RU2053299C1 - Штамм бактерий bacillus badius - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-(a/t)ccgg(a/t)-3' - Google Patents
Штамм бактерий bacillus badius - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-(a/t)ccgg(a/t)-3' Download PDFInfo
- Publication number
- RU2053299C1 RU2053299C1 RU93057108A RU93057108A RU2053299C1 RU 2053299 C1 RU2053299 C1 RU 2053299C1 RU 93057108 A RU93057108 A RU 93057108A RU 93057108 A RU93057108 A RU 93057108A RU 2053299 C1 RU2053299 C1 RU 2053299C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- ccgg
- enzyme
- nucleotide sequence
- restrictase
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Использование: микробиология и биотехнология в генно-инженерных работах. Сущность изобретения: штамм бактерий Bacillus badius ВКПМ В-6616 обеспечивает получение рестриктазы Вba 179 1, узнающей и расщепляющей нуклеотидную последовательность 5′= (A/T)CCGG(A/T)-3′, не требовательный к питательным средам и с небольшим временем культивирования. Штамм Bacillus badius ВКПМ В-6616 выделен из почвы в результате поиска продуцентов рестриктаз. Выход фермента составляет 1000 ед/г сырой биомассы, удельная активность целевого фермента составляет 3000 ед/мл. Рестриктаза Bba 179 1 является изошизомером рестриктазы Bet 1. 1 ил.
Description
Изобретение относится к микробиологической промышленности и генной инженерии и касается получения нового штамма, продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5' -(A/T)CCGG(T/A) 3'.
Рестриктаза такой специфичности может быть использована для исследования первичной структуры ДНК, физического картирования различных геномов. Данная эндонуклеаза является удобной моделью для изучения специфичности белок-нуклеиновых взаимодействий.
Известен штамм Bacillus species М, продуцирующий рестриктазы BspM I и BspM II (сайты узнавания 5'-ACCTGC-3' и 5'-TCCGGA-3', соответственно) [1] Недостатком данного штамма является то, что в одной биомассе находятся 2 рестриктазы. Это затрудняет процедуру очистки, причем ни одна из рестриктаз не способна узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'-(A/T)CCGG(T/A)-3'. Культуральные и биотехнологические свойства штамма не опубликованы.
Известен штамм Citrobacter freundii, продуцирующий рестриктазу Cfr10 I (сайт узнавания 5'-(A/G)CCGG(T/C)) [2] Недостатком данного штамма является его низкая продуктивность. Выход рестриктазы не превышает 300 ед/г сырой биомассы. Штаммы данного вида относятся к энтеробактериям, некоторые серотипы встречаются при массовых пищевых токсикоинфекциях, при инфекциях мочевых путей, желчного пузыря, среднего уха и мозговых оболочек. Этот штамм также не способен продуцировать рестриктазу, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5'-(A/T)CCGG(A/T)-3'. Данные по биотехнологическим показателям штамма не опубликованы.
Наиболее близким к заявленному штамму прототипом является штамм Brevibacterium acetyliticum, продуцирующий рестриктазу Bet I (сайт узнавания 5'-(A/T)CCGG(A/T)-3') [3]
Недостатками данного штамма является низкий выход рестриктазы, составляющий менее 200 ед/г, наличие неспецифического нуклеазного загрязнения, что не позволяет сделать фермент, выделяемый из данного штамма, коммерческим препаратом. Для культивирования необходима богатая среда: Nutrient agar ("Difco", USA). Выращивание штаммов данного вида для выделения эндонуклеаз рестрикции длится 72-120 ч [4]
Целью изобретения является получение штамма, продуцирующего рестриктазу, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность 5'-(A/T)CCGG(A/T)-3', высокопродуктивного по искомой эндоклеазе, неприхотливого к питательным средам, не требующего длительного культивирования.
Недостатками данного штамма является низкий выход рестриктазы, составляющий менее 200 ед/г, наличие неспецифического нуклеазного загрязнения, что не позволяет сделать фермент, выделяемый из данного штамма, коммерческим препаратом. Для культивирования необходима богатая среда: Nutrient agar ("Difco", USA). Выращивание штаммов данного вида для выделения эндонуклеаз рестрикции длится 72-120 ч [4]
Целью изобретения является получение штамма, продуцирующего рестриктазу, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность 5'-(A/T)CCGG(A/T)-3', высокопродуктивного по искомой эндоклеазе, неприхотливого к питательным средам, не требующего длительного культивирования.
Цель достигается выявлением и использованием штамма Bacillus badius 179 продуцента сайт-специфической рестриктазы, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-(A/T)CCGG(A/T)-3'.
Предлагаемый штамм выделен из почвы в результате поиска продуцентов рестриктаз.
Полученный штамм Bacillus badius 179 депонирован в ВКПМ НИИ генетика под регистрационным номером B-6616, а продуцируемая им рестриктаза названа Bda179 I согласно общепринятой номенклатуре.
Штамм Bacillus badius характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки.
Клетки палочковидные, прямые, 0,5-0,8х2-12 мкл, подвижные. Образуют эндоспоры эллиптической формы, расположенные центрально и терминально, вздутости относительно размеров вегетативной клетки не наблюдается.
Окраска по Граму грамположительны.
Культуральные признаки.
Штамм нетребователен к факторам роста, хорошо растет на обычных питательных средах (СПА, МПА, МПВ). На агаризованных средах образует мелкие, круглые, непигментированные колонии, блестящие, с ровным краем.
Оптимальная температура роста 37оС, pH 7,0-7,2.
Культуру поддерживают пересевом на плотных средах, хранят в растворе глицерина при 70оС или в лиофольно-высушенном состоянии.
Физиологические признаки.
Не восстанавливает нитраты, отрицателен в реакции с метиловым красным и Фогес-Проскауэра; гидролизует крахмал, желатин, но не гидролизует казеин; каталазоположителен; не растет при концентрации NaCl выше 5% слабый рост при 0,002% азида натрия и на среде Сабуро, нет роста в анаэробном агаре; индолотрицателен.
Для культивирования Bacillus badius B-6616 применяют СПА, МПА, МПБ. Культивирование проводят на термостатированных качалках или в ферментерах при 37оС и интенсивной аэрации до достижения фазы замедления роста (4-5 ч).
Выход целевого фермента 1000 ед/г сырой биомассы с удельной активностью 3,000 ед/мл.
Определяющими отличиями предлагаемого штамма от штамма-прототипа являются: в 5 раз более высокая продуктивность по целевому ферменту; отсутствие нуклеазного загрязнения; простая питательная среда; высокая скорость роста.
Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и для выделения рестриктазы, имеющей сайт узнавания 5'-(A/T)CCGG(A/T)-3', никогда не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям "Новизна" и "Изобретательский уровень".
На чертеже представлена электрофореграмма продуктов гидролиза ДНК фага лямбда ферментом Avall (дор. 1,5) маркерный гидролиз и продукты гидролиза ДНК pBR322 ферментом Bda179 I (дор.2), Bba179 I совместно с BsaW I (сайт узнавания 5'-(A/T)CCGG(A/T)-3') (дор. 3), BsaW I (дор. 4).
Как видно из чертежа, идентичность полос расщепления при параллельном и последовательном гидролизе подтверждает их изошизомерию.
П р и м е р 1. Получение биомассы и выделение фермента.
Перед началом работы клетки штамма-продуцента пересевают бактериологической петлей на агаризованную среду. Чашки Петри помещают в термостат на 37оС. После 10-12-часовой инкубации подросшие клетки пересевают в колбы со свежей питательной средой (МПВ). Культивирование проводят в ферментере при 37оС с аэрацией 1,5 объема/мин, при перемешивании 150 об/мин, до фазы замедления роста (4-5 ч). Клетки собирают центрифугированием при 1500 g и температуре 4оС. Дезынтеграцию, выделение и очистку проводили по методике Bickle, Pirotta, Imber.
П р и м е р 2. Определение специфичности и активности фермента.
Специфичность фермента определяют по картине совместного и параллельного гидролиза субстратной ДНК. Совпадение длин фрагментов гидролиза говорит о том, что Bba179 I узнает и расщепляет последовательность нуклеотидов: 5'-(A/T)CCGG(A/Т)-3'.
Выход фермента Bba179 I определяют по электрофоретической картине гидролиза ДНК фага лямбда. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч при температуре 37оС. Выход фермента составляет 1,000 ег/г сырой биомассы, удельная активность 3,000 ед/мл.
Фермент хранится при -20оС в глицерине.
Таким образом получен штамм, обладающий следующими преимуществами по сравнению с известным: более высокая продуктивность по целевому ферменту; отсутствие нуклеазного загрязнения; простая питательная среда; высокая скорость роста.
Поскольку рестриктаза Bba179 I имеет сайт узнавания 5'-(A/T)CCGG(A/T)-3', идентичный сайту узнавания рестриктазы Bet I, а выход фермента высок, она может стать коммерческим препаратом и применяться во всех генно-инженерных работах для расщепления последовательности нуклеотидов 5'-(A/T)CCGG(A/T)-3'.
Claims (1)
- Штамм бактерий Bacillus badius ВКПМ В-6616 - продуцент эндонуклеазы реструкции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5′-(A/T)CCGG(A/T)-3′.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU93057108A RU2053299C1 (ru) | 1993-12-22 | 1993-12-22 | Штамм бактерий bacillus badius - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-(a/t)ccgg(a/t)-3' |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU93057108A RU2053299C1 (ru) | 1993-12-22 | 1993-12-22 | Штамм бактерий bacillus badius - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-(a/t)ccgg(a/t)-3' |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2053299C1 true RU2053299C1 (ru) | 1996-01-27 |
RU93057108A RU93057108A (ru) | 1996-07-10 |
Family
ID=20150624
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU93057108A RU2053299C1 (ru) | 1993-12-22 | 1993-12-22 | Штамм бактерий bacillus badius - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-(a/t)ccgg(a/t)-3' |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2053299C1 (ru) |
-
1993
- 1993-12-22 RU RU93057108A patent/RU2053299C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
1. Catalog New England Biolabs, ИSА, 1988/1989. Janulaitis A.A., Stakenas P.S., Berlin Y.A. FEBS Lett. 1983, Y.161, c.210-212. 2. Roberts R.J., Macelis D.Nucl. Acids Res., 1991, v.19, suppl, p.2077-2109. 3. Gelinas R.E., Myers P.A., Weiss G.H., Roberts R.J., Marrayk. J.Mol.biol., 1977,v.441-449. 4. Bickle T.A., Pirotta V., Jmber R. Nucl.Acids Res.1977, v.4,p.2561-2572. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU94035744A (ru) | Днк, микроорганизм, способ получения z-треонина | |
RU2288263C2 (ru) | Штамм bacillus coagulans sim-7 dsm 14043 для получения l(+)-лактата и способ получения l(+)-лактата | |
RU2687137C1 (ru) | Штамм гетеротрофных бактерий Klebsiella pneumonia - ассоциант для получения микробной белковой массы | |
RU2053299C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus badius - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-(a/t)ccgg(a/t)-3' | |
RU2057806C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus coagulans - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-gatnnnnatc-3' | |
RU2037522C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus species - продуцент эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5`-(a/g) ccgg (t/c)-3` | |
RU2040540C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus coagulans - продуцент сайт - специфическойй эндокуклазы, способной узнать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'- ct (a/g) (t/c)ag - 3' | |
RU2745093C1 (ru) | Штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus BF19-07 - продуцент для получения микробной белковой массы | |
RU2046142C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus pumilus - продуцент эндонуклеазы рестрикции ври 19 1 | |
RU2021373C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus pumilus, продуцирующий эндонуклеазу рестрикции, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5` = cctnagc-3` | |
RU2073717C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus schlegelii - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5' - ccnnnnnnn gg-3' | |
RU2054040C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus coagulans - продуцент сайт - специфической эндонуклазы, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5′-ctcttc-3′ | |
RU2034922C1 (ru) | Штамм бактерий acinetobacter calcoaceticus - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5`-ggtacc-3` | |
RU2038380C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus stearothermophilus - продуцент эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5`- cc (a / t) gg - 3` | |
RU2115728C1 (ru) | Штамм бактерии bacillus stearothermophilus - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-ggtnacc-3' | |
RU2110573C1 (ru) | Штамм бактерий photobacterium phosphoreum - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5 - gg (t/c)(ag)cc-3' | |
RU2105811C1 (ru) | Штамм бактерии deleya aquamarina - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-gtgcac-3' | |
RU2266323C2 (ru) | Штамм бактерий sphingobacterium mizutae-32 - продуцент эндонуклеазы рестрикции spmi, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-ат'cgat-3' | |
RU2135581C1 (ru) | Штамм бактерий streptomyces sp. st-12 - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'- ctgcag -3' | |
SU1532583A1 (ru) | Штамм бактерий PaRacoccUS DеNIтRIFIсаNS-продуцент эндонуклеазы рестрикции Р @ 121 | |
RU1806191C (ru) | Штамм бактерий MIcRococcUS SpecIeS - продуцент рестриктазы MSp 20 I | |
SU1659480A1 (ru) | Штамм бактерий КLевSIеLLа рNеUмоNIае-продуцент рестриктазы Кр @ 378 1 | |
RU2018533C1 (ru) | Штамм бактерий micrococcus varians, продуцирующий эндонуклеазу рестрикции, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5′-ttcgaa-3' | |
SU1694647A1 (ru) | Штамм бактерий BacILLUS вRеVIS - продуцент рестриктазы В @ 12 I | |
SU1095645A1 (ru) | Способ получени эндонуклеазы рестрикции |