CN105234167A - 一种含海藻寡糖重金属生物修复剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种含海藻寡糖重金属生物修复剂及其制备方法，涉及重金属生物修复应用技术领域。所述含海藻寡糖重金属生物修复剂各组分的质量百分比为：海藻寡糖5％～15％、枯草芽孢杆菌发酵液10％～20％、淡紫拟青霉固态发酵物65％～85％；其中，有效活菌数≥2亿CFU/g。制备方法：1)制备枯草芽孢杆菌发酵液；2)制备淡紫拟青霉固态发酵物；3)将海藻寡糖、步骤1)所得枯草芽孢杆菌发酵液、步骤2)所得淡紫拟青霉固态发酵物混合，即得含海藻寡糖重金属生物修复剂。枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉对多种重金属具有较强耐受性，能直接吸附重金属离子，与海藻寡糖共同作用，能钝化土壤中的重金属。制备简单，对土壤重金属修复效果好，安全环保。

Description

一种含海藻寡糖重金属生物修复剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及重金属生物修复应用技术领域，尤其是涉及一种含海藻寡糖重金属生物修复剂及其制备方法。

背景技术

我国重金属污染问题日益严峻，2014年的全国土地污染情况调查报告指出，部分土壤污染严重，耕地土壤环境质量堪忧，工矿业废弃地土壤环境问题突出，污染以无机型为主，无机污染物镉(Cd)、汞(Hg)、铜(Cu)、铅(Pb)、铬(Cr)、锌(Zn)、镍(Ni)等8种重金属污染程度最严重，其中重金属Cd点位超标率达到了7.0％，是重金属污染物中点位超标率最高的。中科院院士赵其国教授在“2015重金属污染治理峰会”上指出，我国受重金属污染的耕地约有1000万公顷，占18亿耕地的8％以上，每年直接减少的粮食产量约100亿公斤。由于重金属污染具有隐蔽性、滞后性，形态多样性，且在物质循环和能量循环中难以分解，容易蓄积在土壤中，导致作物减产，并通过植物的根系吸收进入植物体内，再经过食物链的传递和富集而危害人体健康。因此土壤重金属污染已成为全球面临的一个严重环境问题(邢艳帅等,2014)。

目前，土壤重金属污染的治理方法主要有两种方式：一是降低土壤中重金属的生物有效性，减少植物对重金属的吸收；二是通过工程或生物技术方法降低土壤中重金属的含量。后者因工程量大、成本高，不适合大面积的土壤重金属修复。改变土壤中重金属存在形态，降低土壤有效态重金属的含量是土壤重金属修复的主要方法。重金属污染修复方法有物理修复法(电动修复法、电热修复法)、化学修复法(土壤淋洗法、化学固定技术)和生物修复法(植物修复法、动物修复法和微生物修复法)(梁家妮等,2009)。物理修复法和化学修复法修复效果好，但是成本高，且易造成二次污染，不适于大面积土壤重金属修复。微生物修复法是利用微生物对土壤中的重金属污染物的吸收、沉淀、氧化还原等作用降低土壤重金属含量，或使污染物无害化的过程。微生物修复法具有成本低、污染少等优点，再加上国家政策倾斜，使其成为了重金属污染土壤修复的重要方向(乔志香等,2004)。中国专利CN102240670A提供一种重金属污染土壤的微生物修复方法，该球形红细菌微生修复剂能一定程度上降低植物体内重金属积累，但施用时将发酵液直接随水漫溉重金属土壤，保质期较短，存在着应用效果稳定性差等问题；同时施用量为50～200mL/kg土壤，换算成亩施用量为7500～30000L(一亩地耕层土壤质量约为150000kg)，用量大，成本较高。中国专利CN103275728A提供一种土壤重金属生物固定剂，在有机肥中添加纳豆芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和康氏木霉菌四种菌，制备方法复杂，成本较高；而且采用的菌株虽然对重金属有吸附效果，但据相关报道指出，巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌因代谢过程中产生有机酸，对土壤重金属起到溶解活化作用，能提高土壤有效态重金属含量，促进植物吸收重金属(杨卓等,2009；王小敏等,2013；杨榕等,2015)；对重金属作用效果不一样的菌株复配，造成修复效率的下降，成本提高。

海藻寡糖是由海藻多糖降解得到的聚合度在2～10的直链或支链化合物，以琼胶寡糖(agaro-oligosaccharide，AOS)和褐藻寡糖(alginate-derivedoligosaccharide，ADO)等为代表。海藻寡糖具有抗氧化、调节植物生长，提高植物抗逆性，减少植物病虫害发病率的作用(Kangetal.，2014；Zhangetal.，2013)，作为新型绿色环保生物肥在农业生产中起到重要作用。此外，海藻寡糖分子中含有大量的羧基、羟基，带有电负性，能够通过离子交换和络合作用吸附重金属，因此在土壤重金属污染的治理方面显现出一定的潜力。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术存在的上述问题，提供不仅制备方法简单，环境污染小，而且能有效降低土壤中有效态重金属含量，阻止植物对根系周围重金属离子的吸收，同时能改良土壤，促进植物生长的一种含海藻寡糖重金属生物修复剂及其制备方法。

所述含海藻寡糖重金属生物修复剂各组分的质量百分比为：海藻寡糖5％～15％、枯草芽孢杆菌发酵液10％～20％、淡紫拟青霉固态发酵物65％～85％；其中，有效活菌数≥2亿CFU/g。

所述含海藻寡糖重金属生物修复剂的制备方法，包括以下步骤：

1)制备枯草芽孢杆菌发酵液

配制营养琼脂平板，将枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)三炬-07接种在营养琼脂平板上进行划线培养，从营养琼脂平板上将活化好的枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)三炬-07用无菌生理盐水洗涤，制成菌悬液，将菌悬液接种至种子培养基中培养，得种子液，再将种子液接种至发酵罐培养基中发酵，得枯草芽孢杆菌发酵液；

2)制备淡紫拟青霉固态发酵物

配制PDA培养基，将淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus)三炬03号种孢子液，涂布于营养琼脂平板上培养，再用无菌生理盐水将营养琼脂平板上的淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus)三炬03号种的孢子洗涤，制成孢子悬液；将孢子悬液接入种子培养基中培养得种子液；将种子液接种至固体发酵培养基中，于28～32℃下培养1～2d后翻盘一次，前3d保持湿度为70％～80％，后4d保持自然湿度，发酵7d后，孢子成熟，固体发酵结束，固体发酵培养基经常温干燥后粉碎，制得淡紫拟青霉固态发酵物；

3)制备含海藻寡糖重金属生物修复剂

将海藻寡糖、步骤1)所得枯草芽孢杆菌发酵液、步骤2)所得淡紫拟青霉固态发酵物混合，即得含海藻寡糖重金属生物修复剂。

在步骤1)中，所述营养琼脂平板的组成可为牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂20g/L，灭前pH值为7.3；所述枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)三炬-07，已于2014年12月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.10248；所述划线培养的条件可于28～32℃条件下培养24～48h；

所述种子培养基的组成可为牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，灭菌前pH值为7.0；所述菌悬液接种的接种量按体积百分比可为菌悬液的5％，菌悬液OD₆₀₀＝0.84；所述种子培养基中培养的条件可于30～35℃，150～200rpm条件下培养24～36h；

所述发酵培养基的组成可为淀粉20.0～30.0g/L，蔗糖5.0～10.0g/L，豆粕粉10～20g/L，磷酸氢二钾2.0～3.0g/L，硫酸锰0.1～0.5g/L，酵母膏1.0～2.0g/L；所述种子液接种至发酵罐培养基中发酵的接种量按体积百分比可为种子液的10％；所述发酵的条件可为：转速控制在200～300rpm，通气量控制在为1vvm，保持溶解氧10％以上，罐温控制在28～30℃，罐压保持在0.05～0.06MPa，pH值通过10％氨水和10％盐酸控制在6.5，发酵时间为36～72h。

在步骤2)中，所述PDA培养基的组成可为：去皮马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L，自然pH值；所述淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus)三炬03号种，已于2010年6月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏编号为CCTCCNO：M2010165；所述涂布于营养琼脂平板上培养的条件可于28～32℃条件下培养3～5d；所述种子培养基的组成可为：蔗糖15g/L，大豆粉10g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸锌0.1g/L，灭菌前pH值为6.0；所述将孢子悬液接入种子培养基的接种量按体积百分比可为8％～15％，稀释至OD₆₀₀为0.2；所述将孢子悬液接入种子培养基中培养的条件可于28～32℃，150～200rpm下培养3～4d；所述固体发酵培养基的组成可为：麸皮、秸秆粉末、玉米粉、硫酸铵，麸皮、秸秆粉末、玉米粉、硫酸铵按质量比可为(70～80)∶(15～20)∶(10～15)∶(0.5～1.0)；所述将种子液接种至固体发酵培养基的接种量可将种子液以100mL/kg的比例接种至固体培养基中。

在步骤3)中，所述海藻寡糖是利用微生物直接降解龙须菜、马尾藻、褐藻等藻类植物中至少一种所得的聚合度为4～8的寡糖；所述海藻寡糖、步骤1)所得枯草芽孢杆菌发酵液、步骤2)所得淡紫拟青霉固态发酵物按质量百分比可为(5％～15％)∶(10％～20％)∶(65％～85％)。

所述含海藻寡糖重金属生物修复剂可采用粉剂，有效活菌数≥2亿/g，水分20％～25％，有机质含量≥55％，pH值范围在8.0～8.5。

本发明提供一种含海藻寡糖重金属生物修复剂及其制备。本发明提供的一种含海藻寡糖重金属生物修复剂由海藻寡糖、枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉按比例复配而成的，其中枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉对多种重金属具有较强的耐受性，能够直接吸附重金属离子，与海藻寡糖共同作用，能钝化土壤中的重金属；此外，本发明提供一种含海藻寡糖重金属生物修复剂有利于土壤微生物活动，有效改良土壤结构，促进植物根系发育，调节植物生长代谢，缓解重金属对植物造成的伤害，提高作物产量。

本发明具有以下有益效果

1、本发明所用枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉对多种重金属具有较强耐受性，适应范围广。两株菌在含镉为0～1.0g/L的固态培养基上生长良好。同时枯草芽孢杆菌对发酵液中的Cd²⁺(Cd²⁺浓度为0.4g/L)有很强的吸附性，对Cd²⁺的去除率可达到75.3％，而淡紫拟青霉对Cd²⁺的去除率最大可达到86.2％。

2、本发明所用海藻寡糖结构中带有羧基和酚羟基，对重金属离子有很强的吸附作用。枯草芽孢杆菌和淡紫拟青霉可通过离子交换、络合作用、沉淀作用、主动运输等方式富集重金属离子，改变土壤中重金属离子的存在形态。

3、本发明的含海藻寡糖重金属生物修复剂能够提高植物对重金属的耐受性，促进重金属污染土壤中植物种子萌发和幼苗生长，提高根系活力，增加农作物产量。

4、本发明的含海藻寡糖重金属生物修复剂碱性，施加后能有效改善土壤酸化情况；同时海藻寡糖有利于土壤微生物活动，改良土壤结构，更有利于土壤重金属的钝化。

5、本发明的含海藻寡糖重金属生物修复剂制备简单，对土壤重金属修复效果好，且对环境不会造成二次污染，安全环保，具有很好的推广价值。

附图说明

图1为实施例2中Cd²⁺初始浓度为50mg/L时不同处理对Cd²⁺吸附的影响。在图1中，横坐标为重金属生物修复剂添加量(分别为10、20、50、100g/L)，纵坐标为Cd²⁺吸附率(％)。

图2为实施例2中Cd²⁺初始浓度为100mg/L时不同处理对Cd²⁺吸附的影响。在图2中，横坐标为重金属生物修复剂添加量(分别为10、20、50、100g/L)，纵坐标为Cd²⁺吸附率(％)。

图3为实施例2中Cd²⁺初始浓度为150mg/L时不同处理对Cd²⁺吸附的影响。在图3中，横坐标为重金属生物修复剂添加量(分别为10、20、50、100g/L)，纵坐标为Cd²⁺吸附率(％)。吸附率＝100×(C₀－C_e)/C₀，C₀为空白对照水相中Cd²⁺浓度，C_e是试验组处理后水相中Cd²⁺浓度。

具体实施方式

下面通过实施例和附图对本发明作详细说明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1重金属生物修复剂的制备

1、枯草芽孢杆菌发酵液的制备

1)平板培养：配制营养琼脂平板(牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂20g/L，灭前pH值为7.3)。从保存在4℃冰箱中的枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)三炬-07平板上用接种环挑取一环，在营养琼脂平板上进行划线培养，于30℃条件下培养24h。

2)种子培养：配制种子培养基(牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，灭菌前pH值为7.0)。从平板上将活化好的枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)三炬-07刮下，制成菌悬液，以5％(v/v，菌悬液OD₆₀₀＝0.84)的接种量接入接种至种子培养基中，于32℃，200rpm条件下培养24h。

3)发酵培养：配制发酵培养基(淀粉30.0g/L，蔗糖5.0g/L，豆粕粉15g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，硫酸锰0.2g/L，酵母膏1.0g/L)。将培养好的枯草芽孢杆菌种子液按10％(v/v)的接种量接种至发酵罐培养基中；发酵过程中，转速控制在300rpm，通气量控制在为1vvm，保持溶解氧10％以上，罐温控制在30℃，罐压保持在0.05～0.06MPa，pH值通过10％氨水和10％盐酸控制在6.5，培养60h后发酵结束。

2、淡紫拟青霉固态发酵物的制备

1)平板培养：配制PDA培养基(马铃薯(去皮)200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L，自然pH值)，从冷冻甘油管里取20μL的淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus)三炬03号种孢子液，涂布于营养琼脂平板，于28℃条件下培养4d。用生理盐水将平板上的淡紫拟青霉孢子洗涤下来，制成悬浮孢子。

2)种子培养：配制种子培养基(蔗糖15g/L，大豆粉10g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸锌0.1g/L，灭菌前pH值为6.0)。将淡紫拟青霉孢子悬液稀释至OD₆₀₀为0.2，以10％(v/v)的接种量接入种子培养基中，于28℃，180rpm下培养3d。

3)固体发酵培养：配制固体发酵培养基(麸皮、秸秆粉末、玉米粉、硫酸铵的质量比为70∶15∶10∶0.5)，将培养好的淡紫拟青霉种子液以100mL/kg的比例接种至固体培养基中，于28℃下培养1～2d后翻盘一次，前3d保持湿度为70％～80％，后4d保持自然湿度，发酵7d后，孢子成熟，固体发酵结束。

4)固体发酵培养基经常温干燥后粉碎，制得淡紫拟青霉固态发酵物。

3、含海藻寡糖重金属生物修复剂制备

按质量百分比将5％～15％海藻寡糖、10％～20％枯草芽孢杆菌发酵液、65％～85％淡紫拟青霉固态发酵物。优选的，将海藻寡糖、枯草芽孢杆菌发酵液、淡紫拟青霉固态发酵物按质量百分比15％、15％、70％混合均匀，制得含海藻寡糖重金属生物修复剂。

土壤重金属修复剂为粉剂，有效活菌数≥2亿/g，水分20％～25％，有机质含量≥55％，pH值范围在8.0～8.5。

4、不含海藻寡糖重金属生物修复剂制备

将枯草芽孢杆菌发酵液、淡紫拟青霉固态发酵物按质量比15∶70混合均匀，制得不含海藻寡糖重金属生物修复剂。

实施例2重金属生物修复剂对Cd²⁺的吸附作用

试验设计4个试验组，分别为空白对照(处理CK，不添加)、海藻寡糖(处理A)、不含海藻寡糖重金属生物修复剂(处理B)、含海藻寡糖重金属生物修复剂(处理组C)，每个处理(A、B、C)设置四个浓度梯度(10、20、50、100g/L)，每个试验重复3次。按以上试验设计将不同添加量海藻寡糖、不含海藻寡糖重金属生物修复剂、含海藻寡糖重金属生物修复剂加入含不同浓度的Cd²⁺的溶液中，控制溶液的最终体积10mL，使Cd²⁺的终浓度为50mg/L、100mg/L、150mg/L，在28℃、160rpm恒温振荡2h。取出样品，在6000rpm下振荡离心10min。将上清液转移至干净的离心管中，用火焰原子吸收分光光度法检测溶液中剩余的Cd²⁺浓度，并计算溶液中Cd²⁺的吸附率。

所得结果如下：

如图1～3所示，随着海藻寡糖(处理A)、不含海藻寡糖重金属生物修复剂(处理B)、含海藻寡糖重金属生物修复剂(处理组C)添加量的增加，三者对Cd²⁺的吸附率呈现先上升后趋于平稳的变化规律。对溶液中Cd²⁺的去除效果依次为含海藻寡糖重金属生物修复剂、海藻寡糖和不含海藻寡糖重金属生物修复剂。当溶液中Cd²⁺浓度为50mg/L时，添加50g/L含海藻寡糖重金属生物修复剂，Cd²⁺的吸附率最高达90.27％。

实施例3重金属生物修复剂对小白菜种子萌发的影响

挑选籽粒饱满、大小一致的小白菜种子用1％的次氯酸钠消毒15min，用去离子水冲洗干净，然后用去离子水浸泡12h。将浸过水的小白菜种子放在垫有两层滤纸的培养皿中，每个培养皿放置40颗种子。配制不同浓度的Cd²⁺溶液100mL(使溶液中Cd²⁺浓度分别为0、5mg/L、10mg/L、20mg/L)，取10mL上述溶液加入放有种子的培养皿中，分别加入10mg海藻寡糖(处理A)、不含海藻寡糖重金属生物修复剂(处理B)、含海藻寡糖重金属生物修复剂(处理组C)，混匀(每个处理3个重复)。盖上保鲜膜，在27℃的培养箱中培养7d，并统计发芽率。

重金属生物修复剂对小白菜种子萌发的影响如表1所示：随着Cd²⁺浓度的增加，小白菜种子的萌发率逐渐降低，添加海藻寡糖、不含海藻寡糖重金属生物修复剂和含海藻寡糖重金属生物修复剂可以一定程度上缓解重金属离子对小白菜种子的毒害作用，使小白菜种子的发芽质量得到很大的提升。尤其，当Cd²⁺浓度为20mg/L时，加入含海藻寡糖重金属生物修复剂使得小白菜种子萌发率提高到92.5％，比处理CK的种子萌发率(60.0％)提高了54.17％，比处理A(添加海藻寡糖)的种子萌发率(80.0％)提高了15.63％，比处理B(添加不含海藻寡糖重金属生物修复剂)的种子萌发率(70.0％)提高了32.14％。

所以含海藻寡糖重金属生物修复剂对于重金属污染土壤中种子的萌发具有促进作用。

表1

注：发芽率＝100×第7d发芽种子数/供试种子数

实施例4重金属生物修复剂的盆栽应用效果

供试土壤样品特征如表2所示，将供试土壤风干研磨过2mm筛，试验每盆装土2kg，混入CdCl₂溶液，制成2mg/kgCd单一污染土壤，混匀后，平衡50d。取200mg/kg的水(空白对照(CK)、海藻寡糖(处理A)、不含海藻寡糖重金属生物修复剂(处理B)和含海藻寡糖重金属生物修复剂(处理C)(每亩地按150000kg土计算，修复剂用量相当于300kg/亩)分别与尿素0.3g/kg、磷酸二氢钾0.5g/kg、氯化钾0.085g/kg充分混匀，施入土壤。挑选籽粒饱满、大小一致的小白菜种子用1％的次氯酸钠消毒15min，用去离子水冲洗干净，然后用去离子水浸泡12h。将浸过水的小白菜种子播种于盆中，待发芽1周后，选择长势一致的幼苗进行定苗，每盆5株，保持田间持水量60％，在人工气候室培养，种植40d后采收。

结果如下所示：

1)不同处理对土壤理化性质的影响如表2所示，在单一Cd污染(2mg/kg)土壤中处理A、B、C都能使土壤pH值、有机质、全氮、有效磷、有效钾含量有不同程度的提高，其中处理C的土壤的pH值、有机质含量、全氮含量、有效磷含量和有效钾含量分别比空白对照(CK)提高7.74％、11.86％、11.95％、5.55％、18.85％。根据GB/T23739-2009检测土壤中有效态镉的含量。在Cd污染浓度为2mg/kg的土壤中，处理A、B、C都能使土壤有效态Cd含量降低，其中处理C土壤中有效态Cd含量为1.23mg/kg，比修复前土壤有效态Cd(1.87mg/kg)降低了34.22％，比空白对照(CK)中的土壤有效态Cd含量(1.79mg/kg)降低了30.11％，比处理A的降低了15.75％，比处理C的降低了20.13％。本发明的含海藻寡糖重金属生物修复剂可以改良土壤，同时能够有效降低土壤中有效态重金属的含量。

表2

2)小白菜种植40d采收，并计算植物株高、根长、鲜重。不同处理对小白菜生长的影响如表3所示，不同处理对小白菜的生长影响差异明显。未污染土壤中小白菜正常生长，施加海藻寡糖(处理A)、不含海藻寡糖土壤重金属修复剂(处理B)、含海藻寡糖土壤重金属修复剂(处理C)均能促进小白菜生长。在未污染土壤中，处理A能够使得小白菜的株高、根长和鲜重分别比对照CK的提高了19.76％、16.80％和23.89％；处理B的小白菜的株高、根长和鲜重比处理CK的分别提高了11.72％、5.03％和12.35％；而处理C的小白菜的株高(11.33cm)比处理CK(8.45cm)的提高了34.08％，根长(9.39cm)比处理CK的(7.56cm)提高了24.21％，鲜重(9.74g/株)比处理CK的(7.45g/株)提高了30.74％。海藻寡糖可以作为信号分子参与植物生长发育调控活动，能明显促进植物株高、根长、鲜重的提高。在Cd污染土壤，处理CK的小白菜生长缓慢，叶片发黄、萎蔫，污染土壤空白对照(CK)的小白菜鲜重为6.12g/株，比未污染土壤中空白对照(CK)的小白菜鲜重(7.45g/株)降低了21.73％。施加重金属生物修复剂可以缓解重金属对小白菜的毒害作用，小白菜生长较良好，其中处理C的小白菜株高、根长、鲜重分别为10.02cm、7.84cm和7.93g/株，比空白对照组的分别提高了33.96％、25.84％、29.57％。海藻寡糖与功能菌株复配，小白菜生长恢复到未污染水平。

表3

3)小白菜种植40d采收，根据GB5009.15-2014检测小白菜的Cd含量。海藻寡糖土壤重金属修复剂对小白菜重金属含量的影响如表4所示，在Cd污染土壤中，处理C中小白菜地上部Cd含量为0.25mg/kg，比空白对照(处理CK)的(0.43mg/kg)降低了41.86％，比处理A的(0.28mg/kg)降低了10.71％，比处理B的(0.3mg/kg)降低了16.67％；处理C中小白菜根部Cd含量为0.74mg/kg，比空白对照(处理CK)的(1.02mg/kg)降低了27.45％，比处理A的(0.87mg/kg)降低了14.94％，比处理B的(0.81mg/kg)降低了8.64％。这说明了本发明的含海藻寡糖重金属生物修复剂能够抑制植物重金属的过量吸收，降低植物内重金属的积累。

表4

实施例5含海藻寡糖重金属生物修复剂的田间应用效果

(1)试验小区基本情况：供试土壤为某污灌区农田土壤，该地区污水灌溉历史10年以上。修复试验之前进行土壤采集样品检测土壤的理化性质。供试土壤中总Cd含量为1.84mg/kg，有效态Cd含量为0.73mg/kg，pH值为5.87。

(2)试验处理方法：供试植物为菠菜，品种是华菠一号。开始进行试验，试验共分5个处理，3次重复，共计15个小区。随机区组排列，小区面积20m²，四周设保护行。

处理如下：

空白对照组(CK)：不施加修复剂；修复前，施用基肥：尿素20kg/亩、磷酸二氢钾80kg/亩、氯化钾15kg/亩，翻耕后充分耙匀，挖好种植坑，播种华菠一号种子，覆盖土2～4cm。

处理A1：将含海藻寡糖重金属生物修复剂300kg/亩与基肥：尿素20kg/亩、磷酸二氢钾80kg/亩、氯化钾15kg/亩一次性施入农田土壤，翻耕后充分耙匀，挖好种植坑，播种华菠一号种子，覆盖土2～4cm。

处理A2：将含海藻寡糖重金属生物修复剂150kg/亩与基肥：尿素20kg/亩、磷酸二氢钾80kg/亩、氯化钾15kg/亩混合后施入土壤，翻耕后充分耙匀，挖好种植坑，播种华菠一号种子，覆盖土2～4cm。之后间隔20d追施一次含海藻寡糖重金属生物修复剂，每次用量150kg/亩，共施用2次。

处理A3：将含海藻寡糖重金属生物修复剂100kg/亩与基肥：尿素20kg/亩、磷酸二氢钾80kg/亩、氯化钾15kg/亩混合后施入土壤，翻耕后充分耙匀，挖好种植坑，播种华菠一号种子，覆盖土2～4cm。之后间隔13.3d追施一次含海藻寡糖重金属生物修复剂，每次用量100kg/亩，共施用3次。

处理A4：将含海藻寡糖重金属生物修复剂75kg/亩与基肥：尿素20kg/亩、磷酸二氢钾80kg/亩、氯化钾15kg/亩混合后施入土壤，翻耕后充分耙匀，挖好种植坑，播种华菠一号种子，覆盖土2～4cm。之后间隔10d追施一次含海藻寡糖重金属生物修复剂，每次用量75kg/亩，共施用4次。

以上处理均在幼苗长出2～3片真叶进行追肥，施加尿素10kg/亩，追肥次数1～2次。小区间垄隔开，防止田间水流失和串流。保持田间持水量60％，病虫害防治及日常管理按当地常规管理进行。种植40d后采收，菠菜采收后，取每个试验小区0～20cm土壤样品，测定土壤理化性质。

(3)结果如下所示：

1)含海藻寡糖土壤重金属修复剂对土壤理化性质的影响(平均值)如表5所示，与处理CK(空白对照，不施用修复剂)相比，处理A1可使土壤pH、有机质、全氮、有效磷、有效钾含量分别提高了12.37％、6.71％、4.19％、6.69％和9.77％。根据GB/T23739-2009检测土壤中有效态镉的含量，与修复前相比，处理A1使土壤有效态Cd含量下降了30.14％；与空白对照(CK)相比，土壤有效态Cd含量下降了23.28％。

分次施加含海藻寡糖重金属生物修复剂对土壤理化性质变化影响较大，土壤pH、有机质含量、全氮、有效磷、有效钾都有不同程度的提高。与处理CK相比，处理A3、A4的效果最明显，其中处理A4可使土壤有效态Cd含量降低40.00％。

表5

2)菠菜种植40d采收，计算菠菜产量，并根据GB5009.15-2014检测菠菜的镉含量。含海藻寡糖重金属生物修复剂对菠菜生长及Cd含量的影响如表6所示，处理A1的菠菜平均产量为1572kg/亩，比处理CK的菠菜平均产量(1283kg/亩)增产22.53％，而处理A2、A3、A4的菠菜平均产量分别比处理CK的提高了22.21％、23.85％和25.80％。不同处理均能使得菠菜地上部和根部的Cd含量降低，但是降低幅度不一样。其中处理A3中菠菜地上部Cd含量为0.25mg/g，比处理CK(空白对照组)降低了40.48％；而处理A2则能使菠菜根部Cd降到最低(Cd含量为0.75mg/kg)，比处理CK(空白对照组)降低了33.04％。

表6

(4)结论：

1)在重金属污染土壤中，施用含海藻寡糖重金属生物修复剂可以钝化土壤重金属、改良土壤，提高土壤全氮、有效钾、有效磷、有机质含量，与空白对照(CK)相比，土壤有效态Cd含量最大程度下降了40.00％。

2)施用含海藻寡糖重金属生物修复剂可以提高菠菜产量，增产率最高达到25.80％。

3)施用含海藻寡糖重金属生物修复剂能够降低菠菜体内Cd含量，使其地上部Cd含量最大程度降低了40.48％，根部Cd含量最大程度降低了33.04％。

以上试验验证了本发明的含海藻寡糖重金属生物修复剂对重金属污染土壤的修复效果明显，同时还能促进植物根系发育，提高作物产量。

此外，本发明各种不同实施方式中间可以任意组合，只要不违背本发明的思想，应视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种含海藻寡糖重金属生物修复剂，其特征在于各组分的质量百分比为：海藻寡糖5％～15％、枯草芽孢杆菌发酵液10％～20％、淡紫拟青霉固态发酵物65％～85％。

2.如权利要求1所述一种含海藻寡糖重金属生物修复剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)制备枯草芽孢杆菌发酵液

配制营养琼脂平板，将枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)三炬-07接种在营养琼脂平板上进行划线培养，从营养琼脂平板上将活化好的枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)三炬-07用无菌生理盐水洗涤，制成菌悬液，将菌悬液接种至种子培养基中培养，得种子液，再将种子液接种至发酵罐培养基中发酵，得枯草芽孢杆菌发酵液；所述枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)三炬-07，已于2014年12月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.10248；

2)制备淡紫拟青霉固态发酵物

配制PDA培养基，将淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus)三炬03号种孢子液，涂布于营养琼脂平板上培养，再用无菌生理盐水将营养琼脂平板上的淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus)三炬03号种的孢子洗涤，制成孢子悬液；将孢子悬液接入种子培养基中培养得种子液；将种子液接种至固体发酵培养基中，于28～32℃下培养1～2d后翻盘一次，前3d保持湿度为70％～80％，后4d保持自然湿度，发酵7d后，孢子成熟，固体发酵结束，固体发酵培养基经常温干燥后粉碎，制得淡紫拟青霉固态发酵物；所述淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus)三炬03号种，已于2010年6月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2010165；

3)制备含海藻寡糖重金属生物修复剂

将海藻寡糖、步骤1)所得枯草芽孢杆菌发酵液、步骤2)所得淡紫拟青霉固态发酵物混合，即得含海藻寡糖重金属生物修复剂。

3.如权利要求1所述一种含海藻寡糖重金属生物修复剂的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述营养琼脂平板的组成为牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂20g/L，灭前pH值为7.3。

4.如权利要求1所述一种含海藻寡糖重金属生物修复剂的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述划线培养的条件是于28～32℃条件下培养24～48h；

所述种子培养基的组成可为牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，灭菌前pH值为7.0；所述菌悬液接种的接种量按体积百分比可为菌悬液的5％，菌悬液OD₆₀₀＝0.84；所述种子培养基中培养的条件可于30～35℃，150～200rpm条件下培养24～36h。

5.如权利要求1所述一种含海藻寡糖重金属生物修复剂的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述发酵培养基的组成为淀粉20.0～30.0g/L，蔗糖5.0～10.0g/L，豆粕粉10～20g/L，磷酸氢二钾2.0～3.0g/L，硫酸锰0.1～0.5g/L，酵母膏1.0～2.0g/L；所述种子液接种至发酵罐培养基中发酵的接种量按体积百分比可为种子液的10％；所述发酵的条件可为：转速控制在200～300rpm，通气量控制在为1vvm，保持溶解氧10％以上，罐温控制在28～30℃，罐压保持在0.05～0.06MPa，pH值通过10％氨水和10％盐酸控制在6.5，发酵时间为36～72h。

6.如权利要求1所述一种含海藻寡糖重金属生物修复剂的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述PDA培养基的组成为：去皮马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L，自然pH值；所述涂布于营养琼脂平板上培养的条件可于28～32℃条件下培养3～5d。

7.如权利要求1所述一种含海藻寡糖重金属生物修复剂的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述种子培养基的组成为：蔗糖15g/L，大豆粉10g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸锌0.1g/L，灭菌前pH值为6.0。

8.如权利要求1所述一种含海藻寡糖重金属生物修复剂的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述将孢子悬液接入种子培养基的接种量按体积百分比为8％～15％，稀释至OD₆₀₀为0.2；所述将孢子悬液接入种子培养基中培养的条件可于28～32℃，150～200rpm下培养3～4d。

9.如权利要求1所述一种含海藻寡糖重金属生物修复剂的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述固体发酵培养基的组成为：麸皮、秸秆粉末、玉米粉、硫酸铵，麸皮、秸秆粉末、玉米粉、硫酸铵按质量比可为(70～80)∶(15～20)∶(10～15)∶(0.5～1.0)；所述将种子液接种至固体发酵培养基的接种量可将种子液以100mL/kg的比例接种至固体培养基中。

10.如权利要求1所述一种含海藻寡糖重金属生物修复剂的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述海藻寡糖是利用微生物直接降解龙须菜、马尾藻、褐藻等藻类植物中至少一种所得的聚合度为4～8的寡糖；所述海藻寡糖、步骤1)所得枯草芽孢杆菌发酵液、步骤2)所得淡紫拟青霉固态发酵物按质量百分比可为(5％～15％)∶(10％～20％)∶(65％～85％)。