KR20240095066A - 구아노신-5'-인산의 제조방법 - Google Patents

구아노신-5'-인산의 제조방법 Download PDF

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KR20240095066A
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다케히로 기무라
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아지노모토 가부시키가이샤
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Abstract

[과제] 겔을 해소하면서, 구아노신-5'-인산을 제조하는 방법을 제공하는 것.
[해결 수단] Na 이온 농도가 하기 식 (1)을 만족하도록,
6>Na 이온 농도[질량%]≥0.023×GMP 농도[질량%]＋1.8　(1)
(식 중, GMP는 구아닐산을 의미한다.)
NaCl, NaH2PO4, Na2HPO4, Na2CO3, Na2SO4, Na3PO4, 피로인산나트륨, 트리폴리인산나트륨 또는 이들 중 2종 이상의 조합을 첨가한 계에서,
구아노신을 효소적으로 인산화하여 구아노신-5'-인산모노나트륨을 제조하는, 구아노신-5'-인산모노나트륨의 제조방법.

Description

구아노신-5'-인산의 제조방법{METHOD FOR PRODUCING GUANOSINE-5'-PHOSPHATE}
본 발명은 구아노신-5'-인산의 제조방법에 관한 것이다. 구아노신-5'-인산은 조미료, 의약 및 이들의 원료 등으로서 유용하다.
구아노신 등의 뉴클레오시드를 효소적으로 인산화하여, 구아노신-5'-인산(구아닐산, GMP) 등의 뉴클레오시드-5'-인산에스테르를 제조하는 방법으로서, 여러 가지 방법이 알려져 있다. 그 중에서도, 부산물이 적고, 또한, 효율이 좋은 뉴클레오시드-5'-인산에스테르의 제조법으로서, 산성 포스파타제를 pH 3.0 내지 5.5의 조건 하에 뉴클레오시드 및 폴리인산(염), 페닐인산(염) 및 카바밀인산(염)으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 인산 공여체에 작용시켜 뉴클레오시드-5'-인산에스테르를 제조하는 방법이 개발되어 있다(특허문헌 1, 2). 다른 방법으로서, 뉴클레오시드 또는 이의 전구체의 결정을 물리적 처리에 의해 분쇄한 후에, 효소 촉매 하에 인산 공여체와 반응시키는 방법이 개발되어 있다(특허문헌 3).
국제공개 제96/37603호 국제공개 제01/18184호 일본 특허 제4192408호
상기 문헌의 방법에서, 인산 공여체를 나트륨염 형태로 사용하면, 구아노신-5'-인산과 같이, 이의 모노나트륨염이 높은 점성 및 예사성(曳絲性)을 갖고, 교반 혼합성이 저하되고, 반응 수율이 저하된다는 문제가 있었다. 여기서, 구아노신-5'-인산의 모노나트륨염의 반응액이 높은 점성 및 예사성을 갖는 것은, 구아노신-5'-인산이 물 안에서 Hoogsteen형 수소 결합을 통하여, 강고한 4량체 구조를 형성하고(M. Gellert, M. N. Lipsett, D. R Davies, Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 1962, 48, 2013-2018), 나트륨 이온을 통해 적층된 겔을 형성하기 때문이다(T. J. Pinnavaia, C. L. Marshall, C. M. Mettler, C. L. Fisk, H. T. Miles, E. D. Becker, J. Am. Chem. Soc., 1978, 100, 3625-3627). 이러한 겔은 뉴클레오시드 공존 하에서도 형성되는 것이 알려져 있다(Y. Yu, D. Nakamura, K. Deboyace, A. W. Neisius, L. B. McGown, J. Phys. Chem. B 2008, 112, 1130-1134). 여기서, 예사성은 물질이 갖는 실을 당기는 듯한 성질을 나타낸다.
본 발명은, 상기 관점에서 이루어진 것으로, 겔화를 억제하거나 겔을 해소하면서, 즉, 겔 형성을 저지하거나 또는 일단 형성된 겔을 슬러리상으로 하면서, 구아노신-5'-인산을 제조하는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
구아노신-5'-인산이라도, 기질로서 사용되는 인산 공여체, 예를 들면, 트리폴리인산(염), 피로인산(염) 등의 농도가 높거나 또는 반응에 의해 생기는 구아노신-5'-인산의 농도가 낮으면, 이의 나트륨염에 의한 점도의 상승은 문제가 되지 않는다(특허문헌 3). 그러나, 인산 공여체는, 상기 각 특허 방법의 비용에서 차지하는 비율이 높기 때문에, 점도를 저하시키기 위해 인산 공여체를 많이 첨가하면, 다른 뉴클레오시드-5'-인산에스테르의 제조와 비교하여 제조 비용이 높아진다. 또한, 상기 각 특허 방법에서 구아노신-5'-인산의 농도를 낮게 하면, 생산 속도가 저하된다.
그래서 본 발명자들은, 다양한 검토를 행한 결과, 인산 공여체에 더하여, 저렴한 염, 예를 들면, 염화나트륨을 첨가함으로써, 과잉으로 인산 공여체를 첨가하지 않아도, 비교적 높은 농도의 구아노신-5'-인산이라도, 겔을 해소하면서, 구아노신-5'-인산모노나트륨을 제조할 수 있는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명에 의해, 이하의 제조방법을 제공한다.
1. Na 이온 농도가 하기 식 (1)을 만족하도록,
6>Na 이온 농도[질량%]≥0.023×GMP 농도[질량%]＋1.8　(1)
(식 중, GMP는 구아닐산을 의미한다.)
NaCl, NaH2PO4, Na2HPO4, Na2CO3, Na2SO4, Na3PO4, 피로인산나트륨, 트리폴리인산나트륨 또는 이들 중 2종 이상의 조합을 첨가한 계에서,
구아노신을 효소적으로 인산화하여 구아노신-5'-인산모노나트륨을 제조하는 공정을 포함하는, 구아노신-5'-인산모노나트륨의 제조방법.
2. NaCl, NaH2PO4, Na2HPO4, Na2CO3, Na2SO4, Na3PO4, 피로인산나트륨, 트리폴리인산나트륨 또는 이들 중 2종 이상의 조합을 계에 첨가하여, Na 이온 농도가 하기 식 (1)을 만족하도록 한 계에서, 구아노신을 효소적으로 인산화하여 구아노신-5'-인산모노나트륨을 제조하는 공정을 포함하는, 구아노신-5'-인산모노나트륨의 제조방법.
6>Na 이온 농도[질량%]≥0.023×GMP 농도[질량%]＋1.8　(1)
(식 중, GMP는 구아닐산을 의미한다.)
3. 혼합 또는 교반하는 것을 추가로 포함하는, 상기 1 또는 2에 기재된 제조방법.
4. a) 상기 1 내지 3 중 어느 하나에 기재된 제조방법으로 구아노신-5'-인산모노나트륨을 제조하는 공정,
b) 얻어진 구아노신-5'-인산모노나트륨을 pH 7 내지 10의 수용액으로 되도록 하는 공정,
c) 공정 b)에서 얻어진 수용액으로부터 효소를 분리하는 공정 및
d) 공정 c)에서 효소를 분리한 수용액으로부터 구아노신-5'-인산디나트륨의 고체를 취득하는 공정을 포함하는, 구아노신-5'-인산디나트륨의 제조방법.
5. a) 상기 1 내지 3 중 어느 하나에 기재된 제조방법으로 구아노신-5'-인산모노나트륨을 제조하는 공정,
b) 얻어진 구아노신-5'-인산모노나트륨을 pH 7 내지 10의 수용액으로 조정하는 공정,
c) 공정 b)에서 얻어진 수용액으로부터 효소를 분리하는 공정,
e) 공정 c)에서 효소를 분리한 수용액에, 얻어진 구아노신-5'-인산디나트륨과 등몰량이 되도록 이노신-5'-인산을 첨가 용해하여 pH 7 내지 10으로 조정하고, 구아노신-5'-인산디나트륨 및 이노신-5'-인산디나트륨을 포함하는 수용액을 조제하는 공정 및
f) 구아노신-5'-인산디나트륨 및 이노신-5'-인산디나트륨을 포함하는 수용액으로부터, 구아노신-5'-인산디나트륨과 이노신-5'-인산디나트륨의 혼정(混晶)을 취득하는 공정을 포함하는, 구아노신-5'-인산디나트륨과 이노신-5'-인산디나트륨의 혼정의 제조방법.
본 발명에 따르면, 겔화를 억제하거나 겔을 해소하면서 구아노신-5'-인산모노나트륨, 구아노신-5'-인산디나트륨 또는 이노신-5'-인산디나트륨과 구아노신-5'-인산디나트륨의 혼정을 제조할 수 있다.
[도 1] 도 1은, 참고예(·), 비교예(▲) 및 실시예(■)에서 평가한 GMP 용액의 GMP 농도와 Na 이온 농도의 관계를 나타낸다.
[도 2] 도 2에, 겔 해소(혼합 가능)와 겔화(혼합 불가)의 외관을 나타낸다.
[도 3] 도 2에 외관을 나타낸 샘플에 대하여, 레오미터를 사용하여 측정한 저장 탄성률 및 손실 탄성률의 결과를 나타냈다. 레오미터를 사용함으로서, 외관뿐만 아니라, 동적 점탄성 거동으로 명확하게 구별이 가능하다. 즉, 혼합 가능한 샘플은, 고변형 영역(1% 내지 100%의 영역)에서 손실 탄성률이 저장 탄성률을 상회한다. 한편, 혼합 불가한 샘플은, 고변형 영역에서도 저장 탄성률이 손실 탄성률을 상회한다.
본 발명은, 특허문헌 1 등으로부터 공지된 뉴클레오시드-5'-인산에스테르의 제조방법에서, 반응계의 Na 이온 농도가 상기 식 (1)을 만족하도록 특정 나트륨염을 첨가하고, 그 계에서, 구아노신을 효소적으로 인산화하여 목적물을 얻는 방법이다. 따라서, 본 발명에서 사용할 수 있는 효소로서는, 예를 들면, 특허문헌 1에 기재된, pH 3.0 내지 5.5의 조건 하에, 소정의 인산 공여체로부터 구아노신으로의 인산기의 전이에 의해 구아노신-5'-인산을 생성하는 반응을 촉매하는 산성 포스파타제를 들 수 있다. 구체적으로는, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 미생물에 유래하는 것이 바람직하고, 모르가넬라속, 에스케리키아속, 프로비덴시아속, 엔테로박터속, 클렙시엘라속 또는 세라티아속에 속하는 세균이, 상기 효소 활성을 갖고 있으며, 이들 세균에 유래하는 효소가 있다. 이러한 세균의 대표예로서 이하와 같은 균주를 들 수 있다.
모르가넬라 모르가니(Morganella morganii) NCIMB 10466
모르가넬라 모르가니(Morganella morganii) IFO 3168
모르가넬라 모르가니(Morganella morganii) IFO 3848
에스케리키아 블라타에(Escherichia blattae) JCM 1650
에스케리키아 블라타에(Escherichia blattae) ATCC 33429
에스케리키아 블라타에(Escherichia blattae) ATCC 33430
프로비덴시아 스투아르티(Providencia stuartii) ATCC 29851
프로비덴시아 스투아르티(Providencia stuartii) ATCC 33672
엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes) IFO 12010
엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes) IFO 13534
클렙시엘라 플란티콜라(Klebsiella planticola) IFO 14939
클렙시엘라 플란티콜라(Klebsiella planticola) IAM 1133
세라티아 피카리아(Serratia ficaria) IAM 13540
세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) IAM 12143
보다 바람직하게는, 뉴클레오시드에 대한 친화성이 상승한 산성 포스파타제(특개평10-201481호 참조)를 들 수 있다. 이러한 산성 포스파타제로서 구체적으로는, 후기 비교예 1 및 실시예 1에 기재된 에스케리키아 블라타에 유래 변이형 산성 포스파타제, 엔테로박터 아에로게네스 유래 신규 변이형 산성 포스파타제 및 특개평10-201481호 공보에 기재된 각종 변이형 산성 포스파타제를 들 수 있다.
또한, 산성 포스파타제는, 본래 인산에스테르를 산성 조건 하에 가수분해하는 반응을 촉매하는 효소이며, 인산 전이 반응에 의해 생성되는 뉴클레오시드-5'-인산에스테르를 분해하는 뉴클레오티다제 활성을 갖고 있지만, 뉴클레오티다제 활성(인산에스테르 가수분해 활성)이 저하된 변이형 산성 포스파타제(WO96/37603 참조)도 본 발명에 적합하게 사용할 수 있다.
또한, 온도 안정성이 향상된 산성 포스파타제 또는 뉴클레오시드에 대한 친화성이 상승하고, 또한, 온도 안정성이 향상된 산성 포스파타제(특개평10-201481호)도 본 발명에 적합하게 사용할 수 있다.
상기 효소를, 구아노신 및 소정의 인산 공여체에 접촉 반응시킴으로써, 반응액 중에 구아노신-5'-인산을 생성할 수 있다.
반응액에 첨가하는 뉴클레오시드의 농도는 1 내지 20g/dL가 바람직하다.
본 발명에서 사용할 수 있는 인산 공여체는, 피로인산, 트리폴리인산, 폴리인산 또는 이들의 나트륨염이다. 이 중, 저렴하게 유통되고 있는 트리폴리인산이 바람직하다. 인산 공여체의 사용 농도는, 인산 수용체인 구아노신의 농도에 의해 결정된다. 통상, 구아노신의 1 내지 5배량이 바람직하다.
반응은 통상, 온도 20 내지 60℃, 바람직하게는 30 내지 40℃에서, pH 3.5 내지 6.5, 바람직하게는 pH 4.0 내지 5.0의 약산성측에서 좋은 결과를 제공한다. 반응에는 정치 또는 교반 중 어느 방법도 채용할 수 있다. 효소 반응의 반응물과 효소를 효율적으로 접촉시키기 위해서는 교반하는 것이 바람직하다. 반응 시간은, 사용하는 효소의 활성, 구아노신 농도 등의 조건에 따라 상이하지만, 전형적으로는 1 내지 100시간이다.
이와 같이 하여 생성한 구아노신-5'-인산모노나트륨을 반응 종료 혼합물로부터 채취 분리하기 위해서는, 합성 흡착 수지를 사용하는 방법이나 침전제를 사용하는 방법, 기타 통상의 채취 분리 방법을 채용할 수 있다.
인산 공여체와 그 이외의 염의 첨가량은, 다음과 같이 하여 결정할 수 있다.
공정 1: 제조 공정의 반응 현탁액에서 원하는 구아노신-5'-인산모노나트륨 농도로부터 원료가 되는 구아노신 양을 결정한다.
공정 2: 미리 성능을 파악하고 있는 효소와 원하는 효소적 인산화 반응 시간(통상 24시간 이내)으로부터 효소 첨가량을 설정한다.
공정 3: 효소 첨가량과 효소의 성능 정보로부터 원하는 구아노신-5'-인산모노나트륨 농도에 도달하기 위해 필요한 인산 공여체량을 결정한다. 이때, 효소의 성능 정보로서 필요한 인산 공여체량을 구아노신-5'-인산모노나트륨과의 몰비로 나타내도 좋다.
공정 4: 반응 현탁액 계 내의 Na 이온 농도[질량%]가 0.023×GMP 농도[질량%]+1.8 이상이 되도록, 부족분의 Na 이온을 보충하는 인산 공여체 이외의 염의 양을 결정한다.
인산 공여체로서, 피로인산나트륨, 트리폴리인산나트륨, 폴리인산나트륨 또는 이들 중 2종 이상의 조합을 사용하는 경우, Na 이온 농도[질량%]가 0.023×GMP 농도[질량%]+1.8 이상이 되도록 이들 염의 양을 결정해도 좋다(즉, 인산 공여체가 나트륨원으로서도 사용된다). 이 경우, 인산 공여체 이외의 염을 첨가할 필요는 없다. 그 중에서도, 피로인산나트륨, 트리폴리인산나트륨 또는 이들의 조합이 바람직하다.
한편, 부족분의 Na 이온을 보충하는 인산 공여체 이외의 염은, NaCl, NaH2PO4, Na2HPO4, Na2CO3, Na2SO4, Na3PO4 중 어느 하나 또는 이들 중 2종 이상의 조합이 바람직하다. 그 중에서도, 저렴하기 때문에 NaCl이 바람직하다.
나트륨원으로서는, 피로인산나트륨과 트리폴리인산나트륨의 조합 또는 피로인산나트륨과 트리폴리인산나트륨과 NaCl의 조합이 바람직하다.
공정 5: 이상과 같이 하여 결정된 양의, 구아닐산, 효소 및 인산 공여체를 포함하고, 경우에 따라 인산 공여체 이외의 염을 포함해도 좋은 반응계에서 구아노신-5'-인산모노나트륨을 생성시킨다.
보조 공정 6: 필요하다면, 반응 후에 얻어진 구아노신-5'-인산모노나트륨 양, 반응 시간, 반응에 드는 비용 계산으로부터, 최소 비용으로 원하는 양의 구아노신-5'-인산모노나트륨 양이 얻어지도록 인산 공여체량의 양을 최적화하기 위해 재실험을 반복한다.
계의 Na 이온 농도가 상기 식 (1)을 만족하는지 여부는, 계의 조성으로부터 농도를 특정하고, 계산에 의해 구할 수 있다. 구체적으로는, 구아노신-5'-인산은 1가 Na염, 인산은 1가, 피로인산은 2가, 트리폴리인산은 3가로서, 각각 완전히 괴리되어 있다고 가정하여 계의 Na 이온 농도를 계산한다.
본 발명에 의해 겔이 해소되는 이유는, 원리적으로는 이하와 같이 설명할 수 있다고 생각된다. 즉, 구아노신-5'-인산모노나트륨이 형성하는 4량체(G콰르텟)의 적층 양식은 구아노신-5'-인산모노나트륨의 인산기의 국소적인 전하의 반발에 크게 영향을 미친다. 이러한 적층 양식에 의해 겔의 마이크로 구조가 결정된다. 이온 강도가 높아지면 G콰르텟의 적층이 많아져, 봉상(棒狀) 구조체가 커진다. 더욱 높아지면 구조체가 집적되어 액정을 형성하는 것이 알려져 있다(E.J. Baldassarri, M. G. Ortore, F. Spinozzi, A. Round, C. Ferrero, P. Mariani, Nanomaterials, 2020, 10, 629). 교반 가능하게 하기 위해서는, 구조체를 집적시키는 것이 중요해진다. 계의 Na 이온 농도가 (0.023×GMP 농도[질량%]+1.8) 미만인 경우, 마이크로에서는 봉상 구조체가 서로 얽히고, 겔의 성질로서는, 저장 탄성률이 손실 탄성률을 상회하여 예사성을 나타낸다. 이러한 겔은, 예를 들면, 쓰리원 모터에 교반 날개를 달고, 10rpm 이상으로 교반하면, 교반축에 엉겨붙기 때문에 교반 불능이다. 그러나, 계의 Na 이온 농도가 (0.023×GMP 농도[질량%]+1.8) 이상인 경우, 마이크로에서는 봉상 구조체가 집적되고, 겔의 성질로서는, 손실 탄성률이 저장 탄성률을 상회하여 예사성이 소멸한다. 이에 의해, 동 조건에서 교반함으로써 슬러리상이 되어, 교반이 가능해진다. 또한, 본 문맥에서의 「교반」은, 겔이 해소되어 있는지 여부를 검증하기 위한 수단이며, 겔을 해소시키기 위한 수단이 아니다. 본 발명에 따르면, 원리적으로는 소정량의 Na 이온이 존재하면 겔의 해소에는 충분하다. 본 발명의 방법에서 교반 또는 혼합을 행해도 좋고, 이것에 의해 농도를 균일화시킬 수 있다.
여기서, 저장 탄성률과 손실 탄성률은 동적 점탄성을 나타내고, 저장 탄성률은 물체에 외력과 변형에 의해 생긴 에너지 중 물체 내부에 보존하는 성분, 손실 탄성률은 외부로 확산하는 성분이다.
어떠한 이론에도 구속되는 것은 아니지만, 상기 식 (1)에 의해 규정되는 Na 이온 농도를 만족하는 계는, 마이크로 구조에서 구조체가 집적되어 있기 때문에, 모노나트륨염의 겔화를 해소할 수 있는 것으로 생각된다.
목적물인 구아노신-5'-인산모노나트륨을 고수율로 얻기 위해서는, GMP 농도는 높은 편이 좋다. 본 발명에 의해 겔화를 해소하기 위해서는, GMP 농도에 따라 GMP의 카운터 이온인 Na 이온 농도도 높게 할 필요가 있지만, 상기한 바와 같이, 인산 공여체는 비용에서 차지하는 비율이 높기 때문에, 인산 공여체 이외의 염으로 Na 이온 농도를 높이는 것이 바람직하다. 경제적인 관점에서 특허문헌 3에 나타난 인산 공여체 등에 유래하는 Na 이온 농도인 6%보다도 낮다. 예를 들면, GMP 농도 4 내지 17질량%이고, Na 이온 농도가 1.8 내지 3.6질량%가 적합한 범위이다. 또한 GMP 농도 10 내지 16질량%, Na 이온 농도가 2.1 내지 3질량%가 보다 적합한 범위이다. 어느 경우에서도, 인산 공여체 이외의 염으로서 NaCl을 사용하면, 저렴하기 때문에 바람직하다.
효소적 인산화 반응은, 혼합 또는 교반하면서 행할 수도 있다. 혼합은, 예를 들면, 실험실에서 사용되는 범용 마그네틱 스터러와 교반자를 사용하여 행할 수 있다. 교반은, 범용 교반 장치를 사용하여, 예를 들면, 패들 믹서, 호모디스퍼, 호모지나이저 등을 사용하여 행할 수 있다. 혼합 또는 교반 속도는, 바람직하게는 10 내지 200rpm, 더욱 바람직하게는 10 내지 100rpm이다. 반응 생성물이 겔화된 경우에도, 혼합 또는 교반을 행하여 겔을 슬러리상으로 할 수 있다. 이 때의 혼합 또는 교반의 속도 및 시간은, 겔의 상태를 보면서 적절히 설정할 수 있다. 혼합 또는 교반 속도는 통상, 10 내지 200rpm, 바람직하게는 10 내지 100rpm이다. 혼합 또는 교반 시간은 인산화 반응이 계속되고 있는 동안은 끊임없이 계속할 수 있고, 통상, 3 내지 30시간, 바람직하게는 3 내지 24시간이다. 혼합 또는 교반시의 온도는, 교반열을 고려하여 설정할 수 있다. 통상, 15 내지 40℃, 바람직하게는 25 내지 40℃이다. 예를 들면, 35℃에서, 20 내지 100rpm으로 10 내지 24시간 행하는 것이 좋다. 이 때, 겔을 해소시키면서 반응을 계속하는 것이 가능한지 여부는 반응 개시 3시간 내지 6시간의 단계에서 판단할 수 있다.
이와 같이 하여 얻어진 슬러리의 pH를 알칼리성(전형적으로는, pH 7 내지 10 정도)으로 함으로써, 구아노신-5'-인산디나트륨 수용액을 얻을 수 있다. 예를 들면, 수산화나트륨을 슬러리에 첨가하고, 교반함으로써, 슬러리의 pH를 알칼리성으로 하여 용해하고, 효소를 분리한 후에, 상기 구아노신-5'-인산디나트륨 수용액을 농축하거나 또는 상기 수용액에 메탄올 등의 알코올을 첨가하는 등의 방법에 의해 디나트륨염의 고체를 얻을 수 있다. 이때, 효소를 도태한 후에 추가로 pH 11 내지 13의 강알칼리성으로 하여 수용액에 포함된 잔존하는 인산을 도태하고 나서, 상기 조작을 행해도 좋다.
또한, 예를 들면, 얻어진 슬러리를 pH 1 내지 5로 조정하여 구아노신-5'-인산을 유리 또는 모노나트륨염으로서 단리하여 모액측에 포함되는 인산을 도태한 후에, pH 7 내지 10의 수용액으로 조제하여 농축하거나 또는 상기 수용액에 메탄올 등의 알코올을 첨가하는 등의 방법에 의해 디나트륨염의 고체를 얻을 수 있다. 디나트륨염은 조미료, 의약품 등으로서 유용하다.
또한 추가로, 얻어진 슬러리를 사용하여 이노신-5'-인산디나트륨과 구아노신-5'-인산디나트륨의 혼정을 얻을 수 있다. 예를 들면, 얻어진 구아노신-5'-인산모노나트륨 슬러리를 pH 7 내지 10으로 조정하고 나서 효소를 분리한 후에, 이노신-5'-인산디나트륨을 구아노신-5'-인산디나트륨과 대략 등몰 농도가 되도록 첨가하여 용해시킨 수용액을 조제하고, 농축하여 냉각하거나 또는 알코올을 첨가하는 등의 방법에 의해, 이노신-5'-인산디나트륨과 구아노신-5'-인산디나트륨의 혼정을 얻을 수 있다. 혼정은 조미료, 의약품 등으로서 유용하다.
[실시예]
<참고예 1: 염화나트륨 첨가에 의한 구아노신-5'-인산모노나트륨의 겔의 해소>
도 1에 작은 검은 원으로 나타내는 여러가지 GMP 농도 및 NaCl 농도의 GMP 용액(또는 슬러리)을 실온 하에 조제하고, 2M 염산을 사용하여 pH를 4.5로 조정했다. 또한, pH는 유리 전극에 의해 25℃에서 측정했다. 25℃에서 마그네틱 스터러(도쿄 가라스 키카이사 제조 F-207)를 사용하여, 50ml 비이커에 상기 조정한 시료를 넣고, 길이 3cm의 교반자를 넣고, 50rpm으로 혼합했다. 30분 후의 유동성을 육안으로 평가했다. 외관을 도 2에 나타내는 바와 같이, 예사성을 나타내는 혼합 불능인 겔은 투명하고 중심부가 솟아올랐다. 한편, 겔이 해소된 시료는 불투명하고 교반자가 전체적으로 가동하여 혼합 가능했다. 본 수법에서, GMP 농도[질량%]와 Na 이온 농도[질량%]에 대하여 혼합 가능 및 불가능한 영역을 특정하면, 도 1과 같이 작도되었다. 혼합 가능한 영역은 Na 이온 농도[질량%]≥0.023×GMP 농도[질량%]+1.8로 표현할 수 있었다.
또한, 도 2에 외관을 나타낸 혼합 가능/혼합 불가 샘플의 저장 탄성률 및 손실 탄성률을, 레오미터를 사용하여 측정했다. 데이터를 나타낸다(도 3).
<비교예 1>
구아노신, 트리폴리인산나트륨 및 특허문헌 1 및 특개평10-201481호 공보에 기재된 산성 포스파타제를 첨가한 효소 반응 계에서 효소 반응을 행했다. 반응은, 참고예 1과 마찬가지로, 마그네틱 스터러 및 교반자를 사용하여 50rpm으로 혼합하면서 행했다. 여기서, 최종 GMP 농도[질량%]를 7.2, 또한 최종 Na 이온 농도[질량%]를 1.2로 했다. 이와는 별도로, 최종 GMP 농도[질량%]를 7.9, 또한 최종 Na 이온 농도[질량%]를 1.8로 하여 동일한 실험을 행했다. 모두 인산화 반응이 진행됨에 따라 생성된 GMP의 겔이 관측되어, 혼합 불능이 되었다. 이들 조성을 도 1에 ▲로 나타냈다.
<실시예 1>
구아노신, 트리폴리인산나트륨 및 특허문헌 1 및 특개평10-201481호 공보에 기재된 산성 포스파타제를 첨가한 효소 반응 계에, 겔화시키지 않기 위해서 필요한 Na 이온원을 추가로 첨가하고, 효소 반응을 2개의 조건으로 행했다. 반응은, 참고예 1과 마찬가지로, 마그네틱 스터러 및 교반자를 사용하여 50rpm으로 혼합하면서 행했다.
하나는 추가 Na 이온원으로서 NaCl을 추가하여, 최종 GMP 농도[질량%]가 14.3이고, 또한 최종 Na 이온 농도[질량%]가 2.85로 한 계에서 실시했다.
다른 하나는 추가 Na 이온원으로서 피로인산나트륨을 사용하여, 최종 GMP 농도[질량%]가 14.9이고, 또한 최종 Na 이온 농도[질량%]를 2.92로 한 계에서 동일하게 실험을 행했다.
모두 인산화 반응이 진행됨에 따라 생성된 GMP가 겔화되지 않고 슬러리 상태로서 관측되어 혼합 가능했다. 혼합 가능한 조성을 도 1에 ■로 나타냈다.
혼합 가능하게 된 조성은, (1) 식인 Na 이온 농도[질량%]>0.023×GMP 농도[질량%]+1.8을 만족했다.

Claims (5)

  1. Na 이온 농도가 하기 식 (1)을 만족하도록,
    6>Na 이온 농도[질량%]≥0.023×GMP 농도[질량%]＋1.8　(1)
    (식 중, GMP는 구아닐산을 의미한다.)
    NaCl, NaH2PO4, Na2HPO4, Na2CO3, Na2SO4, Na3PO4, 피로인산나트륨, 트리폴리인산나트륨 또는 이들 중 2종 이상의 조합을 첨가한 계에서,
    구아노신을 효소적으로 인산화하여 구아노신-5'-인산모노나트륨을 제조하는 공정을 포함하는, 구아노신-5'-인산모노나트륨의 제조방법.
  2. NaCl, NaH2PO4, Na2HPO4, Na2CO3, Na2SO4, Na3PO4, 피로인산나트륨, 트리폴리인산나트륨 또는 이들 중 2종 이상의 조합을 계에 첨가하여, Na 이온 농도가 하기 식 (1)을 만족하도록 한 계에서, 구아노신을 효소적으로 인산화하여 구아노신-5'-인산모노나트륨을 제조하는 공정을 포함하는, 구아노신-5'-인산모노나트륨의 제조방법.
    6>Na 이온 농도[질량%]≥0.023×GMP 농도[질량%]＋1.8　(1)
    (식 중, GMP는 구아닐산을 의미한다.)
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 혼합 또는 교반하는 것을 추가로 포함하는, 제조방법.
  4. a) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 제조방법으로 구아노신-5'-인산모노나트륨을 제조하는 공정,
    b) 얻어진 구아노신-5'-인산모노나트륨을 pH 7 내지 10의 수용액으로 되도록 하는 공정,
    c) 공정 b)에서 얻어진 수용액으로부터 효소를 분리하는 공정 및
    d) 공정 c)에서 효소를 분리한 수용액으로부터 구아노신-5'-인산디나트륨의 고체를 취득하는 공정을 포함하는, 구아노신-5'-인산디나트륨의 제조방법.
  5. a) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 제조방법으로 구아노신-5'-인산모노나트륨을 제조하는 공정,
    b) 얻어진 구아노신-5'-인산모노나트륨을 pH 7 내지 10의 수용액으로 조정하는 공정,
    c) 공정 b)에서 얻어진 수용액으로부터 효소를 분리하는 공정,
    e) 공정 c)에서 효소를 분리한 수용액에, 얻어진 구아노신-5'-인산모노나트륨과 등몰량이 되도록 이노신-5'-인산을 첨가 용해하여 pH 7 내지 10으로 조정하고, 구아노신-5'-인산디나트륨 및 이노신-5'-인산디나트륨을 포함하는 수용액을 조제하는 공정 및
    f) 구아노신-5'-인산디나트륨 및 이노신-5'-인산디나트륨을 포함하는 수용액으로부터, 구아노신-5'-인산디나트륨과 이노신-5'-인산디나트륨의 혼정(混晶)을 취득하는 공정을 포함하는, 구아노신-5'-인산디나트륨과 이노신-5'-인산디나트륨의 혼정의 제조방법.
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