CN109909294B - 一种重金属污染土壤的微生物修复方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重金属污染土壤的微生物修复方法，包括以下步骤：（1）土样采集；（2）制备土壤稀释液；（3）平板培养基制备；（4）接种；（5）平板培养；（6）碳微球制备；（7）摇瓶培养；（8）悬菌液制备；（9）微生物投放。以重金属污染区域的土壤上清液培养菌株，培养抗性菌株，提高微生物修复中菌株的成活率，利用抗性菌株与污染土壤的相互作用，达到修复重金属污染的目的。以碳微球作为菌株的载体，菌株合理固定，成活率高，有助于形成稳定的菌落，从而降低重金属污染程度。

Description

一种重金属污染土壤的微生物修复方法

技术领域

本发明涉及污染土壤修复技术领域，尤其涉及一种重金属污染土壤的微生物修复方法。

背景技术

2014年国家环保部与国土资源部发布的土壤污染调查报告显示，我国约有16.1%的土壤受到了各种污染。在所有土壤污染物类型中，重污染企业、采矿区、工业园区、重金属污水的灌溉、工业废渣的堆放、大气沉降以及含重金属的化肥等是土壤重金属的重要来源。重金属在土壤中不可生物降解，容易在植物体内富集，最终进入人体，危害人体健康。在农田或场地修复应用中，微生物制剂可辅助植物修复污染土壤，微生物不仅能去除污染土壤中的有害物质，还能提高污染地区的土壤肥力，改善土壤结构。

现有技术中，重金属污染土壤的微生物修复通常直接将微生物接种在土壤中。该方式菌株不易固定，成活率低，从而导致微生物修复的效果欠佳，土壤污染程度难以改善。

发明内容

本发明提供了一种重金属污染土壤的微生物修复方法，以解决微生物修复中菌株不易固定，成活率低，从而导致微生物修复的效果欠佳，土壤污染程度难以改善的问题。

本发明提供的重金属污染土壤的微生物修复方法，包括以下步骤：

（1）土样采集：在重金属污染土壤中取土壤10g备用。

（2）制备土壤稀释液：称取土壤2g，放入有198mL无菌水的三角瓶中，振荡均匀，即为10^-2稀释度的土壤悬液，然后进行十倍梯度稀释，依次制备10^-3到10^-7稀释度的土壤稀释液。

（3）平板培养基制备：按培养基配方各配置牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基、高氏Ⅰ号平板培养基和马丁氏平板培养基各100mL，灭菌后分别倒平板。

（4）接种：用无菌吸管吸取0.1mL相应稀释度（10^-3到10^-7稀释度）的土壤稀释液，以无菌操作技术接种在平板培养基上，涂布均匀；选用三个适宜稀释度的土壤悬液分别接种于牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基、高氏Ⅰ号平板培养基、马丁氏平板培养基，对应得到细菌平板、放线菌平板和真菌平板。

（5）平板培养：细菌平板于37℃恒温培养1-2d，放线菌平板于30℃培养2-3d，真菌平板于30℃培养3-5d，分别对应得到细菌菌种、放线菌菌种、真菌菌种。

（6）碳微球制备：将葡萄糖、聚木糖和甘露糖，加入去离子水溶解，加入三氯化铁混合，转移到反应釜中，在真空干燥箱中150-200℃下，水热反应10-15h，洗涤、过滤后，70-100℃下干燥10-15h，得到碳微球。

（7）摇瓶培养：制备牛肉膏液体培养基、高氏Ⅰ号液体培养基和马丁氏液体培养基，将步骤（6）得到的碳微球加入牛肉膏液体培养基、高氏Ⅰ号液体培养基和马丁氏液体培养基中，将步骤（5）中得到的细菌菌种、放线菌菌种、真菌菌种分别对应接种，在130-170rpm，细菌摇瓶于37℃恒温培养1-2d，放线菌摇瓶于30℃培养2-3d，真菌摇瓶于30℃培养3-5d，分别对应得到细菌悬液、放线菌悬液、真菌悬液。

（8）悬菌液制备：将步骤（7）中得到的细菌悬液、放线菌悬液、真菌悬液取一种或多种，离心10-15min后弃上清，得到悬菌液。

（9）微生物投放：将步骤（8）中得到的悬菌液与未被污染的土壤混合，并撒播于重金属污染土壤区域。

可选地，步骤（6）中，反应釜中还加入NaCl、MgCl₂或/和CaCl₂。

可选地，步骤（6）中，葡萄糖、聚木糖和甘露糖的摩尔比为：1：（0.5-1）：（0.5-1）。

可选地，将重金属污染土壤区域深挖50-80cm，将步骤（9）中得到的悬菌液与未被污染的土壤混合填入。

可选地，步骤（6）中，葡萄糖的浓度为0.2-0.8mol/L。

可选地，所述悬菌液中包括细菌悬液、放线菌悬液、真菌悬液三种。

本发明具有以下有益效果：

（1）以重金属污染区域的土壤上清液培养菌株，培养抗性菌株，提高微生物修复中，菌株的成活率，利用抗性菌株与污染土壤的相互作用，达到修复重金属污染的目的。整个过程中避免了菌株的筛选鉴定，也无需引入新的菌株，操作简单，方便易行。

（2）本发明采用葡萄糖、聚木糖和甘露糖作为混合碳源，在不添加模板剂和表面活性剂的条件下，制备出粒径为5-10μm的单分散碳微球。碳微球作为菌株的载体，菌株合理固定，成活率高，有助于形成稳定的菌落，从而降低重金属污染程度。

应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本发明。

具体实施方式

本发明提供了一种重金属污染土壤的微生物修复方法，以解决微生物修复中菌株不易固定，成活率低，从而导致微生物修复的效果欠佳，土壤污染程度难以改善的问题。下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例1提供的重金属污染土壤的微生物修复方法，包括以下步骤：

（1）土样采集：在重金属污染土壤中取土壤10g备用。

（2）制备土壤稀释液：称取土壤2g，放入有198mL无菌水的三角瓶中，振荡均匀，即为10^-2稀释度的土壤悬液，然后进行十倍梯度稀释，依次制备10^-3到10^-7稀释度的土壤稀释液。

（3）平板培养基制备：按培养基配方各配置牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基、高氏Ⅰ号平板培养基和马丁氏平板培养基500mL，灭菌后分别倒平板。其中，马丁氏平板培养基灭菌前需加入2mL去氧胆酸钠(2%)和0.4mL1万单位/mL链霉素。高氏Ⅰ号平板培养基灭菌前加入10滴10%苯酚。

（4）接种：用无菌吸管吸取0.1mL相应稀释度（10^-3到10^-7稀释度）的土壤稀释液，以无菌操作技术接种在平板培养基上，涂布均匀；选用三个适宜稀释度的土壤悬液分别接种于牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基、高氏Ⅰ号平板培养基和马丁氏平板培养基，对应得到细菌平板、放线菌平板和真菌平板。

（5）平板培养：细菌平板于37℃恒温培养1d，放线菌平板于30℃培养2d，真菌平板于30℃培养4d，分别对应得到细菌菌种、放线菌菌种、真菌菌种。

（6）碳微球制备：取摩尔比为1:0.5:0.5的葡萄糖、聚木糖和甘露糖，加入去离子水溶解，使葡萄糖的浓度为0.5mol/L，再加入FeCl₃、NaCl、MgCl₂、CaCl₂混合，葡萄糖与FeCl₃、NaCl、MgCl₂、CaCl₂的摩尔比为1:0.1:0.1:0.1:0.1。将混合溶液转移到反应釜中，在真空干燥箱中180℃下，水热反应12h，洗涤、过滤后，80℃下干燥12h，得到碳微球。

（7）摇瓶培养：制备牛肉膏液体培养基、高氏Ⅰ号液体培养基和马丁氏液体培养基，将步骤（6）得到的碳微球加入牛肉膏液体培养基、高氏Ⅰ号液体培养基和马丁氏液体培养基中，将步骤（5）中得到的细菌菌种、放线菌菌种、真菌菌种分别对应接种，在150rpm，细菌摇瓶于37℃恒温培养1d，放线菌摇瓶于30℃培养2d，真菌摇瓶于30℃培养4d，分别对应得到细菌悬液、放线菌悬液、真菌悬液。

（8）悬菌液制备：将步骤（7）中得到的细菌悬液、放线菌悬液、真菌悬液混合，2500r/min离心10min后弃上清，得到悬菌液，每毫升悬菌液中的菌总量为5×10⁸-7×10⁸个。

（9）微生物投放：将重金属污染土壤区域深挖50cm，将步骤（8）中得到的悬菌液与未被污染的土壤以0.01L/kg混合填入。

实施例2

本实施例2提供的重金属污染土壤的微生物修复方法，包括以下步骤：

（1）土样采集：在重金属污染土壤中取土壤10g备用。

（2）制备土壤稀释液：称取土壤2g，放入有198mL无菌水的三角瓶中，振荡均匀，即为10^-2稀释度的土壤悬液，然后进行十倍梯度稀释，依次制备10^-3到10^-7稀释度的土壤稀释液。

（3）平板培养基制备：按培养基配方各配置牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基和马丁氏平板培养基100mL，灭菌后分别倒平板。其中，马丁氏平板培养基灭菌前需加入2mL去氧胆酸钠(2%)和0.4mL1万单位/mL链霉素。

（4）接种：用无菌吸管吸取0.1mL相应稀释度（10^-3到10^-7稀释度）的土壤稀释液，以无菌操作技术接种在平板培养基上，涂布均匀；选用三个适宜稀释度的土壤悬液分别接种于牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基、马丁氏平板培养基，对应得到细菌平板、真菌平板；

（5）平板培养：细菌平板于37℃恒温培养1d，真菌平板于30℃培养4d，分别对应得到细菌菌种、真菌菌种。

（6）碳微球制备：取摩尔比为1:0.5:0.5的葡萄糖、聚木糖和甘露糖，加入去离子水溶解，使葡萄糖的浓度为0.5mol/L，再加入FeCl₃、NaCl、MgCl₂、CaCl₂混合，葡萄糖与FeCl₃、NaCl、MgCl₂、CaCl₂的摩尔比为1:0.1:0.1:0.1:0.1。将混合溶液转移到反应釜中，在真空干燥箱中180℃下，水热反应12h，洗涤、过滤后，80℃下干燥12h，得到碳微球。

（7）摇瓶培养：制备牛肉膏液体培养基、马丁氏液体培养基，将步骤（6）得到的碳微球加入牛肉膏液体培养基、马丁氏液体培养基中，将步骤（5）中得到的细菌菌种、真菌菌种分别对应接种，在150rpm，细菌摇瓶于37℃恒温培养1d，真菌摇瓶于30℃培养4d，分别对应得到细菌悬液、真菌悬液。

（8）悬菌液制备：将步骤（7）中得到的细菌悬液、真菌悬液混合，2500r/min离心10min后弃上清，得到悬菌液，每毫升悬菌液中的菌总量为5×10⁸-7×10⁸个。

（9）微生物投放：将重金属污染土壤区域深挖50cm，将步骤（8）中得到的悬菌液与未被污染的土壤以0.01L/kg混合填入。

实施例3

本实施例3提供的重金属污染土壤的微生物修复方法，包括以下步骤：

（1）土样采集：在重金属污染土壤中取土壤10g备用。

（2）制备土壤稀释液：称取土壤2g，放入有198mL无菌水的三角瓶中，振荡均匀，即为10^-2稀释度的土壤悬液，然后进行十倍梯度稀释，依次制备10^-3到10^-7稀释度的土壤稀释液。

（3）平板培养基制备：按培养基配方配置牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基100mL，灭菌后分别倒平板。

（4）接种：用无菌吸管吸取0.1mL相应稀释度（10^-3到10^-7稀释度），以无菌操作技术接种在平板培养基上，涂布均匀；选用三个适宜稀释度的土壤悬液分别接种于牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基，得到细菌平板。

（5）平板培养：细菌平板于37℃恒温培养1d，得到细菌菌种。

（6）碳微球制备：取摩尔比为1:0.5:0.5的葡萄糖、聚木糖和甘露糖，加入去离子水溶解，使葡萄糖的浓度为0.5mol/L，再加入FeCl₃、NaCl、MgCl₂、CaCl₂混合，葡萄糖与FeCl₃、NaCl、MgCl₂、CaCl₂的摩尔比为1:0.1:0.1:0.1:0.1。将混合溶液转移到反应釜中，在真空干燥箱中180℃下，水热反应12h，洗涤、过滤后，80℃下干燥12h，得到碳微球。

（7）摇瓶培养：制备牛肉膏液体培养基，将步骤（6）得到的碳微球加入牛肉膏液体培养基中，将步骤（5）中得到的细菌菌种接种，在150rpm，细菌摇瓶于37℃恒温培养1d，得到细菌悬液。

（8）悬菌液制备：将步骤（7）中得到的细菌悬液，2500r/min离心10min后弃上清，得到悬菌液，每毫升悬菌液中的菌总量为5×10⁸-7×10⁸个。

（9）微生物投放：将重金属污染土壤区域深挖50cm，将步骤（8）中得到的悬菌液与未被污染的土壤以0.01L/kg混合填入。

实施例4

本实施例4提供的重金属污染土壤的微生物修复方法，包括以下步骤：

（1）土样采集：在重金属污染土壤中取土壤10g备用。

（2）制备土壤稀释液：称取土壤2g，放入有198mL无菌水的三角瓶中，振荡均匀，即为10^-2稀释度的土壤悬液，然后进行十倍梯度稀释，依次制备10^-3到10^-7稀释度的土壤稀释液。

（3）平板培养基制备：按培养基配方各配置牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基、高氏Ⅰ号平板培养基和马丁氏平板培养基100mL，灭菌后分别倒平板。其中，马丁氏平板培养基灭菌前需加入2mL去氧胆酸钠(2%)和0.4mL1万单位/mL链霉素。高氏Ⅰ号平板培养基灭菌前加入10滴10%苯酚。

（4）接种：用无菌吸管吸取0.1mL相应稀释度（10^-3到10^-7稀释度），以无菌操作技术接种在平板培养基上，涂布均匀；选用三个适宜稀释度的土壤悬液分别接种于牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基、高氏Ⅰ号平板培养基、马丁氏平板培养基，对应得到细菌平板、放线菌平板和真菌平板。

（5）平板培养：细菌平板于37℃恒温培养2d，放线菌平板于30℃培养3d，真菌平板于30℃培养5d，分别对应得到细菌菌种、放线菌菌种、真菌菌种。

（6）碳微球制备：取摩尔比为1:0.5:0.5的葡萄糖、聚木糖和甘露糖，加入去离子水溶解，使葡萄糖的浓度为0.5mol/L，再加入FeCl₃混合，葡萄糖与FeCl₃的摩尔比为1:0.1。将混合溶液转移到反应釜中，在真空干燥箱中180℃下，水热反应12h，洗涤、过滤后，80℃下干燥12h，得到碳微球。

（7）摇瓶培养：制备牛肉膏液体培养基、高氏Ⅰ号液体培养基和马丁氏液体培养基，将步骤（6）得到的碳微球加入牛肉膏液体培养基、高氏Ⅰ号液体培养基和马丁氏液体培养基中，将步骤（5）中得到的细菌菌种、放线菌菌种、真菌菌种分别对应接种，在150rpm，细菌摇瓶于37℃恒温培养2d，放线菌摇瓶于30℃培养3d，真菌摇瓶于30℃培养5d，分别对应得到细菌悬液、放线菌悬液、真菌悬液。

（8）悬菌液制备：将步骤（7）中得到的细菌悬液、放线菌悬液、真菌悬液混合，2500r/min离心10min后弃上清，得到悬菌液，每毫升悬菌液中的菌总量为5×10⁸-7×10⁸个。

（9）微生物投放：将重金属污染土壤区域深挖50cm，将步骤（8）中得到的悬菌液与未被污染的土壤以0.01L/kg混合填入。

实施例5

本实施例5提供的重金属污染土壤的微生物修复方法，包括以下步骤：

（1）土样采集：在重金属污染土壤中取土壤10g备用。

（2）制备土壤稀释液：称取土壤2g，放入有198mL无菌水的三角瓶中，振荡均匀，即为10^-2稀释度的土壤悬液，然后进行十倍梯度稀释，依次制备10^-3到10^-7稀释度的土壤稀释液。

（3）平板培养基制备：按培养基配方各配置牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基、高氏Ⅰ号平板培养基和马丁氏平板培养基100mL，灭菌后分别倒平板。其中，和马丁氏平板培养基灭菌前需加入2mL去氧胆酸钠(2%)和0.4mL1万单位/mL链霉素。高氏Ⅰ号平板培养基灭菌前加入10滴10%苯酚。

（4）接种：用无菌吸管吸取0.1mL相应稀释度（10^-3到10^-7稀释度），以无菌操作技术接种在平板培养基上，涂布均匀；选用三个适宜稀释度的土壤悬液分别接种于牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基、高氏Ⅰ号平板培养基、马丁氏平板培养基，对应得到细菌平板、放线菌平板和真菌平板。

（5）平板培养：细菌平板于37℃恒温培养1d，放线菌平板于30℃培养2d，真菌平板于30℃培养4d，分别对应得到细菌菌种、放线菌菌种、真菌菌种。

（6）碳微球制备：取摩尔比为1:1:1的葡萄糖、聚木糖和甘露糖，加入去离子水溶解，使葡萄糖的浓度为0.5mol/L，再加入FeCl₃混合，葡萄糖与FeCl₃的摩尔比为1:0.1。将混合溶液转移到反应釜中，在真空干燥箱中180℃下，水热反应12h，洗涤、过滤后，80℃下干燥12h，得到碳微球。（7）摇瓶培养：制备牛肉膏液体培养基、高氏Ⅰ号液体培养基和马丁氏液体培养基，将步骤（6）得到的碳微球加入牛肉膏液体培养基、高氏Ⅰ号液体培养基和马丁氏液体培养基中，将步骤（5）中得到的细菌菌种、放线菌菌种、真菌菌种分别对应接种，在150rpm，细菌摇瓶于37℃恒温培养1d，放线菌摇瓶于30℃培养2d，真菌摇瓶于30℃培养4d，分别对应得到细菌悬液、放线菌悬液、真菌悬液；

（8）悬菌液制备：将步骤（7）中得到的细菌悬液、放线菌悬液、真菌悬液混合，2500r/min离心10min后弃上清，得到悬菌液，每毫升悬菌液中的菌总量为5×10⁸-7×10⁸个。

（9）微生物投放：将重金属污染土壤区域深挖50cm，将步骤（8）中得到的悬菌液与未被污染的土壤以0.01L/kg混合填入。

实施例6

本实施例6提供的重金属污染土壤的微生物修复方法，包括以下步骤：

（1）土样采集：在重金属污染土壤中取土壤10g备用。

（2）制备土壤稀释液：称取土壤2g，放入有198mL无菌水的三角瓶中，振荡均匀，即为10^-2稀释度的土壤悬液，然后进行十倍梯度稀释，依次制备10^-3到10^-7稀释度的土壤稀释液。

（3）平板培养基制备：按培养基配方各配置牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基、高氏Ⅰ号平板培养基和马丁氏平板培养基100mL，灭菌后分别倒平板。其中，马丁氏平板培养基灭菌前需加入2mL去氧胆酸钠(2%)和0.4mL1万单位/mL链霉素。高氏Ⅰ号平板培养基灭菌前加入10滴10%苯酚。

（4）接种：用无菌吸管吸取0.1mL相应稀释度（10^-3到10^-7稀释度），以无菌操作技术接种在平板培养基上，涂布均匀；选用三个适宜稀释度的土壤悬液分别接种于牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基、高氏Ⅰ号平板培养基、马丁氏平板培养基，对应得到细菌平板、放线菌平板和真菌平板。

（5）平板培养：细菌平板于37℃恒温培养1d，放线菌平板于30℃培养2d，真菌平板于30℃培养4d，分别对应得到细菌菌种、放线菌菌种、真菌菌种。

（6）碳微球制备：取摩尔比为1:0.5:1的葡萄糖、聚木糖和甘露糖，加入去离子水溶解，使葡萄糖的浓度为0.5mol/L，再加入FeCl₃混合，葡萄糖与FeCl₃的摩尔比为1:0.1。将混合溶液转移到反应釜中，在真空干燥箱中180℃下，水热反应12h，洗涤、过滤后，80℃下干燥12h，得到碳微球。

（7）摇瓶培养：制备牛肉膏液体培养基、高氏Ⅰ号液体培养基和马丁氏液体培养基，将步骤（6）得到的碳微球加入牛肉膏液体培养基、高氏Ⅰ号液体培养基和马丁氏液体培养基中，将步骤（5）中得到的细菌菌种、放线菌菌种、真菌菌种分别对应接种，在150rpm，细菌摇瓶于37℃恒温培养1d，放线菌摇瓶于30℃培养2d，真菌摇瓶于30℃培养4d，分别对应得到细菌悬液、放线菌悬液、真菌悬液；

（8）悬菌液制备：将步骤（7）中得到的细菌悬液、放线菌悬液、真菌悬液混合，2500r/min离心10min后弃上清，得到悬菌液，每毫升悬菌液中的菌总量为5×10⁸-7×10⁸个。

（9）微生物投放：将重金属污染土壤区域深挖50cm，将步骤（5）中得到的悬菌液与未被污染的土壤以0.01L/kg混合填入。

对比例1

对比例1提供的重金属污染土壤的微生物修复方法，包括以下步骤：

（1）土样采集：在重金属污染土壤中取土壤10g备用。

（2）制备土壤稀释液：称取土壤2g，放入有198mL无菌水的三角瓶中，振荡均匀，即为10^-2稀释度的土壤悬液，然后进行十倍梯度稀释，依次制备10^-3到10^-7稀释度的土壤稀释液。

（3）平板培养基制备：按培养基配方配置牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基100mL，灭菌后倒平板。

（4）接种：用无菌吸管吸取0.1mL相应稀释度（10^-3到10^-7稀释度），以无菌操作技术接种在平板培养基上，涂布均匀；选用三个适宜稀释度的土壤悬液分别接种于牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基，得到细菌平板。

（5）平板培养：细菌平板于37℃恒温培养1d，得到细菌菌种。

（6）摇瓶培养：制备牛肉膏液体培养基，将步骤（5）中得到的细菌菌种接种，在150rpm，细菌摇瓶于37℃恒温培养1d，得到细菌悬液。

（7）悬菌液制备：将步骤（6）中得到的细菌悬液，2500r/min离心10min后弃上清，得到悬菌液，每毫升悬菌液中的菌总量为5×10⁸-7×10⁸个。

（8）微生物投放：将重金属污染土壤区域深挖50cm，将步骤（7）中得到的悬菌液与未被污染的土壤以0.01L/kg混合填入。

对比例2

对比例2提供的重金属污染土壤的微生物修复方法，包括以下步骤：

（1）平板培养基制备：按培养基配方配置牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基100mL，灭菌后分别倒平板。

（2）接种：（1）将枯草芽孢杆菌、酵母菌、解钾菌、固氮菌放入牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基中，置于37℃恒温培养1d，得到细菌菌种。

（3）碳微球制备：取摩尔比为1:0.5:0.5的葡萄糖、聚木糖和甘露糖，加入去离子水溶解，使葡萄糖的浓度为0.5mol/L，再加入FeCl₃、NaCl、MgCl₂、CaCl₂混合，葡萄糖与FeCl₃、NaCl、MgCl₂、CaCl₂的摩尔比为1:0.1:0.1:0.1:0.1。将混合溶液转移到反应釜中，在真空干燥箱中180℃下，水热反应12h，洗涤、过滤后，80℃下干燥12h，得到碳微球。

（4）摇瓶培养：制备牛肉膏液体培养基，将步骤（3）得到的碳微球加入牛肉膏液体培养基中，将步骤（2）中得到的细菌菌种接种，在150rpm，细菌摇瓶于37℃恒温培养1d，得到细菌悬液。

（5）悬菌液制备：将步骤（4）中得到的细菌悬液2500r/min离心10min后弃上清，得到悬菌液，每毫升悬菌液中的菌总量为5×10⁸-7×10⁸个。

（6）微生物投放：将重金属污染土壤区域深挖50cm，将步骤（5）中得到的悬菌液与未被污染的土壤以0.01L/kg混合填入。

通过在扫描电镜下的观察发现实施例1-7的步骤（3）中制备的碳微球的粒径都在5-10μm之间，其中，实施例1中制备的碳微球不仅粒径均匀，而且分散性最好。

为了验证本发明对重金属污染土壤的修复效果，以安徽铜陵矿区周边土壤为研究对象，对实施例1-3和对比例1-2的方法进行功效实验，实验结果如表1所示。

表1微生物修复功效实验结果

通过上表中实施例1-3的对比发现，以重金属污染区域的土壤上清液培养菌株，培养的抗性菌株，分成三种培养基培养的细菌悬液、放线菌悬液、真菌悬液的混合浊液附着在碳微球上，对重金属污染土壤的修复效果最好。通过对比实施例3和对比例1发现，碳微球作为菌株的载体，菌株合理固定，成活率高，形成稳定的菌落，有助于降低重金属污染程度。通过对比实施例3和对比例2发现，直接采用外来菌株枯草芽孢杆菌、酵母菌、解钾菌、固氮菌对重金属污染治理的效果比不上以重金属污染区域的土壤上清液培养的菌株。

以上所述的本发明实施方式并不构成对本发明保护范围的限定。

本领域技术人员在考虑说明书及实践这里发明的公开后，将容易想到本发明的其它实施方案。本发明旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由下面的权利要求指出。

Claims (6)

1.一种重金属污染土壤的微生物修复方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）土样采集：在重金属污染土壤中取土壤10g备用；

（2）制备土壤稀释液：称取土壤2g，放入有198mL无菌水的三角瓶中，振荡均匀，即为10^-2稀释度的土壤悬液，然后进行十倍梯度稀释，依次制备10^-3到10^-7稀释度的土壤稀释液；

（3）平板培养基制备：按培养基配方各配置牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基、高氏Ⅰ号平板培养基和马丁氏平板培养基，灭菌后分别倒平板；

（4）接种：用无菌吸管吸取0.1mL相应稀释度的土壤稀释液，以无菌操作技术接种在平板培养基上，涂布均匀；选用三个适宜稀释度的土壤稀释液分别接种于牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基、高氏Ⅰ号平板培养基、马丁氏平板培养基，对应得到细菌平板、放线菌平板和真菌平板；

（5）平板培养：细菌平板于37℃恒温培养1-2d，放线菌平板于30℃培养2-3d，真菌平板于30℃培养3-5d，分别对应得到细菌菌种、放线菌菌种、真菌菌种；

（6）碳微球制备：将葡萄糖、聚木糖和甘露糖，加入去离子水溶解，加入三氯化铁混合，转移到反应釜中，在真空干燥箱中150-200℃下，水热反应10-15h，洗涤、过滤后，70-100℃下干燥10-15h，得到碳微球；

（7）摇瓶培养：制备牛肉膏蛋白胨液体培养基、高氏Ⅰ号液体培养基和马丁氏液体培养基，将步骤（6）得到的碳微球加入牛肉膏蛋白胨液体培养基、高氏Ⅰ号液体培养基和马丁氏液体培养基中，将步骤（5）中得到的细菌菌种、放线菌菌种、真菌菌种分别对应接种，在130-170rpm，细菌摇瓶于37℃恒温培养1-2d，放线菌摇瓶于30℃培养2-3d，真菌摇瓶于30℃培养3-5d，分别对应得到细菌悬液、放线菌悬液、真菌悬液；

（8）悬菌液制备：将步骤（7）中得到的细菌悬液、放线菌悬液、真菌悬液取一种或多种，离心10-15min后弃上清，得到悬菌液；

（9）微生物投放：将步骤（8）中得到的悬菌液与未被污染的土壤混合，并撒播于重金属污染土壤区域。

2.根据权利要求1所述的重金属污染土壤的微生物修复方法，其特征在于，步骤（6）中，反应釜中还加入NaCl、MgCl₂或/和CaCl₂。

3.根据权利要求1所述的重金属污染土壤的微生物修复方法，其特征在于，步骤（6）中，葡萄糖、聚木糖和甘露糖的摩尔比为：1：（0.5-1）：（0.5-1）。

4.根据权利要求1所述的重金属污染土壤的微生物修复方法，其特征在于，将重金属污染土壤区域深挖50-80cm，将步骤（9）中得到的悬菌液与未被污染的土壤混合填入。

5.根据权利要求3所述的重金属污染土壤的微生物修复方法，其特征在于，步骤（6）中，葡萄糖的浓度为0.2-0.8mol/L。

6.根据权利要求1所述的重金属污染土壤的微生物修复方法，其特征在于，所述悬菌液中包括细菌悬液、放线菌悬液、真菌悬液三种。