CN105219668B

CN105219668B - 一种土壤重金属活化菌剂及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN105219668B
Application number: CN201510546527.9A
Authority: CN
Inventors: 余劲聪; 林克明
Original assignee: FUJIAN SANJU BIOLOGICAL SCIENCE & TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: FUJIAN SANJU BIOLOGICAL SCIENCE & TECHNOLOGY CO., LTD.; Zhangzhou Sanju Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2015-08-31
Filing date: 2015-08-31
Publication date: 2018-10-26
Anticipated expiration: 2035-08-31
Also published as: CN105219668A

Abstract

本发明公开了一种土壤重金属活化菌剂及其制备方法与应用。本发明提供的绿色木霉、尿素酶芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌对多种重金属具有较强的耐受性，菌株协同作用能够活化土壤中的重金属，促进植物对重金属的吸收，提高植物修复重金属污染的效率。本发明利用有机废水为原料，进一步增强了重金属的迁移活性。提供的菌剂应用效果稳定性强，制备方法简单，成本低廉，兼具有重金属修复、病虫害防治、促生增产三大功能。

Description

一种土壤重金属活化菌剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于重金属生物修复应用技术领域，具体涉及一种重金属活化菌剂的制备与应用。

背景技术

我国的土壤重金属污染现状不容乐观，据中国科学院地理科学与资源研究所估算，我国耕地重金属污染面积约1.8亿亩。2013年12月底的国务院新闻办发布会上，国土资源部介绍，我国被中度和重度污染的耕地面积大约是5000万亩。2014年4月17日，环境保护部联合国土资源部发布了全国土地污染情况调查报告，在镉、汞、砷、铜、铅、铬、锌、镍8种重金属污染物中，镉污染居首位，其点位超标率达到7％。镉是耕地的首要污染物，是林地、草地和未利用地的第二污染物。我国的Cd污染事件除发生在共、伴生Cd矿相对丰富及采选冶活动较密集的云南、广东、湖南、贵州等地区外，还发生在城市近郊耕地、菜园土以及引用工业污水灌溉地区(卢红玲，2014)。相对于其他重金属，镉的生物活性更高，在土水系统中有较高的迁移性，更容易被生物利用积累，不仅关系到农产品质量安全，还可通过食物链危及动物和人类健康，因此寻找有效治理镉污染的方法是当前重要的课题。

植物修复是国内外认为能够彻底清除土壤重金属污染的修复方法之一，土壤重金属的活化能够促进土壤中的碳酸盐结合态(同时也包括磷酸盐态)、铁锰(铝)氧化物结合态、有机物结合态、残渣态重金属转化为有效态重金属，大大增加土壤溶液中的有效态重金属，从而大幅提高植物修复修复的效率。土壤微生物能通过代谢活动产生的有机酸、氨基酸以及其它代谢产物溶解重金属及含重金属的矿物，真菌能影响菌根植物对重金属的积累和分配，使菌根植物体内重金属积累量增加，提高植物提取的效果，向宿主植物传递营养，使宿主植物抗逆性增强、生长加快，间接地促进植物对重金属的修复作用。。

中国专利200710132243.0提供了一种铅镉抗性细菌及其用于土壤重金属污染的植物修复方法，所述的土壤重金属活化菌株为伯克霍尔德氏菌属，为无芽孢细菌，非芽孢菌适应能力弱，有效活菌易死亡，同时将发酵液直接灌装或用草炭吸附制成的生物促进剂，保质期较短，存在着应用效果稳定性低等问题。中国专利201310104049.7提供了一种里氏木霉联合伴矿景天在镉污染农田土壤修复中的应用，制剂施加量为供试土壤质量的4％，换算成亩施用量为6000kg(一亩地耕层土壤质量约为150000kg)，用量大，成本较高。中国专利201310196985.5提供了一种东南景天内生菌及其应用，用于植物-微生物联合修复重金属污染土壤，所述的内生菌具有氨苄青霉素、四环素耐药性，施用具有耐药性的菌株容易造成抗生素耐药基因的污染，具有潜在风险。许多重要的生化过程靠单种微生物是不能完成或只能微弱进行，本发明利用微生物之间的协同作用，构建了一种具有重金属修复、病虫害防治、促生增产三效合一的复合微生物活化菌剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种土壤重金属活化菌剂，其制备方法与应用。该菌剂通过绿色木霉、尿素酶芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌的代谢活动，促进土壤中的碳酸盐结合态镉(同时也包括磷酸盐态镉)、铁锰(铝)氧化物结合态镉、有机物结合态镉、残渣态镉转化为有效态镉，促进植物对镉的吸收，同时能够提高植物抗逆性，促进植物生长，抑制病虫害的发生和改善土壤微生态。

一种土壤重金属活化菌剂，其特征在于，它主要是由绿色木霉菌株、尿素酶芽孢杆菌、胶东样芽孢杆菌组成，有效活菌数≥2亿/g。其中，这3种菌中，优选每种菌有效菌≥0.5亿/g。优选地，该菌剂有效活菌数≥2亿/g，水分≤35％，pH值范围在5.5～6.3。优选地，按质量百分比的组成为绿色木霉粉剂35％～75％、尿素酶芽孢杆菌粉剂20％～60％、胶冻样芽孢杆菌发酵液5％～10％。

土壤重金属活化菌剂的制备方法如下：

1)在PDA平板上分别活化绿色木霉，在营养琼脂培养基上活化尿素酶芽孢杆菌，在ACCC55固氮培养基上活化胶冻样芽孢杆菌，将活化好的三株菌转接到相应的液体培养基上制备种子液。

绿色木霉(Hypocrea virens)为三炬-15菌株，保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点，北京市朝阳区，中国科学院微生物研究所，保藏时间2015年07月03日；保藏编号为CGMCC No.11042。

尿素酶芽孢杆菌(Ureibacillus suwonensis)为三炬-13号菌株，保藏机构：中国典型培养物保藏中心，保藏地点：湖北省武汉市，武汉大学；保藏时间2015年5月18日；保藏编号为CCTCC NO:M2015314。

胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)为三炬01号菌株，保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点，北京市朝阳区，中国科学院微生物研究所，保藏时间2010年7月2日；保藏编号为CGMCC No.3995。

PDA培养基组成为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L，自然pH；营养琼脂培养基组成为：蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、氯化钠5g/L、琼脂20g/L，自然pH。ACCC55固氮菌培养基组成为：蔗糖1％、K₂HPO₄·3H₂O 0.05％、NaCl 0.02％、CaCO₃ 0.1％、MgSO₄·7H₂O0.02％，琼脂1.8％，pH 7.0～7.2。

2)绿色木霉、尿素酶芽孢杆菌分别以100mL/kg的比例接种至固体发酵培养基中，发酵7～10d。胶冻样芽孢杆菌以5％～15％体积比的接种量接种至二级液态发酵培养基中，发酵2～3d。

所述的固态发酵培养基的组成为：麸皮90％、豆粕粉5％、酵母粉4.7％、磷酸二氢钾0.1％、七水硫酸镁0.1％、硫酸铵0.1％，加入培养料总质量50％的有机废水后混匀121℃灭菌1h。所述的胶冻样芽孢杆菌二级液态发酵培养基的组成为：淀粉0.55％、酵母膏0.157％、硫酸镁0.14％、磷酸氢二钾0.2％、碳酸钙0.05％、氯化钠0.02％，氯化铁0.0005％，其余为有机废水，pH 7.0～7.2。所述的有机废水是指新鲜的豆腐废水、粉丝废水、玉米淀粉废水、洋芋废水、海产品加工废水、味精废水、酒精废水的至少一种。

3)所述的土壤重金属活化菌剂由绿色木霉粉剂、尿素酶芽孢杆菌粉剂、胶冻样芽孢杆菌发酵液复配组成，按质量百分比的组成为绿色木霉粉剂35％～75％、尿素酶芽孢杆菌粉剂20％～60％、胶冻样芽孢杆菌发酵液5％～10％。

土壤重金属活化菌剂的有益效果：

1)重金属耐受特征：绿色木霉(三炬-15)、尿素酶芽孢杆菌(三炬-13)对多种重金属具有耐受性，适应范围广，绿色木霉对Cd²⁺耐受浓度达到7840mg/L、Pb²⁺耐受浓度达到6216mg/L、Cr⁶⁺耐受浓度达到1560mg/L、Ni²⁺耐受浓度达到2934.5mg/L、Cu²⁺耐受浓度达到320mg/L。尿素酶芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌对Cd²⁺耐受浓度达到100mg/L、Pb²⁺耐受浓度达到500mg/L。

2)土壤重金属活化特征：绿色木霉、尿素酶芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌对发酵液中的CdCO₃的活化率与对照相比均超过100％，显著提高了植物提取修复率。

所述的土壤重金属活化菌剂，其特征为：粉剂，有效活菌数≥2亿/g，水分≤35％，pH值范围在5.5～6.3。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1)绿色木霉、尿素酶芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌对于多种重金属具有较强的耐受性，菌株活性强，菌株之间不拮抗，适应范围广。

2)本发明的土壤重金属活化菌剂能够活化土壤重金属，菌株代谢产酸，能够降低土壤pH，菌株协同作用显著提高土壤有效镉的含量，利用有机废水为发酵原料原料，进一步增强了重金属的迁移活性。促进植物对重金属镉的吸收，提高植物修复效率。

3)本发明的土壤重金属活化菌剂中的功能菌株能够提高植物抗逆性，促进植物生长，抑制病虫害的发生和改善土壤肥力，是一种具有重金属修复、病虫害防治、促生增产三效合一的复合微生物活化菌剂。

4)本发明的土壤重金属活化菌剂制备简单，有效活菌为孢子和芽孢，具有有效活菌数高、存储久、易运输、安全环保、无二次污染等优点。

具体实施方式

下面实例将进一步说明本发明方法的可行性和应用效果

实施例1、菌株活化发酵液中的不溶性重金属镉

为了考察菌株的代谢活动对难溶CdCO₃的活化作用，在500mL的摇瓶中装入100mL培养基，绿色木霉培养基为PDB，尿素酶芽孢杆菌培养基为营养琼脂培养基，胶冻样芽孢杆菌培养基为不添加碳酸钙的ACCC55固氮菌液体培养基。PDB培养基组成为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L，自然pH；营养琼脂培养基成分为：蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、氯化钠5g/L、琼脂20g/L，自然pH。不添加碳酸钙的ACCC55固氮菌培养基组成为：蔗糖1％、K₂HPO₄·3H₂O 0.05％、NaCl 0.02％、MgSO₄·7H₂O 0.02％，琼脂1.8％，自然pH。

分别在不同处理摇瓶中加入CdCO₃ 0.017g和0.034g，使培养基中总镉浓度为100mg/L和200mg/L。含不同质量CdCO₃的培养基灭菌冷却后，接种供试菌株种子液10mL，空白对照(CK)不接种，培养基体积为110mL。28℃、180rpm摇床振荡培养48h，用pH计测定培养液中pH值，观察菌株的代谢产酸能力，发酵液10000r/min离心5min使菌体和未活化的重金属盐沉淀，取上清过膜，原子吸收法测上清中Cd²⁺的浓度。

结果如表1所示：尿素酶芽孢杆菌、绿色木霉、胶冻样芽孢杆菌处理组随着发酵液pH值的变小，溶液中Cd²⁺浓度增大，尿素酶芽孢杆菌、绿色木霉、胶冻样芽孢杆菌对不同添加量的难溶CdCO₃活化率与对照相比均超过100％。综上所述，菌株能够代谢产酸，对难溶CdCO₃具有较强的活化效果。

表1菌株对培养液中不溶性镉的活化作用

实施例2土壤重金属活化菌剂的制备

1、绿色木霉粉剂a的制备：将储存于4℃冰箱内的绿色木霉活化，制备孢子悬浮液，分别将1mL的绿色木霉孢子悬液接种至200mL的PDB培养基中，28℃、180rpm摇瓶培养3d。PDB培养基组成为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L，自然pH。将制备的绿色木霉种子液以100mL/kg的比例接种至固态发酵培养基中，于30℃恒温发酵10d，接种后第5d翻动一次。固态发酵培养基配方(W％)为麸皮90％、豆粕粉5％、酵母粉4.7％、磷酸二氢钾0.1％、七水硫酸镁0.1％、硫酸铵0.1％，加入培养料总质量50％的新鲜豆腐废水水后混匀121℃灭菌1h。收集菌体及其发酵产物，常温干燥，用粉碎机粉碎成粉剂(不超过10s)，制成绿色木霉粉剂a。

2、绿色木霉粉剂b的制备：除固态发酵培养基配方不同外，制备方法同绿色木霉粉剂a的制备，绿色木霉粉剂b固态发酵培养基配方(W％)为麸皮90％、豆粕粉5％、酵母粉4.7％、磷酸二氢钾0.1％、七水硫酸镁0.1％、硫酸铵0.1％，加入培养料总质量50％的水后混匀121℃灭菌1h。收集菌体及其发酵产物，常温干燥，用粉碎机粉碎成粉剂(不超过10s)，制成绿色木霉粉剂b。

3、尿素酶芽孢杆菌粉剂a的制备：将储存于4℃冰箱内的尿素酶芽孢杆菌活化，并用接种环刮取菌落接种至营养琼脂液体培养基中，35℃、180rpm摇瓶培养2d。营养琼脂液体培养基成分为：蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、氯化钠5g/L，自然pH。将制备的尿素酶芽孢杆菌种子液以100mL/kg的比例接种至固态发酵培养基中，于35℃恒温发酵10d，接种后第5d翻动一次。固态发酵培养基配方(W％)为麸皮90％、豆粕粉5％、酵母粉4.7％、磷酸二氢钾0.1％、七水硫酸镁0.1％、硫酸铵0.1％，加入培养料总质量50％的新鲜豆腐废水后混匀121℃灭菌1h。收集菌体及其发酵产物，常温干燥，用粉碎机粉碎成粉剂(不超过10s)，制成尿素酶芽孢杆菌粉剂a。

4、尿素酶芽孢杆菌粉剂b的制备：除固态发酵培养基配方不同外，制备方法同尿素酶芽孢杆菌粉剂a的制备，尿素酶芽孢杆菌粉剂b固态发酵培养基配方(W％)为麸皮90％、豆粕粉5％、酵母粉4.7％、磷酸二氢钾0.1％、七水硫酸镁0.1％、硫酸铵0.1％，加入培养料总质量50％的水后混匀121℃灭菌1h。收集菌体及其发酵产物，常温干燥，用粉碎机粉碎成粉剂(不超过10s)，制成尿素酶芽孢杆菌粉剂b。

5、胶冻样发酵液a的制备：将储存于4℃冰箱内的胶冻样芽孢杆菌活化，并用接种环刮取菌落接种至ACCC55固氮菌培液体培养基中，28℃、180rpm摇瓶培养2d。ACCC55固氮菌液体培养基组成为：蔗糖1％、K₂HPO₄·3H₂O 0.05％、NaCl 0.02％、CaCO₃ 0.1％、MgSO₄·7H₂O 0.02％，其余为水，pH 7.0～7.2。胶冻样芽孢杆菌种子液以10％体积比的接种量接种至二级液态发酵培养基中，发酵2d。胶冻样芽孢杆菌二级液态发酵培养基的组成为：淀粉0.55％、酵母膏0.157％、硫酸镁0.14％、磷酸氢二钾0.2％、碳酸钙0.05％、氯化钠0.02％，氯化铁0.0005％，其余为新鲜豆腐废水，pH 7.2。制成胶冻样芽孢杆菌发酵液a。

6、胶冻样芽孢杆菌发酵液b的制备：除二级液态发酵培养基配方不同外，制备方法同胶冻样芽孢杆菌发酵液a的制备，胶冻样芽孢杆菌二级液态发酵培养基的组成为：淀粉0.55％、酵母膏0.157％、硫酸镁0.14％、磷酸氢二钾0.2％、碳酸钙0.05％、氯化钠0.02％，氯化铁0.0005％，其余为水，pH 7.2。制成胶冻样芽孢杆菌发酵液b。

7、将绿色木霉粉剂a、尿素酶芽孢杆菌粉剂a、胶冻样发酵液a按比例混合均匀，制成活化剂a，按质量百分比组成为：绿色木霉粉剂50％、尿素酶芽孢杆菌粉剂40％、胶冻样发酵液10％。土壤重金属活化剂a特征为：粉剂，有效活菌数10.4亿/g，水分28％，pH值5.6。

6、将绿色木霉粉剂b、尿素酶芽孢杆菌粉剂b、胶冻样发酵液b按比例混合均匀，制成活化剂b，按质量百分比组成为：绿色木霉粉剂50％、尿素酶芽孢杆菌粉剂40％、胶冻样发酵液10％。土壤重金属活化剂b特征为：粉剂，有效活菌数8.6亿/g，水分25％，pH值5.5。

实施例3、重金属污染土壤生物修复试验

1供试土壤

采自某污灌区农田土壤，土壤的基本理化性质为：有机质19.68g/kg、有效磷15.65mg/kg、速效钾106.81mg/kg、总镉4.95mg/kg、pH值7.1。新鲜土壤样品过2mm筛后，添加底肥，施用(NH₄)₂SO₄ 0.71g/kg、NaH₂PO₄ 0.17g/kg和KCl 0.24g/kg，拌匀后用于盆栽试验。

2试验方法

供试植物为伴矿景天，采自浙江衢州某铅锌矿，用超纯水将伴矿景天冲洗干净，剪成大小一致的枝条，采用营养液培养方法预先培养3周，待茎基部长出旺盛的不定根后，开始进行土壤重金属的生物修复试验。所述的培养液为1/4Hoagland’s营养液。

试验处理如表2，将表面消毒的伴矿景天幼苗移植到盛有2kg污染土壤的花盆中，重复3次，每盆5株，各处理置于具有避雨、通风、调温的功能的温室中，统一进行日常喷雾浇水。所用的土壤重金属活化剂为实施例2制备的粉剂。

表2伴矿景天盆栽试验处理

处理	处理设置	重复*土样	施用量(g)
				1	施用土壤重金属活化菌剂a	3*2kg	40
2	施用土壤重金属活化菌剂b	3*2kg	40
				3	施用绿色木霉粉剂b	3*2kg	40
4	施用尿素酶芽孢杆菌粉剂b	3*2kg	40
				5	施用胶冻样芽孢杆菌发酵液b	3*2kg	40
6	对照	3*2kg	0

2结果与分析

伴矿景天移植100d后，小心将植物从盆中移除，用超纯水清洗植物根部3～5次，计算生物量，测定株高、根长和鲜量。测定结果如表3。处理1与处理6差异显著，伴矿景天鲜重增加54.13％。结果表明，用有机废水发酵的活化剂促生效果显著，菌株间的协同促生效果好于单菌的促生效果。

根据GB 5009.15-2014检测植株中的镉含量。处理1中，茎叶中的镉含量达到到310mg/kg，比处理6提高了27.57％。结果表明，用有机废水发酵的活化剂促进植物吸收重金属效果显著，菌株间的协同促生效果好于单菌的强化效果。

表3不同处理下伴矿景天生物量及重金属含量

类别

处理1

处理2

处理3

处理4

处理5

处理6

株高(cm)

15.96a

13.48b

11.09c

11.34c

11.05c

10.61d

根长(cm)

7.96a

5.04c

5.03c

5.84b

5.12b

5.03c

鲜重(g)

10.08a

8.01b

7.07c

7.13c

7.21c

6.54d

镉(mg/kg)

310a

289b

257d

279c

258d

243e

实施例4、土壤重金属活化菌剂的田间试验应用效果

1试验地概况

试验地点为某污灌区，试验田地势平坦，地力均匀，土壤全氮1.43g/kg、有机质26.78g/kg、有效磷55.65mg/kg、速效钾110.21mg/kg、pH值6.35。

2试验方法

供试植物为圆白菜，品种为牛心包，试验设4个处理，随机排列，重复3次，小区面积30m²，四周设保护行，试验处理组分为：

处理1：空白对照

处理2：常规施肥

处理3：常规施肥+土壤重金属活化菌剂b

处理4：常规施肥+土壤重金属活化菌剂a

所用的土壤重金属活化剂为实施例2制备的粉剂。小区间分隔，单独灌溉，第一次做埂，待埂硬化后再加高一次，田埂要求高出土面20cm。土壤重金属活化菌剂以300kg/亩的施用量在土壤翻耕前一次性施入，翻耕拌匀，使土壤重金属活化菌剂与土壤充分混合。结合常规施肥，基肥施尿素、过磷酸钙、氯化钾的量分别为10kg/亩、45kg/亩、15kg/亩，追肥：莲座期施尿素7kg/亩，包心期施尿素25kg/亩，适时浇水。病虫害防治及日常管理按当地常规管理进行。

3田间观测与分析内容

于成熟期取植株和土壤样品。土壤样品用于检测土壤pH值、全氮、有机质、有效磷、速效钾、有效镉含量。植株样品用于检测植株中的镉含量。

及时调查不同处理的生物学性状及病虫害情况。成熟期计产量，小区产量单收单打计产。

4结果与分析

4.1土壤重金属活化菌剂对土壤理化性质的影响

处理4(施用土壤重金属活化菌剂a)，土壤全氮、有机质、有效磷、速效钾含量比对照区(处理2)分别提高了0.11g/kg、1.34g/kg、1.46mg/kg、5.79mg/kg；说明土壤重金属活化菌剂施用可提高土壤养分含量。施用土壤重金属活化菌剂处理，pH值降低了0.25。

表4土壤重金属活化菌剂对土壤理化性质的影响(平均值)

4.2土壤重金属活化菌剂对土壤重金属镉含量的影响

施用土壤重金属活化菌剂在成熟期取样，根据GB/T 23739-2009检测土壤中有效态镉的含量，结果如表5所示：处理4中土壤有效态镉含量显著高于其他三个处理组，处理4与常规施肥对照相比有效态镉含量提高42.98％，处理3与常规施肥对照相比有效态镉含量提高18.18％，

表5土壤重金属活化菌剂对土壤有效态镉的影响

表6土壤有效态镉含量的方差分析

变异来源	自由度	平方和	均方	F值	F_0.05	F_0.01
							处理间	3	0.525	0.175	758.590**	4.76	9.78
重复间	2	1.667×10^-5	8.335×10^-6	0.036	5.14	10.92
							误差	6	0.001	0.00023
总变异	11	0.526

注：方差分析(*-显著，**-极显著)

4.3土壤重金属活化菌剂对圆白菜产量的影响

由表7可知施用土壤重金属活化菌剂a，圆白菜产量提高40.40％，施用土壤重金属活化菌剂b后产量提高12.64％，F测验结果表明，处理间的F值极显著，进一步多重比较显示，处理4和处理2、处理3差异极显著，说明活化剂的施用可有效促进圆白菜的增产，处理3和处理4差异显著。

表7土壤重金属活化菌剂对圆白菜产量的影响

表8圆白菜产量的方差分析

变异来源	自由度	平方和	均方	F值	F_0.05	F_0.01
							处理间	3	3261.919	1087.306	2853.469**	4.76	9.78
重复间	2	3.612	1.806	4.739	5.14	10.92
							误差	6	2.286	0.381
总变异	11	3267.817

注：方差分析(*-显著，**-极显著)

表9圆白菜产量的多重比较(SSR法)

4.4土壤重金属活化菌剂对圆白菜中镉含量的影响

圆白菜采收后，根据GB 5009.15-2014检测叶球和根中镉含量，结果如下：(1)施用土壤重金属活化菌剂a后，圆白菜叶球中的镉含量达到0.13mg/kg。比常规施肥处理提高44.45％。处理4与其他处理间差异达到极显著水平。(2)施用土壤重金属活化菌剂b后，圆白菜叶球中的镉含量达到0.10mg/kg。比常规施肥处理提高11.11％。(3)施用土壤重金属活化菌剂后，圆白菜根中的镉含量达到0.17mg/kg。比常规施肥处理提高41.67％。处理4与其他处理间差异显著。(2)施用土壤重金属活化菌剂b后，圆白菜根中的镉含量达到0.13mg/kg。比常规施肥处理提高8.33％。

表10圆白菜叶球中镉含量的方差分析

变异来源	自由度	平方和	均方	F值	F_0.05	F_0.01
							处理间	3	0.005	0.002	23.350**	4.76	9.78
重复间	2	1.066×10^-4	5.328×10-5	0.808	5.14	10.92
							误差	6	3.954×10^-4	6.590×10-5
总变异	11	0.0055

注：方差分析(*-显著，**-极显著)

表11圆白菜叶球中镉含量的多重比较(SSR法)

表12圆白菜根中镉含量的方差分析

变异来源	自由度	平方和	均方	F值	F_0.05	F_0.01
							处理间	3	0.005	0.002	66.509**	4.76	9.78
重复间	2	2.448×10^-4	1.224×10^-4	4.578	5.14	10.92
							误差	6	1.604×10^-4	2.673×10^-5
总变异	11	0.0054

注：方差分析(*-显著，**-极显著)

表13圆白菜根中镉含量的多重比较(SSR法)

5结论

田间小区试验结果表明：(1)在受镉污染的污灌区土壤中施用土壤重金属活化菌剂a，可以提高土壤中有效态镉的含量，处理间差异显著，处理4与常规施肥对照相比有效态镉含量提高42.98％。(2)施用土壤重金属活化菌剂a，能够促进圆白菜对重金属镉的吸收，处理间差异显著。圆白菜叶球中镉的含量比常规施肥处理提高44.45％，圆白菜根中的镉含量比常规施肥处理提高41.67％。(3)施用土壤重金属活化菌剂a后，土壤全氮、有机质、有效磷、速效钾含量均比对照区(处理2)有所提高，同时，施用土壤重金属活化菌剂处理，pH值降低了0.25。(4)土壤重金属活化菌剂具有促生增产的功效，此试验中圆白菜增产40.40％。综上所述，本发明的土壤重金属活化菌剂具备土壤中重金属镉的活化作用，可强化植物修复土壤重金属污染，不产生二次污染，提高地力的同时促进超级累植物的生物量的增长，进而缩短修复周期。

Claims

1.一种土壤重金属活化菌剂，其特征在于，它由菌株绿色木霉、尿素酶芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌组成，有效活菌数≥2亿/g，所述的重金属为铬。

2.如权利要求1所述的一种土壤重金属活化菌剂，其特征在于，该菌剂有效活菌数≥2亿/g，水分≤35％，pH值范围在5.5～6.3。

3.如权利要求1所述的一种土壤重金属活化菌剂，其特征在于，按质量百分比的组成为绿色木霉粉剂35％～75％、尿素酶芽孢杆菌粉剂20％～60％，胶冻样芽孢杆菌发酵液5％～10％。

4.如权利要求1所述的一种土壤重金属活化菌剂，其特征在于：所述的绿色木霉(Hypocrea virens)为三炬-15菌株，保藏编号为CGMCC No.11042，所述的尿素酶芽孢杆菌(Ureibacillus suwonensis)为三炬-13号菌株，保藏编号为CCTCC NO:M2015314，所述的胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)为三炬01号菌株，保藏编号为CGMCC No.3995。

5.如权利要求1至4任一项所述的一种土壤重金属活化菌剂的制备方法，包括如下步骤：

1)分别在平板上活化菌株绿色木霉、尿素酶芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌，将活化好的菌株转接到相应的液体培养基上制备种子液；

2)绿色木霉、尿素酶芽孢杆菌分别以50～150mL/kg的比例接种至固体发酵培养基中，发酵7～10d，胶冻样芽孢杆菌以5％～15％体积比的接种量接种至二级液态发酵培养基中，发酵2～3d；

3)绿色木霉粉剂、尿素酶芽孢杆菌粉剂、胶冻样芽孢杆菌发酵液复配组成所述的土壤重金属活化菌剂，按质量百分比的组成为绿色木霉粉剂35％～75％、尿素酶芽孢杆菌粉剂20％～60％、胶冻样芽孢杆菌发酵液5％～10％。

6.根据权利要求5所述的一种土壤重金属活化菌剂的制备方法，其特征在于：步骤2)中，所述的二级液态发酵培养基的组成为：淀粉0.55％、酵母膏0.157％、硫酸镁0.14％、磷酸氢二钾0.2％、碳酸钙0.05％、氯化钠0.02％，氯化铁0.0005％，其余为有机废水，pH 7.0～7.2。

7.根据权利要求6的一种土壤重金属活化菌剂的制备方法，其特征在于：所述的有机废水是指新鲜的豆腐废水、粉丝废水、玉米淀粉废水、洋芋废水、海产品加工废水、味精废水、酒精废水的至少一种。

8.根据权利要求5所述的土壤重金属活化菌剂的制备方法，其特征在于：所述的土壤重金属活化菌剂为粉剂，有效活菌数≥2亿/g，水分≤35％，pH值范围在5.5～6.3。

9.权利要求1至4任一项所述的一种土壤重金属活化菌剂的应用，其用于土壤重金属污染修复，和/或用于圆白菜增产。