SU1712415A1 - Способ получени рестриктазы В @ AI - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии и может быть использовано в генно-инженерных и молекул рно-генетических работах. Изобретение заключаетс  в том, что продуцент B.brevis ВКМ В-677 выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в услови х аэрации, целевой продукт выдел ют из полученной биомассы известными методами. Биомасса B.brevis ВКМ- 677 со^^ержит новую рестриктазу BbvAl, узнающую и расщепл ющую последовательность ДНК 5'..,G.AANN' NNTTC...3' В количествах, достаточных дл  получени  рестриктазы в препаративных масштабах. Выход очищенного препарата рестриктазы BbvAl составл ет 1800-2200 ед активно.сти на 1 г сырой биомассы. Эндонуклеаза рестрикции ВbvAf не содержит примесей фос- фатаз, зкзонуклеаз и неспецифических зндонуклеаа. Учитыва  особенности локализации участка узнавани  рестриктазы BbvAl на векторных молекулах ДНК, новый фермент может быть использован в биотехноло- гичеСких и молекул рно-генетических работах.(Лс

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии и может быть использовано в генно-йнг женерных и молекул рно-генетических работах.

Эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы II класса) широко примен ютс  в структурных исследовани х ДНК, конструировании рекомбинантных молекул ДНК |П: vitro, идентификации генетических аномалий у человека и разработке подходов к диагностике наследственных заболеваний, во многих област х молекул рной биологии, биохимии, вирусологии и микробиологии. Облада  высокой специфичностью к узнаваемой и расщепл емой нуклеотидной последовательности ДНК, рестриктазы представл ютудобную модель дл  изучени  проблемы нуклеиновОбелкового узнавани ,

Рестриктаза, выделенна  из Xanthomonas manihotis 7AS1, расщепл ет ДНК фага А в 24 участках, ДНК Ad2 в п ти, а трех, плазмиду pBR 322 в двух и не гидролизует ДНК обезь него вируса SV40.

Согласно предлагаемому cnocolBy продуцент Bacillus brevls ВКМ-677 выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода,- азота и минеральные соли в услови х азрации. целевой продукт выдел ют из полученной биомассы известными методами. Рестриктаза BbvAl - изошизомер XmnI, узнает и расщепл ет участок нуклеотидной последовательности ДНК 5 ...GAANNT NNTTC...3. Фермент гидроЛизует ДНК фага А по 24 участкам, ДНК Ad2 по п ти, ДНК X 174 по трем, плазмиду pBR 322 по двум и не имеет сайтов узнавани  на ДНК обезь него вируса SV40. Поиск штамма-пр| дуцента осуществл ют с помощью разработанного экспресс-метода тестировани  рестриктазной активности в толуольных экстрактах из клеток микроорганизмов с последующим электрофоретическим анализом продуктов расщеплени  ДНК в агарозном геле. Штамм Bacillus brevis 677 получен из Всесоюзной Коллекции микроорганизмов АН СССР, где хранитс  :под№ ВКМ B-677H CIB 8146 АТСС 10068 (каталог культур Всесоюзной коллекции непатогенных Микроорганизмов) и не  вл етс  идентичным описанным в литературе продуцентам рестриктаз Bbvl, Bbvll и BbvSI. Характеристика штамма. Морфологические особенности; подвижные пaлoчkи, грамтположительны (признак варьирует Грам Грам). Культурально-биохимические свойства: на скошенном агаре рост по штриху нежный , мелкие, блест щие, гладкие колонии; на чашке Петри с м ср-пептонным агаром мелкие, блест щие, гладкие колонии; на м со-пептонном бульоне и бульоне Хоттингера осадок. Отношение к кислороду - аэроб. Утилизаци  углеводов: на глюкозе, манните К. Индол и сероводород не образует. Желатина уколом - Разжижение. Чувствительность к антибиотикам: культура обладает множественной устойчивостью к антибиотикам; резистентна к пенициллину , канамицину, хлорамфениколу, оксациллину; чувствительна к стрептомицину , тетрациклину, неомицину, линкомицину , гентамицину, метициклину, нистатину. Опт;1Мдльные услови  выращивани  и хранени  культуры. Культура В.brevis ВКМ-677 хорошо растет в услови х аэрации при на бульоне Хоттингера с добавлением 2% глюкозы, а также На среде, содержащей в 1 л, г; дрожжевой экстракт 5; пептон 10; глюкоза 5; Na2HP04-12 НгО 2,2; NaCI 3; Mg S04 0,5; CaCl2 0,25, рН 7,2-7,5. Ферментацию культуры провод т после добавлени  в ферментер инокул та в соотношении 1:10 к объему среды. Рабочие культуры пересевают на бульон Хоттингера один раз в 7-10 дней. Хран т культуру в полужидком агаре под вазелиновым маслом или в лиофилизированном виде в ампулах. Культура непатогенна дл  мышей. Инкубационна  смесь дл  определени  активности рестриктазы BbvAl обьемом 4050 мкл содержит 0,05 М трис-НС, рН 7,5, 0,01 М MgCIa, 0,001 М , дитиотреитола, 0,1 М NaCI, 2 мкг ДНК фага А и 0,5-10 мкл фермента . Инкубацию провод т при 37°С в течение 60 мин. Продукты расщеплени  ДНК фага Арестриктазой BbvAl определ ют электрофоретически в 1,5%-ном агарозном геле с последующим прокрашиванием гел  бромидом этиди . За единицу активности фермента принимают то минимальное количество его (в мкл), которое необходимо дл  полного расщеплени  1 мкг ДНК фага А при 37°Сза 1 ч инкубации в стандартных услови х инкубационной смеси. Приме р 1. Культуру Bacillus brevis ВКМ-677 предварительно адаптируют в течение ночи при 37°С в услови х аэрации на основной питательной среде, содержащей в 1л, г: дрожжевой экстракт 5; пептон 10; глюкоза 5; Na2HP04-12H20 2,2; NaCi 3; MgS04 0,5; CaCh 0,25, рН среды 7,2-7,5. Инокул т дл  ферментации готов т, пересева  адаптированную культуру на 1 л свежей среды из.расчета 1:10 и размножают в услови х аэрации. Ферментацию культуры провод т после добавлени  в ферментер инокул та в соотношении 1:10 к объему при 37°С с аэрацией, рН 7,2-7,5. Во врем  ферментации рН культуральной жидкости поддерживают в пределах 7,3-7,6. Выращивание продолжают до достижени  конца логарифмической фазы роста. Выход сырой биомассы составл ет 79 г/л культуральной жидкости. Содержание рестриктазы BbvAl в биомассе оценить не возможно, поскольку культура В.brevis ВКМ-677 продуцирует еще две эндонуклеазы рестрикции BbvAll и Bbvllico специфичностью соответственно рестриктаз Clal и BspMll. Выделение .рестриктазы BbvAl. 10 г биомассы Bacillus brevis ВКМ-677 суспендируют в буферном растворе и клетки разрушают ультразвуковой дезинтеграцией при 2-4°С. После удалени  остатков клеточных Оболочек и неразрушенных клеток с помощью ультрацентрифугировани  бесклеточный экстракт обрабатывают полиэтиленимином , фракционируют сернокислым аммонием, сульфатаммониевую

фракцию диализуют и ведут последовательно хроматографию на колонках с ДЭАЭ-целлюлозой (ДЕ-52. Ватман) и голубой сефарозой (фирмы Фармаци ) и рехроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе.

Получают 22000 ед рестриктазы в 20 мл глицеринового буфера. Выход очищенного препарата фермента 2200 ед на 1 г сырого веса биомассы. Рестриктаза BbvAl стабильно сохран ет активность в течение не менее 6-8 мес при хранении при -20°С. Фермент не содержит примес.ей t ocфaтaз, неспецифических эндонуклеаз и экзонуклет аз, пригоден дл  картировани  ДНК и всех видов генно-инженерных работ.

Пример 2. Культивирование штамма Bacillus brevis ВКМ-677 провод т аналогично примеру 1, за исключением того, что в качестве питательной среды используют м со-пептонный бульон с2% глюкозы.

Выхрд биомассы 6-7 г/л культуральной жидкости.

После очистки фермента выход рестриктазы составл ет 1800 ед/г биомассы.

Таким образом, по предлагаемому способу получают новую рестриктазу BbvAl.

Поиск новой рестриктазы проведен путем скрининга у 70 штаммов бактерий рода Bacillus.

Биомасса штамма Bacillus brevis ВКМ677 содержит зндонуклеазу рестрикции BbvAl, узнающую и расщепл ющую нуклеотидную последовательность ДНК 5 GAANM NNTTC...3 в количествах, достаточных дл  получени  рестриктазы в препаративных масштабах.

Выход очищенного фермента BbvAl составл ет 1800-2200 ед на 1 г сырой биомассы .

Эндонуклеаза рестрикции BbyAl не содержит примесей неспецифических нуклеаз и фосфатаз.

Учитыва  особенности локализации участка узнавани  рестриктазы Bbvl на векторных молекулах ДНК. новый фермент может быть использован в биотехнологйческих и молекул рно-генетических работах.

- .

Claims (1)

1. Формулаизобре те и и   Способ получени  рестриктазы BbvAl, заключающи| с  в культивировании продуцирующего микроорганизма Bacillus brevis ВКМ-677 на питательной СРФде1 содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в услови х аэрации с последующим выделением фермента и очисткой его хроматографией.