JPH08173165A - クフェア属植物の中鎖脂肪酸合成に関する遺伝子 - Google Patents
クフェア属植物の中鎖脂肪酸合成に関する遺伝子Info
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- JPH08173165A JPH08173165A JP6320547A JP32054794A JPH08173165A JP H08173165 A JPH08173165 A JP H08173165A JP 6320547 A JP6320547 A JP 6320547A JP 32054794 A JP32054794 A JP 32054794A JP H08173165 A JPH08173165 A JP H08173165A
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- acp
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 配列番号２で表されるアミノ酸配列をコード
するアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ遺伝子。 【効果】 中鎖脂肪酸合成の鍵となるアシル−ＡＣＰ−
チオエステラーゼの遺伝子が提供される。
するアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ遺伝子。 【効果】 中鎖脂肪酸合成の鍵となるアシル−ＡＣＰ−
チオエステラーゼの遺伝子が提供される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、クフェア・レプトポダ
・ヘムスル（Cuphea leptopoda Hemsl. ）由来のアシル
−ＡＣＰ−チオエステラーゼ遺伝子に関する。
・ヘムスル（Cuphea leptopoda Hemsl. ）由来のアシル
−ＡＣＰ−チオエステラーゼ遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】ミソハギ科に属する温帯性植物であるク
フェア・レプトポダ・ヘムスルの種子中に蓄積される種
子油の脂肪酸組成は中鎖脂肪酸が大半を占めている。中
鎖脂肪酸は医薬品、食品としての利用価値が高い。この
中鎖脂肪酸合成の鍵酵素がアシル−ＡＣＰ−チオエステ
ラーゼであり、遺伝子工学的手法によるこの遺伝子の発
現制御、ナタネ、ダイズ等の温帯性油料作物への導入等
により、温帯性作物による中鎖脂肪酸の生産、利用に資
することができる。
フェア・レプトポダ・ヘムスルの種子中に蓄積される種
子油の脂肪酸組成は中鎖脂肪酸が大半を占めている。中
鎖脂肪酸は医薬品、食品としての利用価値が高い。この
中鎖脂肪酸合成の鍵酵素がアシル−ＡＣＰ−チオエステ
ラーゼであり、遺伝子工学的手法によるこの遺伝子の発
現制御、ナタネ、ダイズ等の温帯性油料作物への導入等
により、温帯性作物による中鎖脂肪酸の生産、利用に資
することができる。
【０００３】アシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ遺伝子
については、既にゲッケイジュ（Voelker TA et al. Sc
ience 257:72-74(1992) ）、ベニバナ（Knutzon et al.
Plant Physiol. 100:1751-1758(1992) ）、ナタネ（Lo
ader N et al. Plant Mol.Biol. 23:769-778(1993)）に
おいて、全塩基配列が決定されている。また、クフェア
属植物についてもクフェア・ランセオラタ（Cuphea lan
ceorata）（Toepfer R. and N. Martini J.Plant Physi
ol. 143:416-425(1994)）において、全塩基配列が決定
されている。
については、既にゲッケイジュ（Voelker TA et al. Sc
ience 257:72-74(1992) ）、ベニバナ（Knutzon et al.
Plant Physiol. 100:1751-1758(1992) ）、ナタネ（Lo
ader N et al. Plant Mol.Biol. 23:769-778(1993)）に
おいて、全塩基配列が決定されている。また、クフェア
属植物についてもクフェア・ランセオラタ（Cuphea lan
ceorata）（Toepfer R. and N. Martini J.Plant Physi
ol. 143:416-425(1994)）において、全塩基配列が決定
されている。
【０００４】しかし、クフェア・レプトポダ・ヘムスル
については、現在に至るまで、アシル−ＡＣＰ−チオエ
ステラーゼ遺伝子を単離し、その塩基配列を決定できた
という報告はない。
については、現在に至るまで、アシル−ＡＣＰ−チオエ
ステラーゼ遺伝子を単離し、その塩基配列を決定できた
という報告はない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、クフェア・
レプトポダ・ヘムスルの中鎖脂肪酸合成に関わるアシル
−ＡＣＰ−チオエステラーゼ遺伝子を提供することを目
的とする。
レプトポダ・ヘムスルの中鎖脂肪酸合成に関わるアシル
−ＡＣＰ−チオエステラーゼ遺伝子を提供することを目
的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、クフェア
・レプトポダ・ヘムスル由来のアシル−ＡＣＰ−チオエ
ステラーゼ遺伝子を単離し、その塩基配列を決定するこ
とに成功し、本発明を完成した。即ち、本発明は、配列
番号２で表されるアミノ酸配列をコードするアシル−Ａ
ＣＰ−チオエステラーゼ遺伝子である。
・レプトポダ・ヘムスル由来のアシル−ＡＣＰ−チオエ
ステラーゼ遺伝子を単離し、その塩基配列を決定するこ
とに成功し、本発明を完成した。即ち、本発明は、配列
番号２で表されるアミノ酸配列をコードするアシル−Ａ
ＣＰ−チオエステラーゼ遺伝子である。
【０００７】また、本発明は、塩基配列が、配列番号１
で表される上記記載のアシル−ＡＣＰ−チオエステラー
ゼ遺伝子である。さらに、本発明は、上記記載のアシル
−ＡＣＰ−チオエステラーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに
挿入した組み換え体ＤＮＡである。以下、本発明を詳細
に説明する。
で表される上記記載のアシル−ＡＣＰ−チオエステラー
ゼ遺伝子である。さらに、本発明は、上記記載のアシル
−ＡＣＰ−チオエステラーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに
挿入した組み換え体ＤＮＡである。以下、本発明を詳細
に説明する。
【０００８】本発明は、クフェア・レプトポダ・ヘムス
ル由来のアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ遺伝子に関
するものである。クフェア・レプトポダ・ヘムスル由来
のアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼは、他の植物由来
のアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼと異なり、炭素数
１０の脂肪酸（カプリン酸）と結合したＡＣＰ（アシル
キャリアー蛋白）に基質特異性を示す。このため、本遺
伝子は中鎖脂肪酸に分類されるカプリン酸（炭素鎖長１
０）を構成成分に含む貯蔵脂質を合成するための鍵酵素
をコードするものであり、オレイン酸（炭素鎖長１８）
等を蓄積する通常の油料作物に由来する酵素と異なり、
中鎖脂肪酸を遺伝子工学的に生産するための重要な遺伝
物質である。
ル由来のアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ遺伝子に関
するものである。クフェア・レプトポダ・ヘムスル由来
のアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼは、他の植物由来
のアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼと異なり、炭素数
１０の脂肪酸（カプリン酸）と結合したＡＣＰ（アシル
キャリアー蛋白）に基質特異性を示す。このため、本遺
伝子は中鎖脂肪酸に分類されるカプリン酸（炭素鎖長１
０）を構成成分に含む貯蔵脂質を合成するための鍵酵素
をコードするものであり、オレイン酸（炭素鎖長１８）
等を蓄積する通常の油料作物に由来する酵素と異なり、
中鎖脂肪酸を遺伝子工学的に生産するための重要な遺伝
物質である。
【０００９】本発明の遺伝子は、（１）アシル−ＡＣＰ
−チオエステラーゼ遺伝子を含むｃＤＮＡの合成、
（２）アシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ遺伝子の一部
を含むＤＮＡ断片の増幅、（３）アシル−ＡＣＰ−チオ
エステラーゼ遺伝子の全体を含むＤＮＡ断片の増幅とい
う工程を経て得られる。以下、各工程ごとに説明する。１）アシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ遺伝子を含むｃ
ＤＮＡの合成 アシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ遺伝子を含むｃＤＮ
Ａは以下のようにして合成することができる。まず、開
花後１１日から２週間程度経過したクフェア・レプトポ
ダ・ヘムスルの未熟種子を採種し、ＳＤＳおよびフェノ
ール等を含む適当な抽出液中で磨砕して総ＲＮＡを抽出
する。得られた総ＲＮＡから、例えば、ｏｌｉｇｏｔｅ
ｘ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞を用いてｐｏｌｙ Ａ
（＋）ＲＮＡを単離し、これを鋳型として、適当な逆転
写酵素、例えば、Ｍｏ−ＭＬＶ逆転写酵素（米ＢＲＬ社
製）を用いてｃＤＮＡを合成する。２）アシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ遺伝子の一部を
含むＤＮＡ断片の増幅 まず、ゲッケイジュ、ベニバナ、ナタネなどの既にアシ
ル−ＡＣＰ−チオエステラーゼのアミノ酸配列が知られ
ている植物のアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼのアミ
ノ酸配列同士を比較し、保存配列を見つける。このよう
な類縁関係の遠い種の間で共通しているアミノ酸配列
は、酵素の活性中心などの機能系に重要な領域を構成し
ていることが推定される。従って、ゲッゲイジュ等で見
出された保存配列は、クフェア・レプトポダ・ヘムスル
においても保存されている可能性が高い。
−チオエステラーゼ遺伝子を含むｃＤＮＡの合成、
（２）アシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ遺伝子の一部
を含むＤＮＡ断片の増幅、（３）アシル−ＡＣＰ−チオ
エステラーゼ遺伝子の全体を含むＤＮＡ断片の増幅とい
う工程を経て得られる。以下、各工程ごとに説明する。１）アシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ遺伝子を含むｃ
ＤＮＡの合成 アシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ遺伝子を含むｃＤＮ
Ａは以下のようにして合成することができる。まず、開
花後１１日から２週間程度経過したクフェア・レプトポ
ダ・ヘムスルの未熟種子を採種し、ＳＤＳおよびフェノ
ール等を含む適当な抽出液中で磨砕して総ＲＮＡを抽出
する。得られた総ＲＮＡから、例えば、ｏｌｉｇｏｔｅ
ｘ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞を用いてｐｏｌｙ Ａ
（＋）ＲＮＡを単離し、これを鋳型として、適当な逆転
写酵素、例えば、Ｍｏ−ＭＬＶ逆転写酵素（米ＢＲＬ社
製）を用いてｃＤＮＡを合成する。２）アシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ遺伝子の一部を
含むＤＮＡ断片の増幅 まず、ゲッケイジュ、ベニバナ、ナタネなどの既にアシ
ル−ＡＣＰ−チオエステラーゼのアミノ酸配列が知られ
ている植物のアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼのアミ
ノ酸配列同士を比較し、保存配列を見つける。このよう
な類縁関係の遠い種の間で共通しているアミノ酸配列
は、酵素の活性中心などの機能系に重要な領域を構成し
ていることが推定される。従って、ゲッゲイジュ等で見
出された保存配列は、クフェア・レプトポダ・ヘムスル
においても保存されている可能性が高い。
【００１０】次に、保存配列の中から、対応する塩基配
列がＰＣＲ法に用いるプライマーとして好適な条件を満
たすものを２つ選択する。具体的には、２つのプライマ
ーの熱化学的性状が近接していること、分子内、分子間
の塩基対形成能が低いことなどの条件を満たすものを選
択する。また、本発明のクフェア・レプトポダ・ヘムス
ルのアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼは、前記ゲッケ
イジュ等の従来の同酵素と異なり、炭素数１０の脂肪酸
と結合したＡＣＰに基質特異性を示すことから、従来の
同酵素のアミノ酸配列とは、保存配列以外の部分の相同
性はかなり低いと予想される。従って、ＰＣＲ法により
得られたクローンが、正しくアシル−ＡＣＰ−チオエス
テラーゼ遺伝子であるか否かを判定するため、選択され
る２つの保存配列の間に第３の保存配列が含まれている
ことが好ましい。
列がＰＣＲ法に用いるプライマーとして好適な条件を満
たすものを２つ選択する。具体的には、２つのプライマ
ーの熱化学的性状が近接していること、分子内、分子間
の塩基対形成能が低いことなどの条件を満たすものを選
択する。また、本発明のクフェア・レプトポダ・ヘムス
ルのアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼは、前記ゲッケ
イジュ等の従来の同酵素と異なり、炭素数１０の脂肪酸
と結合したＡＣＰに基質特異性を示すことから、従来の
同酵素のアミノ酸配列とは、保存配列以外の部分の相同
性はかなり低いと予想される。従って、ＰＣＲ法により
得られたクローンが、正しくアシル−ＡＣＰ−チオエス
テラーゼ遺伝子であるか否かを判定するため、選択され
る２つの保存配列の間に第３の保存配列が含まれている
ことが好ましい。
【００１１】本実施例においては、５’側のプライマー
に対応する保存配列として、ゲッケイジュのアシル−Ａ
ＣＰ−チオエステラーゼにおける第２１６アミノ酸から
第２３３アミノ酸配列に相当するThr-Ser-(LeuまたはLy
s)-(Ser またはTrp)-Val-(Leu またはMet)-Met-Asn（以
下、「配列Ａ」という。）を選択した。但し、この配列
は、アミノ酸が１種に決定できない部位があり、後述す
るようにプライマー配列数を増加させるため、あまり好
ましくない。３’側のプライマーに対応する保存配列と
しては、ゲッケイジュのアシル−ＡＣＰ−チオエステラ
ーゼにおける第３１６アミノ酸から第３２０アミノ酸配
列に相当するTyl-Arg-Arg-Glu-Cys （以下、「配列Ｂ」
という。）を選択した。
に対応する保存配列として、ゲッケイジュのアシル−Ａ
ＣＰ−チオエステラーゼにおける第２１６アミノ酸から
第２３３アミノ酸配列に相当するThr-Ser-(LeuまたはLy
s)-(Ser またはTrp)-Val-(Leu またはMet)-Met-Asn（以
下、「配列Ａ」という。）を選択した。但し、この配列
は、アミノ酸が１種に決定できない部位があり、後述す
るようにプライマー配列数を増加させるため、あまり好
ましくない。３’側のプライマーに対応する保存配列と
しては、ゲッケイジュのアシル−ＡＣＰ−チオエステラ
ーゼにおける第３１６アミノ酸から第３２０アミノ酸配
列に相当するTyl-Arg-Arg-Glu-Cys （以下、「配列Ｂ」
という。）を選択した。
【００１２】次に、選択した保存配列のアミノ酸配列に
基づき、ＰＣＲ法に用いるプライマーを合成する。プラ
イマーの合成は市販のＤＮＡ合成機等を用いて行うこと
ができる。アミノ酸配列から推定されるＤＮＡ配列は、
コドンの縮合のために一意に決定されず、保存配列のア
ミノ酸配列が１種類であっても、複数存在することにな
る。また、前記配列Ａの如くアミノ酸配列が１種に決定
できないような場合には、プライマーの種類は更に多く
なる。例えば、以下に示すように配列Ａ及び配列Ｂでは
それぞれプライマーは、１６種類、６４種類となる。
基づき、ＰＣＲ法に用いるプライマーを合成する。プラ
イマーの合成は市販のＤＮＡ合成機等を用いて行うこと
ができる。アミノ酸配列から推定されるＤＮＡ配列は、
コドンの縮合のために一意に決定されず、保存配列のア
ミノ酸配列が１種類であっても、複数存在することにな
る。また、前記配列Ａの如くアミノ酸配列が１種に決定
できないような場合には、プライマーの種類は更に多く
なる。例えば、以下に示すように配列Ａ及び配列Ｂでは
それぞれプライマーは、１６種類、６４種類となる。
【００１３】 TAA AAG CTT (A,C,G,T)T(C,G) GGT G(A,C)T GAT GAA （配列Ａに対応、１６種） TCT CTG CAG CA(C,T) TC(A,C,G,T) C(G,T)(C,T) C(G,T)
G TA （配列Ｂに対応、６４種） このようにプライマーの配列の種類が多いと、ＰＣＲの
特異性も失われる。この場合、推定される全ての配列の
組み合わせの中から、少しずつプライマーの種類を減ら
していくことも考えられるが、プライマーの種類を減ら
すにつれ、完全に一致する配列を持ったプライマーを排
除してしまう可能性が増大する。このため、本発明にお
いては、保存配列から推定されるすべての塩基配列をプ
ライマーとして用い、特異性の問題は後述する反応条件
により解決する。
G TA （配列Ｂに対応、６４種） このようにプライマーの配列の種類が多いと、ＰＣＲの
特異性も失われる。この場合、推定される全ての配列の
組み合わせの中から、少しずつプライマーの種類を減ら
していくことも考えられるが、プライマーの種類を減ら
すにつれ、完全に一致する配列を持ったプライマーを排
除してしまう可能性が増大する。このため、本発明にお
いては、保存配列から推定されるすべての塩基配列をプ
ライマーとして用い、特異性の問題は後述する反応条件
により解決する。
【００１４】次に、合成されたプライマーを用いてＰＣ
Ｒ法よりアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ遺伝子の一
部を含むＤＮＡ断片の増幅を行う。本発明では、最初に
ヌクレオチド同士の特異性の低い条件で増幅を行い、次
いで特異性の高い条件で増幅を行う。特異性の低い条件
及び特異性の高い条件とは、例えば、実施例で行ってい
るような条件である。このような反応条件を設定するこ
とにより、プライマー結合時の特異性を低め、かつ目的
の配列がクローニング可能な程度に特異性を保つことが
できる。ＰＣＲに用いる反応液は、特別なものを用いる
必要はなく、プライマー、ｃＤＮＡのほか、塩化カリウ
ム、塩化マグネシウム、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＴＴＰなどを含むものを用いる。また、耐熱性酵
素は、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（米パーキ
ンエルマ社製）のような一般的に使用されているもので
よい。このようにして増幅されるＤＮＡ断片は、前記プ
ライマーに挟まれる領域、即ち、クフェア・レプトポダ
・ヘムスル由来のアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ遺
伝子の一部を含む。３）アシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ遺伝子の全体を
含むＤＮＡ断片の増幅 まず、１）で得られたｃＤＮＡの5'末端部分及び3'末端
部分を増幅する。これは、いわゆる５’ＲＡＣＥ法及び
３’ＲＡＣＥ法（Frohmannら(1988) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 85:8998-9002）により行うことができる。Ｒ
ＡＣＥ法とは、ＰＣＲ法を用いてｍＲＮＡの３’末端お
よび５’末端に対応する塩基配列を含むＤＮＡ断片を増
幅する方法である。この方法を行うにあたっては対象遺
伝子の一部の配列が、短い領域でよいが、既知であるこ
とが前提となる。３’末端を増幅する場合にはｃＤＮＡ
の１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ合成の際に（ｄＴ）17−アダプ
タープライマー（GAC TCG AGT CGA CAT CGA TTT TTT TT
T TTT TTT TT）を用い、次いで既知領域の一部の配列を
持つ特異的なプライマー（Gene Specific Primer、以下
単に「ＧＳＰ」という）とアダプタープライマー（（ｄ
Ｔ）17−アダプタープライマーの前半部分と同じ配列：
GAC TCG AGT CGA CAT CGA ）を用いてＰＣＲを行うこと
により、既知領域から３’末端までを増幅する。５’末
端を増幅する場合には、既知領域に含まれる適当なＧＳ
ＰをプライマーとしてｃＤＮＡを合成した後、ｃＤＮＡ
の５’末端にデオキシリボヌクレオチド末端転移酵素
（ＴｄＴａｓｅ）を用いてｐｏｌｙ（Ａ）を付加する。
ＰＣＲ反応に際してはアダプタープライマーと、ｃＤＮ
Ａ合成のプライマーとして用いた配列の上流に位置する
既知領域中の第二の３’側ＧＳＰを用いてＰＣＲを行っ
てｃＤＮＡの５’末端から既知領域の間を増幅するが、
反応開始時におけるｃＤＮＡの相補鎖の合成のために１
／１００量程度のｏｌｉｇｏ（ｄＴ）17−アダプタープ
ライマーをさらに加えておく必要がある。このとき用い
るＰＣＲ反応液は、原則として前記（２）と同様なもの
を用いるが、耐熱性酵素としては、前記のＡｍｐｌｉＴ
ａｑＤＮＡポリメラーゼのような3'→5'エキソヌクレア
ーゼ活性を持たない酵素は誤った塩基配列を取り込む率
が高いため、ＵＬＴｍａTMＤＮＡポリメラーゼ（米パー
キンエルマー社製）のような３’→５’エキソヌクレア
ーゼ活性を持つ酵素が好ましい。ＰＣＲの反応条件は、
前記（２）のように低特異性増幅と高特異性増幅に分け
て行う必要はなく、通常のＰＣＲ法と同様に行うことが
できる。
Ｒ法よりアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ遺伝子の一
部を含むＤＮＡ断片の増幅を行う。本発明では、最初に
ヌクレオチド同士の特異性の低い条件で増幅を行い、次
いで特異性の高い条件で増幅を行う。特異性の低い条件
及び特異性の高い条件とは、例えば、実施例で行ってい
るような条件である。このような反応条件を設定するこ
とにより、プライマー結合時の特異性を低め、かつ目的
の配列がクローニング可能な程度に特異性を保つことが
できる。ＰＣＲに用いる反応液は、特別なものを用いる
必要はなく、プライマー、ｃＤＮＡのほか、塩化カリウ
ム、塩化マグネシウム、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＴＴＰなどを含むものを用いる。また、耐熱性酵
素は、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（米パーキ
ンエルマ社製）のような一般的に使用されているもので
よい。このようにして増幅されるＤＮＡ断片は、前記プ
ライマーに挟まれる領域、即ち、クフェア・レプトポダ
・ヘムスル由来のアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ遺
伝子の一部を含む。３）アシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ遺伝子の全体を
含むＤＮＡ断片の増幅 まず、１）で得られたｃＤＮＡの5'末端部分及び3'末端
部分を増幅する。これは、いわゆる５’ＲＡＣＥ法及び
３’ＲＡＣＥ法（Frohmannら(1988) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 85:8998-9002）により行うことができる。Ｒ
ＡＣＥ法とは、ＰＣＲ法を用いてｍＲＮＡの３’末端お
よび５’末端に対応する塩基配列を含むＤＮＡ断片を増
幅する方法である。この方法を行うにあたっては対象遺
伝子の一部の配列が、短い領域でよいが、既知であるこ
とが前提となる。３’末端を増幅する場合にはｃＤＮＡ
の１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ合成の際に（ｄＴ）17−アダプ
タープライマー（GAC TCG AGT CGA CAT CGA TTT TTT TT
T TTT TTT TT）を用い、次いで既知領域の一部の配列を
持つ特異的なプライマー（Gene Specific Primer、以下
単に「ＧＳＰ」という）とアダプタープライマー（（ｄ
Ｔ）17−アダプタープライマーの前半部分と同じ配列：
GAC TCG AGT CGA CAT CGA ）を用いてＰＣＲを行うこと
により、既知領域から３’末端までを増幅する。５’末
端を増幅する場合には、既知領域に含まれる適当なＧＳ
ＰをプライマーとしてｃＤＮＡを合成した後、ｃＤＮＡ
の５’末端にデオキシリボヌクレオチド末端転移酵素
（ＴｄＴａｓｅ）を用いてｐｏｌｙ（Ａ）を付加する。
ＰＣＲ反応に際してはアダプタープライマーと、ｃＤＮ
Ａ合成のプライマーとして用いた配列の上流に位置する
既知領域中の第二の３’側ＧＳＰを用いてＰＣＲを行っ
てｃＤＮＡの５’末端から既知領域の間を増幅するが、
反応開始時におけるｃＤＮＡの相補鎖の合成のために１
／１００量程度のｏｌｉｇｏ（ｄＴ）17−アダプタープ
ライマーをさらに加えておく必要がある。このとき用い
るＰＣＲ反応液は、原則として前記（２）と同様なもの
を用いるが、耐熱性酵素としては、前記のＡｍｐｌｉＴ
ａｑＤＮＡポリメラーゼのような3'→5'エキソヌクレア
ーゼ活性を持たない酵素は誤った塩基配列を取り込む率
が高いため、ＵＬＴｍａTMＤＮＡポリメラーゼ（米パー
キンエルマー社製）のような３’→５’エキソヌクレア
ーゼ活性を持つ酵素が好ましい。ＰＣＲの反応条件は、
前記（２）のように低特異性増幅と高特異性増幅に分け
て行う必要はなく、通常のＰＣＲ法と同様に行うことが
できる。
【００１５】次に、増幅された両末端の塩基配列を基に
して、５’末端部分及び３’末端部分に相補的なプライ
マーを合成する。このプライマーには、その後のクロー
ニングに利用するために適当な制限酵素、例えば、Ｘｂ
ａＩやＳａｃＩなどの認識部位を付加しておくことが好
ましい。最後に、前記の両末端に相補的なプライマーを
用いて、ＰＣＲ法によりアシル−ＡＣＰ−チオエステラ
ーゼ遺伝子の全体を含むＤＮＡ断片の増幅を行う。ここ
で用いる反応液及び耐熱性酵素は上述したＲＡＣＥ法と
同様なものを用いることができ、また、反応条件も上述
したＲＡＣＥ法と同様な条件でよい。
して、５’末端部分及び３’末端部分に相補的なプライ
マーを合成する。このプライマーには、その後のクロー
ニングに利用するために適当な制限酵素、例えば、Ｘｂ
ａＩやＳａｃＩなどの認識部位を付加しておくことが好
ましい。最後に、前記の両末端に相補的なプライマーを
用いて、ＰＣＲ法によりアシル−ＡＣＰ−チオエステラ
ーゼ遺伝子の全体を含むＤＮＡ断片の増幅を行う。ここ
で用いる反応液及び耐熱性酵素は上述したＲＡＣＥ法と
同様なものを用いることができ、また、反応条件も上述
したＲＡＣＥ法と同様な条件でよい。
【００１６】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
する。但し、本発明の技術的範囲は実施例に限定される
ものではない。 〔実施例１〕開花後１１日から２週間経過したクフェア
・レプトポダ・ヘムスルの未熟種子を採種し、ＳＤＳ−
フェノール法を用いてＲＮＡ抽出を行った。すなわち、
試料１００ｍｇを液体窒素で凍結し、乳鉢・乳棒を用い
て粉砕した。次いで抽出用緩衝液（１００ｍＭ、Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌｐＨ９．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｓ
ＤＳ、１．４Ｍ ２−メルカプトエタノール）２００μ
ｌ、および水飽和フェノール１００μｌを加え、一様な
溶液になるまで混和した。さらにクロロホルム１００μ
ｌを加え、混和した後、微量遠心分離機で１５，０００
ｇ １０分遠心し、水相をとった。これをフェノール抽
出３回によって蛋白質等の夾雑物を取り除いた後終濃度
３００ｍＭとなるように酢酸ナトリウムを加え、さらに
液量の２．５倍量のエタノールを加えてＲＮＡを沈殿さ
せた。
する。但し、本発明の技術的範囲は実施例に限定される
ものではない。 〔実施例１〕開花後１１日から２週間経過したクフェア
・レプトポダ・ヘムスルの未熟種子を採種し、ＳＤＳ−
フェノール法を用いてＲＮＡ抽出を行った。すなわち、
試料１００ｍｇを液体窒素で凍結し、乳鉢・乳棒を用い
て粉砕した。次いで抽出用緩衝液（１００ｍＭ、Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌｐＨ９．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｓ
ＤＳ、１．４Ｍ ２−メルカプトエタノール）２００μ
ｌ、および水飽和フェノール１００μｌを加え、一様な
溶液になるまで混和した。さらにクロロホルム１００μ
ｌを加え、混和した後、微量遠心分離機で１５，０００
ｇ １０分遠心し、水相をとった。これをフェノール抽
出３回によって蛋白質等の夾雑物を取り除いた後終濃度
３００ｍＭとなるように酢酸ナトリウムを加え、さらに
液量の２．５倍量のエタノールを加えてＲＮＡを沈殿さ
せた。
【００１７】得られた総ＲＮＡは１００μｌの滅菌水に
溶解し、ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞
（販売元：宝酒造）を用いてｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡを
単離した。すなわち総ＲＮＡ溶液１００μｌに対し１０
０μｌのＥｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．
１％ ＳＤＳ）およびＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０＜Ｓ
ｕｐｅｒ＞２００μｌを加え、よく混合した後６５℃で
５分間加熱し次いで氷上で３分間急冷した。５ＭＮａＣ
ｌ ４０μｌを加え、３７℃で１０分間加温した後１
８，０００ｇ ３分間遠心分離し、上清を除く。得られ
た沈殿を滅菌水１００μｌに懸濁し、６５℃で５分間加
熱し次いで氷上で３分間急冷する。１８，０００ｇで３
分間遠心分離し、上清を回収した。
溶解し、ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞
（販売元：宝酒造）を用いてｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡを
単離した。すなわち総ＲＮＡ溶液１００μｌに対し１０
０μｌのＥｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．
１％ ＳＤＳ）およびＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０＜Ｓ
ｕｐｅｒ＞２００μｌを加え、よく混合した後６５℃で
５分間加熱し次いで氷上で３分間急冷した。５ＭＮａＣ
ｌ ４０μｌを加え、３７℃で１０分間加温した後１
８，０００ｇ ３分間遠心分離し、上清を除く。得られ
た沈殿を滅菌水１００μｌに懸濁し、６５℃で５分間加
熱し次いで氷上で３分間急冷する。１８，０００ｇで３
分間遠心分離し、上清を回収した。
【００１８】このようにして得られたｐｏｌｙＡ（＋）
ＲＮＡのうち１μｇを用いてｃＤＮＡを合成した。反応
液の組成は以下の通りである。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣｌｐＨ８．３、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ
2 、１０ｍＭ ＤＴＴ、各２５０μＭ ｄＮＴＰ、２５
μｇ／ｍｌ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）、２００単位Ｍｏ−Ｍ
ＬＶ逆転写酵素（米ＢＲＬ社製）。この反応液中で４２
℃一時間保温し、ｃＤＮＡを合成した。 〔実施例２〕既に報告されているゲッケイジュ、ベニバ
ナ、ナタネのアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼのアミ
ノ酸配列を比較したところ、少数のアミノ酸配列からな
るいくつかの保存配列が認められた。これらの中から、
下記の配列Ａ及び配列Ｂをプライマー合成のための保存
配列として選択した。
ＲＮＡのうち１μｇを用いてｃＤＮＡを合成した。反応
液の組成は以下の通りである。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣｌｐＨ８．３、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ
2 、１０ｍＭ ＤＴＴ、各２５０μＭ ｄＮＴＰ、２５
μｇ／ｍｌ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）、２００単位Ｍｏ−Ｍ
ＬＶ逆転写酵素（米ＢＲＬ社製）。この反応液中で４２
℃一時間保温し、ｃＤＮＡを合成した。 〔実施例２〕既に報告されているゲッケイジュ、ベニバ
ナ、ナタネのアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼのアミ
ノ酸配列を比較したところ、少数のアミノ酸配列からな
るいくつかの保存配列が認められた。これらの中から、
下記の配列Ａ及び配列Ｂをプライマー合成のための保存
配列として選択した。
【００１９】配列Ａ： Thr-Ser-(LeuまたはLys)-(Ser またはTrp)-Val-(Leu ま
たはMet)-Met-Asn 配列Ｂ： Tyl-Arg-Arg-Glu-Cys このアミノ酸配列から下記のプライマーを合成した。
たはMet)-Met-Asn 配列Ｂ： Tyl-Arg-Arg-Glu-Cys このアミノ酸配列から下記のプライマーを合成した。
【００２０】 TAA AAG CTT (A,C,G,T)T(C,G) GGT G(A,C)T GAT GAA （配列Ａに対応、１６種） TCT CTG CAG CA(C,T) TC(A,C,G,T) C(G,T)(C,T) C(G,T)
G TA （配列Ｂに対応、６４種） 次に、この２系統のプライマーと、実施例１で合成した
ｃＤＮＡを含むＰＣＲ反応液を調製した（表１に示
す。）。
G TA （配列Ｂに対応、６４種） 次に、この２系統のプライマーと、実施例１で合成した
ｃＤＮＡを含むＰＣＲ反応液を調製した（表１に示
す。）。
【００２１】 表１ ＰＣＲ反応液組成 ────────────────────────────────── １０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ ８．３） ５０ｍＭ 塩化カリウム 各１５０μＭ デオキシヌクレオチド３リン酸 （ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ） １．５ｍＭ 塩化マグネシウム ２．５単位 ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ （米パーキンエルマー社製） 各２．３μＭ プライマー ２５ｎｇ クフェア・レプトポダ・ヘムスル未熟種子由来ｃＤＮＡ ────────────────────────────────── この反応液を用いて、下記の条件でＰＣＲを行い、クフ
ェア・レプトポダ・ヘムスル未熟種子由来ｃＤＮＡの特
定領域の増幅を行った。
ェア・レプトポダ・ヘムスル未熟種子由来ｃＤＮＡの特
定領域の増幅を行った。
【００２２】 （１）初期変性： ９４℃２分１サイクル （２）低特異性増幅： ９４℃１分→３７℃３分→７２℃３分３サイクル 温度変化勾配毎秒０．２５℃ （３）高特異性増幅： ９４℃１分→５５℃２分→７２℃３分３０サイクル 温度変化勾配毎秒１．０℃ （４）最終伸長 ： ７２℃１５分１サイクル 得られたＤＮＡ断片の塩基配列を自動ＤＮＡ配列決定装
置（米アプライドバイオシステムズ社製３７３Ａ型）を
用いて解析し、ＤＮＡ配列（塩基数２７７）を得た。こ
のＤＮＡ配列を配列番号３に示す（但し、クローン両端
部の合成ＤＮＡ由来の配列は記していない。）。また、
このＤＮＡ配列を翻訳した場合に推定されるアミノ酸配
列を配列番号４に示す。
置（米アプライドバイオシステムズ社製３７３Ａ型）を
用いて解析し、ＤＮＡ配列（塩基数２７７）を得た。こ
のＤＮＡ配列を配列番号３に示す（但し、クローン両端
部の合成ＤＮＡ由来の配列は記していない。）。また、
このＤＮＡ配列を翻訳した場合に推定されるアミノ酸配
列を配列番号４に示す。
【００２３】このアミノ酸配列は、ゲッゲイジュのアシ
ル−ＡＣＰ−チオエステラーゼの対応する配列と比較し
て５５．６％の高い相同性があり、また、ゲッケイジ
ュ、ベニバナ、ナタネのアシル−ＡＣＰ−チオエステラ
ーゼの間で保存されているアミノ酸配列Thr-Arg-Arg-Le
u （ゲッゲイジュのアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ
における第２２６アミノ酸から第２２９アミノ酸までに
相当する。）、His-Val-Asn-Asn （ゲッゲイジュのアシ
ル−ＡＣＰ−チオエステラーゼにおける第２８５アミノ
酸から第２８８アミノ酸までに相当する。）等をもって
いる。このことから、得られたクローンがクフェア・レ
プトポダ・ヘムスルのアシル−ＡＣＰ−チオエステラー
ゼ遺伝子の一部であることは明らかである。
ル−ＡＣＰ−チオエステラーゼの対応する配列と比較し
て５５．６％の高い相同性があり、また、ゲッケイジ
ュ、ベニバナ、ナタネのアシル−ＡＣＰ−チオエステラ
ーゼの間で保存されているアミノ酸配列Thr-Arg-Arg-Le
u （ゲッゲイジュのアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ
における第２２６アミノ酸から第２２９アミノ酸までに
相当する。）、His-Val-Asn-Asn （ゲッゲイジュのアシ
ル−ＡＣＰ−チオエステラーゼにおける第２８５アミノ
酸から第２８８アミノ酸までに相当する。）等をもって
いる。このことから、得られたクローンがクフェア・レ
プトポダ・ヘムスルのアシル−ＡＣＰ−チオエステラー
ゼ遺伝子の一部であることは明らかである。
【００２４】〔実施例３〕 クフェア・レプトポダ・ヘ
ムスルのアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼｃＤＮＡ全
長のクローニング 実施例２で記した部分的なアシル−ＡＣＰ−チオエステ
ラーゼ遺伝子の配列を元に、実施例１で得られたｃＤＮ
Ａを鋳型とし、いわゆる５’ＲＡＣＥ法および３’ＲＡ
ＣＥ法（Frohmannら(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 85:8998-9002）によってｃＤＮＡの両末端部分を増幅
し、クローニングした。３’ＲＡＣＥ法は以下のように
して行った。前述したものと同じｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮ
Ａ １μｇ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．
３、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１０ｍＭ
ＤＴＴ、各２５０μＭ ｄＮＴＰ、０．５μＭ（ｄ
Ｔ）17−アダプタープライマー（GAC TCG AGT CGA CAT
CGA TTT TTT TTT TTT TTT TT）、２００単位Ｍｏ−ＭＬ
Ｖ−逆転写酵素（米ＢＲＬ社製）からなる反応液２０μ
ｌ中で４２℃一時間保温し、ｃＤＮＡを合成した。反応
後、反応液を蒸留水で１０倍に希釈し、そのうち５μｌ
をとってＰＣＲをおこなった。５’側の既知配列（配列
番号３）中のプライマーとしてはCAT GAG ATA GAG CCT
CAT TTT GTG （ＧＳＰ１）を用い、３’側プライマーに
はアダプタープライマーを用いた。５’ＲＡＣＥ法は以
下のようにして行った。前述したものと同じｐｏｌｙＡ
（＋）ＲＮＡ １μｇ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
ｐＨ８．３、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ2 、
１０ｍＭ ＤＴＴ、各２５０μＭ ｄＮＴＰ、０．１μ
Ｍプライマー、２００単位Ｍｏ−ＭＬＶ−逆転写酵素
（米ＢＲＬ社製）からなる反応液２０μｌ中で４２℃一
時間保温し、ｃＤＮＡを合成した。プライマーには既知
配列（配列番号３）の一部に相補的な配列を持つ、CAG
GGT AAG GGA ACA TAA CTC CTG （ＧＳＰ２）を用いた。
得られたｃＤＮＡはマイクロコン１００（米アミコン社
製）を用いて限外濾過法により余剰のプライマーを除い
た後、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３、７５ｍ
Ｍ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ2 、２００μＭ ｄＡＴ
Ｐ、１０単位ＴｄＴａｓｅからなる反応液２０μｌ中で
３７℃で１０分間保温し、５’末端にｐｏｌｙ（Ａ）を
付加した。反応液は６５℃、１５分間の熱処理によりＴ
ｄＴａｓｅを不活化した後、５μｌをとってＰＣＲの鋳
型とした。ＰＣＲ反応に際してのプライマーとしては
５’側にアダプタープライマー、３’側にはＰＣＲの特
異性を高めるため、ＧＳＰ２のさらに上流にあるCTCTCA
AGA ATC CAC CCG ATG TA（ＧＳＰ３）を用いた。さら
に、ＰＣＲの第１サイクルでｃＤＮＡの相補鎖を合成す
るために２ｎＭ（ｄＴ）17−アダプタープライマーを加
えておいた。他の条件は通常のＰＣＲと同様な条件で行
った。
ムスルのアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼｃＤＮＡ全
長のクローニング 実施例２で記した部分的なアシル−ＡＣＰ−チオエステ
ラーゼ遺伝子の配列を元に、実施例１で得られたｃＤＮ
Ａを鋳型とし、いわゆる５’ＲＡＣＥ法および３’ＲＡ
ＣＥ法（Frohmannら(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 85:8998-9002）によってｃＤＮＡの両末端部分を増幅
し、クローニングした。３’ＲＡＣＥ法は以下のように
して行った。前述したものと同じｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮ
Ａ １μｇ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．
３、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１０ｍＭ
ＤＴＴ、各２５０μＭ ｄＮＴＰ、０．５μＭ（ｄ
Ｔ）17−アダプタープライマー（GAC TCG AGT CGA CAT
CGA TTT TTT TTT TTT TTT TT）、２００単位Ｍｏ−ＭＬ
Ｖ−逆転写酵素（米ＢＲＬ社製）からなる反応液２０μ
ｌ中で４２℃一時間保温し、ｃＤＮＡを合成した。反応
後、反応液を蒸留水で１０倍に希釈し、そのうち５μｌ
をとってＰＣＲをおこなった。５’側の既知配列（配列
番号３）中のプライマーとしてはCAT GAG ATA GAG CCT
CAT TTT GTG （ＧＳＰ１）を用い、３’側プライマーに
はアダプタープライマーを用いた。５’ＲＡＣＥ法は以
下のようにして行った。前述したものと同じｐｏｌｙＡ
（＋）ＲＮＡ １μｇ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
ｐＨ８．３、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ2 、
１０ｍＭ ＤＴＴ、各２５０μＭ ｄＮＴＰ、０．１μ
Ｍプライマー、２００単位Ｍｏ−ＭＬＶ−逆転写酵素
（米ＢＲＬ社製）からなる反応液２０μｌ中で４２℃一
時間保温し、ｃＤＮＡを合成した。プライマーには既知
配列（配列番号３）の一部に相補的な配列を持つ、CAG
GGT AAG GGA ACA TAA CTC CTG （ＧＳＰ２）を用いた。
得られたｃＤＮＡはマイクロコン１００（米アミコン社
製）を用いて限外濾過法により余剰のプライマーを除い
た後、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３、７５ｍ
Ｍ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ2 、２００μＭ ｄＡＴ
Ｐ、１０単位ＴｄＴａｓｅからなる反応液２０μｌ中で
３７℃で１０分間保温し、５’末端にｐｏｌｙ（Ａ）を
付加した。反応液は６５℃、１５分間の熱処理によりＴ
ｄＴａｓｅを不活化した後、５μｌをとってＰＣＲの鋳
型とした。ＰＣＲ反応に際してのプライマーとしては
５’側にアダプタープライマー、３’側にはＰＣＲの特
異性を高めるため、ＧＳＰ２のさらに上流にあるCTCTCA
AGA ATC CAC CCG ATG TA（ＧＳＰ３）を用いた。さら
に、ＰＣＲの第１サイクルでｃＤＮＡの相補鎖を合成す
るために２ｎＭ（ｄＴ）17−アダプタープライマーを加
えておいた。他の条件は通常のＰＣＲと同様な条件で行
った。
【００２５】以上のようにしてｍＲＮＡの５’末端また
は３’末端に対応する塩基配列を含むＤＮＡ断片を得
た。これらの断片は常法によりクローニングし、末端部
の塩基配列を決定した。得られた両末端の配列を元にし
て、５’末端部に相補的なプライマーCGA TGCTCT AGA A
TC ATG GTG GCT および３’末端部に相補的なプライマ
ーGGC CAA AGAGCT CCA AAC AAA CTA C を合成し、これ
らを用いて、実施例１で得られたｃＤＮＡを鋳型として
ＰＣＲ法を行い、一続きのアシル−ＡＣＰ−チオエステ
ラーゼ遺伝子を増幅した。プライマーにはその後のクロ
ーニングに利用するためにＸｂａＩおよびＳａｃＩの制
限酵素認識配列が含まれいている。なお、耐熱性ＤＮＡ
合成酵素は、ＵＬＴｍａTMＤＮＡポリメラーゼ（米パー
キンエルマー社製）を用いた。
は３’末端に対応する塩基配列を含むＤＮＡ断片を得
た。これらの断片は常法によりクローニングし、末端部
の塩基配列を決定した。得られた両末端の配列を元にし
て、５’末端部に相補的なプライマーCGA TGCTCT AGA A
TC ATG GTG GCT および３’末端部に相補的なプライマ
ーGGC CAA AGAGCT CCA AAC AAA CTA C を合成し、これ
らを用いて、実施例１で得られたｃＤＮＡを鋳型として
ＰＣＲ法を行い、一続きのアシル−ＡＣＰ−チオエステ
ラーゼ遺伝子を増幅した。プライマーにはその後のクロ
ーニングに利用するためにＸｂａＩおよびＳａｃＩの制
限酵素認識配列が含まれいている。なお、耐熱性ＤＮＡ
合成酵素は、ＵＬＴｍａTMＤＮＡポリメラーゼ（米パー
キンエルマー社製）を用いた。
【００２６】得られたＤＮＡ断片は制限酵素ＸｂａＩお
よびＳａｃＩで消化した後プラスミドベクターｐＵＣ１
９のマルチクローニング部位に挿入してクローニングし
た。この組み換え体プラスミドをｐＣＬＴＥ４６と命名
した。なお、このプラスミドベクターを導入したＥ．ｃ
ｏｌｉ ＣＬＴＥ４６は、工業技術院生命工学工業技術
研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１４７０５として（寄託日：平
成６年１２月１３日）寄託されている。
よびＳａｃＩで消化した後プラスミドベクターｐＵＣ１
９のマルチクローニング部位に挿入してクローニングし
た。この組み換え体プラスミドをｐＣＬＴＥ４６と命名
した。なお、このプラスミドベクターを導入したＥ．ｃ
ｏｌｉ ＣＬＴＥ４６は、工業技術院生命工学工業技術
研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１４７０５として（寄託日：平
成６年１２月１３日）寄託されている。
【００２７】得られたクローンｐＣＬＴＥ４６の全塩基
配列は、配列番号１に示す通りである。１４９０塩基か
らなるこの配列は、最長４１９アミノ酸からなる蛋白質
をコードできる読み枠を持つ。この最も長い読み枠に従
ってこの遺伝子のコードする蛋白質の推定アミノ酸配列
は、配列番号２に示す通りである。このアミノ酸配列は
ゲッケイジュのアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼとア
ミノ酸配列レベルで５３％の相同性があり、ゲッケイジ
ュ、ナタネ、ベニバナのアシル−ＡＣＰ−チオエステラ
ーゼ間で保存されたアミノ酸配列の殆どを共通に持つ。
このことから、このクローンがクフェア・レプトポダ・
ヘムスルのアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼをコード
するｃＤＮＡを含むことは明らかである。
配列は、配列番号１に示す通りである。１４９０塩基か
らなるこの配列は、最長４１９アミノ酸からなる蛋白質
をコードできる読み枠を持つ。この最も長い読み枠に従
ってこの遺伝子のコードする蛋白質の推定アミノ酸配列
は、配列番号２に示す通りである。このアミノ酸配列は
ゲッケイジュのアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼとア
ミノ酸配列レベルで５３％の相同性があり、ゲッケイジ
ュ、ナタネ、ベニバナのアシル−ＡＣＰ−チオエステラ
ーゼ間で保存されたアミノ酸配列の殆どを共通に持つ。
このことから、このクローンがクフェア・レプトポダ・
ヘムスルのアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼをコード
するｃＤＮＡを含むことは明らかである。
【００２８】
【発明の効果】本発明により、クフェア・レプトポダ・
ヘムスル由来のアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ遺伝
子が提供される。アシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ
は、医薬品、食品として有用である中鎖脂肪酸合成の鍵
となる酵素であり、産業的に利用価値が高い。
ヘムスル由来のアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ遺伝
子が提供される。アシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ
は、医薬品、食品として有用である中鎖脂肪酸合成の鍵
となる酵素であり、産業的に利用価値が高い。
【００２９】
配列番号 １ 配列の長さ：１４９０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：mRNA to cDNA 起源 生物名 ：Cuphea leptopoda Hemsl. 配列
【００３０】
【００３１】配列番号 ２ 配列の長さ：４１９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 起源 生物名 ：Cuphea leptopoda Hemsl. 配列
【００３２】
【００３３】配列番号 ３ 配列の長さ：２７７ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：mRNA to cDNA 起源 生物名 ：Cuphea leptopoda Hemsl. 配列
【００３４】
【００３５】配列番号 ４ 配列の長さ：９２ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：不明 配列の種類：ペプチド 起源 生物名 ：Cuphea leptopoda Hemsl. 配列
【００３６】
Claims (3)
- 【請求項１】 配列番号２で表されるアミノ酸配列をコ
ードするアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ遺伝子。 - 【請求項２】 塩基配列が、配列番号１で表される請求
項１記載のアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ遺伝子。 - 【請求項３】 請求項１又は請求項２記載のアシル−Ａ
ＣＰ−チオエステラーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入
した組み換え体ＤＮＡ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6320547A JPH08173165A (ja) | 1994-12-22 | 1994-12-22 | クフェア属植物の中鎖脂肪酸合成に関する遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6320547A JPH08173165A (ja) | 1994-12-22 | 1994-12-22 | クフェア属植物の中鎖脂肪酸合成に関する遺伝子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08173165A true JPH08173165A (ja) | 1996-07-09 |
Family
ID=18122655
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6320547A Pending JPH08173165A (ja) | 1994-12-22 | 1994-12-22 | クフェア属植物の中鎖脂肪酸合成に関する遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08173165A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101490241A (zh) * | 2006-05-19 | 2009-07-22 | Ls9公司 | 脂肪酸及其衍生物的制备 |
| CN104894044A (zh) * | 2006-05-19 | 2015-09-09 | Reg生命科学有限责任公司 | 脂肪酸及其衍生物的制备 |
| US10844406B2 (en) | 2006-05-19 | 2020-11-24 | Genomatica, Inc. | Production of fatty acids and derivatives thereof |
| US11046635B2 (en) | 2006-05-19 | 2021-06-29 | Genomatica, Inc. | Recombinant E. coli for enhanced production of fatty acid derivatives |
| US11434512B2 (en) | 2006-05-19 | 2022-09-06 | Genomatica, Inc. | Production of fatty acid esters |
-
1994
- 1994-12-22 JP JP6320547A patent/JPH08173165A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101490241A (zh) * | 2006-05-19 | 2009-07-22 | Ls9公司 | 脂肪酸及其衍生物的制备 |
| CN104894044A (zh) * | 2006-05-19 | 2015-09-09 | Reg生命科学有限责任公司 | 脂肪酸及其衍生物的制备 |
| CN105838657A (zh) * | 2006-05-19 | 2016-08-10 | Reg生命科学有限责任公司 | 脂肪酸及其衍生物的制备 |
| US10844406B2 (en) | 2006-05-19 | 2020-11-24 | Genomatica, Inc. | Production of fatty acids and derivatives thereof |
| US11046635B2 (en) | 2006-05-19 | 2021-06-29 | Genomatica, Inc. | Recombinant E. coli for enhanced production of fatty acid derivatives |
| US11434512B2 (en) | 2006-05-19 | 2022-09-06 | Genomatica, Inc. | Production of fatty acid esters |
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