RU2057806C1 - Штамм бактерий bacillus coagulans - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-gatnnnnatc-3' - Google Patents
Штамм бактерий bacillus coagulans - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-gatnnnnatc-3' Download PDFInfo
- Publication number
- RU2057806C1 RU2057806C1 RU94017996A RU94017996A RU2057806C1 RU 2057806 C1 RU2057806 C1 RU 2057806C1 RU 94017996 A RU94017996 A RU 94017996A RU 94017996 A RU94017996 A RU 94017996A RU 2057806 C1 RU2057806 C1 RU 2057806C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- producer
- bacillus coagulans
- nucleotide sequence
- enzyme
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Использование: микробиология и биотехнология для получения термостабильной рестриктазы, узнающей и расщепляющей нуклеотидную последовательность 5′-GATNNNNATC- 3′, с высоким выходом и активностью фермента. Сущность изобретения: предложен новый штамм Bacillus coagulans (ВКПМ В-6670) - продуцент рестриктазы Bco631 I, выделенный из термальных источников в результате поиска продуцентов рестриктаз. Положительный эффект: выход фермента составляет 6000 ед/г сырой биомассы, удельная активность целевого фермента составляет 10000 ед/мл. Рестриктаза Bco631 I является изошизомером рестриктазы BsaB I и может заменить последнюю во всех генно-инженерных работах. 1 ил.
Description
Изобретение относится к микробиологической промышленности и генной инженерии и касается получения нового штамма, продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'-GAТNNNNAТС-3'.
Рестриктаза такой специфичности может быть использована для исследования первичной структуры ДНК, физического картирования различных геномов. Данная эндонуклеаза является удобной моделью для изучения специфичности белок-нуклеиновых взаимодействий.
Известен штамм Bacillus species М, продуцирующий рестриктазы BspM I и BspM II (сайты узнавания 5'-ACCТGC-3' и 5'ТССGGA-3', соответственно) [1]
Недостатком данного штамма является то, что в одной биомассе находятся 2 рестриктазы. Это затрудняет процедуру очистки, причем ни одна из рестриктаз не способна узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'GAТNNNNАТС-3'. Культуральные и биотехнологические свойства штамма не опубликованы.
Недостатком данного штамма является то, что в одной биомассе находятся 2 рестриктазы. Это затрудняет процедуру очистки, причем ни одна из рестриктаз не способна узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'GAТNNNNАТС-3'. Культуральные и биотехнологические свойства штамма не опубликованы.
Известен штамм Microbacterium ammoniaphilus, продуцирующий рестриктазу Mam I (сайт узнавания 5'GAТNNNNAТС-3') [2]
Недостатком данного штамма является термолабильность эндонуклеазы рестрикции. Данные по биотехнологическим показателям штамма не опубликованы.
Недостатком данного штамма является термолабильность эндонуклеазы рестрикции. Данные по биотехнологическим показателям штамма не опубликованы.
Наиболее близким к заявленному штамму прототипом, является штамм Bacillus stearothermophilus, продуцирующий рестриктазу BsaB I [3] узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5'GAТNNNNAТС-3'. Для культивирования этого штамма требуется традиционная богатая среда, культивирование ведется при 55оС. Продуцируемая им рестриктаза является термостабильной.
Недостатками данного штамма является то, что выход рестриктазы не превышает 1000 ед/г cырой биомассы.
Технической задачей изобретения является получение штамма, продуцирующего термостабильную рестриктазу, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность 5'-GAТNNNNAТС-3', с высоким выходом фермента.
Цель достигается выявлением и использованием штамма Bacillus coagulans 631 продуцента сайт-специфической рестриктазы Bcо631 I.
Предлагаемый штамм выделен из термальных источников в результате поиска продуцентов рестриктаз.
Полученный штамм Bacillus coagulans 631 депонирован в ВКПМ ВНИИ генетика под регистрационным номером В-6670, а продуцируемая им рестриктаза названа Bco631 I согласно общепринятой номенклатуре.
Штамм Bacillus cоаgulans характеризуется следующими признаками:
Морфологические признаки. Клетки палочковидные, прямые, 0,5-0,8 х 2-12 мкл, подвижные. Образуют эндоспоры овальной формы, расположенные преимущественно центрально и терминально, превышают размеры вегетативной клетки. Окраска по Граму грамположительны.
Морфологические признаки. Клетки палочковидные, прямые, 0,5-0,8 х 2-12 мкл, подвижные. Образуют эндоспоры овальной формы, расположенные преимущественно центрально и терминально, превышают размеры вегетативной клетки. Окраска по Граму грамположительны.
Культуральные признаки. Штамм нетребователен к факторам роста, хорошо растет на обычных питательных средах (СПА, MПА, MПБ). На агаризованных средах образует круглые, непигментированные колонии, блестящие, с ровным краем.
Оптимальная температура роста 60оС, рН 7,0-7,2.
Культуру поддерживают пересевом на плотных средах, хранят в растворе глицерина при -70оС или в лиофильно-высушенном состоянии.
Физиологические признаки. Не восстанавливает нитраты, отрицателен в реакции с метиловым красным и Фогес-Проскауэра; не гидролизует крахмал, казеин, желатин; каталазоположителен; растет при концентрации NaCl до 5% cлабо растет на 0,002% азиде натрия и на среде Сабуро, не наблюдали роста в анаэробном агаре, если не добавлять в среду триптон; индолотрицателен.
Для культивирования Bacillus cоagulans B-6670 применяют среду следующего состава (г/л): пептон 10, дрожжевой экстракт 5, глюкоза 5, вода дистиллированная остальное. Культивирование проводят при 60оС и интенсивной аэрации до достижения фазы замедления роста.
Выход целевого фермента 6 000 ед/г cырой биомассы с удельной активностью 10000 ед/мл.
Определяющим отличием предлагаемого штамма от штамма-прототипа является его высокая продуктивность.
Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и для выделения рестриктазы, имеющей сайт узнавания 5'-GAТNNNNAТС-3', никогда не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень".
На чертеже представлена электрофореграмма продуктов гидролиза ДНК фага лямбда ферментом Bcо631 I (дор.1), Bcо631 I и BsaB I (New England Biolabs) (дор.2), BsaB I (дор.3), фаг лямбда (дор.4).
Как видно идентичность полос расщепления при параллельном и совместном гидролизе подтверждает их изошизомерию.
П р и м е р 1. Получение биомассы и выделение фермента.
Перед началом работы клетки штамма-продуцента пересевают бактериологической петлей на агаризованную среду. Чашки Петри помещают в термостат на 60оС. После 10-часовой инкубации подросшие клетки пересевают в колбы со свежей питательной средой, состоящей из (г/л): пептон 10; дрожжевой экстракт (Difco) 5; глюкоза 5; вода дистиллированная остальное. Культивирование проводят при 60оС с аэрацией 1,5 объема/мин, при перемешивании _ 150 об/мин, до фазы замедления роста. Клетки собирают центрифугированием при 1500 g и температуре 4оС. Дезынтеграцию, выделение и очистку проводили по методике Bickle, Pirotta, Imber [4]
П р и м е р 2. Определение специфичности и активности фермента.
П р и м е р 2. Определение специфичности и активности фермента.
Специфичность фермента определяют по картине параллельного и совместного гидролиза субстратной ДНК (см.чертеж). Идентичность картин гидролиза на 1-3 дорожках говорит о том, что эти ферменты узнают и расщепляют одинаковую последовательность нуклеотидов 5'-GAТNNNNAТС-3'.
Выход фермента Bco631 I определяют по электрофоретической картине гидролиза ДНК фага лямбда. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч при 60оС. Выход фермента составляет 6.000 ед/г cырой биомассы, удельная активность 10.000 ед/мл.
Фермент хранится при -20оС в глицерине.
Таким образом, получен штамм, обладающий следующим преимуществом по сравнению с известным:
высокая продуктивность штамма.
высокая продуктивность штамма.
Поскольку рестриктаза Bco631 I имеет сайт узнавания 5'-GAТNNNNАТС-3', идентичный сайту узнавания рестриктазы BsaB 1, она может заменить прототип во всех генно-инженерных работах.
Claims (1)
- Штамм бактерий Bacillus coagulans ВКПМ В-6670 продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5′-GATNNNNATC-3′.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU94017996A RU2057806C1 (ru) | 1994-05-17 | 1994-05-17 | Штамм бактерий bacillus coagulans - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-gatnnnnatc-3' |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU94017996A RU2057806C1 (ru) | 1994-05-17 | 1994-05-17 | Штамм бактерий bacillus coagulans - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-gatnnnnatc-3' |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2057806C1 true RU2057806C1 (ru) | 1996-04-10 |
RU94017996A RU94017996A (ru) | 1996-08-20 |
Family
ID=20155997
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU94017996A RU2057806C1 (ru) | 1994-05-17 | 1994-05-17 | Штамм бактерий bacillus coagulans - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-gatnnnnatc-3' |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2057806C1 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2475533C1 (ru) * | 2011-12-12 | 2013-02-20 | Общество с ограниченной ответственностью "СибЭнзайм" | ШТАММ БАКТЕРИЙ Microbacterium testaceum 17B - ПРОДУЦЕНТ САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ MteI |
RU2617965C2 (ru) * | 2013-12-24 | 2017-04-28 | Мухаммед Маджид | Способ получения препарата внеклеточного метаболита bacillus coagulans и его биологические применения |
-
1994
- 1994-05-17 RU RU94017996A patent/RU2057806C1/ru active
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
1. Catalog New England Biolabs, USA, 1988/1989. * |
2. Kessler C.Manta V.Gene - 1990 v. 92, p.1-248. * |
3. Catalog New England Biolabs, USA, 1992. * |
4. Bickle T.A., Pirotta V., Jmber R. Nucl. Acids Res. 1977. v.4, p.2561-2572. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2475533C1 (ru) * | 2011-12-12 | 2013-02-20 | Общество с ограниченной ответственностью "СибЭнзайм" | ШТАММ БАКТЕРИЙ Microbacterium testaceum 17B - ПРОДУЦЕНТ САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ MteI |
RU2617965C2 (ru) * | 2013-12-24 | 2017-04-28 | Мухаммед Маджид | Способ получения препарата внеклеточного метаболита bacillus coagulans и его биологические применения |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU94017996A (ru) | 1996-08-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU94035744A (ru) | Днк, микроорганизм, способ получения z-треонина | |
RU2057806C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus coagulans - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-gatnnnnatc-3' | |
RU2046142C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus pumilus - продуцент эндонуклеазы рестрикции ври 19 1 | |
RU2040540C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus coagulans - продуцент сайт - специфическойй эндокуклазы, способной узнать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'- ct (a/g) (t/c)ag - 3' | |
RU2037522C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus species - продуцент эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5`-(a/g) ccgg (t/c)-3` | |
RU2073717C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus schlegelii - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5' - ccnnnnnnn gg-3' | |
RU2054040C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus coagulans - продуцент сайт - специфической эндонуклазы, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5′-ctcttc-3′ | |
RU2053299C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus badius - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-(a/t)ccgg(a/t)-3' | |
RU2021373C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus pumilus, продуцирующий эндонуклеазу рестрикции, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5` = cctnagc-3` | |
RU2038380C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus stearothermophilus - продуцент эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5`- cc (a / t) gg - 3` | |
RU2110573C1 (ru) | Штамм бактерий photobacterium phosphoreum - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5 - gg (t/c)(ag)cc-3' | |
RU2115728C1 (ru) | Штамм бактерии bacillus stearothermophilus - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-ggtnacc-3' | |
RU2034922C1 (ru) | Штамм бактерий acinetobacter calcoaceticus - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5`-ggtacc-3` | |
RU2105811C1 (ru) | Штамм бактерии deleya aquamarina - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-gtgcac-3' | |
RU1806191C (ru) | Штамм бактерий MIcRococcUS SpecIeS - продуцент рестриктазы MSp 20 I | |
RU2135581C1 (ru) | Штамм бактерий streptomyces sp. st-12 - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'- ctgcag -3' | |
SU1645300A1 (ru) | Штамм SтRертомYсеS FRaDIae - продуцент рестриктазы SFR I | |
SU1659480A1 (ru) | Штамм бактерий КLевSIеLLа рNеUмоNIае-продуцент рестриктазы Кр @ 378 1 | |
RU2266323C2 (ru) | Штамм бактерий sphingobacterium mizutae-32 - продуцент эндонуклеазы рестрикции spmi, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-ат'cgat-3' | |
RU2018533C1 (ru) | Штамм бактерий micrococcus varians, продуцирующий эндонуклеазу рестрикции, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5′-ttcgaa-3' | |
RU2007453C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus sphaericus-продуцент рестриктазы bsh 45 i | |
SU1694647A1 (ru) | Штамм бактерий BacILLUS вRеVIS - продуцент рестриктазы В @ 12 I | |
SU1532583A1 (ru) | Штамм бактерий PaRacoccUS DеNIтRIFIсаNS-продуцент эндонуклеазы рестрикции Р @ 121 | |
RU1784642C (ru) | Штамм бактерий BacILLUS SрнаеRIсUS-продуцент рестриктазы BSI 1 | |
DK157562B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af mindst to deoxyribonukleaser |