CN113637600B - 一种高效石油烃降解菌及其筛选方法和应用 - Google Patents

一种高效石油烃降解菌及其筛选方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高效石油烃降解菌及其筛选方法和应用，该石油烃降解菌为红球菌Rhodococcus sp.OBD‑3，所述红球菌为革兰氏阳性菌，菌株形态呈杆状，且在Luria‑Bertani固体培养基上菌落形态规则，呈乳酪色，圆形，菌落表面干燥粗糙，不透明。可在降解有机化合物中应用；经鉴定一株高效石油烃降解菌红球菌Rhodococcus sp.OBD‑3在28℃，pH 8.0，总盐度1％下，有氧避光培养，能降解浓度为1g/L的原油，3天降解率为75.8％，7天降解率为89.1％。所述红球菌在广泛的温度范围(15℃‑37℃)、pH范围(pH 6.0‑9.0)和盐度范围(总盐度1％‑7％)条件下均可高效降解石油烃，对环境产生的负面影响小，可应用于一般土壤或水环境、盐碱地和海洋石油污染的生物修复中，具有很好的开发利用前景。

Description

一种高效石油烃降解菌及其筛选方法和应用
技术领域
本发明属于微生物降解处理技术领域，涉及一种高效石油烃降解菌及其筛选方法和应用。
背景技术
随着我国经济的高速发展，石油的需求逐渐增加，石油工业快速发展，但石油的环境污染问题日益严重。在石油的开采、炼制、加工、运输及使用过程中出现的原油泄漏与溢油事故，对土壤和水体造成了严重污染。石油污染会影响土壤的通透性，破坏土壤结构，影响土壤种微生物和植物的生长，降低土壤的利用价值。石油会在水面形成油膜，从而降低水中溶解氧，严重破坏水生生态系统。另一方面，石油中主要含有烷烃、烷烃、环烷烃、芳烃，可通过食物链进入人体，危害人类健康。
目前，常用的石油烃污染修复方法主要有物理、化学和生物修复法。相较于物理和化学修复，生物修复具有成本低，操作简便，二次污染小以及处理效果良好等优点，被视为最有前途的环境治理手段。然而，由于盐度和温度等因素，一般的石油烃降解菌对盐碱土和海洋的石油污染修复效果不理想。因此，耐盐、低温等可抵抗极端环境的高效石油烃降解菌成为解决此类问题的关键。近年来，围绕耐盐、低温高效石油烃降解菌的筛选，国内外的多个研发机构和企业单位开展了积极探索。例如：
CN109652339A公开了一种原油降解菌株及其应用，利用中度嗜盐菌Salinicolasp.X4在30-40℃下在盐浓度为30-80g/L的环境下5d降解50％以上的3g/L柴油，适于高盐环境，在石油行业高盐含油废水及海上原油泄漏事故处理中有良好的应用潜力。
CN104017747A公开了一种含油污泥中石油降解菌及其应用，利用谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum在37℃下降解含油污泥，对饱和烃降解率为 20.74％，对总石油烃的降解率为39.69％，其在22℃下对总石油烃的降解率低于20％。
CN105907675A公开了一株具有低温降解石油功能的红球菌Rhodococcus sp.QY-2及其应用。该菌可在低温条件和2.4％盐度的条件下高效降解石油，在0℃和15℃下60d分别可降解5g/L原油的53％和67％，可应用于北方海域冬季等低温环境下的石油污染的生物修复。
以上专利中提供的菌株，在一定条件下对原油污染物具有一定的降解功能，但针对可在广泛的温度范围(15℃-37℃)、pH范围(pH 6.0-9.0)和盐度范围(总盐度1％-7％)条件下均可高效降解石油烃的降解菌株还有待挖掘。
发明内容
本发明的目的就是为了提供一种高效石油烃降解菌及其筛选方法和应用，以解决现有菌株难以在广泛温度、pH范围和盐度内均可以实现对石油烃化合物的高效降解等问题。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一方面，本发明提供了一种高效石油烃降解菌，其为红球菌Rhodococcus sp.OBD-3，菌株代码为OBD-3，已于2020年12月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏编号为 CCTCC NO:M 2020978。
进一步的，其革兰氏染色呈阳性，菌株形态呈杆状，且在Luria-Bertani固体培养基上菌落形态规则，呈乳酪色，圆形，菌落表面干燥粗糙，不透明。
另一方面，本发明还提供了一种高效石油烃降解菌的筛选方法，包括以下步骤：
(1)将基础无机盐培养基、微量元素混合液和原油溶液混合，得到液体培养基；
(2)取来源于油库污染土壤的土壤样品置于一份液体培养基中，混合，得到含菌的第一混合液，培养后移取10％的第一混合液再转移至另一份液体培养基中，得到第二混合液，如此重复若干次，直至得到第n混合液，其中，n＝6-8；
(3)将所得第n混合液涂布到Luria-Bertani固体培养基平板上，划线分离培养，即得到高效石油烃降解菌。另外，对所得高效石油烃降解菌进行16S rRNA基因测序，经鉴定本发明的降解菌其16S rRNA基因部分序列与模式菌株Rhodococcus qingshengii djl-6的相似度为100％，因此，命名为红球菌Rhodococcus sp.OBD-3。同时，本发明的红球菌Rhodococcus sp.OBD-3的16S rRNA基因部分序列由其基因组为模板采用通用27F/1492R引物PCR扩增，并在GeneBank上选取高相似度序列，用MEGA X构建系统发育树，且Rhodococcussp.OBD-3 16S rRNA基因部分序列已上传至GeneBank(MW404441)。
进一步的，步骤(1)中，所述的基础无机盐培养基中的无机盐成分至少包含：0.2g/L NH4Cl，7.95g/L NaCl，0.77g/L MgCl2·6H2O，1.05g/L MgSO4·7H2O，0.076 g/LCaCl2，0.22g/L KCl，0.01g/L NaHCO3，0.026g/L NaBr，0.25g/L K2HPO4。
进一步的，步骤(1)中，所述的微量元素混合液中的溶质成分至少包括：0.15 g/LZnSO4·7H2O，0.26g/L MnSO4·H2O，0.03g/L CoCl2·6H2O，4.5g/L FeSO4·7H2O， 0.02g/LNiCl2·6H2O，0.01g/L CuCl2，0.1g/L Na2MoO4·2H2O，0.06g/L H3BO3。
进一步的，步骤(1)中，所述的原油的密度为0.8g/cm3，终浓度为800mg/L，且基础无机盐培养基、微量元素溶液和原油溶液的体积比为103:1:1。
进一步的，步骤(2)中，制得第一混合液时，土壤样品与液体培养基的添加量之比为5g:100mL。
进一步的，步骤(3)中，分离纯化过程具体为：用接种环蘸取第n混合液在 Luria-Bertani固体培养基平板上涂布培养出的单菌在另一干净的Luria-Bertani固体培养基平板上继续划线分离，重复2-3次，即得到高效石油烃降解菌。
进一步的，步骤(2)中和步骤(3)中，培养过程在密闭条件下进行，温度为 28℃，每次培养的时间为2-3d。
再另一方面，本发明还提出了一种高效石油烃降解菌在降解石油烃类化合物体系中的应用。
与现有技术相比，本发明提供的红球菌Rhodococcus sp.OBD-3，其16S rRNA 基因部分序列与模式菌株Rhodococcus qingshengii djl-6的相似度为100％。红球菌Rhodococcus sp.OBD-3在28℃，pH 8.0，总盐度1％下，有氧避光培养，能降解浓度为1g/L的原油，3天降解率为75.8％，7天降解率为89.1％。在广泛的温度范围 (15℃-37℃)和pH范围(pH 6.0-9.0)条件下，7天降解率达60.6％-89.1％。红球菌Rhodococcus sp.OBD-3在广泛的温度范围(15℃-37℃)、pH范围(pH 6.0-9.0) 和盐度范围(总盐度1％-7％)条件下均可高效降解石油烃，对环境产生的负面影响小，具有很好的开发利用前景。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
图1为本发明提供的石油烃降解菌株红球菌Rhodococcus sp.OBD-3的菌落形态图。
图2为本发明提供的石油烃降解菌株红球菌Rhodococcus sp.OBD-3的扫描电镜图。
图3为本发明提供的石油烃降解菌株红球菌Rhodococcus sp.OBD-3的系统发育树。
图4为本发明中提供的不同底物浓度对石油烃降解菌株红球菌Rhodococcussp.OBD-3的石油烃降解率效果示意图。
图5为本发明中提供的不同pH对石油烃降解菌株红球菌Rhodococcus sp.OBD-3的石油烃降解率效果示意图。
图6为本发明中提供的不同温度对石油烃降解菌株红球菌Rhodococcus sp.OBD-3的石油烃降解率效果示意图。
图7为本发明中提供的不同盐度对石油烃降解菌株红球菌Rhodococcus sp.OBD-3的石油烃降解率效果示意图。
图8为本发明中提供的石油烃降解菌株红球菌Rhodococcus sp.OBD-3的降解率曲线图。
图9为本发明中提供的石油烃降解菌株红球菌Rhodococcus sp.OBD-3降解石油烃的GC色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
特别的，在本文中所披露范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
以下各实施例中，如无特别说明的原料或处理技术，即表明其均为本领域的常规市售原料或常规处理技术。
一方面，本发明提供了一种高效石油烃降解菌，其为红球菌，菌株代码为 OBD-3，已于2020年12月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC NO:M 2020978。
进一步的，其革兰氏染色呈阳性，菌株形态呈杆状，且在Luria-Bertani固体培养基上菌落形态规则，呈乳酪色，圆形，菌落表面干燥粗糙，不透明。
另一方面，本发明还提供了一种高效石油烃降解菌的筛选方法，包括以下步骤：
(1)将基础无机盐培养基、微量元素混合液和原油溶液混合，得到液体培养基；
(2)取来源于油库污染土壤的土壤样品置于一份液体培养基中，混合，得到含菌的第一混合液，培养后移取10％的第一混合液再转移至另一份液体培养基中，得到第二混合液，如此重复若干次，直至得到第n混合液，其中，n＝6-8；
(3)将所得第n混合液涂布到Luria-Bertani固体培养基平板上，划线分离培养，即得到高效石油烃降解菌。另外，对所得高效石油烃降解菌进行16S rRNA基因测序，经鉴定本发明的降解菌其16S rRNA基因部分序列与模式菌株Rhodococcus qingshengii djl-6的相似度为100％，因此，命名为红球菌Rhodococcus sp.OBD-3。同时，本发明的红球菌Rhodococcus sp.OBD-3的16S rRNA基因部分序列由其基因组为模板采用通用27F/1492R引物PCR扩增，并在GeneBank上选取高相似度序列，用MEGA X构建系统发育树，且Rhodococcussp.OBD-3 16S rRNA基因部分序列已上传至GeneBank(MW404441)。
进一步的，步骤(1)中，所述的基础无机盐培养基中的无机盐成分至少包含：0.2g/L NH4Cl，7.95g/L NaCl，0.77g/L MgCl2·6H2O，1.05g/L MgSO4·7H2O，0.076 g/LCaCl2，0.22g/L KCl，0.01g/L NaHCO3，0.026g/L NaBr，0.25g/L K2HPO4。
进一步的，步骤(1)中，所述的微量元素混合液中的溶质成分至少包括：0.15 g/LZnSO4·7H2O，0.26g/L MnSO4·H2O，0.03g/L CoCl2·6H2O，4.5g/L FeSO4·7H2O， 0.02g/LNiCl2·6H2O，0.01g/L CuCl2，0.1g/L Na2MoO4·2H2O，0.06g/L H3BO3。
进一步的，步骤(1)中，所述的原油的密度为0.8g/cm3，终浓度为800mg/L，且基础无机盐培养基、微量元素溶液和原油溶液的体积比为103:1:1。
进一步的，步骤(2)中，制得第一混合液时，土壤样品与液体培养基的添加量之比为5g:100mL。
进一步的，步骤(3)中，分离纯化过程具体为：用接种环蘸取第n混合液在 Luria-Bertani固体培养基平板上涂布培养出的单菌在另一干净的Luria-Bertani固体培养基平板上继续划线分离，重复2-3次，即得到高效石油烃降解菌。
进一步的，步骤(2)中和步骤(3)中，培养过程在密闭条件下进行，温度为 28℃，每次培养的时间为2-3d。
再另一方面，本发明还提出了一种高效石油烃降解菌在降解石油烃类化合物体系中的应用。
下面结合具体实施例来对上述实施方式进行更详细的说明。
实施例1：
菌株的形态特征
将单菌落划线接种至Luria-Bertani固体培养基上，将平板倒置在恒温培养箱，28℃培养2天，菌落形态规则，呈乳酪色，圆形，菌落表面干燥粗糙，不透明，参见图1。菌株形态呈杆状，参见图2。
实施例2：
菌株的筛选与鉴定
从上海某油库采取污染土壤(样品编号D7，地下1.7m)装于棕色瓶中运回实验室进行菌株筛选工作。
(1)将基础无机盐培养基、微量元素混合液和原油溶液混合，得到液体培养基；其中，所述的基础无机盐培养基中的无机盐成分包含：0.2g/L NH4Cl，7.95g/L NaCl，0.77g/LMgCl2·6H2O，1.05g/L MgSO4·7H2O，0.076g/L CaCl2，0.22g/L KCl，0.01g/L NaHCO3，0.026g/L NaBr，0.25g/L K2HPO4。所述的微量元素混合液中的溶质成分包括：0.15g/LZnSO4·7H2O，0.26g/L MnSO4·H2O，0.03g/L CoCl2·6H2O，4.5g/L FeSO4·7H2O，0.02g/LNiCl2·6H2O，0.01g/L CuCl2，0.1g/L Na2MoO4·2H2O，0.06g/L H3BO3。所述的原油的密度为0.8g/cm3，终浓度为800 mg/L。无机盐培养基，微量元素溶液，原油添加体积比为103:1:1。
(2)取来源于油库污染土壤的土壤样品置于一份液体培养基中，混合，得到含菌的第一混合液，培养后移取10％的第一混合液再转移至另一份液体培养基中，得到第二混合液，如此重复若干次，直至得到第6混合液；制得第一混合液时，土壤样品与液体培养基的添加量之比为5g:100mL。所述筛选条件为在密闭条件下进行，温度为28℃，摇床转速为180r/min，培养时间为4d左右。
(3)将所得第6混合液涂布到Luria-Bertani固体培养基平板上，28℃温箱培养2天后从平板上挑出不同形态的菌落，分离纯化，提取DNA，进行16S rRNA 基因测序，即得红球菌Rhodococcus sp.OBD-3，其中，所述Luria-Bertani固体培养基的组分为胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂粉15g，去离子水1L。
此处，分离纯化过程具体为：用接种环蘸取第6混合液在Luria-Bertani固体培养基平板上涂布培养出的单菌在另一干净的Luria-Bertani固体培养基平板上划线分离，划线分离重复2-3次，即得到石油烃降解菌。
上述红球菌Rhodococcus sp.OBD-3 16S rRNA基因部分序列由其基因组为模板采用通用27F/1492R引物PCR扩增，并在GeneBank上选取高相似度序列，用MEGA X构建系统发育树，参见图3。
实施例3：
菌株对水体中石油烃降解效果的优化
将红球菌Rhodococcus sp.OBD-3接入至含有0.8g/L石油烃的Luria-Bertani培养基扩大培养后，8000r/min离心5min，并用1％无机盐培养基重悬洗菌2次，转接至50mL无机盐培养基置于250mL三角烧瓶中，初始OD600为0.2。菌液置于 180r/min，避光条件下振荡培养7天，取样利用GC测定石油烃的残留浓度。
1.不同底物浓度
降解条件：温度28℃，pH 6.6，酵母粉50mg/L，总盐度1％；原油：0.5g/L、 1.0g/L、1.5g/L、2.0g/L；
结果表明：图4为本发明中提供的不同底物浓度对石油烃降解菌株红球菌Rhodococcus sp.OBD-3的石油烃降解率效果示意图。底物浓度在0-2g/L范围内对菌株OBD-3降解效果无抑制作用，均可稳定降解，且在范围内最大降解速率为 207.3mg/(L·d)。
2.不同pH
降解条件：温度28℃，原油1.0g/L，酵母粉50mg/L，总盐度1％；pH：6.0、 7.0、8.0、9.0；
结果表明：图5为本发明中提供的不同温度对石油烃降解菌株红球菌Rhodococcus sp.OBD-3的石油烃降解率效果示意图。菌株OBD-3在pH 6.0-9.0环境内对石油烃均有良好的降解效果，降解率为75.3％-86.6％，且可在中性和碱性环境下(pH 7.0-9.0)降解率均大于82.0％。
3.不同温度
降解条件：pH 8.0，原油1.0g/L，酵母粉50mg/L，总盐度1％；温度：15℃、 28℃、37℃；
结果表明：图6为本发明中提供的不同pH对石油烃降解菌株红球菌 Rhodococcussp.OBD-3的石油烃降解率效果示意图。菌株OBD-3在28℃-37℃环境内对石油烃均有良好的降解效果，降解率可达83.4％以上；且在低温环境下 (15℃)降解率可达60.6％，降解速率为86.6mg/(L·d)，较Rhodococcus sp.QY-2 在15℃下的降解速率55.8mg/(L·d)高1.56倍。
4.不同盐度
降解条件：温度28℃，pH 8.0，原油1.0g/L，酵母粉50mg/L；总盐度：1％、 3％、5％、7％(按上述基础无机盐培养基配方比例配置)；
结果表明，图7为本发明中提供的不同盐度对石油烃降解菌株红球菌Rhodococcus sp.OBD-3的石油烃降解率效果示意图。菌株OBD-3在总盐度为 1％-7％环境内对石油烃均有良好的降解效果，降解率为81.1％-84.8％。与一般石油烃降解菌株相比具有耐盐性(而在原油初始浓度5g/L的MMS培养、菌液接种量10％(v/v)、120rpm的条件下降解60d，QY-2在0℃和15℃的降解率分别为53％和66％)。
实施例4：
菌株对水体中石油烃降解的最优效果
将红球菌Rhodococcus sp.OBD-3接入至含有0.8g/L石油烃的Luria-Bertani培养基扩大培养后，8000r/min离心5min，并用1％无机盐培养基重悬洗菌2次，转接至pH 8.0的50mL无机盐培养基置于250mL三角烧瓶中，初始OD600为0.2。菌液置于180r/min，避光条件下28℃振荡培养，分别在0天、3天、5天、7天、 9天取样，利用GC测定石油烃的残留浓度。
结果表明：图8为本发明中提供的石油烃降解菌株红球菌Rhodococcus sp.OBD-3的降解率曲线图以及图9为本发明中提供的石油烃降解菌株红球菌 Rhodococcus sp.OBD-3降解石油烃的GC色谱图。菌株OBD-3在28℃，pH 8.0，总盐度1％下7天内可有效降解原油，7天降解率为89.1％；且3天内可降解75.8％的原油，3天降解速率为252.8mg/(L·d)。
实施例5：
菌株对上海某汽修厂污染场地土壤中石油烃的修复效果
将红球菌Rhodococcus sp.OBD-3接入至含有0.8g/L石油烃的Luria-Bertani培养基扩大培养后，转接至50L LB培养基中培养，接种量为4％。当OD600为1.0 左右，将菌剂与水按1:1比例混合配兑，混合均匀后，采用土壤分层喷洒的投加方式，逐层覆土与喷洒至100-300ppm污染浓度的土壤，土方量约60方。土壤pH 环境为8.1-8.2；土壤初始含水率为25％左右；试验温度为当时的室外温度3-16℃。利用PID气体探测器检测总石油烃含量。
结果表明：该地块使用红球菌Rhodococcus sp.OBD-3修复44天后，总石油烃降解率为22.4％，说明红球菌Rhodococcus sp.OBD-3对实际污染场地修复具有一定的效果。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华东理工大学
<120> 一种高效石油烃降解菌及其筛选方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1325
<212> DNA
<213> Rhodococcus sp.
<400> 1
tacacgagcg gcgaacgggt gagtaacacg tgggtgatct gccctgcact tcgggataag 60
cctgggaaac tgggtctaat accggatatg acctcctatc gcatggtggg tggtggaaag 120
atttatcggt gcaggatggg cccgcggcct atcagcttgt tggtggggta atggcctacc 180
aaggcgacga cgggtagccg acctgagagg gtgaccggcc acactgggac tgagacacgg 240
cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattgcac aatgggcgaa agcctgatgc 300
agcgacgccg cgtgagggat gacggccttc gggttgtaaa cctctttcag cagggacgaa 360
gcgcaagtga cggtacctgc agaagaagca ccggctaact acgtgccagc agccgcggta 420
atacgtaggg tgcaagcgtt gtccggaatt actgggcgta aagagttcgt aggcggtttg 480
tcgcgtcgtt tgtgaaaacc agcagctcaa ctgctggctt gcaggcgata cgggcagact 540
tgagtactgc aggggagact ggaattcctg gtgtagcggt gaaatgcgca gatatcagga 600
ggaacaccgg tggcgaaggc gggtctctgg gcagtaactg acgctgagga acgaaagcgt 660
gggtagcgaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacggtgg gcgctaggtg 720
tgggttcctt ccacggaatc cgtgccgtag ctaacgcatt aagcgccccg cctggggagt 780
acggccgcaa ggctaaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gcggagcatg 840
tggattaatt cgatgcaacg cgaagaacct tacctgggtt tgacatatac cggaaagctg 900
cagagatgtg gccccccttg tggtcggtat acaggtggtg catggctgtc gtcagctcgt 960
gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cctatcttat gttgccagca 1020
cgttatggtg gggactcgta agagactgcc ggggtcaact cggaggaagg tggggacgac 1080
gtcaagtcat catgcccctt atgtccaggg cttcacacat gctacaatgg ccagtacaga 1140
gggctgcgag accgtgaggt ggagcgaatc ccttaaagct ggtctcagtt cggatcgggg 1200
tctgcaactc gaccccgtga agtcggagtc gctagtaatc gcagatcagc aacgctgcgg 1260
tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacgt catgaaagtc ggtaacaccc 1320
gaagc 1325

Claims (2)

1.一种高效石油烃降解菌，其特征在于，其为红球菌，菌株代码为OBD-3，已于2020年12月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020978。
2.如权利要求1所述的一种高效石油烃降解菌在降解石油烃类化合物体系中的应用。
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