RU2110573C1 - Штамм бактерий photobacterium phosphoreum - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5 - gg (t/c)(ag)cc-3' - Google Patents
Штамм бактерий photobacterium phosphoreum - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5 - gg (t/c)(ag)cc-3' Download PDFInfo
- Publication number
- RU2110573C1 RU2110573C1 RU94028933A RU94028933A RU2110573C1 RU 2110573 C1 RU2110573 C1 RU 2110573C1 RU 94028933 A RU94028933 A RU 94028933A RU 94028933 A RU94028933 A RU 94028933A RU 2110573 C1 RU2110573 C1 RU 2110573C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- producer
- enzyme
- nucleotide sequence
- restrictase
- Prior art date
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Использование: микробиология и биотехнология. Сущность изобретения: предложен новый штамм Photobacterium phosphoreum ВКПМ В-6687 - продуцент рестриктазы Pph14 1, выделенный из морской воды в результате поиска продуцентов рестриктаз. Положительный эффект: выход фермента составляет 10000 ед/г сырой биомассы, удельная активность целевого фермента составляет 20000 ед/мл. Рестриктаза Pph14 1 является изошизомером рестриктазы HgiH 1 и может заменить последнюю во всех генно-инженерных работах. 1 ил.
Description
Изобретение относится к микробиологической промышленности и генной инженерии и касается получения нового штамма, продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'-GG(T/C)(A/G)CC-3'.
Рестриктаза такой специфичности может быть использована для исследования первичной структуры ДНК, физического картирования различных геномов. Данная эндонуклеаза является удобной моделью для изучения специфичности белок-нуклеиновых взаимодействий.
Известен штамм Enterobacter cpecies RFL6, продуцирующий рестриктазы Ese6 I и Ese6 II (сайты узнавания 5'-CCGCGG-3' и 5'-CCWGG-3' соответственно [1]. Недостатком данного штамма является то, что в одной биомассе находятся две рестриктазы. Это затрудняет процедуру очистки, причем ни одна из рестриктаз не способна узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'-GG(T/C)(A/G)CC-3'. Культуральные и биотехнологические свойства штамма не опубликованы.
Известен штамм Bacillus aneuri nolyticus, продуцирующий рестриктазу Ban I (сайт узнавания 5'-GG(T/C)(A/G)CC-3') [2]. Штамм растет при 30oC на традиционных средах. Основным недостатком данного штамма является то, что помимо Ban I он продуцирует рестриктазу Ban II и Ban III. Это затрудняет процедуру выделения из данного штамма чистого фермента с нужной специфичностью.
Наиболее близким к заявляемому штамму - прототипу, является штамма Herpetosiphon giganteus, продуцирующий рестриктазу Hig HI, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов. 5'-GG(T/C)(A/G)CC-3' [3]. Для культивирования этого штамма требуется традиционные среды. Недостатком данного штамма является то, что выход рестриктазы не превышает 500 ед/г сырой биомассы. Кроме того, выделение затруднено наличием двух интерферирующих эндонуклеазных активностей: Hgi H II и Hgi H III.
Технической задачей изобретения является получение штамма, продуцирующего единственную рестриктазу, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность 5'-GG(T/C)(A/G)CC-3', с высоким выходом фермента.
Поставленная цель достигается выявлением и использованием штамма Photobacterium phosphoreum 14 - продуцента сайт-специфической реструктазы Pph14 I.
Предлагаемый штамм выделен из морской воды в результате поиска продуцентов рестриктаз.
Полученный штамм Photobacterium phosphoreum14 депонирован в ВКПМ ВНИИ генетика под регистрационным номером В-6667, а продуцируемая им рестриктаза названа Pph14 I согласно общепринятой номенклатуре.
Штамм Photobacterium phosphoreum характеризуется следующими признаками:
Морфологические признаки.
Морфологические признаки.
Клетки палочковидные, короткие, прямые, 0,8 - 1,3•2 - 2,4 мм, подвижные. В старой культуре при неблагоприятных условиях роста наблюдаются плеоморфные формы. Окраска по Граму - грамотрицательны.
Культурные признаки.
Штамм не требователен к факторам роста, хорошо растет на обычных питательных средах (СПА, МПА, МПВ) с добавлением NaCl до концентрации 2 - 3%. Все добавления NaCl рост отсутствует. На агаризованных средах образует круглые, непигментированные, плоские колонии, блестящие, с ровным краем.
Оптимальная температура роста 30o, pH 7,0 - 7,2.
Культуру поддерживают пересевом на плотных средах, хранят в растворе глицерина при 70oC или в лиофильно-высушенном состоянии.
Физические признаки.
Восстанавливает нитраты, положителен в реакции Фогес-Проскауэра; не гидролизует крахмал, желатин, каталазоположителен, растет при концентрации NaCl до 4% и при 4oC, на среде с пептоном образует аммиак, не наблюдали роста в анаэробном агаре, индолотрицателен; не образует сероводород.
Для культивирования Photobacterium phosphoreum B-6667 применяют среду следующего состава (г/л): рыбный гидролизат 37, NaCl до 25, вода дистиллированная остальное. Культивирование проводят при 30oC и интенсивной аэрации до достижения фазы замедления роста.
Выход целевого фермента: 10000 ед/г сырой биомассы с удельной активностью 20000 ед/мл.
Определяющим отличием предлагаемого штамма от штамма-прототипа являются: наличие единственной эндонуклеазы рестрикции; высокая продуктивность штамма в 20 раз превышающая по данному показателю штамм-прототип.
Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и для выделения рестриктазы, имеющей сайт узнавания 5'-GG(T/C)(A/G)CC-3', никогда не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень".
На чертеже представлена электрофорограмма продуктов гидролиза ДНК фаза лямбда ферментом Pphi14 I (доп. 1), Pphi14 I и Ban I (New England Biolabs, сайт узнавания 5'-GG(T/C)(A/G)CC-3') (доп. 2), Ban1 I (доп. 3), фаг лямбда (доп. 4).
Как видно из представленного чертежа, идентичность полос расщепления при параллельном и совместном гидролизе подтверждает их изошизомерию.
Пример 1. Получение биомассы и выделение фермента.
Перед началом работы клетки штамма-продуцента пересевают бактериологической петлей на агаризованную среду. Чаши Петри помещают в термостат на 30oC. После 10-часовой инкубации подросшие клетки пересевают в колбы со свежей питательной средой, состоящей из (г/л): рыбный гидролизат 37, NaCl 25, вода дистиллированная остальное. Культивирование проводят при 30oC с аэрацией 1,5 об/мин, при перемешивании 150 об/мин, до фазы замедления роста. Клетки собирают центрифугированием при 1500 г и температуре 4oC. Дезынтеграцию, выделение и очистку проводят по методике Bickle, Pirotta, Imber [4].
Пример 2. Определение специфичности и активности фермента.
Специфичность фермента определяется по картинке параллельно и совместного гидролиза субстратной ДНК (см. чертеж). Идентичность картин гидролиза на 1 - 3 дорожках говорит о том, что эти ферменты узнают и расщепляют одинаковую последовательность нуклеотидов 5'-GG(N/C)(A/G)CC-3'.
Выход фермента Pph14 I определяется по электрофоретической картинке гидролиза ДНК фага лямбда. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкл ДНК фага лямбда в течение 1 ч при температуре 37oC. Выход фермента составляет 10000 ед/г сырой биомассы, удельная активность 20000 ед/мл. Фермент хранится при -20oC в глицерине.
Таким образом, получен штамм, обладающий следующим преимуществом по сравнению с известным: наличие единственной эндонуклеазы рестрикции; высокая продуктивность штамма.
Поскольку рестриктаза Pphi14 I имеет сайт узнавания 5'-GG(T/C)(A/G)CC-3', идентичный сайту узнавания рестриктазы HgiH I, она может заменить прототип во всех генно-инженерных работах.
Claims (1)
- Штамм бактерий Photobacterium phosphoreum ВКПМ В-6667 - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-GG(T/C)(AG)CC-3'.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU94028933A RU2110573C1 (ru) | 1994-08-02 | 1994-08-02 | Штамм бактерий photobacterium phosphoreum - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5 - gg (t/c)(ag)cc-3' |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU94028933A RU2110573C1 (ru) | 1994-08-02 | 1994-08-02 | Штамм бактерий photobacterium phosphoreum - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5 - gg (t/c)(ag)cc-3' |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU94028933A RU94028933A (ru) | 1997-03-10 |
RU2110573C1 true RU2110573C1 (ru) | 1998-05-10 |
Family
ID=20159290
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU94028933A RU2110573C1 (ru) | 1994-08-02 | 1994-08-02 | Штамм бактерий photobacterium phosphoreum - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5 - gg (t/c)(ag)cc-3' |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2110573C1 (ru) |
-
1994
- 1994-08-02 RU RU94028933A patent/RU2110573C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
1. Roberts P.J., Macelis D. Nucl., Aci ds Res.-1992, v.20, suppl, p. 2167 - 2180. 2. Bingham A.H.A., Atkinson T., Sciaky D., Roberts R.J., Nucl. Acids Res, 1978, v.5, p. 3457 - 3467. 3. Whitehead Ph.R., Jacods D., Brown N.L. Nucl. Acids Res, 1986, v.14, p. 7031 - 7045. 4. Brickle T.A., Pirotta V., Imber R., Nucl. Acids Res. 1977, v.4, p. 2561 - 2572. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU94028933A (ru) | 1997-03-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Abdel-Fattah et al. | Biodegradation of feather waste by keratinase produced from newly isolated Bacillus licheniformis ALW1 | |
El-Refai et al. | Improvement of the newly isolated Bacillus pumilus FH9 keratinolytic activity | |
RU2288263C2 (ru) | Штамм bacillus coagulans sim-7 dsm 14043 для получения l(+)-лактата и способ получения l(+)-лактата | |
Meyer et al. | Efficient production of the industrial biocatalysts hydantoinase and N-carbamyl amino acid amidohydrolase: Novel non-metabolizable inducers | |
RU2110573C1 (ru) | Штамм бактерий photobacterium phosphoreum - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5 - gg (t/c)(ag)cc-3' | |
RU2500811C1 (ru) | Рекомбинантный штамм бактерий bacillus subtilis - продуцент фосфолипазы с | |
RU2057806C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus coagulans - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-gatnnnnatc-3' | |
RU2115728C1 (ru) | Штамм бактерии bacillus stearothermophilus - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-ggtnacc-3' | |
RU2021373C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus pumilus, продуцирующий эндонуклеазу рестрикции, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5` = cctnagc-3` | |
RU2046142C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus pumilus - продуцент эндонуклеазы рестрикции ври 19 1 | |
RU2073717C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus schlegelii - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5' - ccnnnnnnn gg-3' | |
RU2105811C1 (ru) | Штамм бактерии deleya aquamarina - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-gtgcac-3' | |
RU2037522C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus species - продуцент эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5`-(a/g) ccgg (t/c)-3` | |
RU2054040C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus coagulans - продуцент сайт - специфической эндонуклазы, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5′-ctcttc-3′ | |
RU2040540C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus coagulans - продуцент сайт - специфическойй эндокуклазы, способной узнать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'- ct (a/g) (t/c)ag - 3' | |
RU2053299C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus badius - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-(a/t)ccgg(a/t)-3' | |
KR100365838B1 (ko) | 브레비바실러스 보스테렌시스 bcs-1 에서 유래한 신규내열성 d-입체특이적 디펩티다아제 및 이를 이용한d-아미노산 함유 펩타이드의 합성 방법 | |
RU2038380C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus stearothermophilus - продуцент эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5`- cc (a / t) gg - 3` | |
SU1659480A1 (ru) | Штамм бактерий КLевSIеLLа рNеUмоNIае-продуцент рестриктазы Кр @ 378 1 | |
KR100352192B1 (ko) | 신규 고온성 미생물 브레비바실러스 보스테렌시스bcs-1 및 그로부터 생산되는 내열성 d-입체특이적아미노산 아미다아제 | |
RU1806191C (ru) | Штамм бактерий MIcRococcUS SpecIeS - продуцент рестриктазы MSp 20 I | |
RU2270859C1 (ru) | ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ Bisi | |
RU2018533C1 (ru) | Штамм бактерий micrococcus varians, продуцирующий эндонуклеазу рестрикции, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5′-ttcgaa-3' | |
RU2500812C1 (ru) | Рекомбинантный штамм бактерий bacillus licheniformis - продуцент термостабильной липазы | |
SU1694647A1 (ru) | Штамм бактерий BacILLUS вRеVIS - продуцент рестриктазы В @ 12 I |