácido 4-cloromercurifenilsulfónico, 4-cloromercuribenzoato; 2-cloromercuri-4-nitrofenol, cloreto de fenilmercúrio e outros compostos mercuriais; formação de dissulfuretos 17 mistos com outros compostos tiol; reacção com maleimida, anidrido maleico ou outra maleimida substituída; carboximetilação com ácido iodoacético ou iodoacetamida, e carbamoílação com cianato a pH alcalino.

Resíduos triptofano podem ser modificados, por exemplo, por alquilação do anel indolo com brometo de 2-hidroxi-5-nitrobenzilo ou haletos de sulfonilo, ou por oxidação com N-bromos succinimida.

Resíduos tirosina podem ser modificados por nitração com tetranitrometano para formar um derivado 3-nitrotirosina. 0 anel imidazolo de um resíduo histidina pode ser modificado por N-carbetoxilação com pirocarbonato de dietilo ou por alquilação com derivados do ácido iodoacético.

Exemplos de incorporação de aminoácidos não naturais e derivados durante a síntese peptídica incluem mas não estão limitados à utilização de ácido 4-aminobutírico, ácido 6-amino-hexanóico, ácido 4-amino-3-hidroxi-5-fenilpentanóico, ácido 4-amino-3-hidroxi-6-metil-heptanóico, t-butilglicina, norleucina, norvalina, fenilglicina, ornitina, sarcosina, 2-tienilalanina e/ou D-isómeros de aminoácidos.

Derivados também podem incluir parceiros de fusão e caudas de epítopos. Exemplos bem conhecidos de parceiros de fusão incluem mas não estão limitados a glutationa-S-transferase (GST), porção Fc de IgG humana, proteína de ligação a maltose (MBP) e hexa-histidina (HISô) , que são particularmente úteis para o isolamento da proteína de fusão por cromatografia de afinidade. Para a finalidade de 18 purificação de polipéptidos de fusão por cromatografia de afinidade, matrizes relevantes para cromatografia de afinidade são resinas conjugadas a glutationa, amilose e niquel ou cobalto, respectivamente. Muitas dessas matrizes estão disponíveis em forma de "estojo", como o sistema QIAexpress™ (Qiagen), útil com parceiros de fusão (HIS6), e o sistema de purificação com GST da Pharmacia.

Um exemplo particular de um parceiro de fusão é GST, como descrito em Ryan et al. (supra). Nalguns casos, os parceiros de fusão também têm sítios de clivagem de proteases, como para Factor Xa ou Trombina, que permitem que a protease relevante digira parcialmente o polipéptido de fusão da invenção e, desse modo, daí liberte o polipéptido recombinante da invenção. 0 polipéptido libertado pode então ser isolado do parceiro de fusão por separação cromatográfica subsequente. Por exemplo, por clivagem de GST-cpnlO é produzida a proteína derivada GSM-cpnlO.

Parceiros de fusão de acordo com a especificação também incluem no seu âmbito "caudas de epitopos", que habitualmente são pequenas sequências peptídicas para as quais está disponível um anticorpo específico. Exemplos bem conhecidos de caudas de epitopos para as quais estão disponíveis anticorpos monoclonais específicos estão prontamente disponíveis e incluem caudas de c-myc, hemaglutinina e FLAG.

Proteínas cpnlO da especificação (inclusive fragmentos, variantes, derivados e homólogos) podem ser preparadas por qualquer procedimento adequado conhecido dos profissionais, incluindo síntese química e expressão recombinante. 19

Preferivelmente, a cpnlO é cpnlO recombinante.

Por exemplo, a proteína cpnlO recombinante pode ser preparada por um procedimento que inclui os passos seguintes: (i) preparar uma construção de expressão que compreende um ácido nucleico isolado que codifica a cpnlO operativamente ligado a uma ou mais sequências de nucleótidos reguladoras num vector de expressão; (ii) transfectar ou transformar uma célula-hospedeiro adequada com a construção de expressão, e (iii) expressar a proteína recombinante nessa célula-hospedeiro .

Um "vector de expressão" pode ser um vector extra-cromossómico de auto-replicação, como um plasmídeo, ou um vector que é integrado no genoma de um hospedeiro.

Por "operativamente ligado" pretende-se significar que essa(s) sequência(s) de nucleótidos reguladora(s) está/estão posicionada(s), relativamente ao ácido nucleico recombinante da invenção, de modo a iniciar, regular ou então controlar a transcrição.

Sequências de nucleótidos reguladoras serão geralmente apropriadas para a célula-hospedeiro utilizada para expressão. Numerosos tipos de vectores de expressão apropriados e sequências reguladoras adequadas são conhecidos na área para uma variedade de células-hospedeiro. Tipicamente, a referida uma ou mais sequências de nucleótidos reguladoras podem incluir mas não estão 20 limitadas a sequências promotoras, sequências líder ou de sinal, sítios de ligação de ribossomas, sequências de início e terminação da transcrição, sequências de início e terminação da tradução, sequências dadoras/aceitadoras de processamento e sequências intensificadoras ou activadoras.

Promotores constitutivos ou indutíveis, como conhecidos na área, são contemplados pela invenção e incluem, por exemplo, promotores repressíveis por tetraciclina e indutíveis por metalotioneína. Os promotores podem ser promotores de ocorrência natural ou promotores híbridos que combinam elementos de mais do que um promotor.

Numa forma de realização preferida, o vector de expressão contém um gene marcador seleccionável para permitir a selecção de células-hospedeiro transformadas. Genes marcadores seleccionáveis são bem conhecidos na área e irão variar com a célula-hospedeiro utilizada. Células-hospedeiro adequadas para expressão podem ser procarióticas ou eucarióticas, como Escherichia coli (DH5a, por exemplo), células de levedura, células SF9 utilizadas com um sistema de expressão de baculovírus, células CHO, COS, CV-1 e células 293, sem limitação. A proteína cpnlO recombinante pode ser convenientemente preparada pelo profissional usando protocolos comuns como descritos, por exemplo, em Sambrook et al., "MOLECULAR CLONING. A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Press, 1989), em particular as Secções 16 e 17; "CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY" Editores Ausubel et al., (John Wiley & Sons, Inc. 1995-1999), em particular os Capítulos 10 e 16, e "CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE" Editores 21

Coligan et al., (John Wiley & Sons, Inc. 1995-1999), em particular os Capítulos 1, 5 e 6.

Um exemplo de produção e purificação de cpnlO sintética recombinante utilizando o sistema pGEX é apresentado em WO 95/15338. Um sistema de expressão bacteriano de alto rendimento que se sabe produzir cpnlO activa (Ryan et al., supra) foi utilizado para produzir a cpnlO (SEQ ID NO: 1) utilizada nas experiências descritas aqui.

Composições farmacêuticas A especificação proporciona uma utilização de cpnlO para o tratamento terapêutico de doenças ou estados clínicos causados por transplantação de células, tecidos ou órgãos, em particular GVHD. A invenção proporciona composições farmacêuticas que compreendem cpnlO com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1.

De modo adequado, a composição farmacêutica compreende um transportador, diluente ou excipiente apropriado farmaceuticamente aceitável.

De modo adequado, a composição farmacêutica compreende cpnlO, um transportador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável e pelo menos outro agente imunossupressor. Preferivelmente, o outro agente imunossupressor é um fármaco imunossupressor ou um anticorpo específico dirigido contra linfócitos B ou T, ou receptores da superfície que medeiam a sua activação. Mais preferivelmente, o agente imunossupressor é qualquer um de 22 entre ciclosporina, tacrolimus, sirolimus, micofenolato de mofetil e metotrexato. A composição farmacêutica também pode compreender um esteróide.

Por "transportador, diluente ou excípiente farmaceuticamente aceitável" pretende-se designar um agente de enchimento, diluente ou substância de encapsulação sólida ou líquida que possa ser utilizada de modo seguro em administração sistémica. Dependendo da via de administração particular, pode ser utilizada uma variedade de transportadores bem conhecidos na área. Estes transportadores podem ser seleccionados de um grupo que inclui açúcares, amidos, celulose e seus derivados, malte, gelatina, talco, sulfato de cálcio, óleos vegetais, óleos sintéticos, polióis, ácido alginico, soluções tamponadas com fosfato, emulsionantes, solução salina isotónica e sais, como sais de ácidos minerais, incluindo cloridratos, brometos e sulfatos, ácidos orgânicos, como acetatos, propionatos e malonatos, e água sem pirogénio.

Uma referência útil que descreve transportadores, diluentes e excipientes farmaceuticamente aceitáveis é "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Mack Publishing Co. N.J. E.U.A., 1991) .

Pode ser empregue qualquer via de administração segura para proporcionar a um paciente a composição da divulgação. Por exemplo, pode ser empregue a via oral, rectal, parentérica, sublingual, bucal, intravenosa, intra-articular, intramuscular, intradérmica, subcutânea, por inalação, intra-ocular, intraperitoneal, intracerebroventricular, transdérmica e afins. Injecções intramusculares e subcutâneas são apropriadas, por exemplo, para 23 administração de composições imunogénicas, vacinas e vacinas de DNA.

Formas galénicas incluem comprimidos, dispersões, suspensões, injecções, soluções, xaropes, trociscos, cápsulas, supositórios, aerossóis, emplastros transdérmicos e afins. Estas formas galénicas também podem incluir a injecção ou implantação de dispositivos de libertação controlada concebidos especificamente para esta finalidade, ou outras formas de implantes modificadas para actuarem adicionalmente deste modo. A libertação controlada do agente terapêutico pode ser efectuada revestindo-o, por exemplo, com polímeros hidrófobos, incluindo resinas acrílicas, ceras, álcoois alifáticos de cadeia longa, ácidos polilácticos e poliglicólicos e certos derivados da celulose, como hidroxipropilmetilcelulose. Adicionalmente, a libertação controlada pode ser efectuada utilizando outras matrizes poliméricas, lipossomas e/ou microesferas.

As composições acima podem ser administradas de um modo compatível com a formulação galénica e numa quantidade tal que seja farmaceuticamente eficaz. A dose administrada a um paciente, no contexto da presente invenção, deve ser suficiente para originar uma resposta benéfica num paciente durante um período de tempo apropriado. A quantidade do(s) agente(s) a ser(em) administrado(s) pode depender do sujeito a ser tratado, inclusive a sua idade, sexo, peso e estado geral de saúde, factores que dependerão da avaliação do médico.

De modo que a presente especificação possa ser mais facilmente entendida e implementada, referem-se ao profissional os seguintes exemplos não limitadores. 24

EXEMPLOS Métodos

Transplantação

Ratinhos foram transplantados de acordo com um protocolo padrão como descrito em Hill et al., 1997, Blood, 90_, 3204-3213, e Hill et al., 1999, J. Clin. Invest., 104, 459-467. No dia 0, ratinhos B6D2F1 receberam 1400 cGy de irradiação total do corpo (TBI, fonte de 137Cs) em duas doses separadas por três horas, para minimizar a toxicidade gastrointestinal. Cinco x 106 células de medula óssea e 2 x 106 células T esplénicas dadoras purificadas em lã de "nylon" de ratinhos B6 (alogénicos) ou ratinhos B6D2F1 (singeneicos) foram novamente suspensas em 0,25 mL de meio L-15 de Leibovitz e injectadas intravenosamente nos receptores irradiados.

Preparação de cpnlO recombinante Células de E. coli XLl-Blue foram transformadas com cpnlO utilizando o vector de expressão pPL550 e cresceram a 37°C. As células em crescimento exponencial foram induzidas a expressar proteína por aumento da temperatura para 42°C durante 4 horas. As células foram transformadas em grânulos, foram novamente suspensas em 30 mL de TrisHCl 0,025 M pH 8,0 e armazenadas a -30°C.

Um grânulo celular de uma cultura de 1 L foi descongelado, as células foram submetidas a lise com lisozima (100 pg/mL, 15 minutos a 37°C) seguida de sonicação (5 x 10 segundos, 25 4°C) e os detritos celulares foram removidos por centrifugação (30 minutos, 4°C, 48 384 x g). A cpnlO foi purificada do lisato clarificado por cromatografia de permuta iónica e interacção hidrófoba. A proteína foi identificada em fracções da coluna na forma de uma banda de ~10 kDa utilizando SDS-PAGE em géis de Tris-Tricina 10-20% (100 x 100 x 1 mm; Novex). 0 lisato foi aplicado numa coluna de 200 mL Macroprep HighQ (BIO-RAD) utilizando TrisHCl 0,025 M pH 8,0 como tampão de separação a uma taxa de fluxo de 8 mL/minuto. A fracção não ligada foi retida e o pH foi ajustado para 6,8. A amostra foi aplicada num cartucho de 5 mL EconoPac S (BIO-RAD) utilizando tampão de fosfato de sódio 0,025 M pH 6,8 como tampão de separação a uma taxa de fluxo de 2 mL/minuto. A coluna eluiu com um gradiente de NaCl 0 -> 1 M em tampão de fosfato de sódio 0,025 M pH 6,8, aplicado durante 30 minutos a 2 mL/minuto.

As fracções contendo cpnlO foram reunidas e adicionou-se um volume igual de (NH4)2S04 3 M em tampão de fosfato de sódio 0,05 M pH 6,8. A amostra foi aplicada num cartucho de 5 mL Econo-pac Methyl HIC, utilizando (NH4)2S04 1,5 M em tampão de fosfato de sódio 0,05 M pH 6,8 como tampão de separação, a uma taxa de fluxo de 2 mL/minuto. A coluna eluiu com um gradiente de (nh4)2S04 1,5 -> 0 M em tampão de fosfato de sódio 0,05 M pH 6,8, aplicado durante 15 minutos a 2 mL/minuto.

As fracções contendo cpnlO foram reunidas, dializadas contra solução salina durante a noite, distribuídas em alíquotas apropriadas e armazenadas a -30°C. 26

Tratamento com cpnlO

CpnlO humana recombinante foi diluída em PBS antes da injecção. Ratinhos foram injectados subcutaneamente com cpnlO diariamente (10 pg/dose ou 100 pg/dose) antes ou após BMT, como descrito. Os ratinhos dos grupos de controlo receberam injecção só de diluente.

Avaliação de GVHD O grau de GVHD sistémica foi avaliado por sobrevivência e por um sistema de pontuação que soma alterações em cinco parâmetros clínicos: perda de peso, postura (arqueada), actividade, textura do pêlo e integridade da pele (índice máximo = 10) (Cooke et al., 1996, Blood, 8_8, 3230-3239;

Hill et al., 1999, J. Clin. Invest., 104, 459-467). Os ratinhos individuais foram marcados na orelha e classificados semanalmente desde 0 até 2 para cada critério. Os animais com GVHD clínica grave (pontuações >6) foram sacrificados de acordo com directrizes éticas, e o dia da morte foi considerado o dia seguinte.

Análise estatística

As curvas de sobrevivência foram representadas graficamente utilizando estimativas de Kaplan-Meier e foram comparadas por análise de classificações logarítmicas. O Teste U de Mann Whitney foi utilizado para a análise estatística de pontuações clínicas. P <0,05 foi considerado estatisticamente diferente. 27

Exemplo 1 - Experiências com macrófagos de ratinho in vitro

Realizaram-se experiências in vitro para determinar o efeito da cpnlO numa população de células fisiológicas.

Ratinhos

Ratinhos fêmeas C57BL/6 (B6, H-2b, Ly-5.2+), B6 Ptprca Ly-5a (H-2b, Ly-5.1+) e B6D2F1 (H-2b/d, Ly-5.2 + ) foram adquiridos ao Australian Research Centre (Perth, Austrália Ocidental, Austrália). Ratinhos C57BL/6 IL-10_/“ (B6, H-2b, Ly-5.2 + ) foram fornecidos pela Australian National University (Camberra, Austrália). A idade dos ratinhos usados como receptores de transplantes variou entre 8 e 14 semanas. Os ratinhos foram alojados em gaiolas micro-isoladoras esterilizadas e receberam água acidificada sujeita a autoclavagem (pH 2,5) e ração normal durante as primeiras duas semanas pós-transplantação.

Transplantação de medula óssea

Os ratinhos foram transplantados de acordo com um protocolo padrão (Hill et al., 1997 supra). Em resumo, no dia 1, ratinhos B6D2F1 receberam 1300 cGy de irradiação total do corpo (fonte de 137Cs a 108 cGy/minuto) dividida em duas doses separadas por 3 horas, para minimizar a toxicidade gastrointestinal. Células de medula óssea de dadores (5 x 106 por animal) e T esplénicas (3 x 106 por animal) foram novamente suspensas em 0,25 mL de meio L-15 de Leibovitz (Gibco BRL, Gaithersburg MD) e foram injectadas intravenosamente nos receptores. A sobrevivência foi monitorizada diariamente e as pontuações clinicas de GVHD foram medidas semanalmente. CpnlO ou diluente de controlo 28 foi injectado subcutaneamente a doses de 100 pg por animal. O grau de GVHD sistémica foi avaliado como descrito acima.

Culturas de células O meio de cultura utilizado foi 10% FCS/IMDM (JRH Biosciences, Lenexa, KS) suplementado com 50 unidades/mL de penicilina, 50 pg/mL de estreptomicina, L-glutamina 2 mM, piruvato de sódio 1 mM, aminoácidos não essenciais 0,1 mM, β-mercaptoetanol 0,02 mM e HEPES 10 mM. As experiências foram realizadas a pH 7,75 e 37°C numa incubadora humidificada suplementada com 5% de CO2.

Para experiências de estimulação com LPS in vitro, macrófagos peritoneais ou esplenócitos foram estimulados com concentrações definidas de LPS, TNFa e IL-10 determinadas em sobrenadantes de cultura às 5 horas e 48 horas, respectivamente. Para experiências com aloantigenes in vitro, células τ C57BL/6 purificadas foram cultivadas em placas de 96 cavidades (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) com 105 macrófagos peritoneais B6D2F1 irradiados (2000 cGy) (MLC primários) e os sobrenadantes foram recolhidos às 72 horas. Em seguida, as culturas foram pulsadas com 3H-timidina (1 pCi por cavidade) e a proliferação foi determinada 16 horas depois num leitor 1205 Betaplate (Wallac, Turku, Finlândia). Para estimulação com mitogenes in vitro, células τ C57BL/6 purificadas foram cultivadas em placas de 96 cavidades de fundo plano, pré-revestidas com CD3 e CD28 monoclonais a concentrações finais de 10 pg/mL. Os sobrenadantes foram recolhidos às 48 horas e as culturas foram pulsadas com 3H-timidina (1 pCi por cavidade). A proliferação foi determinada 16 horas depois. 29 ELISAS de citoquinas

Os anticorpos utilizados nos ensaios de IFNy, IL-10, IL-4 e TNFa foram adquiridos à PharMingen (San Diego, CA) e os ensaios foram realizados de acordo com o protocolo do fabricante. Em resumo, amostras foram diluídas 1:3 até 1:24 e citoquinas foram capturadas pelo anticorpo monoclonal primário especifico (mAb) e detectadas por mAbs secundários etiquetados com biotina. Os ensaios etiquetados com biotina foram desenvolvidos com estreptavidina e substrato (Kirkegaard and Perry laboratories, Gaithersburg, MD) . As placas foram lidas a 450 nm utilizando o leitor de microplacas Spectraflour Plus (Tecan, Durham, NC).

Citoquinas recombinantes (PharMingen) foram utilizadas como padrões para ensaios ELISA. As amostras e padrões foram processados em duplicado, e a sensibilidade dos ensaios foi 0,063 U/mL para IFNy e 15 pg/mL para IL-10, IL-4 e TNFa.

Resultados A administração in vivo de cpnlO reduziu a capacidade de macrófagos peritoneais para produzir TNFa (FIG. 2A) . Ratinhos B6 (n=3) foram tratados durante 5 dias com cpnlO (100 pg, uma vez por dia) (cpnl0+) ou diluente de controlo (cpnlO-). Os macrófagos peritoneais foram recolhidos por lavagem peritoneal no dia 6 e foram reunidos de animais individuais no grupo de tratamento. As células foram plaqueadas a 2 x 105/cavidade na ausência (não mostrado) ou presença de LPS (1 pg/mL). Os sobrenadantes de cultura foram recolhidos às 5 horas, e os níveis de TNFa (pg/mL) foram avaliados por ELISA. Os resultados estão normalizados para a produção por 105 macrófagos com base em coloração de CDllb. A FIG. 2A apresenta dados de duas experiências 30 idênticas. A secreção induzida por LPS de TNFa a partir destas células foi reduzida em 40%. O tratamento in vivo com cpnlO aumentou a produção de IL-10 a partir de esplenócitos (FIG. 2B) . Ratinhos B6 foram tratados com cpnlO ou diluente de controlo como descrito acima. Os esplenócitos foram recolhidos no dia 6 e foram reunidos de animais individuais num grupo de tratamento antes de cultura a 5 x 105/cavidade na ausência (não mostrado) ou presença de LPS (10 pg/mL). Os sobrenadantes de cultura foram recolhidos às 48 horas, e os níveis de IL-10 (pg/mL) foram determinados por ELISA. Os dados de duas experiências idênticas estão apresentados na FIG. 2B. Observou-se produção de IL-10 significativamente aumentada em comparação com animais de controlo. O tratamento in vivo com cpnlO reduziu a produção de TNFa de macrófagos peritoneais IL10-/- (FIG. 2C) . Ratinhos B6 ILlO_/“ foram tratados com cpnlO ou diluente de controlo, macrófagos peritoneais foram recolhidos por lavagem peritoneal no dia 6 e foram reunidos de animais individuais no grupo de tratamento. Após 5 horas de cultura na ausência (LPS 0) ou presença de LPS (0,1, 1 e 10 pg/mL) determinou-se a quantidade de TNFa nos sobrenadantes de cultura. A redução mediada por cpnlO da produção de TNFa induzida por LPS (Fig. 2A) não requer IL-10, pois foram observadas reduções semelhantes na secreção de TNFa quando macrófagos peritoneais de ratinhos IL-10_/_ tratados com cpnlO foram estimulados com LPS in vitro. Assim, a secreção reduzida de TNFa e produção aumentada de IL-10 parecem ser consequências independentes do tratamento com cpnlO. 31 0 tratamento com cpnlO não aparentou afectar a secreção de IFNy ou IL-4 por células T. Relatos anteriores sugeriram que a cpnlO pode inibir a proliferação de células T em resposta a mitogenes (Morton H. 1998 Immunol. Cell Biol., 76, 483-496). As respostas imunológicas de Thl são habitualmente caracterizadas por citoquinas pró-inflamatórias, como TNFa e IFNy. As respostas de Th2 envolvem secreção de IL-4 e IL-10, e as respostas de células T reguladoras (Treg) são caracterizadas por produção de IL-10 e TGFp. Uma vez que respostas de Th2 e Treg suprimem a proliferação e respostas de Thl suprimem a produção de citoquinas, investigou-se a capacidade da cpnlO para influenciar a diferenciação de células T. A administração in vivo de cpnlO não afectou a resposta proliferativa de linfócitos T a aloantigenes (FIG. 2D) . Ratinhos B6 (n=3) foram tratados com injecções diárias de cpnlO ou diluente de controlo. As populações de células T derivadas de esplenócitos foram estimuladas in vitro com esplenócitos alogénicos durante 7 dias numa cultura mista de linfócitos (MLC). Células T purificadas (0,5 x 105, 1 x 105 e 2 x 105/cavidade) foram estimuladas com macrófagos peritoneais B6D2F1 alogeneicos irradiados (0,5 x 105/cavidade), e mediu-se a proliferação às 72 horas via ensaio padrão de incorporação de 3[H] Timidina. Os valores representados graficamente na FIG. 2D representam média ± EP de cavidades em triplicado. A proliferação de células T nestas MLCs não diferiu significativamente entre animais tratados com cpnlO e de controlo, indicando que a cpnlO não é um regulador do crescimento de células T.

As FIGS. 2E-G mostram os efeitos da administração in vivo de cpnlO na diferenciação de células T. Animais B6 foram 32 tratados in vivo com cpnlO como descrito acima. Células T (2 x 106/cavidade) de animais tratados com cpnlO e tratados com veiculo foram estimuladas em cultura durante 7 dias com esplenócitos B6D2F1 alogeneicos irradiados (3 x 106/cavidade) (cultura de linfócitos mistos primários). No dia 7, as células T foram recolhidas e estimuladas novamente com anticorpos ligados a placas para CD3 e CD28, que estimulam células T. os sobrenadantes de cultura foram recolhidos às 24 horas e as concentrações de IFNy, IL4 e IL-10 foram determinadas por ELISA. Os valores de concentrações nas FIGS 4E-G representam a média ± EP de cavidades em triplicado.

Nem a secreção de IL-4 (FIG. 2E) nem a secreção de IFNy (FIG. 2F) por células T diferiram significativamente entre animais tratados com cpnlO e de controlo, sugerindo que a cpnlO não influencia o equilíbrio Thl/Th2.

Em contraste, a secreção de IL-10 por células T foi significativamente aumentada (FIG. 2G) . Também foi observado um aumento semelhante na secreção de IL-10 quando o tratamento com cpnlO foi efectuado in vitro durante a cultura de células (MLC), em vez de in vivo, e de novo a proliferação de IFNy e IL-4 não foi afectada (dados não mostrados). Estes dados indicam que a cpnlO consegue aumentar a produção de IL-10 em resposta a estimulação com LPS e aloantigenes, e sugere que a produção de IL-10 aumentada por cpnlO pode dever-se em parte a IL-10 derivada de células T. 33

Exemplo 2 - Efeito de tratamento pré- e pós-transplante com cpnlO no modelo de GVHD in vivo

Conduziram-se experiências in vivo para investigar se a administração de cpnlO no período peri-transplante poderia prevenir a GVHD.

Administração de cpnlO pós-tratamento Células de medula óssea (5 x 106/animal) e células T purificadas (descritas acima) de ratinhos B6 dadores foram transplantadas para ratinhos receptores B6D2F1 irradiados de modo letal (1100 cGy) (grupos alogeneicos). Os receptores B6D2F1 do grupo de controlo singeneico receberam doses iguais de células da medula óssea e T B6D2F1. No período pós-transplante (dia 0 até 21), os animais foram injectados subcutaneamente com veículo (singeneico, n=8, e grupo de controlo alogeneico, n=10) ou cpnlO (10 e 100 pg/animal/dia: cpnlO 10 pg/dia alogeneico, n=10, e cpnlO 100 pg/dia alogeneico, n=10). As pontuações clínicas de GVHD (como descrito acima) foram determinadas como medida da gravidade da GVHD em animais sobreviventes. Foi observada GVHD clinicamente mais ligeira nos dias 14 e 21 em animais alogeneicos injectados com 100 pg/dia de cpnlO em comparação com o controlo alogeneico tratado com veículo (* *P <0,01). Não houve uma diferença significativa na percentagem de sobrevivência entre grupos injectados com veículo e alogeneicos injectados com cpnlO. A FIG. 3 mostra curvas de sobrevivência de ratinhos por análise de Kaplan-Meier. A administração de cpnlO após transplantação de medula óssea (BMT) não conseguiu prevenir a mortalidade por GVHD e 34 só reduziu brevemente a morbidez, determinado por pontuações clinicas de GVHD (FIG: 3B) . Foi observada GVHD clinicamente mais ligeira no dia 14 e dia 21 em animais alogeneicos injectados com 100 pg/dia de cpnlO em comparação com o controlo alogeneico tratado com veiculo (**P <0,01) .

Administração pré-tratamento de cpnlO

Ratinhos B6D2F1 receptores e B6 dadores foram tratados durante 5 dias pré-transplante com cpnlO (100 pg/dia/ subcutaneamente) ou diluente de controlo. Células de medula óssea (5 x 106/animal) e T (3 x 106/animal), recolhidas no dia 6 de ratinhos dadores B6, foram transplantadas para receptores B6D2F1 irradiados letalmente. Formaram-se cinco grupos de receptores:

Grupo 1: Controlo singeneico (n=8) representou B6D2F1 transplantados com células de medula óssea e τ B6D2F1 singeneicas.

Grupo 2: Controlo alogeneico (n=10) consistiu em receptores B6D2F1 pré-tratados com diluente, transplantados com células de dadores B6 pré-tratados com diluente.

Grupo 3: Receptor alogeneico pré-tratado (n=10), ratinhos B6D2F1 receptores foram tratados pré-transplante com cpnlO e foram transplantados com células dadoras B6 pré-tratadas com veiculo.

Grupo 4: Ratinhos B6D2F1 receptores pré-tratados só com diluente que receberam transplante de dadores B6 pré-tratados com cpnlO (dador alogeneico pré-tratado, n=10). 35

Grupo 5: Ratinhos receptores B6D2F1 e dadores B6 foram pré-tratados com cpnlO antes da transplantação (receptor e dador alogeneico pré-tratado, n=10).

Determinaram-se pontuações clinicas de GVHD como descrito acima como medida da gravidade da GVHD em animais sobreviventes.

Pontuações clinicas significativamente menores foram observadas no dia 7 no Grupo 5 (receptores e dadores pré-tratados com cpnlO antes da transplantação) em comparação com o grupo de controlo alogeneico (FIG. 4B; ***p <0,001). A FIG: 4 mostra curvas de sobrevivência de ratinhos por análise de Kaplan-Meier. A administração de cpnlO a dadores e receptores de transplantes durante 5 dias antes do transplante retardou significativamente a mortalidade por GVHD (*P <0,01 versus controlo alogeneico). Adicionalmente, a gravidade da GVHD, determinada pela pontuação clinica, também foi reduzida logo após BMT. A capacidade da cpnlO para retardar a mortalidade por GVHD guando administrada antes de BMT é consistente com o efeito anti-inflamatório descrito aqui, isto é, uma limitação da produção de TNFa (Hill et ai., 1998 J. Clin. Invest., 102, 115-123; Hill et al., 1997, supra) . O facto de a administração de cpnlO após BMT não ter conseguido prevenir o desenvolvimento de GVHD é consistente com a ausência de um efeito na activação e diferenciação de células T nas doses e calendarização utilizadas neste Exemplo, como foi caracterizado na FIG 3. 36 0 condicionamento do transplante (irradiação letal) nestes modelos monta um processo de lesão progressiva no tracto GI, fuga de LPS e geração de citoquinas inflamatórias, que por sua vez induz lesões adicionais no tracto Gi, e assim o processo continua na forma de um circuito de realimentação positiva. 0 processo pode ser interrompido por agentes farmacológicos que protegem o tracto gastrointestinal de lesão por radiação (como IL-11 e Factor de Crescimento de Queratinócitos; Krijanovski et al., 1999, Blood, 9_4, 825-831), antagonistas directos de LPS (Cooke et al., 2001, J. Clin. Invest., 107, 1581-1589) ou inibidores do próprio TNFa (Hill et al., 1997 supra). No entanto, estes agentes tendem a retardar e não a prevenir GVHD a menos que o TNFa seja completamente neutralizado, ou que haja efeitos adicionais na activação e diferenciação de células T. Assim, o retardamento da mortalidade por GVHD pela administração de cpnlO é consistente com uma limitação da sinalização de LPS e subsequente produção de TNFa logo após BMT, mas também falha em exercer impacto na função subsequente de células T alo-reactivas. 1997, J. Immunol., 158, 5185-

Em consequência, a cpnlO tem potencial para se tornar num fármaco terapêutico importante no tratamento de GVHD. A eficácia aumentada do tratamento de GVHD observada quando dador e receptor recebem cpnlO antes do procedimento de transplantação é consistente com o facto de o TNFa ser originário de ambas as fontes de tecido ou órgão no período pós-transplante (Cooke et al., 2000, J. Immunol., 165, 6612-6619; Speiser et al., 5190). 37

Além disso, a cpnlO pode ser útil no tratamento de GVHD em combinação com agentes imunossupressores tradicionais, que limitam a resposta imunológica adaptável secundária.

Ao longo da especificação, o objectivo foi descrever as formas de realização preferidas sem limitar a especificação a qualquer forma de realização ou conjunto especifico de características. Em consequência, os profissionais apreciarão que, à luz da presente divulgação, várias modificações e alterações podem ser feitas nas formas de realização particulares exemplificadas sem sair do âmbito da especificação.

Lisboa, 2 de Dezembro de 2010

Claims (4)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Composição farmacêutica compreendendo: uma quantidade farmaceuticamente eficaz de chaperonina 10 com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 e um transportador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.

2. Composição farmacêutica da reivindicação 1 compreendendo adicionalmente pelo menos outro agente imunossupressor.

3. Composição farmacêutica da reivindicação 2, em que o outro agente imunossupressor é seleccionado do grupo que consiste em ciclosporina, tacrolimus, sirolimus, micofenolato de mofetil e metotrexato.

4. Polipéptido isolado com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1. Lisboa, 2 de Dezembro de 2010