CN107087641A

CN107087641A - 一种提高作物抗盐性的海洋寡糖生物制剂及其制备方法

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Publication number: CN107087641A
Application number: CN201710068358.1A
Authority: CN
Inventors: 何舒雅; 余劲聪; 林克明
Original assignee: FUJIAN SANJU BIOLOGICAL SCIENCE & TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: FUJIAN SANJU BIOLOGICAL SCIENCE & TECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2017-02-08
Filing date: 2017-02-08
Publication date: 2017-08-25
Anticipated expiration: 2037-02-08
Also published as: CN107087641B

Abstract

本发明涉及一种提高作物抗盐性的海洋寡糖生物制剂及其制备方法。所述提高作物抗盐性的海洋寡糖生物制剂组成，包括分子量3000‑4000的甲壳低聚糖、龙须菜琼胶寡糖、胶冻样芽孢杆菌、氯化钙和水；其中甲壳低聚糖：龙须菜琼胶寡糖质量比为（1‑3）:0.5，优选的1:0.5；氯化钙10‑20 mmol/L，寡糖含量≥0.2%，有效活菌数≥2亿/mL。制备方法：1）制备甲壳低聚糖溶液；2）制备胶冻样芽孢杆菌发酵液；4）在常温下降将制得的甲壳低聚糖溶液、龙须菜琼胶寡糖和氯化钙按一定比例加入胶冻样芽孢杆菌发酵液中，并搅拌混合均匀，即得一种提高作物抗盐性的海洋寡糖生物制剂。所述一种提高作物抗盐性的海洋寡糖生物制剂用于促进盐胁迫下辣椒种子萌发，能显著提高辣椒种子的萌发率，促进苗期生长发育，增强辣椒幼苗对盐胁迫的抵抗能力,也可适用于促进黄瓜、水稻等其他作物种子萌发和幼苗的生长。

Description

一种提高作物抗盐性的海洋寡糖生物制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物制剂，尤其是涉及一种提高作物抗盐性的海洋寡糖生物制剂及其制备方法，属于海洋生物活性物质组合物生物技术领域。

背景技术

我国盐渍土面积大、分布广泛，土壤盐渍化严重影响作物的正常生产发育，降低果蔬的产量和品质。种子萌发期是作物生育期中对盐胁迫最为敏感的时期之一（顾闽峰,2010）。研究表明，高浓度NaCl胁迫下，种子发芽显著降低，这可能是由于高浓度的NaCl盐的毒害作用，降低了K、Ca等元素含量，造成细胞的渗透调节紊乱，同时对膜脂和脂肪酸的组成及生理代谢酶活等方面产生不良影响所致（程大友, 1996）。除了发芽期外，幼苗期也是植物对盐胁迫最敏感的时期（阮松林, 2002）。盐胁迫下一般表现为出苗不整齐，延迟出苗，幼苗生长缓慢，叶片翻卷，色浓，乃至发黄；根系发育不良，从而表现出根系吸水困难，严重时会导致根部腐烂而死苗。大量研究表明（苑泽宁, 2008；柳絮, 2001；陈志德, 2004），大部分的蔬菜对盐胁迫表现出敏感性，辣椒作为栽培的主要蔬菜之一对盐胁迫表现出了很强的敏感性（顾闽峰, 2010）。因此，提高辣椒萌芽期和苗期的耐盐性，对于实现辣椒在盐渍土壤的栽培利用具有重要的意义。

研究表明，海洋寡糖具有调节植物生长，诱导植物产生广谱抗性，提高植物抗病性，缓解高盐、低温和干旱等逆境胁迫对植物的伤害（余劲聪, 2016）。中国专利CN200810013176.5公开了一种促植物生长的褐藻寡糖浸种剂，该浸种剂可以用于促进禾本植物和豆科植物生长，但未涉及盐胁迫下种子的萌发。

中国专利CN201310618019.8公开了一种提高马齿苋耐盐性的浸种剂及其制备方法，该浸种剂包括氯化钙、水杨酸、5-氨基乙酰丙酸、微量元素，可提高马齿苋种子在盐胁迫处理下的发芽率，增强马齿苋幼苗对盐胁迫的抵抗能力。中国专利CN200910091268.X提供了一种促进盐胁迫条件下黄瓜种子萌发的方法及专用浸种液，改浸种剂包括氯化钙、L-谷氨酸和水，但未涉及提高辣椒的盐胁迫能力，促进辣椒种子萌发和幼苗生长。

目前，分子量3000-4000的甲壳低聚糖和聚合度4-8的龙须菜琼胶寡糖与微生物复配用于盐胁迫下辣椒种子萌发的报道还未见。

发明内容

本发明的目的在于针对上述存在的问题，提供一种提高作物抗盐性的海洋寡糖生物制剂及其制备方法，制备简单，使用方便，应对盐胁迫对辣椒生长造成的严重危害，减少辣椒由于发芽期因盐胁迫造成的损失。

所述一种提高作物抗盐性的海洋寡糖生物制剂各组分包括分子量为3000-4000的甲壳低聚糖、聚合度4-8的龙须菜琼胶寡糖、胶冻样芽孢杆菌发酵液和氯化钙。按质量配比计算，3000-4000的甲壳低聚糖：聚合度4-8的龙须菜琼胶寡糖比值为（1-3）:0.5，寡糖含量≥0.2%，氯化钙浓度为10-20 mmol/L,胶冻样芽孢杆菌有效活菌数≥2亿/mL，其余为水。

所述一种提高作物抗盐性的海洋寡糖生物制剂制备方法，包括以下步骤：

1）制备甲壳低聚糖溶液

将淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）三炬03号菌种孢子液，涂布于PDA平板上培养，再用无菌生理盐水将PDA平板上的淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）三炬03号菌种的孢子洗涤下来，制成孢子悬液；将孢子悬液接种到种子培养基中得到种子液；再将种子液接种到含虾蟹壳原料的发酵培养基中发酵培养48-72 h得到淡紫拟青霉发酵液；将淡紫拟青霉发酵液离心除去菌体，获得上清液，浓缩，制得含量10%-15%的分子量3000-4000的甲壳低聚糖溶液；

2）制备胶冻样芽孢杆菌发酵液；

配置无氮固体培养基，将胶冻样芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）三炬01菌株接种到无氮固体培养基进行划线培养，将无氮固体培养基上活化好的胶冻样芽孢杆菌（Bacillus Mucilaginosus）三炬01菌株转接至无氮液体培养基中，培养得到一级种子液，将一级种子液接种至种子发酵罐中，培养得到二级种子液。再将种子液接种至发酵培养基中发酵，制得胶冻样芽孢杆菌发酵液；

3）制备提高作物抗盐性的海洋寡糖生物制剂

将步骤1）所得的甲壳低聚糖溶液、龙须菜琼胶寡糖溶液按质量比（1-3）:0.5，加入步骤2所制得的胶冻样芽孢杆菌发酵液中，并控制寡糖浓度≥0.2%，同时加入氯化钙，使氯化钙终浓度为10-20 mmol/L，搅拌混合均匀，即得一种提高作物抗盐性的海洋寡糖生物制剂。

在步骤1）中，所述的PDA平板组成可为：去皮马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂15 g/L,自然pH；所述涂布于PDA平板上培养条件可为：培养温度28℃、培养时间72 h；所述种子培养基的组成可为：蔗糖12~16 g/L、大豆粉8~12 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、硫酸锌0.1g/L，灭菌前pH值为6.0；所述将孢子悬液接种入种子培养基中培养的条件可为：稀释至OD600为0.2，接种量为10%（V/V），培养温度28℃、转数200 rpm，培养时间72 h；所述发酵培养基的组成可为：虾蟹壳粉35 g/L、蛋白胨4 g/L，葡萄糖3 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、硫酸镁0.5 g/L；所述种子液接种量为8%；所述发酵培养条件可为：接种后通风1.0 vvm，后期根据OD值逐步提高通风量、发酵中后期，按5%的量分三次逐步流加补料，补料的成分为10%虾蟹壳粉和0.05%的硫酸镁混合悬浮液；所述的离心条件可为转速5000 rpm、离心时间30分钟；

在步骤2）中，所述固体无氮培养基的组成为蔗糖10g/L、磷酸氢二钾0.8 g/L、硫酸镁0.4 g/L、氯化钠0.15 g/L、碳酸钙0.5 g/L，琼脂20 g/L。灭菌前pH值为7.5；所述的活化培养的条件是于30℃条件下培养48 h；所述的种子培养基的组成可为蔗糖10 g/L、磷酸氢二钾0.8 g/L、硫酸镁0.4 g/L、氯化钠0.15 g/L、碳酸钙0.5 g/L，灭菌前pH值为7.5。所述的一级种子培养的条件可于30℃，150 rpm条件下培养24 h；所述的二级种子培养的条件可于种子发酵罐中，30℃条件下，保持罐转速125～150rpm，培养24 h；所述的发酵培养基的组成为酵母膏1.5 g/L、淀粉5.0 g/L、豆粕粉5.0 g/L、硫酸镁1.2 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、碳酸钙8.5 g/L、氯化钠0.2 g/L，灭菌前pH值为7.2；所述种子液接种至发酵罐培养基中发酵的接种量按体积的百分比为种子液的10％；所述发酵条件可为：转速控制在180～250 rpm，通过调节转速和通气量使溶解氧控制在20％（V/V），罐温控制在30℃，罐压保持在0.05～0.06MPa，pH值通过10％的氨水和10％的盐酸控制在7.2，发酵时间48～72 h。

所述的海洋寡糖生物制剂在辣椒浸种中的应用；也可用于促进黄瓜、水稻等其他作物种子萌发和幼苗的生长。

本发明具有以下有益效果：

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面通过实施例对本发明作详细说明，但本发明并不局限于以下实施例。

实施例1 海藻寡糖复合微生物肥的制备

1）制备甲壳低聚糖溶液

配置PDA培养基，将淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）三炬03号菌种孢子液，涂布于PDA平板上培养，再用无菌生理盐水将PDA平板上的淡紫拟青霉（Paecilomyceslilacinus）三炬03号菌种的孢子洗涤下来，制成孢子悬液；将孢子悬液接种到种子培养基中得到种子液；再将种子液接种到含虾蟹壳原料的发酵培养基中发酵培养48 h得到淡紫拟青霉发酵液；将淡紫拟青霉发酵液离心除去菌体，获得上清液，浓缩，制得含量10％-15％的分子量3000-4000的甲壳低聚糖溶液；

在步骤1）中，所述的PDA平板组成可为：去皮马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂15 g/L,自然pH；所述淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）三炬03号菌种已于2010年6月30日收藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2010165；所述涂布于PDA平板上培养条件可为：培养温度28℃、培养时间72 h；所述种子培养基的组成可为：蔗糖12 g/L、大豆粉10 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、硫酸锌0.1 g/L，灭菌前pH值为6.0；所述将孢子悬液接种入种子培养基中培养的条件可为：稀释至OD600为0.2，接种量为10%（V/V），培养温度28℃、转数200 rpm，培养时间72 h；所述发酵培养基的组成可为：虾蟹壳粉35 g/L、蛋白胨4 g/L，葡萄糖3 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、硫酸镁0.5 g/L；所述种子液接种量为8%；所述发酵培养条件可为：接种后通风1.0vvm，后期根据OD值逐步提高通风量、发酵中后期，按5%的量分三次逐步流加补料，补料的成分为10%虾蟹壳粉和0.05%的硫酸镁混合悬浮液；所述的离心条件可为转速5000 rpm、离心时间30分钟。

2）制备胶冻样芽孢杆菌发酵液；

在步骤2）中，所述固体无氮培养基的组成为蔗糖10g/L、磷酸氢二钾0.8 g/L、硫酸镁0.4 g/L、氯化钠0.15 g/L、碳酸钙0.5 g/L，琼脂20 g/L。灭菌前pH值为7.5；所述的活化培养的条件是于30℃条件下培养48h；所述的种子培养基的组成可为蔗糖10g/L、磷酸氢二钾0.8 g/L、硫酸镁0.4 g/L、氯化钠0.15 g/L、碳酸钙0.5 g/L，灭菌前pH值为7.5。所述的一级种子培养的条件可于30℃，150 rpm条件下培养24 h；所述的二级种子培养的条件可于种子发酵罐中，30℃条件下，保持罐转速125～150rpm，培养24 h；所述的发酵培养基的组成为酵母膏1.5 g/L、淀粉5.0 g/L、豆粕粉5.0 g/L、硫酸镁1.2 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、碳酸钙8.5g/L、氯化钠0.2 g/L，灭菌前pH值为7.2；所述种子液接种至发酵罐培养基中发酵的接种量按体积的百分比为种子液的10％；所述发酵条件可为：转速控制在200 rpm，通过调节转速和通气量使溶解氧控制在20％（V/V），罐温控制在30℃，罐压保持在0.05～0.06MPa，pH值通过10％的氨水和10％的盐酸控制在7.2，发酵时间60 h。

3）制备提高作物抗盐性的海洋寡糖生物制剂

将步骤1）所得的甲壳低聚糖溶液、龙须菜琼胶寡糖溶液按质量比1:0.5，加入步骤2所制得的胶冻样芽孢杆菌发酵液中，并控制寡糖浓度为0.3%，同时加入氯化钙，使氯化钙终浓度为15 mmol/L，搅拌混合均匀，即得一种提高作物抗盐性的海洋寡糖生物制剂。

实施例2 海洋寡糖生物制剂对辣椒种子萌发的影响

挑选籽粒饱满、大小一致的辣椒种子用1%的次氯酸钠消毒15 min，用去离子水冲洗干净，在室温条件下分别用清水（处理CK）和5个不同稀释倍数（0倍（处理A）、10倍（处理B）、100倍（处理C）、500倍（处理D）和1000倍（处理E））海洋寡糖生物制剂浸种12 h，每个处理100粒，3重复。浸种后用清水冲洗3次，放在垫有两层滤纸的培养皿中，加5 mL 质量浓度0.4%的NaCl溶液，对照加清水，放至27℃培养箱中正常萌发，以后每天观察记录发芽数（以胚根长大种子长1/2为准），更换盐溶液以维持盐浓度不变。第6天统计发芽势，第14天取幼苗的胚根长，计算统计发芽率。发芽势(GE)=（6 d内发芽种子数/供试种子数）x100%；发芽率（GP）=（14 d内发芽中子数/供试种子数）x100%；发芽指数（Gi）= QUOTE ，式中，Gt为在时间t日的发芽数，Dt为相应的发芽天数。

NaCl溶液处理14天时同时进行生物量的测定，测量幼苗的鲜重、株高、和根系长度，105℃杀青20 min，于70℃烘干至恒重，称其干重。

结果如下所示：

1）不同稀释倍数的海洋寡糖生物制剂后，辣椒中的发芽势、发芽率、发芽指数和胚根长均较对照有较大提高。经统计分析表明，各处理的发芽势、发芽率、发芽指数和胚根长分别较对照组有显著提高，其中以稀释500倍的海洋寡糖生物制剂处理效果最佳，其发芽势、发芽率、发芽指数、胚根长分别比对照提高了112.6%、10.6%、30.3%和87.5%；用稀释0倍（未稀释）的海洋寡糖生物制剂处理效果最差，辣椒的发芽势、发芽率、发芽指数、胚根长分别比对照提高了31.3%、4.5%、4.0%和22.1%；

表1 海洋寡糖生物制剂浸种对辣椒种子萌发的影响

处理	发芽势%	发芽率%	发芽指数	胚根长（mm）
					CK	35.62^c	80.20	33.25	26.3
A	46.78^b	83.82	34.58	32.1
					B	73.56^a	85.24	40.39	41.6
C	74.18^a	87.41	42.29	44.5
					D	75.76^a	88.68	43.32	49.3
E	73.89^a	86.37	39.87	41.7

2）盐分过高，不但影响辣椒的正常出苗而且影响幼苗的生长。相比对照CK，不同处理组均能使辣椒幼苗株高、叶面积、鲜重、干重有所提高，尤其处理D能使辣椒幼苗株高、叶面积、鲜重、干重分别比对照CK增加125.5%、65.5%、49.0%和49.3%。

表2 海洋寡糖生物制剂浸种对辣椒幼苗生长的影响

处理	株高（cm）	叶面积(cm²/植株)	鲜重（g）	干重（g）
					CK	11.27	14.58	3.921	1.234
A	15.21	15.71	4.124	1.521
					B	18.39	17.45	4.865	1.665
C	24.56	20.47	5.243	1.794
					D	25.41	24.13	5.842	1.842
E	19.32	18.3	4.789	1.697

实施例3 海洋寡糖生物制剂对辣椒幼苗生长的影响

挑选籽粒饱满、大小一致的辣椒种子用1%的次氯酸钠消毒15 min后，用去离子水冲洗干净，在室温条件下清水浸种12 h后，将种子置于铺有滤纸的培养皿中催芽。出芽后播种于盛有蛭石和珍珠岩（体积比为3:1）混合基质培养钵中（12 cm×10 cm）。待辣椒子叶完全展开，用稀释20%的霍格兰氏（Hoagland）营养液浇灌，每隔2天浇灌一次。当辣椒幼苗有5片真叶完全展开时，用5%的NaCl溶液进行处理，对照用等量清水处理。同时用稀释500倍的海洋寡糖生物制剂进行叶面喷施，连喷4天，每次用量25 mL，对照CK2用等量清水处理。每个处理10株，重复3次。于钠盐处理后第6、12、18d，进行生理生化指标的测定。4个处理分别为：CK1：清水处理；CK2：海洋寡糖生物制剂；CK3：钠盐处理；实验组：钠盐处理+海洋寡糖生物制剂。

结果如下所示：

1）单独海洋寡糖生物制剂处理（CK2）对可溶性糖、脯氨酸、MDA含量的影响不大。经NaCl的胁迫后，与对照CK1相比，盐胁迫（CK3）明显提高了辣椒叶片的可溶性糖、MDA、脯氨酸含量，在胁迫第6d、12d和18d后，可溶性糖含量分别提高了109.5%、67.3%和55.8%，MDA含量分别提高了20.9%、68.8%和41.2%。盐胁迫后，用海洋寡糖生物制剂处理（实验组）后，辣椒叶片的可溶性糖、MDA、脯氨酸含量均低于单纯NaCl胁迫的。NaCl胁迫下可通过增加可溶性糖、MDA、脯氨酸含量来维持渗透平衡，具有一定的抗盐性，而海洋寡糖生物制剂能抑制膜脂过氧化作用，从而减轻盐胁迫对细胞的伤害；

2）SOD是清除超氧自由基酶系统中最重要的一种酶，使植物抵御活性氧伤害，当植物体处于胁迫环境中，这种酶活性通常显著降低。在NaCl胁迫条件下，随着胁迫时间的延长，辣椒幼苗的SOD活性较对照CK1不同程度降低。加海洋寡糖生物制剂（实验组）处理后有效抑制了SOD活性的降低。

表3 海洋寡糖生物制剂对辣椒幼苗生理生化指标的影响

以上结果表明，在海洋寡糖生物制剂处理下可提高种子在正常萌发、盐胁迫处理下的发芽率，以及提高幼苗抗盐能力，促进生根发芽。

此外，本发明各种不同实施方式中间可以任意组合，只要不违背本发明的思想，应视为本发明所公开的内容。

Claims

1.一种提高作物抗盐性的海洋寡糖生物制剂，其特征在各组分组成包括分子量为3000-4000的甲壳低聚糖、聚合度4-8的龙须菜琼胶寡糖、胶冻样芽孢杆菌发酵液、氯化钙，按质量配比计算，3000-4000的甲壳低聚糖：聚合度4-8的龙须菜琼胶寡糖比值为（1-3）:0.5，氯化钙浓度为10-20 mmol/L，寡糖含量≥0.2%，有效活菌数≥2亿/mL，其余为水。

2.如权利要求1所述的一种提高作物抗盐性的海洋寡糖生物制剂，其特征在于所述分子量为3000-4000的甲壳低聚糖是利用淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）三炬03号菌种为发酵菌，以虾蟹壳为原料，通过微生物发酵生产得到的发酵上清液，经过膜过滤得到的分子量为3000-4000的甲壳低聚糖；淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）三炬03号菌种已于2010年6月30日收藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2010165；所述胶冻样芽孢杆菌为胶冻样芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）三炬-10菌株，已于2015年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记入册编号为CGMCC NO.3995。

3.如权利要求1所述的一种提高作物抗盐性的海洋寡糖生物制剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）制备甲壳低聚糖溶液

2）制备胶冻样芽孢杆菌发酵液；

配置无氮固体培养基，将胶冻样芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）三炬01菌株接种到无氮固体培养基进行划线培养，将无氮固体培养基上活化好的胶冻样芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）三炬01菌株转接至无氮液体培养基中，培养得到一级种子液，将一级种子液接种至种子发酵罐中，培养得到二级种子液；将种子液接种至发酵培养基中发酵，制得胶冻样芽孢杆菌发酵液；

3）制备提高作物抗盐性的海洋寡糖生物制剂

将步骤1）所得的甲壳低聚糖溶液与龙须菜琼胶寡糖溶液按质量比（1-3）:0.5加入步骤2所制得的胶冻样芽孢杆菌发酵液中，并控制寡糖浓度≥0.2%，同时加入氯化钙，使氯化钙终浓度为10-20 mmol/L，搅拌混合均匀，即得一种提高作物抗盐性的海洋寡糖生物制剂。

4.如权利要求1所述的一种提高作物抗盐性的海洋寡糖生物制剂的制备方法，其特征在于步骤4）中，所述龙须菜琼胶寡糖是利用微生物直接降解龙须菜所得的聚合度为4～8的寡糖。

5.如权利要求1所述的一种提高作物抗盐性的海洋寡糖生物制剂在辣椒浸种中的应用；也可用于促进黄瓜、水稻等其他作物种子萌发和幼苗的生长。