CN104894205B - 一种利用不动杆菌提高细菌可得然胶产量的方法 - Google Patents

一种利用不动杆菌提高细菌可得然胶产量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用不动杆菌提高细菌可得然胶产量的方法，包括：将鲁氏不动杆菌与可得然胶产生菌共同培养，即得。本发明的方法提高了可得然胶产生菌的产胶量，为微生物发酵生产可得然胶提供了新方法。

Description

一种利用不动杆菌提高细菌可得然胶产量的方法
技术领域
本发明属于提高可得然胶的产量的方法领域，特别涉及一种利用不动杆菌提高细菌可得然胶产量的方法。
背景技术
可得然胶(Curdlan)又称热凝胶，是一种微生物胞外多糖，主要由土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)和根瘤菌属(Rhizobium sp.)的细菌产生。可得然胶分子是由葡萄糖结构单元以β-l，3糖苷键连接而成的线性分子，无分支，相对分子质量约为5.3×104～2.0×106。
可得然胶具有独特的流变学、热成胶和结构简单等性能，可广泛应用于食品、生物医学等领域。可得然胶具有加热凝固成胶的特性，形成的胶体分为低度胶体和高度胶体。将可得然胶的水分散液加热到55～65℃后再降温，形成热可逆性的低度胶体。当可得然胶的水分散液被加热到80℃以上时，则形成热不可逆的高度胶体。高度胶体不仅具有很好的强度和弹性，而且具有很好的稳定性，加热至120℃不融化，在pH3～10的范围内保持稳定的结构，经多轮冻融处理而不改变胶体的结构，能抗酶和酸的水解。1996年，美国FDA批准可得然胶作为一种食品添加剂应用。可得然胶在食品工业中可用作增稠剂、凝胶剂、脂肪替代物等。生物医学上，可得然胶可用于药物缓释和免疫增强剂。根据可得然胶形成的空间网状结构和成膜性，还能将其应用于药物输送方面，用可得然胶包裹药物，控制药物连续缓慢的释放。可得然胶的结构经过修饰后，可转化为硫酸可得然胶、羧甲基化可得然胶和磷酸酯化的可得然胶，这些可得然胶的衍生物具有抗病毒、抗肿瘤和抗感染等生物活性。得然胶也可应用于混凝土的制作，增加混凝土的流体特性，防止水泥和小石子的分离。
可得然胶是一种具有良好前景的微生物多糖。然而目前可得然胶的价格仍较高，提高可得然胶产量、降低生产成本是可得然发酵生产的主要方向。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种利用不动杆菌提高细菌可得然胶的方法，该方法利用鲁氏不动杆菌和可得然胶产生菌共培养来生产可得然胶，可显著提高可得然胶产量，有助于降低可得然胶的生产成本。
本发明的一种利用不动杆菌提高细菌可得然胶产量的方法，包括：
(1)从鲁氏不动杆菌斜面取一环菌接种到种子培养基中，于28～32℃、150～240rpm振荡培养20～24h，得到活化的鲁氏不动杆菌种子液；
(2)从可得然胶产生菌斜面上取一环菌接种于种子培养基中，于28～32℃、150～240rpm振荡培养16～24h，得到活化的可得然胶产生菌种子液；
(3)以步骤(1)制备的鲁氏不动杆菌种子液和步骤(2)制备的可得然胶产生菌种子液接种发酵培养基，接种体积为5％～10％V/V，两种菌的接种体积比为1:3～1:6；接种后于28～32℃，200～260rpm振荡培养3～5d，得到含有可得然胶的发酵液；
(4)将上述发酵液离心，所得沉淀先加水离心洗涤，然后无水乙醇离心洗涤，所得沉淀干燥，得到可得然胶。
所述步骤(1)中鲁氏不动杆菌为鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)CGMCC1.3778。
所述步骤(2)中可得然胶产生菌为土壤杆菌ATCC 31749(Agrobacterium sp.)或根瘤菌ATCC 31750(Rhizobium radiobacter)。
所述步骤(1)和步骤(2)中的种子培养基组成为：每升培养基中含有蛋白胨10g，酵母提取物2g和MgSO4·7H2O 1g。
所述步骤(3)中的发酵培养基组成为：每升培养基中含有50g葡萄糖，1.5g(NH4)2HPO4、1g酵母膏、1g KH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、0.05g FeSO4·7H2O、0.02g MnSO4·H2O、0.01g CoCl2·6H2O、0.01g ZnCl2和3g CaCO3。
所述步骤(3)中的两种菌的接种体积比为1:4。
所述步骤(4)中水离心洗涤的次数为2次，洗涤时加水至发酵液体积。
所述步骤(4)中无水乙醇洗涤的次数为2次，洗涤时加入的体积为沉淀体积的5倍。
有益效果
本发明利用鲁氏不动杆菌和可得然胶产生菌共培养技术，提高了可得然胶产生菌的产胶量，在最优选的实施方案中，根瘤菌ATCC 31750可得然胶产量提高24％，为微生物发酵生产可得然胶提供了新方法。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)选取鲁氏不动杆菌CGMCC 1.3778，购自中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)。从鲁氏不动杆菌斜面取一环菌接种到装有50ml种子培养基的250ml三角瓶中，于28℃、200rpm振荡培养20h，用作种子液；其中，培养基组成(g/L)为：蛋白胨10g，酵母提取物2g和MgSO4·7H2O 1g；
(2)选取可得然胶产生菌根瘤菌ATCC 31750，购自美国ATCC菌种保藏中心。从根瘤菌斜面上取一环菌种接种到装有50ml种子培养基的250ml三角瓶中，于28℃振荡培养20h，转速为150rpm，得到可得然胶产生菌种子液；其中，培养基组成与步骤(1)相同；
(3)把步骤(1)制备的鲁氏不动杆菌种子液和步骤(2)制备的可得然胶产生菌的种子液以1:3比例混合接种发酵培养基，接种体积为5％(V/V)。接种后于28℃、200rpm振荡培养3d。同时，分别以单独接种了鲁氏不动杆菌和根瘤菌的体系为对照；其中，发酵培养基组成(g/L)为：50g葡萄糖，1.5g(NH4)2HPO4，1g酵母膏，1g KH2PO4，0.5g MgSO4·7H2O，0.05gFeSO4·7H2O，0.02g MnSO4·H2O，0.01g CoCl2·6H2O，0.01g ZnCl2和3g CaCO3；
(4)发酵液于5000rpm离心5min，所得沉淀加水补充至原发酵液体积，离心洗涤2次，然后加入5倍体积无水乙醇，离心得到沉淀，用乙醇重复洗涤2次，所得沉淀于50℃干燥，计算可得然胶得率。
结果表明，单独培养的根瘤菌ATCC 31750产胶量为19.5g/L，单独培养的鲁氏不动杆菌不产胶，两种菌共同培养时可得然胶的产量为22.5g/L，产量提高了15.3％。
实施例2
(1)选取鲁氏不动杆菌CGMCC 1.3778，购自中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)。从鲁氏不动杆菌斜面取一环菌接种到装有50ml种子培养基的250ml三角瓶中，于32℃、150rpm振荡培养22h，用作种子液；其中，培养基组成与实施例1相同；
(2)选取可得然胶产生菌土壤杆菌ATCC 31749，购自美国ATCC菌种保藏中心。从土壤杆菌斜面上取一环菌种接种到装有50ml种子培养基的250ml三角瓶中，于32℃振荡培养16h，转速为240rpm，得到可得然胶产生菌种子液；其中，培养基组成与步骤(1)相同；
(3)把步骤(1)制备的鲁氏不动杆菌种子液和步骤(2)制备的可得然胶产生菌的种子液以1:4比例混合接种，接种体积为8％(V/V)。接种后于30℃、220rpm振荡培养4d。同时，分别以单独接种了鲁氏不动杆菌和土壤杆菌的体系为对照；其中，发酵培养基组成与实施例1相同；
(4)发酵液于5000rpm离心5min，所得沉淀加水补充至原发酵液体积，离心洗涤2次，然后加入5倍体积无水乙醇，离心得到沉淀，用乙醇重复洗涤2次，所得沉淀于50℃干燥，计算可得然胶得率。
结果表明，单独培养的土壤杆菌ATCC 31749产胶量为26.1g/L，单独培养的鲁氏不动杆菌不产胶，两种菌共同培养时可得然胶的产量为30.8％，产量提高了18％。
实施例3
(1)选取鲁氏不动杆菌CGMCC 1.3778，购自中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)。从鲁氏不动杆菌斜面取一环菌接种到装有50ml种子培养基的250ml三角瓶中，于30℃、240rpm振荡培养24h，用作种子液；其中，培养基组成与实施例1相同；
(2)选取可得然胶产生菌根瘤菌ATCC 31750，购自美国ATCC菌种保藏中心。从根瘤菌斜面上取一环菌种接种到装有50ml种子培养基的250ml三角瓶中，于30℃振荡培养20h，转速为200rpm，得到可得然胶产生菌种子液；其中，培养基组成与步骤(1)相同；
(3)把步骤(1)制备的鲁氏不动杆菌种子液和步骤(2)制备的可得然胶产生菌的种子液以1:4比例混合接种，接种体积为10％(V/V)。接种后于30℃、220rpm振荡培养5d。同时，分别以单独接种了鲁氏不动杆菌和根瘤菌的体系为对照；其中，发酵培养基组成与实施例1相同；
(4)发酵液于5000rpmrpm离心5min，所得沉淀加水补充至原发酵液体积，离心洗涤2次，然后加入5倍体积无水乙醇，离心得到沉淀，用乙醇重复洗涤2次，所得沉淀于50℃干燥，计算可得然胶得率。
结果表明，单独培养的根瘤菌ATCC 31750产胶量为27.8g/L，单独培养的鲁氏不动杆菌不产胶，两种菌共同培养时可得然胶的产量为34.5g/L，产量提高了24.1％。
实施例4
(1)选取鲁氏不动杆菌CGMCC 1.3778，购自中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)。从鲁氏不动杆菌斜面取一环菌接种到装有50ml种子培养基的250ml三角瓶中，于32℃、200rpm振荡培养24h，用作种子液；其中，培养基组成与实施例1相同；
(2)选取可得然胶产生菌土壤杆菌ATCC 31749，购自美国ATCC菌种保藏中心。从土壤杆菌斜面上取一环菌种接种到装有50ml种子培养基的250ml三角瓶中，于28℃振荡培养24h，转速为180rpm，得到可得然胶产生菌种子液；其中，培养基组成与步骤(1)相同；
(3)把步骤(1)制备的鲁氏不动杆菌种子液和步骤(2)制备的可得然胶产生菌的种子液以1:5比例混合接种，接种体积为5％(V/V)。接种后于32℃、240rpm振荡培养4d。同时，分别以单独接种了鲁氏不动杆菌和土壤杆菌的体系为对照；其中，发酵培养基组成与实施例1相同；
(4)发酵液于5000rpm离心5min，所得沉淀加水补充至原发酵液体积，离心洗涤2次，然后加入5倍体积无水乙醇，离心得到沉淀，用乙醇重复洗涤2次，所得沉淀于50℃干燥，计算可得然胶得率。
结果表明，单独培养的土壤杆菌ATCC 31749产胶量为24.9g/L，单独培养的鲁氏不动杆菌不产胶，两种菌共同培养时可得然胶的产量为29.2％，产量提高了17.2％。
实施例5
(1)选取鲁氏不动杆菌CGMCC 1.3778，购自中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)。从鲁氏不动杆菌斜面取一环菌接种到装有50ml种子培养基的250ml三角瓶中，于28℃、180rpm振荡培养22h，用作种子液；其中，培养基组成与实施例1相同；
(2)选取可得然胶产生菌根瘤菌ATCC 31750，购自美国ATCC菌种保藏中心。从根瘤菌斜面上取一环菌种接种到装有50ml种子培养基的250ml三角瓶中，于30℃振荡培养18h，转速为220rpm，得到可得然胶产生菌种子液；其中，培养基组成与步骤(1)相同；
(3)把步骤(1)制备的鲁氏不动杆菌种子液和步骤(2)制备的可得然胶产生菌的种子液以1:6比例混合接种，接种体积为10％(V/V)。接种后于29℃、260rpm振荡培养5d。同时，分别以单独接种了鲁氏不动杆菌和根瘤菌的体系为对照；其中，发酵培养基组成与实施例1相同；
(4)发酵液于5000rpmrpm离心5min，所得沉淀加水补充至原发酵液体积，离心洗涤2次，然后加入5倍体积无水乙醇，离心得到沉淀，用乙醇重复洗涤2次，所得沉淀于50℃干燥，计算可得然胶得率。
结果表明，单独培养的根瘤菌ATCC 31750产胶量为26.5g/L，单独培养的鲁氏不动杆菌不产胶，两种菌共同培养时可得然胶的产量为31.9g/L，产量提高了20.4％。

Claims (6)

1.一种利用不动杆菌提高细菌可得然胶产量的方法，包括：
(1)从鲁氏不动杆菌CGMCC 1.3778斜面取一环菌接种到种子培养基中，于28～32℃、150～240rpm振荡培养20～24h，得到活化的鲁氏不动杆菌CGMCC 1.3778种子液；
(2)从土壤杆菌ATCC 31749或根瘤菌ATCC 31750斜面上取一环菌接种于种子培养基中，于28～32℃、150～240rpm振荡培养16～24h，得到活化的土壤杆菌ATCC 31749或根瘤菌ATCC 31750种子液；
(3)以步骤(1)制备的鲁氏不动杆菌CGMCC 1.3778种子液和步骤(2)制备的土壤杆菌ATCC 31749或根瘤菌ATCC 31750种子液接种发酵培养基，接种体积为5％～10％V/V，两种菌的接种体积比为1:3～1:6；接种后于28～32℃，200～260rpm振荡培养3～5d，得到含有可得然胶的发酵液；
(4)将上述发酵液离心，所得沉淀先加水离心洗涤，然后无水乙醇离心洗涤，所得沉淀干燥，得到可得然胶。
2.根据权利要求1所述的一种利用不动杆菌提高细菌可得然胶产量的方法，其特征在于，所述步骤(1)和步骤(2)中的种子培养基组成为：每升培养基中含有蛋白胨10g，酵母提取物2g和MgSO4·7H2O 1g。
3.根据权利要求1所述的一种利用不动杆菌提高细菌可得然胶产量的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的发酵培养基组成为：每升培养基中含有50g葡萄糖，1.5g(NH4)2HPO4、1g酵母膏、1g KH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、0.05g FeSO4·7H2O、0.02g MnSO4·H2O、0.01gCoCl2·6H2O、0.01g ZnCl2和3g CaCO3。
4.根据权利要求1所述的一种利用不动杆菌提高细菌可得然胶产量的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的两种菌的接种体积比为1:4。
5.根据权利要求1所述的一种利用不动杆菌提高细菌可得然胶产量的方法，其特征在于，所述步骤(4)中水离心洗涤的次数为2次，洗涤时加水至发酵液体积。
6.根据权利要求1所述的一种利用不动杆菌提高细菌可得然胶产量的方法，其特征在于，所述步骤(4)中无水乙醇离心洗涤的次数为2次，洗涤时加入的体积为沉淀体积的5倍。
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