CN116083509A - 提高多黏菌素b发酵产物中多黏菌素b2含量的补料方法 - Google Patents

提高多黏菌素b发酵产物中多黏菌素b2含量的补料方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物发酵技术领域，特别涉及一种提高多黏菌素B发酵产物中多黏菌素B2含量的补料方法，在补料分批发酵的发酵方式下，在发酵培养至少12h后将缬氨酸溶液以间歇补料的方式补加到发酵液中。本发明所提供的补料方法可有效提高多黏菌素B发酵产物中多黏菌素B2的含量至0.7g/L以上，纯度达23％以上。

Description

提高多黏菌素B发酵产物中多黏菌素B2含量的补料方法
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，特别涉及一种提高多黏菌素B发酵产物中多黏菌素B2含量的补料方法。
背景技术
多黏菌素B是一种由多黏类芽孢杆菌产生的环肽类抗生素，除变形杆菌外，几乎对所有革兰阴性杆菌均有抗菌作用。其作用机制是破坏细菌细胞的完整性，导致细胞膜的通透性增加，细胞内成分外漏从而达到杀菌的目的。临床主要用于铜绿假单胞菌及其他假单胞菌引起的创面、尿路以及眼、耳、气管等部位感染，也可用于败血症、腹膜炎等。
随着抗生素的广泛应用，革兰氏阴性菌的耐药性问题突出，多黏菌素B被认为是治疗革兰氏阴性菌引起感染的最后一道防线。
多黏菌素B是一种多组分物质，包括B1、B2、B3和B1-1。结构式如下通式(1)和表1所示：
Figure BDA0004036318930000011
表1
Polymyxin R R’ X Y
B1 <![CDATA[-CH<sub>2</sub>CH<sub>3</sub>]]> <![CDATA[-CH<sub>3</sub>]]> -H <![CDATA[-CH<sub>3</sub>]]>
B2 <![CDATA[-CH<sub>3</sub>]]> <![CDATA[-CH<sub>3</sub>]]> -H <![CDATA[-CH<sub>3</sub>]]>
B3 <![CDATA[-CH<sub>2</sub>CH<sub>3</sub>]]> -H -H <![CDATA[-CH<sub>3</sub>]]>
B1-1 <![CDATA[-CH<sub>2</sub>CH<sub>3</sub>]]> <![CDATA[-CH<sub>3</sub>]]> <![CDATA[-CH<sub>3</sub>]]> -H
现有文献对多黏菌素B2的相关研究较少，而国内外对多黏菌素的组分有相关的质量要求，USP/EP药典有明确规定：多黏菌素B含量≥80％，最大单杂≤3.0％、总杂≤17％、B3≤6.0％、B1-1≤15％，各组分在一定程度上影响药品的质量和效果。因此，获得高含量的多黏菌素B2对提高多黏菌素B含量，提升产品质量具有重大的意义。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是：提供一种可提高多黏菌素B发酵产物中多黏菌素B2含量的补料方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种提高多黏菌素B发酵产物中多黏菌素B2含量的补料方法，在补料分批发酵的发酵方式下，在发酵培养至少12h后将缬氨酸溶液以间歇补料的方式补加到发酵液中。
本发明的有益效果在于：多黏菌素B2是由带环十肽和支链脂肪酸通过肽键相连的化合物。本发明在发酵过程中将缬氨酸以补料的形式间歇加入到发酵液中，由于缬氨酸是支链脂肪酸合成的前体之一，在生物体内，缬氨酸通过酶催化生成异丁基辅酶A，进而参与支链脂肪酸的合成途径中，因此在下述实验中已经充分证明，通过加入适量的缬氨酸至发酵液中可有效提高生物体内支链脂肪酸的含量，从而使得生物体发酵液中多黏菌素B2的含量提高至0.7g/L以上，纯度达23％以上。
附图说明
图1所示为本发明实施例1发酵液的高效液相色谱图；
图2所示为本发明对比例1发酵液的高效液相色谱图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式予以说明。
一种提高多黏菌素B发酵产物中多黏菌素B2含量的补料方法，在补料分批发酵的发酵方式下，在发酵培养至少12h后将缬氨酸溶液以间歇补料的方式补加到发酵液中。
由于缬氨酸是支链脂肪酸合成的前体之一，在生物体内，缬氨酸通过酶催化生成异丁基辅酶A，进而参与支链脂肪酸的合成途径中，因此在下述实验中已经充分证明，通过加入适量的缬氨酸至发酵液中可有效提高生物体内支链脂肪酸的含量。
其中，所述缬氨酸溶液的浓度为2～7wt％，优选为5wt％。所述缬氨酸溶液的添加量为0.1～0.3v/v％，优选为0.2v/v％。
为了避免补料在配制过程中染菌，最终导致发酵液污染，优选对补料，即缬氨酸溶液进行预先灭菌处理。所述灭菌处理优选为高压湿热灭菌。在一种实施方式中，所述高压湿热灭菌在灭菌温度121℃，灭菌时间30min条件下进行。
在一种实施方式中，所述缬氨酸溶液在发酵培养12h时以一次性补料的方式补加入发酵液中。
在一种实施方式中，所述发酵液中的发酵菌种为多黏类芽孢杆菌(P.polymyxa)。
具体地，所述补料方法包括如下步骤：
S1、将发酵菌种在种子培养下培养至种子成熟，获得成熟的种子液；
S2、将所述成熟的种子液进行发酵培养，发酵培养至少12h后将所述缬氨酸溶液加入发酵液，发酵38～44h后结束发酵。
在一种实施方式中，所述种子培养为：配制种子培养基，控制罐温28～30℃、罐压0.03～0.05MPa、搅拌速率150～200rpm、通气比0.7～1.0vvm，接入发酵菌种后培养10～13h，种子液pH下降至6.0～6.2，镜检发酵菌种菌丝分布均匀，获得成熟的种子液。
在一种实施方式中，所述种子培养基包括如下质量百分比的组分：
面粉8～9％、酵母浸粉0.2～0.3％、磷酸氢二钾0.013～0.016％、碳酸钙0.3～0.4％、硫酸铵0.40～0.50％、消泡剂0.04～0.06％，余量为水。优选地，所述种子培养基由如下质量百分比的组分制备得到：面粉8％、酵母浸粉0.3％、磷酸氢二钾0.015％、碳酸钙0.3％、硫酸铵0.45％、消泡剂0.04％，余量为水。
在一种实施方式中，所述发酵培养为：配制发酵培养基，控制罐温28～30℃、罐压0.03～0.05MPa、搅拌速率150～600rpm、通气比0.7～1.5vvm，溶氧值≥40％。
在一种实施方式中，所述发酵培养基包括如下质量百分比的组分：
面粉10～11％、棉籽精粉0.7～0.9％、磷酸氢二钾0.013～0.016％、碳酸钙0.3～0.4％、硫酸铵0.4～0.50％、消泡剂0.03～0.06％，余量为水。优选地，所述发酵培养基由如下质量百分比的组分制备得到：面粉10％、棉籽精粉0.8％、磷酸氢二钾0.015％、碳酸钙0.3％、硫酸铵0.45％、消泡剂0.03％，余量为水。
在一种实施方式中，所述成熟的种子液的接种量为7.5～15v/v％。
实施例1
一种提高多黏菌素B发酵产物中多黏菌素B2含量的补料方法，包括如下步骤：
S1、种子培养：配制种子培养基，控制罐温29℃，罐压0.04MPa，搅拌150～200pm，通气比0.7～1.0vvm，接入产多黏菌素B的多黏类芽孢杆菌进行培养，控制种子罐上的溶氧值(DO)≥40％，培养周期10～13h，pH下降至6.0～6.2，镜检菌丝分布均匀视为种子成熟，获得成熟的多黏菌素B种子液。
所用种子培养基由如下质量百分比的原料混合制备得到：面粉(食品级精面粉，购于益海嘉里粮油食品工业有限公司，下同)8％，酵母浸粉(购于北京鸿润宝顺科技有限公司，下同)0.3％，磷酸氢二钾0.015％，碳酸钙0.3％，硫酸铵0.45％，消泡剂(GPE，购于江苏利宏科技发展有限公司，下同)0.04％，余量为水。
S2、将所述成熟的多黏菌素B种子液按15(V/V)％接种量接种到含有发酵培养基的发酵罐中培养，控制罐温29℃，罐压0.04MPa，搅拌150～600rpm，通气比0.7～1.5vvm，控制发酵罐上的溶氧值(DO)≥40％。
所述发酵培养基由如下质量百分比的原料混合制备得到：面粉10％，棉籽精粉(购于江苏玖瑞科技有限公司，下同)0.8％，磷酸氢二钾0.015％，碳酸钙0.3％，硫酸铵0.45％，消泡剂0.03％，余量为水。
S3、当发酵培养12h时，向发酵液中一次性补入质量浓度为5％缬氨酸溶液，补入缬氨酸溶液的量为0.2(V/V)％。发酵42h后结束发酵，收集发酵液。
经检测(如图1，具体测试方法参见中国药典硫酸多黏菌素B高效液相色谱法)，发酵液中多黏菌素B2的平均含量为0.755g/L，纯度24.2％。
实施例2
一种提高多黏菌素B发酵产物中多黏菌素B2含量的补料方法，包括如下步骤：
S1、种子培养：配制种子培养基，控制罐温29℃，罐压0.04MPa，搅拌150～200rpm，通气比0.7～1.0vvm，接入产多黏菌素B的多黏类芽孢杆菌进行培养，控制种子罐上的溶氧值(DO)≥40％，培养周期10～13h，pH下降至6.0～6.2，镜检菌丝分布均匀视为种子成熟，获得成熟的多黏菌素B种子液。
所用种子培养基由如下质量百分比的原料混合制备得到：面粉8％，酵母浸粉0.3％，磷酸氢二钾0.015％，碳酸钙0.3％，硫酸铵0.45％，消泡剂0.04％，余量为水。
S2、将成熟的多黏菌素B种子液按15(V/V)％接种量接种到含有发酵培养基的发酵罐中培养，控制罐温29℃，罐压0.04MPa，搅拌150～600rpm，通气比0.7～1.5vvm，控制发酵罐上的溶氧值(DO)≥40％。
所述发酵培养基由如下质量百分比的原料混合制备得到：面粉10％，棉籽精粉0.8％，磷酸氢二钾0.015％，碳酸钙0.3％，硫酸铵0.45％，消泡剂0.03％，余量为水。
S3、当发酵培养12h时，向发酵液中一次性补入质量浓度为5％缬氨酸溶液，补入缬氨酸溶液的量为0.2(V/V)％。发酵42h后结束发酵，收集发酵液。
经检测，发酵液中多黏菌素B2的平均含量为0.727g/L，纯度23.5％。
实施例3
一种提高多黏菌素B发酵产物中多黏菌素B2含量的补料方法，包括如下步骤：
S1、种子培养：配制种子培养基，控制罐温29℃，罐压0.04MPa，搅拌150～200rpm，通气比0.7～1.0vvm，接入产多黏菌素B的多黏类芽孢杆菌进行培养，控制种子罐上的溶氧值(DO)≥40％，培养周期10～13h，pH下降至6.0～6.2，镜检菌丝分布均匀视为种子成熟，获得成熟的多黏菌素B种子液。
所用种子培养基由如下质量百分比的原料混合制备得到：面粉8％，酵母浸粉0.3％，磷酸氢二钾0.015％，碳酸钙0.3％，硫酸铵0.45％，消泡剂0.04％，余量为水。
S2、将成熟的多黏菌素B种子液按15(V/V)％接种量接种到含有发酵培养基的发酵罐中培养，控制罐温29℃，罐压0.04MPa，搅拌150～600rpm，通气比0.7～1.5vvm，控制发酵罐上的溶氧值(DO)≥40％。
所述发酵培养由如下质量百分比的原料混合制备得到：面粉10％，棉籽精粉0.8％，磷酸氢二钾0.015％，碳酸钙0.3％，硫酸铵0.45％，消泡剂0.03％，余量为水。
S3、当发酵培养12h时，向发酵液中一次性补入质量浓度为5％缬氨酸溶液，补入缬氨酸溶液的量为0.2(V/V)％。发酵42h后结束发酵。
经检测，发酵液中多黏菌素B2的平均含量为0.742g/L，纯度23.8％。
对比例1
一种提高多黏菌素B发酵产物中多黏菌素B2含量的补料方法，与实施例1的区别在于：当发酵培养12h时，用等体积水替代缬氨酸溶液进行补料。经检测(参见图2)，发酵液中多黏菌素B2的平均含量为0.387g/L，纯度13.6％。
需要说明，实施例1至3实质上为同一生产条件的三次重复试验，各参数在发酵过程中均在前述范围值内浮动。比如在发酵过程中通过对搅拌速率和通气比的控制以保持发酵罐上的溶氧值(DO)≥40％。
实验例
设置对照组和实验组1～5，其中实验组1～5按实施例1的方法进行发酵，对照组按对比例1的方法进行发酵。具体结果如表2所示：
表2
项目 多黏菌素B2平均含量(g/L) 多黏菌素B2平均纯度(％)
对照组 0.412 14.6
实验组1 0.746 24.2
实验组2 0.805 25.4
实验组3 0.775 24.8
实验组4 0.734 23.7
实验组5 0.729 23.5
从表1中可以看出，通过在发酵过程中补加缬氨酸可显著提高发酵液中多黏菌素B2的含量。
综上所述，多黏菌素B2是由带环十肽和支链脂肪酸通过肽键相连的化合物。本发明在发酵过程中将缬氨酸以补料的形式间歇加入到发酵液中，由于缬氨酸是支链脂肪酸合成的前体之一，在生物体内，缬氨酸通过酶催化生成异丁基辅酶A，进而参与支链脂肪酸的合成途径中，因此在下述实验中已经充分证明，通过加入适量的缬氨酸至发酵液中可有效提高生物体内支链脂肪酸的含量，从而使得生物体发酵液中多黏菌素B2的含量提高至0.7g/L以上，纯度达23％以上。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种提高多黏菌素B发酵产物中多黏菌素B2含量的补料方法，其特征在于，在补料分批发酵的发酵方式下，在发酵培养至少12h后将缬氨酸溶液以间歇补料的方式补加到发酵液中。
2.根据权利要求1所述补料方法，其特征在于，所述缬氨酸溶液的浓度为2～7wt％。
3.根据权利要求2所述补料方法，其特征在于，所述缬氨酸溶液的添加量为0.1～0.3v/v％。
4.根据权利要求1所述补料方法，其特征在于，所述发酵的发酵菌种为多黏类芽孢杆菌。
5.根据权利要求1所述补料方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将发酵菌种在种子培养下培养至种子成熟，获得成熟的种子液；
S2、将所述成熟的种子液进行发酵培养，发酵培养至少12h后将所述缬氨酸溶液加入发酵液，发酵38～44h后结束发酵。
6.根据权利要求5所述补料方法，其特征在于，所述种子培养为：配制种子培养基，控制罐温28～30℃、罐压0.03～0.05MPa、搅拌速率150～200rpm、通气比0.7～1.0vvm，接入发酵菌种后培养10～13h，种子液pH下降至6.0～6.2，镜检发酵菌种菌丝分布均匀，获得成熟的种子液。
7.根据权利要求6所述补料方法，其特征在于，所述种子培养基包括如下质量百分比的组分：
面粉8～9％、酵母浸粉0.2～0.3％、磷酸氢二钾0.013～0.016％、碳酸钙0.3～0.4％、硫酸铵0.40～0.50％、消泡剂0.04～0.06％，余量为水。
8.根据权利要求5所述补料方法，其特征在于，所述发酵培养为：配制发酵培养基，控制罐温28～30℃、罐压0.03～0.05MPa、搅拌速率150～600rpm、通气比0.7～1.5vvm，溶氧值≥40％。
9.根据权利要求8所述补料方法，其特征在于，所述发酵培养基包括如下质量百分比的组分：
面粉10～11％、棉籽精粉0.7～0.9％、磷酸氢二钾0.013～0.016％、碳酸钙0.3～0.4％、硫酸铵0.4～0.50％、消泡剂0.03～0.06％，余量为水。
10.根据权利要求5所述补料方法，其特征在于，所述成熟的种子液的接种量为7.5～15v/v％。
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