JP6960349B2 - 2−デオキシリボース−5−リン酸エステルの製造方法 - Google Patents
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Description
[2] 前記リン酸供与体が酸性ピロリン酸ナトリウムを含む、[1]に記載の製造方法。
[3] 前記オルトリン酸塩がリン酸二水素ナトリウムを含む、[1]又は[2]に記載の製造方法。
本実施形態は、酸性ホスファターゼの存在下、2−デオキシリボースとリン酸供与体とから2−デオキシリボース−5−リン酸エステルを製造する製造方法であって、反応開始時における反応液中のオルトリン酸塩濃度が8質量%以下である製造方法である。
一般的に酸性ピロリン酸ナトリウムは、リン酸二水素ナトリウムを加熱し縮合させて製造する。その製造過程において、加熱温度及び/又は加熱時間が不足すると、リン酸二水素ナトリウムが比較的多量に残留し、一方で、加熱温度及び/又は加熱時間が過剰であると、副産物としてトリポリリン酸ナトリウム及び/又はトリメタリン酸ナトリウムが生成する。
上記の化学物質の影響を本発明者が検討したところ、反応液中のリン酸二水素ナトリウム等のオルトリン酸塩濃度が2−デオキシリボース−5−リン酸エステルの収率に影響することが分かった。一方、反応液中のトリメタリン酸ナトリウム等のトリメタリン酸塩濃度は、2−デオキシリボース−5−リン酸エステルの収率に影響しないことがわかった。なお、トリポリリン酸ナトリウム等のトリポリリン酸塩は、酸性ホスファターゼの基質、つまり2−デオキシリボース−5−リン酸エステルの合成反応のリン酸供与体となるので、反応液中に存在していても、2−デオキシリボース−5−リン酸エステルの収率を低下させることはない。
本開示において反応液中のオルトリン酸塩濃度について言及する場合、反応液中にオルトリン酸塩に該当する物質が複数種存在する場合には、特に断らない限り、反応液中に存在する当該複数種の物質の合計濃度を意味する。
本実施形態において、酸性ホスファターゼの存在下、2−デオキシリボースとリン酸供与体とから2−デオキシリボース−5−リン酸エステルを合成する場である反応液は、水を主溶媒とすることが好ましく、必要に応じてアルコール、ジメチルスルホキシド等の有機溶媒を適量添加してもよい。酸性ホスファターゼのうち、金属イオンを補因子とする酸性ホスファターゼを使用する場合は、補因子となる金属イオンを反応液中に添加する。
酸性ホスファターゼは、ホスファターゼ(EC3.1.3)のうち、至適pHが酸性側にある酵素の総称である。酸性ホスファターゼの至適pHは一般的に4.0〜6.0程度である。
2−デオキシリボースは、リボースの2位のヒドロキシ基が水素原子に置換された構造を有する。2−デオキシリボースは、本実施形態の技術分野において、その他の名称として、デオキシリボース、2−デオキシ−D−リボース、D−2−デオキシリボース等とも呼ばれる。
本実施形態におけるリン酸供与体は、酸性ホスファターゼの基質となり、2−デオキシリボースにリン酸基を与える化学物質であれば、その種類に特に制限はない。
特開2012−80875号公報の段落0235〜0286に記載されている方法に従い、Shigella flexneri由来変異型酸性ホスファターゼ遺伝子を含むプラスミドpSFAPm75を有する大腸菌を作製し、変異型酸性ホスファターゼを発現させた。この変異型酸性ホスファターゼは、Shigella flexneriの野生型酸性ホスファターゼの57番目のアミノ酸残基をスレオニン、122番目のアミノ酸残基をグリシン、126番目のアミノ酸残基をバリン、171番目のアミノ酸残基をグルタミン酸、197番目のアミノ酸残基をチロシンに置換した変異型酵素である。変異型酸性ホスファターゼを発現した大腸菌を培養し、遠心分離により回収し、培養上清にて懸濁した(菌体濃度8.3質量%)。この菌体懸濁液を−20℃にて凍結保存した。以下の実験例には、凍結保存した菌体懸濁液を解凍し、これを酸性ホスファターゼ液として用いた。
反応液中の2−デオキシリボース−5−リン酸エステルは、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により定量した。分析条件は下記のとおりである。
・カラム:Shodex Asahipak NH2P−50 4E(昭和電工株式会社)
・カラム温度:40℃
・流速:1.0mL/min
・検出器:示差屈折率検出器(RID)
・キャリア:75mmol/L リン酸二水素ナトリウム水溶液
以下の実験例で使用した酸性ピロリン酸ナトリウム試薬(「試薬A」という。)中のリン酸二水素ナトリウム及び縮合リン酸ナトリウムの含有量は、樹脂分離−バナドモリブデン酸アンモニウム法(日本化学雑誌85巻5号)により定量した。試薬Aの定量結果を表1に示す。
反応液中のオルトリン酸塩濃度の影響を調べる目的で下記の実験例1〜5を行った。以下において、「dR」とは、2−デオキシ−D−リボースを意味し、「dR5P」とは、2−デオキシリボース−5−リン酸エステルを意味する。
100mL丸底フラスコにdR試薬(Biosynth社品)3.9g(0.029モル)と水26gを入れたのち、フラスコを冷却した水浴に入れ、三日月翼で攪拌してdRを水に溶解させた。dR溶解液に試薬A 8.11g(酸性ピロリン酸ナトリウム 0.035モル)を入れ、4℃で約30分間攪拌した。液のpHを確認したところ3.7であった。次いで、2N−水酸化ナトリウム水溶液(和光純薬工業社品)で液のpHを4.5に調整し、菌体濃度8.3質量%の酸性ホスファターゼ液1.4g(換算活性量32ユニット/dR1g)を入れ、水を足して反応液の全量を41gに調製し、反応を開始した。反応期間は22時間とし、反応期間中、反応液の温度を4℃±1℃の範囲内に維持した。反応期間中、三日月翼にて反応液をゆっくり攪拌した。
100mL丸底フラスコにdR試薬(Biosynth社品)3.9g(0.029モル)と水26gを入れたのち、フラスコを冷却した水浴に入れ、三日月翼で攪拌してdRを水に溶解させた。dR溶解液に試薬A 8.11g(酸性ピロリン酸ナトリウム 0.035モル)とリン酸二水素ナトリウム試薬(無水物、和光純薬工業社品)0.231g(総リン酸塩量に対するリン酸二水素ナトリウム量が5質量%になる量)とを入れ、4℃で約30分間攪拌した。液のpHを確認したところ3.6であった。次いで、2N−水酸化ナトリウム水溶液(和光純薬工業社品)で液のpHを4.5に調整し、菌体濃度8.3質量%の酸性ホスファターゼ液1.4g(換算活性量32ユニット/dR1g)を入れ、水を足して反応液の全量を41gに調製し、反応を開始した。反応期間は22時間とし、反応期間中、反応液の温度を4℃±1℃の範囲内に維持した。反応期間中、三日月翼にて反応液をゆっくり攪拌した。
総リン酸塩量に対するリン酸二水素ナトリウム量が10質量%、20質量%又は30質量%になるようにリン酸二水素ナトリウムの添加量を変更し、反応液の全量が41gになるように水の量を加減した以外は、実験例2と同様にして反応を行った。
反応液中のトリメタリン酸塩濃度の影響を調べる目的で下記の実験例6〜7を行った。
100mL丸底フラスコにdR試薬(Biosynth社品)3.9g(0.029モル)と水26gを入れたのち、フラスコを冷却した水浴に入れ、三日月翼で攪拌してdRを水に溶解させた。dR溶解液に試薬A 8.11g(酸性ピロリン酸ナトリウム 0.035モル)とトリメタリン酸ナトリウム試薬(Combi−Blocks社品)0.293g(総リン酸塩量に対するトリメタリン酸ナトリウム量が5質量%になる量)とを入れ、4℃で約30分間攪拌した。液のpHを確認したところ3.6であった。次いで、2N−水酸化ナトリウム水溶液(和光純薬工業社品)で液のpHを4.5に調整し、菌体濃度8.3質量%の酸性ホスファターゼ液1.4g(換算活性量32ユニット/dR1g)を入れ、水を足して反応液の全量を41gに調製し、反応を開始した。反応期間は22時間とし、反応期間中、反応液の温度を4℃±1℃の範囲内に維持した。反応期間中、三日月翼にて反応液をゆっくり攪拌した。
総リン酸塩量に対するトリメタリン酸ナトリウム量が10質量%になるようにトリメタリン酸ナトリウムの添加量を変更し、反応液の全量が41gになるように水の量を加減した以外は、実験例6と同様にして反応を行った。
Claims (3)
- 酸性ホスファターゼの存在下、2−デオキシリボースとリン酸供与体とから2−デオキシリボース−5−リン酸エステルを製造する製造方法であって、
反応開始時における反応液中のオルトリン酸塩濃度が5質量%以下である、2−デオキシリボース−5−リン酸エステルの製造方法。 - 前記リン酸供与体が酸性ピロリン酸ナトリウムを含む、請求項1に記載の製造方法。
- 前記オルトリン酸塩がリン酸二水素ナトリウムを含む、請求項1又は請求項2に記載の製造方法。
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