JP6534612B2 - グリセロールのリン酸化物の製造方法 - Google Patents
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Description
項1.グリセロールのリン酸化物の製造方法であって、リン酸基供与体の存在下でリン酸化酵素をグリセロールに作用させる工程を含み、
前記リン酸化酵素が、クラスAの酸性ホスファターゼであり、且つ活性中心として下記配列(1)で表わされるアミノ酸配列を含むポリペプチドからなることを特徴とする、前記製造方法:
―X1―X2―X3−Pro−Ser−Gly−His−X4― (1)
ここで、
X1は、グリシン、アラニン又はフェニルアラニンを示し、
X2は、任意のアミノ酸を示し、
X3は、チロシン又はトリプトファンを示し、
X4は、トレオニン、セリン又はアラニンを示し、
且つ、X1がフェニルアラニンの場合は、X4がトレオニン又はセリンである。
項2.配列(1)におけるX1、及びX4が以下の(A1)〜(A8)のいずれかである、項1に記載の製造方法。
(A1)X1がグリシン、且つX4がトレオニン;
(A2)X1がグリシン、且つX4がセリン;
(A3)X1がアラニン、且つX4がセリン;
(A4)X1がアラニン、且つX4がトレオニン;
(A5)X1がアラニン、且つX4がアラニン;
(A6)X1がグリシン、且つX4がアラニン;
(A7)X1がフェニルアラニン、且つX4がトレオニン;
(A8)X1がフェニルアラニン、且つX4がセリン。
項3.配列(1)において、X2がセリン、アラニン又はアスパラギン酸である、項1又は2に記載の製造方法。
項4.配列(1)におけるX1、X2、X3及びX4が以下の(B1)〜(B11)のいずれかである、項1又は3に記載の製造方法。
(B1)X1がグリシン、X2がセリン、X3がチロシン、且つX4がトレオニン;
(B2)X1がグリシン、X2がアラニン、X3がチロシン、且つX4がトレオニン;
(B3)X1がグリシン、X2がセリン、X3がチロシン、且つX4がセリン;
(B4)X1がグリシン、X2がアスパラギン酸、X3がチロシン、且つX4がトレオニン;
(B5)X1がアラニン、X2がセリン、X3がチロシン、且つX4がセリン;
(B6)X1がアラニン、X2がセリン、X3がチロシン、且つX4がトレオニン;
(B7)X1がアラニン、X2がセリン、X3がチロシン、且つX4がアラニン;
(B8)X1がグリシン、X2がセリン、X3がチロシン、且つX4がアラニン;
(B9)X1がフェニルアラニン、X2がセリン、X3がチロシン、且つX4がトレオニン;
(B10)X1がフェニルアラニン、X2がセリン、X3がチロシン、且つX4がセリン;
(B11)X1がグリシン、X2がセリン、X3がトリプトファン、且つX4がセリン。
項5.配列(1)で表わされるアミノ酸配列において第7位のヒスチジン(His)残基が、リン酸化酵素として用いられるポリペプチドのN末端から数えて第120〜160位に位置する、項1〜4のいずれかに記載の製造方法。
項6.前記リン酸化酵素が、更に下記(I)又は(II)に示されるポリペプチドからなる、項1〜5のいずれかに記載される製造方法:
(II)に示されるポリペプチドが挙げられる。
(I)前記配列(1)で表わされる活性中心をコードするアミノ酸配列部位よりもN末端側に配列番号2で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(II)前記配列(1)で表わされる活性中心をコードするアミノ酸配列部位よりもN末端側に、配列番号2で示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ前記(I)に示されるポリペプチドと比べて同等以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド。
項7.配列番号2で示されるアミノ酸配列における第1位のアミノ酸残基が、リン酸化酵素として用いられるポリペプチドのN末端側から数えて第5〜40位に配置されている、項6に記載される製造方法。
項8.前記リン酸化酵素が、更に下記(III)〜(VI)のいずれか示すポリペプチドからなる、項1〜5のいずれかに記載される製造方法:
(III)配列(1)で表わされるアミノ酸配列のN末端側に、配列番号26〜32及び106〜110のいずれかに示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(IV)配列(1)で表わされるアミノ酸配列のN末端側に、配列番号26〜32及び106〜110のいずれかに示すアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ(III)に示される各々対応するポリペプチドと比べて同等以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド、
(V)配列(1)で表わされるアミノ酸配列のC末端側に、配列番号33〜39及び111〜115のいずれかに示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに
(VI)配列(1)で表わされるアミノ酸配列のC末端側に、配列番号33〜39及び111〜115のいずれかに示すアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ(V)に示される、対応するポリペプチドと比べて同等以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド。
項9.前記リン酸化酵素が、下記(VII)又は(VIII)に示されるポリペプチドからなる、項1〜8のいずれかに記載の製造方法:
(VII)配列番号3〜9、13、104、105、116、117、及び119〜121のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(VIII)配列番号3〜9、13、104、105、116、117、及び119〜121のいずれかに示されるアミノ酸配列において、前記配列(1)で表わされるアミノ酸配列からなる活性中心以外の領域の1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ(VII)に示される、対応するポリペプチドと比べて同等以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド。
項10.グリセロールのリン酸化物の製造方法であって、リン酸基供与体の存在下でリン酸化酵素をグリセロールに作用させる工程を含み、
前記リン酸化酵素が、クラスAの酸性ホスファターゼであり、且つ下記(i)又は(ii)に示されるポリペプチドからなることを特徴とする、前記製造方法:
(i)配列番号2で示されるアミノ酸配列を有し、グリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド、
(ii)配列番号2で示されるアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、且つ前記(i)に示されるポリペプチドと比べて同等以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド。
項11.配列番号2で示されるアミノ酸配列における第1位のアミノ酸残基が、リン酸化酵素として用いられるポリペプチドのN末端側から数えて第5〜40位に配置されている、項10に記載の製造方法。
項12.前記リン酸化酵素が、配列番号2で表わされるアミノ酸配列よりもC末端側に、下記配列(1)で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる、項10又は11に記載される製造方法:
―X1―X2―X3−Pro−Ser−Gly−His−X4― (1)
ここで、
X1は、グリシン、アラニン又はフェニルアラニンを示し、
X2は、任意のアミノ酸を示し、
X3は、チロシン又はトリプトファンを示し、
X4は、トレオニン、セリン又はアラニンを示し、
且つ、X1がフェニルアラニンの場合は、X4がトレオニン又はセリンである。
項13.配列(1)におけるX1及びX4が以下の(A1)〜(A8)のいずれかである、項12に記載の製造方法。
(A1)X1がグリシン、且つX4がトレオニン;
(A2)X1がグリシン、且つX4がセリン;
(A3)X1がアラニン、且つX4がセリン;
(A4)X1がアラニン、且つX4がトレオニン;
(A5)X1がアラニン、且つX4がアラニン;
(A6)X1がグリシン、且つX4がアラニン;
(A7)X1がフェニルアラニン、且つX4がトレオニン;
(A8)X1がフェニルアラニン、且つX4がセリン。
項14.配列(1)において、X2がセリン、アラニン又はアスパラギン酸である、項12又は13に記載の製造方法。
項15.配列(1)におけるX1、X2、X3及びX4が以下の(B1)〜(B11)のいずれかである、項12〜14のいずれかに記載の製造方法。
(B1)X1がグリシン、X2がセリン、X3がチロシン、且つX4がトレオニン;
(B2)X1がグリシン、X2がアラニン、X3がチロシン、且つX4がトレオニン;
(B3)X1がグリシン、X2がセリン、X3がチロシン、且つX4がセリン;
(B4)X1がグリシン、X2がアスパラギン酸、X3がチロシン、且つX4がトレオニン;
(B5)X1がアラニン、X2がセリン、X3がチロシン、且つX4がセリン;
(B6)X1がアラニン、X2がセリン、X3がチロシン、且つX4がトレオニン;
(B7)X1がアラニン、X2がセリン、X3がチロシン、且つX4がアラニン;
(B8)X1がグリシン、X2がセリン、X3がチロシン、且つX4がアラニン;
(B9)X1がフェニルアラニン、X2がセリン、X3がチロシン、且つX4がトレオニン;
(B10)X1がフェニルアラニン、X2がセリン、X3がチロシン、且つX4がセリン;
(B11)X1がグリシン、X2がセリン、X3がトリプトファン、且つX4がセリン。
項16.配列(1)で表わされるアミノ酸配列において第7位のヒスチジン(His)残基が、リン酸化酵素として用いられるポリペプチドのN末端から数えて第120〜160位に位置する、項12〜15のいずれかに記載の製造方法。
項17.前記リン酸化酵素が、更に下記(iii)〜(vi)に示すアミノ酸配列の少なくとも1種を含む、項10〜16のいずれかに記載される製造方法:
(iii)配列番号2で表わされるアミノ酸配列のN末端側に、配列番号40で示すアミノ酸配列を有し、グリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド、
(iv)配列番号2で表わされるアミノ酸配列のN末端側に、配列番号40で示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、且つ(iii)に示されるポリペプチドと比べて同等以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド、
(v)配列番号2で表わされるアミノ酸配列のC末端側に、配列番号41で示されるアミノ酸配列を有し、グリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド、ならびに
(vi)配列番号2で表わされるアミノ酸配列のC末端側に、配列番号41で示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ(v)に示されるポリペプチドと比べて同等以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド。
項18.前記リン酸化酵素が、下記(vii)又は(viii)に示されるポリペプチドからなる、項10〜17のいずれかに記載の製造方法:
(vii)配列番号9、15〜17、19、22及び25のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(viii)配列番号9、15〜17、19、22及び25のいずれかに示されるアミノ酸配列において、配列番号2で示されるアミノ酸配列以外の領域の1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ前記(vii)のポリペプチドと比べて同等以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド。
項19.前記リン酸基供与体がポリリン酸である、項1〜18のいずれかに記載の製造方法。
項20.前記グリセロールのリン酸化物がα−グリセロリン酸である、項1〜19のいずれかに記載される製造方法。
項21.前記リン酸基供与体の存在下でリン酸化酵素をグリセロールに作用させる工程において、反応液のpHが4〜5である、項1〜20のいずれかに記載の製造方法。
項22.前記リン酸基供与体の存在下でリン酸化酵素をグリセロールに作用させる工程において、リン酸化酵素1重量部当たりのグリセロールの添加量が1000〜50000重量部である、項1〜21のいずれかに記載の製造方法。
項23.前記リン酸基供与体の存在下でリン酸化酵素をグリセロールに作用させる工程において、反応液中のリン酸基供与体の濃度が2〜10重量%である、項1〜22のいずれかに記載の製造方法。
本発明はグリセロールのリン酸化物の製造方法を提供する。当該方法はリン酸基供与体の存在下において、所定のリン酸化酵素をグリセロールに作用させることを特徴とする。以下、本発明のグリセロールのリン酸化物の製造方法を「本発明の方法」と略記することがある。
本発明の方法において使用されるリン酸化酵素の態様(α)として、下記配列(1)(配列番号1)で表されるアミノ酸配列からなる活性中心を含み、且つグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するリン酸化酵素が挙げられる。
―X1―X2―X3−Pro−Ser−Gly−His−X4― (1)
ここで、
X1は、グリシン、アラニン又はフェニルアラニンを示し、
X2は、任意のアミノ酸を示し、
X3は、チロシン又はトリプトファンを示し、
X4は、トレオニン、セリン又はアラニンを示し、
且つ、X1がフェニルアラニンの場合は、X4がトレオニン又はセリンである。
(A1)X1がグリシン、且つX4がトレオニン;好ましくは、X1がグリシン、X2がセリン、アラニン、又はアスパラギン酸、且つX4がトレオニン;更に好ましくはX1がグリシン、X2がアラニン、且つX4がトレオニン、
(A2)X1がグリシン、且つX4がセリン;好ましくは、X1がグリシン、X2がセリン、且つX4がセリン、
(A3)X1がアラニン、且つX4がセリン;好ましくは、X1がアラニン、X2がセリン、且つX4がセリン、
(A4)X1がアラニン、且つX4がトレオニン;好ましくは、X1がアラニン、X2がセリン、且つX4がトレオニン、
(A5)X1がアラニン、且つX4がアラニン;好ましくは、X1がアラニン、X2がセリン、且つX4がアラニン、
(A6)X1がグリシン、且つX4がアラニン;好ましくは、X1がグリシン、X2がセリン、且つX4がアラニン、
(A7)X1がフェニルアラニン、且つX4がトレオニン;好ましくは、X1がフェニルアラニン、X2がセリン、且つX4がトレオニン、
(A8)X1がフェニルアラニン、且つX4がセリン;好ましくはX1がフェニルアラニン、X2がセリン、且つX4がセリン。
(B1)X1がグリシン、X2がセリン、X3がチロシン、且つX4がトレオニン;
(B2)X1がグリシン、X2がアラニン、X3がチロシン、且つX4がトレオニン;
(B3)X1がグリシン、X2がセリン、X3がチロシン、且つX4がセリン;
(B4)X1がグリシン、X2がアスパラギン酸、X3がチロシン、且つX4がトレオニン;
(B5)X1がアラニン、X2がセリン、X3がチロシン、且つX4がセリン;
(B6)X1がアラニン、X2がセリン、X3がチロシン、且つX4がトレオニン;
(B7)X1がアラニン、X2がセリン、X3がチロシン、且つX4がアラニン;
(B8)X1がグリシン、X2がセリン、X3がチロシン、且つX4がアラニン;
(B9)X1がフェニルアラニン、X2がセリン、X3がチロシン、且つX4がトレオニン;
(B10)X1がフェニルアラニン、X2がセリン、X3がチロシン、且つX4がセリン;
(B11)X1がグリシン、X2がセリン、X3がトリプトファン、且つX4がセリン。
(I)前記配列(1)で表わされる活性中心をコードするアミノ酸配列部位よりもN末端側に配列番号2で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(II)前記配列(1)で表わされる活性中心をコードするアミノ酸配列部位よりもN末端側に、配列番号2で示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ前記(I)に示されるポリペプチドと比べて同等以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド。
PDERLVLAPPPAPGSAAQ(配列番号2)
(III)配列(1)で表わされるアミノ酸配列のN末端側に、配列番号26〜32及び106〜110のいずれかに示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(IV)配列(1)で表わされるアミノ酸配列のN末端側に、配列番号26〜32及び106〜110のいずれかに示すアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ(III)に示される各々対応するポリペプチドと比べて同等以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド、
(V)配列(1)で表わされるアミノ酸配列のC末端側に、配列番号33〜39及び111〜115のいずれかに示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに
(VI)配列(1)で表わされるアミノ酸配列のC末端側に、配列番号33〜39及び111〜115のいずれかに示すアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ(V)に示される、対応するポリペプチドと比べて同等以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド。
MDAGYLTPATQPDATQYLPPPPQAGSARQAADDHAFESTRGLKGGARWALATSDADLRIEALLRSFSCAAGFTIDASKAPRLAALIHRMDVSEIPDMRNAKASWHRARPFVGNTQSICTEDDRSHLATS
配列番号27:
MDAHGYLEKSELPDSLQLVPPPPQDDSAALANDETVSKAMLALRGTPRWELAAQDAVLRFPAAATHFSCALGIQIDQTSTPHLVRVLERSMRDASTATSAAKARYQRPRPFMRNAQPMCTPDDDAALRKN
配列番号28:
MDHPHGYLTAENTPNAANFLPPPPAEGSLREQADIAAYRAMRSLEGSERWAIARADNEIETPGAPRAFDCALGFKFEPEQMPTLTLLMGKMLGDLEMIQTPAKKGYFRKRPFVVEPLPTCIAPETWLAAS
配列番号29:
MDTAPYLAAGQYPDGMAILPPPPALDSPGAALDMAVFRATRKLEGTPRWRIATDDVTNDPLRRNACAMGMVLDVKTAPALARLLDRAGTGPVVGRVKAAYQVPRPYLREDGPICEAKTAHLASN
配列番号30:
MDLSQSVSAHTEKSEPSSTYHFHSDPLLYLAPPPTSGSPLQAHDDQTFNSTRQLKGSTRWALATQDADLHLASVLKDYACAAGMNLDIAQLPHLANLIKRALRTEYDDIGRAKNNWNRKRPFVDTDQPICTEKDREGLGKQ
配列番号31:
MDIGINSDPQLAWSETQFVSPQQVDLARLLPPPPAMDSAEQRDEIALLLQLQKDRTPDMVAFAQADAAREVFRFTDVVGPQFTAEKLPVAAAFFKAVKENGDAILGNAKKHWDRPRPYAASSQIDPCVPKPGN
配列番号32:
MDTSATAQGGILPDSAAPDERLVLAPPPAPGSAAQSDDDRVFHVTRALKDTPRWKLAQSDADLDPAHVVRDFSCAAGFEIDLARAPHLARVLERIRHAVGHRTSDVKKYWHRTRPFVGTNLPICTSPEGLGLN
配列番号106:
MDTGPTVTDPHFKLAPGYLEPASLPVRLALLGGPPKPDSAAFARDEEARRAALALRGSAREKLAATDAELTFPAPAKSFSCALGTDINEKKTPHLYAMMQHVLTDAGGSTYAGKNAYNRTRPFVQHDEGTCRKDMEPVLRTD
配列番号107:
MEEAKPFITSQELDLTQYLPAPPADDSAQTQAELKELLQIQATRTPEQEKAAIADAQENVWRFADVMGPGFDAEKLPKTAALFERIVATEDVVDDHAKKAFNRPRPYMLDEQIHPLLKKSKS
MDALLDGYLSEAEMPDSLLLLSPPPEHNSSLFDLDLEHAKKAVESKDKERFLQAARDADLSFPFAVKSFEPILGIEISETKTPKFYVLMRRVMTDAGLSTYAAKNHYKRERPFMVNNQKTCTPDQENILYKV
配列番号109:
MDSAPSLEKDKLAAAAPKGYLSEEATPNLVAILPPPPAGHSAAEAADRAVYNAARAFQGSPRWALATDDVADGGAALLQDYACVLGQRIDQASVPDLMRLLDRARIDIARATRVAKRRYRRLRPFVGNDLPICVARTAELADS
配列番号110:
MDSSLFGYTAQAQQFTLPDGRAFLPPPPQAEEPAQQADLRAFEKTRGLKDKARWKLAQNDANLNPSHVIKDFSCAAGFNLDPEKLPAMVNLLTSLAQPVEQDVSNEKDFWKRRRPFVGTNKDICTAHSDGLDNS
LLGWSTALVLAELLPDRSTEILQRGRVFGESRIVCGVHWASDVLEGYMTGAGDIAAMHGNPAFRADLDAARTELEGLRHEAPKPNPQACTIEHDAAAHSPL
配列番号34:
AIGWTWGLILSEIAPAHRDALLARGRAFGDSRLVCNVHWQSDVIQGRMVGAAAVAALHGNPAFEKDLAAARREIEKAQAKQPTAAAAAACNAEREALKTVLPGVM
配列番号35:
ALGWAWGLVLAELAPDRADAILRRGLAYGESRAVCGVHYPSDVEAGRIVGATIVTRLKADPAFQADFAKAKEEFDAARAAATEATAACPASLARQ
配列番号36:
ANGWLEAQILAEVMPDKATAILARGRAYGESRAICGSHSKSAVEAGYMAGASVFAVLQTSPAYQRDLAAARQEAARLRTTAPRPDAQSCVAEAEALRVRP
配列番号37:
TIGWSVALILAELIPDHAANILQRGQIFGTSRIVCGAHWFSDVQAGYIMASGEIAALHGDADFRRDMELARKELEKARTSAHTPDDLLCKIEQSAR
配列番号38:
TYGTLMGIILANMVPEKAQALAARAEQYRFNREIGGVHYPSDVAAGRITGTVIAAFLFNSPEFQQQYAAARAEVRSALGLAQ
配列番号39:
TAGYGMALLLAHLMPEHASAILQRGRVFGESRIVCGAHWKSDVQAGYLNASSLMDVLLARPELQDDLAAARQELLAMQGTAPVPDAGTCAVEHDAAIHSLLSE
配列番号111:
SAAGWAWGLVLAEVQPARATELLARGLAFGQSRVVCNAHWQSDVDAGRIMGAATVAVLHDNPAFLADLAAAKREVQDATNANLKPTEDCAAERVALSLSMH
配列番号112:
STIGYLMATVLGEMVPEKRNALFARASGYAENRLVAGFHYRSDTVMSRTGAALIAQKMEEQPDFKTEFDAAKAELRAQSGLK
AVGWAWSLVLIKLFPDKQEEILKRGHDFGESRVICNAHWYSDVEMGRVMGRAAVECLCVNSAFLSDLEEVKKEMAGA
配列番号114:
SQGWAYGLIMANLMPEKATQFLVRSRLYGESRVVCGVHWLSDIEAARTGASALVAVLLADPGFRTDLERARTDLKRALSGEGAKPDPALCAREDAAARQPLL
配列番号115:
TWGWLTASILASALPDRATQIMQRGRIFGESRIVCGVHWKSDVQAGYMNGSAIFAALQEQPTFTEQMAKVRQELLALRDAKTAPDAKTCAVEQQAAQD
(VII)配列番号3〜9、13、104、105、116、117、及び119〜121のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(VIII)配列番号3〜9、13、104、105、116、117、及び119〜121のいずれかに示されるアミノ酸配列において、前記配列(1)で表わされるアミノ酸配列からなる活性中心以外の領域の1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ(VII)に示される、対応するポリペプチドと比べて同等以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド。
本発明の方法において使用されるリン酸化酵素の態様(β)として、下記(i)又は(ii)に記載されるポリペプチドからなるものが挙げられる。
(i)配列番号2で示されるアミノ酸配列を有し、グリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド、
(ii)配列番号2で示されるアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、且つ前記(i)に示されるポリペプチドと比べて同等以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド。
更に、上記(i)及び(ii)のポリペプチドは、グリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を損なわない限り、活性中心をコードするアミノ酸配列部位のC末端側に、例えば60〜120個、好ましくは70〜110個、更に好ましくは80〜100個の任意のアミノ酸配列を有するものであってもよい。上記(i)及び(ii)のポリペプチドにおいて、活性中心よりもC末端側のアミノ酸配列は、クラスAの酸性ホスファターゼにおける活性中心よりもC末端側のアミノ酸配列と同様であればよい。
(iii)配列番号2で表わされるアミノ酸配列のN末端側に、配列番号40で示すアミノ酸配列を有し、グリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド、
(iv)配列番号2で表わされるアミノ酸配列のN末端側に、配列番号40で示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、且つ(iii)に示されるポリペプチドと比べて同等以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド、
(v)配列番号2で表わされるアミノ酸配列のC末端側に、配列番号41で示されるアミノ酸配列を有し、グリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド、ならびに
(vi)配列番号2で表わされるアミノ酸配列のC末端側に、配列番号41で示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ(v)に示されるポリペプチドと比べて同等以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド。
MDTSATAQGGILPDSAA
配列番号41:
SDDDRVFHVTRALKDTPRWKLAQSDADLDPAHVVRDFSCAAGFEIDLARAPHLARVLERIRHAVGHRTSDVKKYWHRTRPFVGTNLPICTSPEGLGLNASYPSGHTTAGYGMALLLAHLMPEHASAILQRGRVFGESRIVCGAHWKSDVQAGYLNASSLMDVLLARPELQDDLAAARQELLAMQGTAPVPDAGTCAVEHDAAIHSLLSE
(vii)配列番号9、15〜17、19、22及び25のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(viii)配列番号9、15〜17、19、22及び25のいずれかに示されるアミノ酸配列において、配列番号2で示されるアミノ酸配列以外の領域の1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ前記(vii)のポリペプチドと比べて同等以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド。
上述のようなグリセロールのリン酸化反応において触媒活性を有する酵素は、例えば、これらの酵素を有している微生物の培養物から得ることができる。或いは、これらの酵素を有している微生物から目的のリン酸化酵素をコードする塩基配列を取得し、組換えタンパク質として従来公知の方法に従って調製することができる。
本発明のグリセロールをリン酸化する方法においては、グリセロール、リン酸基供与体及び前記リン酸化酵素を溶媒に添加して反応液組成物を調製し、リン酸化反応を行うことができる。あるいは、前記リン酸化酵素を産生し得る前述の微生物の培養物又は前記形質転換体の培養物を、リン酸基供与体の存在下でグリセロールに作用させることによりグリセロールのリン酸化を行ってもよい。
リン酸化酵素遺伝子の取得
下表1に示される各菌株よりゲノムDNAを調製し、各菌株に対応するプライマーを用いてリン酸化酵素遺伝子をPCR法により増幅した。
配列番号3〜7、9〜12、104及び105に関しては、得られたPCR産物を制限酵素(NcoI及びHindIII)で消化し、NcoI及びHindIIIで制限酵素処理したpET22b(+)ベクター(Novagen)とライゲーションによりこれらを連結して、リン酸化酵素発現用ベクターを得た。配列番号8に関しては、得られたPCR産物を制限酵素(BamHI及びHindIII)で消化し、BamHI及びHindIIIで制限酵素処理したpET22b(+)ベクター(Novagen)とライゲーションによりこれらを連結して、リン酸化酵素発現用ベクターを得た。なお、該ベクターには、リン酸化酵素をコードする領域の他に、更にT7プロモーター、産生されるタンパク質をペリプラズムに移行するためのpelBシグナル、タンパク質精製のためのHisタグ遺伝子、及び薬剤選択のためのアンピシリン耐性遺伝子が保持されている。上記方法により得られたベクターをヒートショック法により大腸菌BL21(DE3)株(Novagen)に形質転換した。
リン酸化酵素発現用ベクターを有する大腸菌BL21(DE3)株の形質転換体の培養は、0.2重量%グルコース、0.5重量%カザミノ酸、0.1mg/mlアンピシリンを含むLB培地(ナカライテスク(株)製:(組成)1重量%トリプトン;0.5重量%乾燥酵母エキス;0.5重量%塩化ナトリウム)中で、培養温度27℃にてインキュベートした。培養液の600nmにおける光学密度が0.5になったら、0.1mMの濃度となるようにイソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを添加し、更に培養温度27℃で16〜24時間、培養を行った。
カラム:His−Trap HP(GE healthcare製)
平衡化緩衝液:20mM Tris−HCl(pH7.5)、50mM塩化ナトリウム
溶出緩衝液:20mM Tris−HCl(pH7.5)、50mM塩化ナトリウム、1M イミダゾール
(溶出緩衝液を0〜50%のグラジエントで溶出)
流速:5.0ml/min
精製機器:AKTA prime plus(GE healthcare)
上述のようにして得られた各微生物由来のリン酸化酵素(配列番号3〜12、104及び105により示される)を用いて、グリセロールのリン酸化を行った。リン酸化反応の条件及び結果を以下に示す。
超純水にグリセロール(4M又は0.5M)、リン酸基供与体としてポリリン酸(4重量%)(商品名:ポリリン酸、ナカライテスク社製)、及びTritonX−100(0.1重量%)を添加して反応混合溶液を調製した。この時、グリセロール4Mを使用した場合はKOHで反応液をpH4.0又は5.0に調整し、グリセロール0.5Mを使用した場合はKOHで反応液をpH4.5に調整した。更に、反応混合溶液に配列番号3〜12、104及び105で示されるアミノ酸配列からなるリン酸化酵素を終濃度20μg/mlとなるよう添加した。この反応液を37℃の恒温エアーインキュベーター内で一晩反応させた。その後、反応液0.1mlを採取し、50mM PIPES緩衝液(pH7.0)にて50〜500倍に希釈した。このサンプル中におけるグリセロール−3−リン酸濃度を下記条件のグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼを用いた酵素法により検出した。
グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ10U/ml、フェリシアンカリウム2mMとなるよう50mM PIPES緩衝液(pH7.0)と混合した。この測定溶液0.9mlにリン酸化反応後の溶液を0.1ml混合し、37℃で3分間、420nmにおける吸光度の減少速度を測定した。既知濃度のグリセロール−3−リン酸を用いた際の吸光度の減少速度から標準曲線を作製し、産生されたグリセロール−3−リン酸の濃度を算出した。結果を図1に示す。図1中、(i)はグリセロール4M、pH5.0で反応させた場合、(ii)はグリセロール4M、pH4.0で反応させた場合、(iii)はグリセロール0.5M、pH4.5で反応させた場合の結果を示す。なお、コントロールとして50mM PIPES緩衝液(pH7.0)の吸光度を測定した(図中、「緩衝液」と示される)。
図1(i)より、グリセロール4M、pH5.0で反応させた場合には、配列番号3〜9、104及び105で示されるアミノ酸配列からなるリン酸化酵素を使用してグリセロールのリン酸化を行った場合、他のリン酸化酵素と比較して、リン酸化効率が顕著に高かったことが示された。また、配列番号4に示されるアミノ酸配列からなるリン酸化酵素は、これらの中でも特に高いグリセロール−3−リン酸を生成し、前記条件下でグリセロールに対して高いリン酸化作用を有していることが示された。この結果から、活性中心として前記配列(1)に示すアミノ酸配列を有しているクラスAの産生ホスファターゼは、グリセロールのリン酸化酵素として利用できることが明らかとなった。
リン酸基供与体の検討
リン酸基供与体の種類をかえて、各リン酸化酵素(配列番号3〜6及び8)によるグリセロールのリン酸化効率を検討した。リン酸基供与体としてピロリン酸ナトリウム、トリポリリン酸ナトリウム、テトラポリリン酸ナトリウム、トリポリリン酸カリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウム、又はポリリン酸を使用した。なお、ポリリン酸としてナカライテスク社製 ポリリン酸を使用した。リン酸基供与体の濃度は0.2Mとした。但し、ポリリン酸について7.5重量%とした。リン酸化酵素(配列番号3〜6又は8で示されるリン酸化酵素:各0.02mg/ml)、基質(グリセロール)濃度1M、及びリン酸基供与体を超純水に加えて反応液を調製した。なお、反応液のpHは水酸化カリウムもしくは酢酸にてpH5.0となるように調整した。また、反応は、37℃にて24時間行った。反応後、生成されたグリセロール−3−リン酸の量を、試験例1と同様の方法に従ってグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼを用いた酵素法により測定した。結果を図2に示す。
リン酸化酵素の変異体によるグリセロールのリン酸化
(3-1)活性中心近傍に変異が導入された変異体−1
(変異の導入及び形質転換体の作製)
グリセロールのリン酸化活性が認められなかった配列番号11に示すアミノ酸配列からなるリン酸化酵素に変異を導入し、変異体aを作製した。作製方法を以下に示す。
グリセロールリン酸化酵素発現用ベクターを有する大腸菌BL21(DE3)株の形質転換体の培養は、0.2重量%グルコース、0.5重量%カザミノ酸、0.1mg/mlアンピシリンを含むLB培地(ナカライテスク(株)製:(組成)1重量%トリプトン;0.5重量%乾燥酵母エキス;0.5重量%塩化ナトリウム)中で、培養温度27℃にてインキュベートした。培養液の600nmにおける光学密度が0.5になったら、0.1mMとなるようにイソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを添加し、更に培養温度27℃で16〜24時間、培養を行った。
培養後、湿菌体重量15gを150mMの塩化ナトリウムを含む20mMトリス−HCl緩衝液(pH8.0)に懸濁し、超音波ホモジナイザー(TOMY UD201)を用いて細胞抽出液を得た。この抽出液を20,000×gにて20分間遠心分離操作を行い、上清画分を回収した。60%飽和度となるよう硫酸アンモニウムを加え、20,000×gにて20分間遠心分離操作を行い、沈殿を回収した。この硫安分画後の沈殿を20mMトリス−HCl緩衝液(pH7.5)に懸濁し、50mM塩化ナトリウムを含む20mMトリス−HCl緩衝液(pH7.5)にて透析を行った。透析後、His−Trap HPカラムを用いたアフィニティー精製を行った。グリセロールリン酸化酵素を含むフラクションを回収後、20mMトリス−HCl緩衝液(pH7.5)にて透析し、グリセロールリン酸化酵素変異体を取得した。配列番号11に示すアミノ酸配列からなるリン酸化酵素と、変異体aの活性中心のアミノ酸配列を表5に示す。
アフィニティー精製の条件は次の通りである。
カラム:His−Trap HP(GE healthcare製)
平衡化緩衝液:20mM トリス−HCl(pH7.5)、50mM塩化ナトリウム
溶出緩衝液:20mM トリス−HCl(pH7.5)、50mM塩化ナトリウム、1M イミダゾール
(溶出緩衝液を0−50%のグラジエントで溶出)
流速:5.0ml/min
精製機器:AKTA prime plus(GE healthcare)
以上のようにして得られた変異体aのリン酸化酵素を用いてグリセロールのリン酸化反応を行った。超純水にグリセロール(4M)、リン酸基供与体としてポリリン酸(7.5重量%)(商品名:ポリリン酸、ナカライテスク社製)を添加して反応混合溶液を調製した。また、KOHで反応液をpH5.0に調整した。更に、反応混合溶液に変異体aのリン酸化酵素をそれぞれ終濃度50μg/mlとなるよう添加した。この反応液を37℃の恒温エアーインキュベーター内で24時間反応させた。このサンプル中におけるグリセロール−3−リン酸濃度をグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼを用いた酵素法により検出した。グリセロールのリン酸化及びグリセロール−3−リン酸の検出は試験例1と同様に行った。結果を図3に示す。
グリセロールのリン酸化活性が認められなかった配列番号11に示すアミノ酸配列からなるリン酸化酵素に変異を導入し、変異体b〜gを作製した。変異体b〜gの作製方法は、配列番号11で示されるアミノ酸配列をコードしている塩基配列(ワイルドタイプ)を大腸菌発現用としてコドンを最適化した塩基配列(配列番号128)をテンプレートとして用い、表6及び7に示すプライマーを使用したこと以外は、前記(3-1)と同様である。
配列番号12に示されるアミノ酸配列をコードするDNAをテンプレートとして配列番号9の部分配列で置換された変異体A〜Lを作製した。作製方法は、前記(3−1)に記載される変異体a〜dと同様に行い、下表9に示されるプライマーセット及びテンプレートを用いてPCR産物を得た。更に、表9中、各変異体に対応して記載される制限酵素サイトに作用する各制限酵素を用いてPCR産物を処理し、ベクターに挿入した。変異体A〜Lの構造を図5(i)及び(ii)に示す。
得られた変異体A〜Lを用いてグリセロールのリン酸化反応を行った。グリセロールのリン酸化については前記変異体a〜dの場合と同様に行い、グリセロール−3−リン酸の検出は試験例1と同様に行った。結果を図6に示す。
配列番号2はリン酸化酵素のN末端必須領域のアミノ酸配列である。
配列番号13は変異体a(F144G/A151T)のアミノ酸配列である。
配列番号14は変異体A(A143−E244)のアミノ酸配列である。
配列番号15は変異体B(M1−A143)のアミノ酸配列である。
配列番号16は変異体C(M1−P122)のアミノ酸配列である。
配列番号17は変異体D(M1−R70)のアミノ酸配列である。
配列番号18は変異体E(S126−A143)のアミノ酸配列である。
配列番号19は変異体F(P18−R70)のアミノ酸配列である。
配列番号20は変異体G(A29−R70)のアミノ酸配列である。
配列番号21は変異体H(R53−R70)のアミノ酸配列である。
配列番号22は変異体I(M1−P52)のアミノ酸配列である。
配列番号23は変異体J(M1−A25)のアミノ酸配列である。
配列番号24は変異体K(M1−A17)のアミノ酸配列である。
配列番号25は変異体L(M1−Q35)のアミノ酸配列である。
配列番号42はアミノ酸配列3で示されるリン酸化酵素に対するフォワードプライマーである。
配列番号43はアミノ酸配列3で示されるリン酸化酵素に対するリバースプライマーである。
配列番号44はアミノ酸配列4で示されるリン酸化酵素に対するフォワードプライマーである。
配列番号45はアミノ酸配列4で示されるリン酸化酵素に対するリバースプライマーである。
配列番号46はアミノ酸配列5で示されるリン酸化酵素に対するフォワードプライマーである。
配列番号47はアミノ酸配列5で示されるリン酸化酵素に対するリバースプライマーである。
配列番号48はアミノ酸配列6で示されるリン酸化酵素に対するフォワードプライマーである。
配列番号49はアミノ酸配列6で示されるリン酸化酵素に対するリバースプライマーである。
配列番号50はアミノ酸配列7で示されるリン酸化酵素に対するフォワードプライマーである。
配列番号51はアミノ酸配列7で示されるリン酸化酵素に対するリバースプライマーである。
配列番号52はアミノ酸配列8で示されるリン酸化酵素に対するフォワードプライマーである。
配列番号53はアミノ酸配列8で示されるリン酸化酵素に対するリバースプライマーである。
配列番号54はアミノ酸配列9で示されるリン酸化酵素に対するフォワードプライマーである。
配列番号55はアミノ酸配列9で示されるリン酸化酵素に対するリバースプライマーである。
配列番号56はアミノ酸配列10で示されるリン酸化酵素に対するフォワードプライマーである。
配列番号57はアミノ酸配列10で示されるリン酸化酵素に対するリバースプライマーである。
配列番号58はアミノ酸配列11で示されるリン酸化酵素に対するフォワードプライマーである。
配列番号59はアミノ酸配列11で示されるリン酸化酵素に対するリバースプライマーである。
配列番号60はアミノ酸配列12で示されるリン酸化酵素に対するフォワードプライマーである。
配列番号61はアミノ酸配列12で示されるリン酸化酵素に対するリバースプライマーである。
配列番号62はプライマー番号(1)の塩基配列である。
配列番号63はプライマー番号(2)の塩基配列である。
配列番号64はプライマー番号(3)の塩基配列である。
配列番号65はプライマー番号(4)の塩基配列である。
配列番号66はプライマー番号1の塩基配列である。
配列番号67はプライマー番号2の塩基配列である。
配列番号68はプライマー番号3の塩基配列である。
配列番号69はプライマー番号4の塩基配列である。
配列番号70はプライマー番号5の塩基配列である。
配列番号71はプライマー番号6の塩基配列である。
配列番号72はプライマー番号7の塩基配列である。
配列番号73はプライマー番号8の塩基配列である。
配列番号74はプライマー番号9の塩基配列である。
配列番号75はプライマー番号10の塩基配列である。
配列番号76はプライマー番号11の塩基配列である。
配列番号77はプライマー番号12の塩基配列である。
配列番号78はプライマー番号13の塩基配列である。
配列番号79はプライマー番号14の塩基配列である。
配列番号80はプライマー番号15の塩基配列である。
配列番号81はプライマー番号16の塩基配列である。
配列番号82はプライマー番号17の塩基配列である。
配列番号83はプライマー番号18の塩基配列である。
配列番号84はプライマー番号19の塩基配列である。
配列番号85はプライマー番号20の塩基配列である。
配列番号86はプライマー番号21の塩基配列である。
配列番号87はプライマー番号22の塩基配列である。
配列番号88はプライマー番号23の塩基配列である。
配列番号89はプライマー番号24の塩基配列である。
配列番号90はプライマー番号25の塩基配列である。
配列番号91はプライマー番号26の塩基配列である。
配列番号92はプライマー番号27の塩基配列である。
配列番号93はプライマー番号28の塩基配列である。
配列番号116は変異体b(F144A)のアミノ酸配列である。
配列番号117は変異体c(F144G)のアミノ酸配列である。
配列番号118は変異体d(A151D)のアミノ酸配列である。
配列番号119は変異体e(A151T)のアミノ酸配列である。
配列番号120は変異体f(A151S)のアミノ酸配列である。
配列番号121は変異体g(F144G/A151S)のアミノ酸配列である。
配列番号124はアミノ酸配列104で示されるリン酸化酵素に対するフォワードプライマーである。
配列番号125はアミノ酸配列104で示されるリン酸化酵素に対するリバースプライマーである。
配列番号126はアミノ酸配列105で示されるリン酸化酵素に対するフォワードプライマーである。
配列番号127はアミノ酸配列105で示されるリン酸化酵素に対するリバースプライマーである。
配列番号128は、配列番号11示されるリン酸化酵素をコードする遺伝子を大腸菌発現用としてコドンを最適化した塩基配列である。
配列番号129はプライマー番号(5)の塩基配列である。
配列番号130はプライマー番号(6)の塩基配列である。
配列番号131はプライマー番号(7)の塩基配列である。
配列番号132はプライマー番号(8)の塩基配列である。
配列番号133はプライマー番号(9)の塩基配列である。
配列番号134はプライマー番号(10)の塩基配列である。
配列番号135はプライマー番号(11)の塩基配列である。
配列番号136はプライマー番号(12)の塩基配列である。
配列番号137はプライマー番号(13)の塩基配列である。
配列番号138はプライマー番号(14)の塩基配列である。
配列番号139はプライマー番号(15)の塩基配列である。
Claims (8)
- グリセロールのリン酸化物の製造方法であって、リン酸基供与体の存在下でリン酸化酵素をグリセロールに作用させる工程を含み、
前記リン酸化酵素が、下記(VII)又は(VIII)に示されるポリペプチドからなるクラスAの酸性ホスファターゼであることを特徴とする、前記製造方法:
(VII)配列番号3〜9、13、104、105、116、117、及び119〜121のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(VIII)配列番号3〜9、13、104、105、116、117、及び119〜121のいずれかに示されるアミノ酸配列において、活性中心のアミノ酸配列以外の領域の1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ当該置換、欠失、挿入又は付加が行われていない対応するポリペプチドと比べて同等以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド。
前記活性中心のアミノ酸配列は、
配列番号3の場合は、―Gly―Ala―Tyr−Pro−Ser−Gly−His−Thr―、
配列番号4、及び7の場合は、―Gly―Ser―Tyr−Pro−Ser−Gly−His−Thr―、
配列番号5、及び121の場合は、―Gly―Ser―Tyr−Pro−Ser−Gly−His−Ser―、
配列番号6の場合は、―Gly―Asp―Tyr−Pro−Ser−Gly−His−Thr―、
配列番号8の場合は、―Ala―Ser―Tyr−Pro−Ser−Gly−His−Ser―、
配列番号9の場合は、―Ala―Ser―Tyr−Pro−Ser−Gly−His−Thr―、
配列番号13の場合は、―Gly―Ser―Tyr−Pro−Ser−Gly−His−Thr―、
配列番号104及び105の場合は、―Gly―Ser―Trp−Pro−Ser−Gly−His−Ser―、
配列番号116の場合は、―Ala―Ser―Tyr−Pro−Ser−Gly−His−Ala―、
配列番号117の場合は、―Gly―Ser―Tyr−Pro−Ser−Gly−His−Ala―、
配列番号119の場合は、―Phe―Ser―Tyr−Pro−Ser−Gly−His−Thr―、並びに
配列番号120の場合は、―Phe―Ser―Tyr−Pro−Ser−Gly−His−Ser―である。 - グリセロールのリン酸化物の製造方法であって、リン酸基供与体の存在下でリン酸化酵素をグリセロールに作用させる工程を含み、
前記リン酸化酵素が、下記(vii)又は(viii)に示されるポリペプチドからなるクラスAの酸性ホスファターゼであることを特徴とする、前記製造方法:
(vii)配列番号9、15〜17、19、22及び25のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(viii)配列番号9、15〜17、19、22及び25のいずれかに示されるアミノ酸配列において、配列番号2で示されるアミノ酸配列以外の領域の1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ当該置換、欠失、挿入又は付加が行われていない対応するポリペプチドと比べて同等以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド。 - 前記リン酸基供与体がポリリン酸である、請求項1又は2に記載の製造方法。
- 前記リン酸基供与体が、式:Hn+2PnO3n+1(nは3〜10000)で表されるポリリン酸である、請求項1〜3のいずれかに記載される製造方法。
- 前記グリセロールのリン酸化物がα−グリセロリン酸である、請求項1〜4のいずれかに記載される製造方法。
- 前記リン酸基供与体の存在下でリン酸化酵素をグリセロールに作用させる工程において、反応液のpHが4〜5である、請求項1〜5のいずれかに記載の製造方法。
- 前記リン酸基供与体の存在下でリン酸化酵素をグリセロールに作用させる工程において、リン酸化酵素1重量部当たりのグリセロールの添加量が1000〜50000重量部である、請求項1〜6のいずれかに記載の製造方法。
- 前記リン酸基供与体の存在下でリン酸化酵素をグリセロールに作用させる工程において、反応液中のリン酸基供与体の濃度が2〜10重量%である、請求項1〜7のいずれかに記載の製造方法。
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