RU2038380C1 - Штамм бактерий bacillus stearothermophilus - продуцент эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5`- cc (a / t) gg - 3` - Google Patents
Штамм бактерий bacillus stearothermophilus - продуцент эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5`- cc (a / t) gg - 3` Download PDFInfo
- Publication number
- RU2038380C1 RU2038380C1 SU5047917A RU2038380C1 RU 2038380 C1 RU2038380 C1 RU 2038380C1 SU 5047917 A SU5047917 A SU 5047917A RU 2038380 C1 RU2038380 C1 RU 2038380C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- enzyme
- producer
- nucleotide sequence
- bacillus stearothermophilus
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Использование: микробиология и биотехнология. Сущность изобретения: предложен новый штамм бактерий Bacillus stearothermophilus ВКПМ В - 5465 - продуцент эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5′-CC(A/T)GG-3′. Штамм выделен из термальных источников в результате поиска продуцентов рестриктаз. Выход фермента составляет 100000 ед./г сырой биомассы, удельная активность целевого фермента составляет 30000 ед./мл. Рестриктаза Bst 381 является изошизомером рестриктазы Bst Gii и может заменить последнюю во всех генно-инженерных работах. 1 ил.
Description
Изобретение относится к микробиологической промышленности и генной инженерии и касается получения нового штамма, продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'-CC(A/T)GG-3'.
Рестриктаза такой специфичности может быть использована для исследования первичной структуры ДНК, физического картирования различных геномов. Данная эндонуклеаза является удобной моделью для излучения специфичности белок-нуклеиновых взаимодействий.
Известен штамм Escherichia coli, продуцирующий рестриктазу EcoR II (сайт узнавания 5'-CC(A/T)GG-3') [1]
Данная рестриктаза не является термостабильной, выход фермента не превышает 2000 ед/г сырой биомассы. Культуральные и биотехнологические свойства штамма не опубликованы.
Данная рестриктаза не является термостабильной, выход фермента не превышает 2000 ед/г сырой биомассы. Культуральные и биотехнологические свойства штамма не опубликованы.
Известен штамм Bacillus sphaericus, продуцирующий рестриктазу BshG I (сайт узнавания 5'-CC(A/T)GG-3').
Недостатком данного штамма является термолабильность эндонуклеазы рестрикции. Оптимальная температура работы фермента 37оС [2]
Наиболее близким к предлагаемому является штамм Bacillus stearothermophilus G3, продуцирующий рестриктазы BstG I и BstG II (сайт узнавания 5'-CC(A/T)GG-3') [3]
Эндонуклеазы рестрикции данного штамма термостабильны.
Наиболее близким к предлагаемому является штамм Bacillus stearothermophilus G3, продуцирующий рестриктазы BstG I и BstG II (сайт узнавания 5'-CC(A/T)GG-3') [3]
Эндонуклеазы рестрикции данного штамма термостабильны.
Недостатками данного штамма является то, что им продуцируются две рестриктазы. Это затрудняет получение чистого фермента без интерферирующей активности. Данные по продуктивности штамма и активности ферментов не опубликованы.
Цель изобретения получение штамма, продуцирующего единственную и термостабильную рестриктазу, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность 5'-CC(A/T)GG-3', с высоким выходом и активностью фермента.
Поставленная цель достигается выявлением и использованием штамма Bacillus stearothermophilus 38 продуцента сайт-специфической рестриктазы Bst38 I.
Предлагаемый штамм выделен из термальных источников в результате поиска продуцентов рестриктаз.
Полученный штамм Bacillus stearo-thermophilus депонирован в ВКПМ ВНИИ генетика под регистрационным номером В-5465, а продуцируемая им рестриктаза названа Bst38 I согласно общепринятой номенклатуре.
Штамм Bacillus stearothermophilus 38 характеризуется следующими признаками:
Морфологические признаки.
Морфологические признаки.
Клетки палочковидные, прямые, 0,5 0,8 х 2 12 мкл, подвижные. Образуют эндоспоры овальной формы, терминально расположенные, вздутые относительно размеров вегетативной клетки. Окраска по Граму грамположительны.
Культуральные признаки.
Штамм нетребователен к факторам роста, хорошо растет на обычных питательных средах (СПА, МПА, МПБ). На агаризованных средах образует мелкие, круглые, непигментированные колонии, блестящие, с ровным краем.
Оптимальная температура роста 65оС, рН 7,0-7,2.
Культуру поддерживают пересевом на плотных средах, хранят в растворе глицерина при -70оС или в лиофильно-высушенном состоянии.
Физиологические признаки.
Не восстанавливает нитраты, отрицателен по лецитиназе в реакции с метиловым красным и Фогес-Проскауера; не гидролизует крахмал, казеин, желатин, эскулин; не использует малонат, цитрат, не растет при концентрации NaCl до 5% 0,001% лизоцима; энергично образует кислоту из глюкозы, очень слабо из арабинозы, ксилозы и маннита; не дезаминирует фенилаланин, не выделяет индол и сероводород.
Штамм высокочувствителен к антибиотикам: пенициллину, сульфатиозолу, ампициллину, гентамицину, менее чувствителен к тетрациклину, мономицину, неомицину, олеандомицину, левомицетину; устойчив к стрептомицину.
Для культивирования Bacillus stearothermophilus В-5465 применяют среду следующего состава, г/л: пептон 10, дрожжевой экстракт 5, глюкоза 5, вода дистиллированная остальное. Культивирование проводят при 65оС и интенсивной аэрации до достижения фазы замедления роста.
Выход целевого фермента 100.000 ед/г сырой биомассы с удельной активностью 30.000 ед/мл.
Определяющими отличиями предлагаемого штамма от штамма-прототипа являются:
наличие единственной термостабильной рестриктазы;
высокая продуктивность штамма;
высокая активность фермента.
наличие единственной термостабильной рестриктазы;
высокая продуктивность штамма;
высокая активность фермента.
Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и для выделения рестриктазы, имеющей сайт узнавания 5'-CC(A/T)GG-3', никогда не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения "новизна" и "существенные отличия".
На чертеже представлена электрофореграмма продуктов гидролиза ДНК фага ферментом Bst38 I (дор. 1), EcoR II и Bst38 I (дор. 2), EcoR II (дор. 3), Bst38 I (дор. 4), ДНК фага λ (контроль, дор. 5).
Как видно из чертежа, идентичность полос расщепления при параллельном и совместном гидролизе подтверждает их изошизометрию.
П р и м е р 1. Получение биомассы и выделение фермента.
Перед началом работы клетки штамма продуцента пересевают бактериологической петлей на агаризованную среду. Чашки Петри помещают в термостат на 65оС. После 10-12-часовой инкубации подросшие клетки пересевают в колбы со свежей питательной средой, содержащей, г/л: пептон 10, дрожжевой экстракт (Difco) 5, глюкоза 5, вода дистиллированная остальное. Культивирование проводят при 65оС с аэрацией 2 объема/мин, при перемешивании -150 об/мин, до фазы замедления роста. Клетки собирают центрифугированием при 1500 g и температуре 4оС. Дезынтеграцию, выделение и очистку проводят по методике Bickle, Pirotta, Imber.
П р и м е р 2. Определение специфичности и активности фермента.
Специфичность фермента определяют по картине параллельного и совместного гидролиза субстратной ДНК. Идентичность картин гидролиза на 1-4 дорожках говорит о том, что эти ферменты узнают и расщепляют одинаковую последовательность нуклеотидов 5'-CC(A/T)GG-3'.
Выход фермента Bst38 I определяют по электрофоретической картине гидролиза ДНК фага лямбда. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч при температуре 65оС. Выход фермента составляет 100.000 ед/г сырой биомассы, удельная активность 30.000 ед/мл.
Фермент хранится при -20оС в глицерине.
Таким образом, полученный штамм, обладает следующими преимуществами по сравнению с известным:
наличие единственной термостабильной рестриктазы;
высокая продуктивность штамма;
высокая активность фермента.
наличие единственной термостабильной рестриктазы;
высокая продуктивность штамма;
высокая активность фермента.
Поскольку рестриктаза Bst38 I имеет сайт узнавания 5'-CC(A/T)GG-3', идентичный сайту узнавания рестриктазы BstG II, она может заменить прототип во всех генно-инженерных работах.
Claims (1)
- Штамм бактерий Bacillus stearothermophilus ВКПМ В-5465 продуцент эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'-СС(А/Т) GG 3'.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU5047917 RU2038380C1 (ru) | 1992-06-15 | 1992-06-15 | Штамм бактерий bacillus stearothermophilus - продуцент эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5`- cc (a / t) gg - 3` |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU5047917 RU2038380C1 (ru) | 1992-06-15 | 1992-06-15 | Штамм бактерий bacillus stearothermophilus - продуцент эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5`- cc (a / t) gg - 3` |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2038380C1 true RU2038380C1 (ru) | 1995-06-27 |
Family
ID=21607098
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU5047917 RU2038380C1 (ru) | 1992-06-15 | 1992-06-15 | Штамм бактерий bacillus stearothermophilus - продуцент эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5`- cc (a / t) gg - 3` |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2038380C1 (ru) |
-
1992
- 1992-06-15 RU SU5047917 patent/RU2038380C1/ru active
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
1. Boyer H.W., Chow L.T., Dugaiczyk A., Hedgreth J., Goodman H.M. Nature New Biol 1973, v.244. p.40-43. * |
2. Scarpelis G., Moissidou A., Rina M., Bouriotis V. Nucl.Acids Res.-1989, v.17. -p.8883. * |
3. Catalog New England Biolabs, USA, 1988/1989. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU94035744A (ru) | Днк, микроорганизм, способ получения z-треонина | |
US3972774A (en) | Enzymatic de-esterification of cephalosporin para-nitrobenzyl esters | |
EP0052974B1 (en) | Improvements in enzymatic deesterification | |
RU2038380C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus stearothermophilus - продуцент эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5`- cc (a / t) gg - 3` | |
RU2057806C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus coagulans - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-gatnnnnatc-3' | |
Fukagawa et al. | DEACETYLATION OF PS-5, A NEW β-LACTAM COMPOUND I. MICROBIAL DEACETYLATION OF PS-5 | |
JPS6129953B2 (ru) | ||
RU2021373C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus pumilus, продуцирующий эндонуклеазу рестрикции, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5` = cctnagc-3` | |
RU2073717C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus schlegelii - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5' - ccnnnnnnn gg-3' | |
RU2054040C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus coagulans - продуцент сайт - специфической эндонуклазы, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5′-ctcttc-3′ | |
CH636078A5 (it) | Complessi enzimatici atti a trasformare idantoine raceme in amminoacidi otticamente attivi e loro applicazioni. | |
RU2046142C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus pumilus - продуцент эндонуклеазы рестрикции ври 19 1 | |
RU2037522C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus species - продуцент эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5`-(a/g) ccgg (t/c)-3` | |
RU2040540C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus coagulans - продуцент сайт - специфическойй эндокуклазы, способной узнать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'- ct (a/g) (t/c)ag - 3' | |
RU2053299C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus badius - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-(a/t)ccgg(a/t)-3' | |
Mahesh et al. | Optimization for the production of extracellular alkaline phosphatase from Proteus mirabilis | |
RU2115728C1 (ru) | Штамм бактерии bacillus stearothermophilus - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-ggtnacc-3' | |
RU2105811C1 (ru) | Штамм бактерии deleya aquamarina - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-gtgcac-3' | |
RU2110573C1 (ru) | Штамм бактерий photobacterium phosphoreum - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5 - gg (t/c)(ag)cc-3' | |
RU1806191C (ru) | Штамм бактерий MIcRococcUS SpecIeS - продуцент рестриктазы MSp 20 I | |
RU2135581C1 (ru) | Штамм бактерий streptomyces sp. st-12 - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'- ctgcag -3' | |
RU2034922C1 (ru) | Штамм бактерий acinetobacter calcoaceticus - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5`-ggtacc-3` | |
RU2007453C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus sphaericus-продуцент рестриктазы bsh 45 i | |
US5985632A (en) | Peptide amidase from xanthomonas | |
RU2266323C2 (ru) | Штамм бактерий sphingobacterium mizutae-32 - продуцент эндонуклеазы рестрикции spmi, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-ат'cgat-3' |