RU2046142C1 - Штамм бактерий bacillus pumilus - продуцент эндонуклеазы рестрикции ври 19 1 - Google Patents
Штамм бактерий bacillus pumilus - продуцент эндонуклеазы рестрикции ври 19 1 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2046142C1 RU2046142C1 RU93041225A RU93041225A RU2046142C1 RU 2046142 C1 RU2046142 C1 RU 2046142C1 RU 93041225 A RU93041225 A RU 93041225A RU 93041225 A RU93041225 A RU 93041225A RU 2046142 C1 RU2046142 C1 RU 2046142C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- enzyme
- bpu
- restrictase
- producer
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Использование: микробиология и биотехнология, для получения эндуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей нуклеотидную последовательность 5′-CCATGG-3′ с высоким выходом и активностью фермента. Сущность изобретения: предложен новый штамм Bacillus pumilus (ВКПМ В-6308) продуцент рестриктазы Ври19 1, выделенный из почвы в результате поиска продуцентов рестриктаз. Положительный эффект: выход фермента составляет 5000 ед/г сырой биомассы, удельная активность целевого фермента составляет 20000 ед/мл. Рестриктаза Ври19 1 является изошизомером рестриктазы NspSA III и может заменить последнюю во всех генно-инженерных работах. 1 ил.
Description
Изобретение относится к микробиологической промышленности и генной инженерии и касается получения нового штамма, продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'-ССАТGG-3'.
Рестриктаза такой специфичности может быть использована для исследования первичной структуры ДНК, физического картирования различных геномов. Данная эндонуклеаза является удобной моделью для изучения специфичности белок-нуклеиновых взаимодействий.
Известен штамм Bacillus species M, продуцирующий рестриктазы BspM 1 и BspM II (сайты узнавания 5'-АССTGC-3' и 5'-ТССGGa-3', соответственно) [1]
Недостатком данного штамма является то, что в одной биомассе находятся две рестриктазы. Это затрудняет процедуру очистки, причем ни одна из рестриктаз не способна узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'-ССАTGG-3'. Культуральные и биотехнологические свойства штамма не опубликованы.
Недостатком данного штамма является то, что в одной биомассе находятся две рестриктазы. Это затрудняет процедуру очистки, причем ни одна из рестриктаз не способна узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'-ССАTGG-3'. Культуральные и биотехнологические свойства штамма не опубликованы.
Известен штамм Bacillus pumilus, продуцирующий рестриктазу Bpul [2] узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5'-G(A/G)GC(T/C)C-3'. Данные по биотехнологическим показателям штамма не опубликованы. Однако и этот штамм не способен продуцировать рестриктазу, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5'-ССАТGG-3'.
Наиболее близким к заявленному штамму прототипом является штамм Nostoc species SA, продуцирующий рестриктазу NspSA III [3] узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5'-ССАТGG-3'. Этот штамм относится к цианобактериям, имеет клеточную стенку, состоящую из муреина, способен к фотосинтезу. Биомассу можно разрушать лизоцимом.
Недостатком данного штамма является то, что выход продуцируемой им рестриктазы NspSA III не превышает 500 ед/г сырой биомассы. Для очистки фермента требуются специальные методы, так как данном штамме содержатся четыре различные по специфичности рестриктазы. Штаммы данного вида требуют специальных условий культивирования и режимов подсветки.
Технической задачей изобретения является получение штамма, продуцирующего единственную рестриктазу, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность 5'-ССАЕGG-3' с высоким выходом и активностью фермента.
Цель достигается выявлением и использованием штамма Bacilllus pumilus продуцента сайт-специфической рестриктазы Вpu19 I.
Предлагаемый штамм выделен из почвы в результате поиска продуцентов рестриктаз.
Полученный штамм Bacillus pumilus депонирован в ВКПМ ВНИИ генетика под регистрационным номером В-6308, а продуцируемая им рестриктаза названа Bpu19 I согласно общепринятой номенклатуре.
Штамм Bacillus pumilus характеризуется следующими признаками:
Морфологические признаки.
Морфологические признаки.
Клетки палочковидные, округлые, мелкие, 0,5-0,7х3,5 мкм, подвижные. Образуют эндоспоры овальной формы, расположенные в основном центрально, не превышающие размеров вегетативной клетки. Окраска по Граму грамположительны.
Культуральные признаки.
Штамм нетребователен к факторам роста, хорошо растет на обычных питательных средах (CПА, МПА, МПБ). На агаризованных средах образует круглые, непигментированные колонии, блестящие, с ровным краем.
Оптимальная температура роста 37оС, рН 7,0-7,2.
Культуру поддерживают пересевом на плотных средах, хранят в растворе глицерина при 70оС или в лиофильно-высушенном состоянии.
Физиологические признаки.
Не восстанавливает нитраты, отрицателен в реакции с метиловым красным и Фогес-Проскауэра; не гидролизует крахмал, гидролизует казеин; каталазоположителен; растет при концентрации NaCl до 7% слабо растет на 0,002% азиде натрия и на среде Сабуро, не наблюдали роста в анаэробном агаре.
Для культивирования Ваcillus pumilus B-6308 применяют среду следующего состава, г/л: пептон 10; дрожжевой экстракт 5; глюкоза 5; вода дистиллированная остальное. Культивирование проводят при 37оС и интенсивной аэрации до достижения фазы замедления роста.
Выход целевого фермента 5000 ед/г сырой биомассы с удельной активностью 20000 ед/мл.
Определяющими отличиями предлагаемого штамма от штамма-прототипа являются следующие:
наличие единственной рестриктазы;
высокая продуктивность штамма;
высокая активность фермента.
наличие единственной рестриктазы;
высокая продуктивность штамма;
высокая активность фермента.
Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и для выделения рестриктазы, имеющей сайт узнавания 5'-ССАТGG-3', никогда не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения "Новизна" и "Изобретательский уровень".
На чертеже представлена электрофореграмма продуктов гидролиза ДНК фага лямбда ферментом Bsu19 I (дор. 1), Bsu19 I и Nco I (сайт узнавания 5'-ССАТGG-3', Boehringer Mannheim) (дор. 2), Nco I (дор. 3).
Как видно из представленного чертежа, идентичность полос расщепления при параллельном и совместном гидролизе подтверждает их изошизомерию.
П р и м е р 1. Получение биомассы и выделение фермента.
Перед началом работы клетки штамма-продуцента пересевают бактериологической петлей на агаризованную среду. Чашки Петри помещают в термостат на 37оС. После 10-часовой инкубации подросшие клетки пересевают в колбы со свежей питательной средой, состоящей из г/л: пептон 10; дрожжевой экстракт (Difco) 5; глюкоза 5; вода дистиллированная остальное. Культивирование проводят при 37оС с аэрацией 1,5 объема/мин, при перемешивании 150 об/мин, до фазы замедления роста. Клетки собирают центрифугированием при 1500 g и температуре 4оС. Дезинтеграцию, выделение и очистку проводили по методике Bickle, Pirotta, Imber [4]
П р и м е р 2. Определение специфичности и активности фермента.
П р и м е р 2. Определение специфичности и активности фермента.
Специфичность фермента определяют по картине параллельного и совместного гидролиза субстратной ДНК (чертеж). Идентичность картин гидролиза на 1-3 дорожках говорит о том, что эти ферменты узнают и расщепляют одинаковую последовательность нуклеотидов 5'-CCATGG-3'.
Выход фермента Bpu19 I определяют по электрофоретической картине гидролиза ДНК фага лямбда. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч при температуре 37оС. Выход фермента составляет 5000 ед/г сырой биомассы, удельная активность 20000 ед/мл.
Фермент хранится при -20оС в глицерине.
Таким образом, получен штамм, обладающий следующими преимуществами по сравнению с известным:
наличие единственной рестриктазы:
высокая продуктивность штамма;
высокая активность фермента.
наличие единственной рестриктазы:
высокая продуктивность штамма;
высокая активность фермента.
Поскольку рестриктаза Bpu19 I имеет сайт узнавания 5'-ССАТGG-3', идентичный сайту узнавания рестриктазы NspSA III, она может заменить прототип во всех генно-инженерных работах.
Claims (1)
- Штамм бактерий Bacillus pumilus ВКПМ В-6308 продуцент эндонуклеазы рестрикции Bpu 19 1.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU93041225A RU2046142C1 (ru) | 1993-08-16 | 1993-08-16 | Штамм бактерий bacillus pumilus - продуцент эндонуклеазы рестрикции ври 19 1 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU93041225A RU2046142C1 (ru) | 1993-08-16 | 1993-08-16 | Штамм бактерий bacillus pumilus - продуцент эндонуклеазы рестрикции ври 19 1 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2046142C1 true RU2046142C1 (ru) | 1995-10-20 |
RU93041225A RU93041225A (ru) | 1996-02-20 |
Family
ID=20146567
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU93041225A RU2046142C1 (ru) | 1993-08-16 | 1993-08-16 | Штамм бактерий bacillus pumilus - продуцент эндонуклеазы рестрикции ври 19 1 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2046142C1 (ru) |
-
1993
- 1993-08-16 RU RU93041225A patent/RU2046142C1/ru active
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
1. Kessler C., Manta V. Gene. 1990, V.92, p.1-248. * |
2. Catalog New England Biolabs, USA, 1988/1989. * |
3. Dean P.D.C., Walker. J. N. B. Biochem Soc. Trans., 1985, v.13, p.1055 - 1058. * |
4. Bickle T.A., Pirotta v., Jmber. R. Nucl. Acids Res., 1977, v.4 p. 2561 - 2572. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2288263C2 (ru) | Штамм bacillus coagulans sim-7 dsm 14043 для получения l(+)-лактата и способ получения l(+)-лактата | |
RU2057806C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus coagulans - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-gatnnnnatc-3' | |
RU2046142C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus pumilus - продуцент эндонуклеазы рестрикции ври 19 1 | |
RU2500811C1 (ru) | Рекомбинантный штамм бактерий bacillus subtilis - продуцент фосфолипазы с | |
RU2073717C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus schlegelii - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5' - ccnnnnnnn gg-3' | |
RU2037522C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus species - продуцент эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5`-(a/g) ccgg (t/c)-3` | |
RU2040540C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus coagulans - продуцент сайт - специфическойй эндокуклазы, способной узнать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'- ct (a/g) (t/c)ag - 3' | |
RU2054040C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus coagulans - продуцент сайт - специфической эндонуклазы, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5′-ctcttc-3′ | |
RU2021373C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus pumilus, продуцирующий эндонуклеазу рестрикции, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5` = cctnagc-3` | |
RU2053299C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus badius - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-(a/t)ccgg(a/t)-3' | |
RU2110573C1 (ru) | Штамм бактерий photobacterium phosphoreum - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5 - gg (t/c)(ag)cc-3' | |
RU2115728C1 (ru) | Штамм бактерии bacillus stearothermophilus - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-ggtnacc-3' | |
RU2034922C1 (ru) | Штамм бактерий acinetobacter calcoaceticus - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5`-ggtacc-3` | |
RU2105811C1 (ru) | Штамм бактерии deleya aquamarina - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-gtgcac-3' | |
RU2038380C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus stearothermophilus - продуцент эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5`- cc (a / t) gg - 3` | |
RU2266323C2 (ru) | Штамм бактерий sphingobacterium mizutae-32 - продуцент эндонуклеазы рестрикции spmi, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-ат'cgat-3' | |
RU2308485C1 (ru) | Штамм бактерий serratia species - продуцент липазы | |
RU1806191C (ru) | Штамм бактерий MIcRococcUS SpecIeS - продуцент рестриктазы MSp 20 I | |
Rasheva et al. | Taxonomic investigation of Monascus purpureus 94-25 strain | |
RU2018533C1 (ru) | Штамм бактерий micrococcus varians, продуцирующий эндонуклеазу рестрикции, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5′-ttcgaa-3' | |
RU2135581C1 (ru) | Штамм бактерий streptomyces sp. st-12 - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'- ctgcag -3' | |
SU1694647A1 (ru) | Штамм бактерий BacILLUS вRеVIS - продуцент рестриктазы В @ 12 I | |
SU1659480A1 (ru) | Штамм бактерий КLевSIеLLа рNеUмоNIае-продуцент рестриктазы Кр @ 378 1 | |
SU1645300A1 (ru) | Штамм SтRертомYсеS FRaDIae - продуцент рестриктазы SFR I | |
RU2007453C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus sphaericus-продуцент рестриктазы bsh 45 i |