CH642681A5 - METHOD FOR PRODUCING NEW POLYSACCHARIDES WITH ANTI-CARCINOGENIC EFFECT. - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung neuer Polysaccharide mit antikarzinogener Wirkung, wobei ein Stamm eines Mikroorganismus, welcher ein antikarzinogenes Polysaccharid zu erzeugen vermag und der Gattung Polyporus aus der Klasse Basidiomycetes angehört, verwendet wird. The present invention relates to a process for the preparation of new polysaccharides with an anticarcinogenic effect, using a strain of a microorganism which is capable of producing an anticarcinogenic polysaccharide and which belongs to the genus Polyporus from the class Basidiomycetes.
Erfindungsgemäss kann man einen beliebigen Stamm einer solchen Art verwenden, welche der Gattung Polyporus aus der Klasse Basidiomycetes angehört und ein antikarzinogenes Polysaccharid zu erzeugen vermag. According to the invention, any strain of such a type can be used, which belongs to the genus Polyporus from the class Basidiomycetes and is capable of producing an anticarcinogenic polysaccharide.
Zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung wurde bei den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ein Stamm von Polyporus tuberaster (Fr.) verwendet, welcher dadurch erhalten worden ist, dass man einen Fruchtkörper (Organ oder Gewebe) einer Pilzart züchtete, welche im National Park «Izumidake», Miyagi Prefecture, Japan, im Herbst 1973 gesammelt worden ist. Die Identifizierung dieser Art wurde mit den folgenden Büchern vorgenommen: «Coloured Illustrations of Fungi of Japan», herausgegeben durch Rokuya Imazeki und Tsugio Hongo (publiziert durch Hoiku-Sha, Osaka, Japan) 1965; «Mycological flora of Japan», Herausgeber Seiya Ito (publiziert durch Yoken-Do, Tokyo, Japan), Bd. 2, Nr. 4, 1955; und Canadian Journal of Botany 29, 147-157, 1951. In order to explain the present invention, a strain of Polyporus tuberaster (Fr.) was used in the embodiments of the present invention, which was obtained by cultivating a fruiting body (organ or tissue) of a fungus species which is found in the National Park "Izumidake", Miyagi Prefecture, Japan, was collected in the fall of 1973. This species was identified with the following books: "Colored Illustrations of Fungi of Japan", published by Rokuya Imazeki and Tsugio Hongo (published by Hoiku-Sha, Osaka, Japan) in 1965; "Mycological flora of Japan", published by Seiya Ito (published by Yoken-Do, Tokyo, Japan), Vol. 2, No. 4, 1955; and Canadian Journal of Botany 29, 147-157, 1951.
Die Eigenschaften dieses Stammes sind die folgenden. Der Fruchtkörper besitzt einen Durchmesser von ungefähr 5,08 bis 15,24 cm (2 bis 6 inches) und eine ungefähr gleich grosse Höhe. Die Kappe des Fruchtkörpers ist zuerst hemisphärisch, ergibt aber bald eine Struktur, welche auf der oberen Seite schwach gebogen und an ihrer unteren Seite im wesentlichen flach ist. Diese Kappe ist hellbraun oder cha-moisfarbig und haftet durch gedrungene Stiele am Sclerotium (aus welchem der gesamte Fruchtkörper wächst). Die Kappe ist weich und käseähnlich in der Textur und beim Reifwerden mit feinen chamoisfarbenen Schuppen bedeckt. Auf der unteren Seite der Kappe befindet sich eine Schicht von Röhrchen, wobei die dem Stielende des Pilzes nahegelegenen Röhrchen kürzer und flacher sind. Das Sclerotium dieses Stammes ist nicht sphärisch oder oval, sondern in seiner Form abgeflacht. Die Sporen sind farblos (erscheinen aber in der Masse als weiss), oval und glatt, und deren Grösse liegt bei 1,2-4 p.. The characteristics of this strain are as follows. The fruiting body is approximately 5.08 to 15.24 cm (2 to 6 inches) in diameter and approximately the same height. The cap of the fruiting body is hemispherical at first, but soon results in a structure that is slightly curved on the upper side and essentially flat on its lower side. This cap is light brown or cha-mois colored and sticks to the sclerotium (from which the entire fruiting body grows) through stubby stems. The cap is soft and cheese-like in texture and covered with fine chamois-colored scales when it ripens. There is a layer of tubes on the lower side of the cap, the tubes near the stalk end of the mushroom being shorter and flatter. The sclerotium of this stem is not spherical or oval, but is flattened in shape. The spores are colorless (but appear massively as white), oval and smooth, and their size is 1.2-4 p ..
Aufgrund dieser charakteristischen Merkmale und unter Bezugnahme auf die obenerwähnten Literaturstellen wurde dieser Stamm mit Polyporus tuberaster (Fr.) identifiziert. Dieser Stamm ist am 30. August 1978 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industriai Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, 1-3, Higashi 1-chome, Yatabe-machi Tsubuka-gun, Ibaraki-ken 305 Japan, unter der Nr. FERM-P 4641 und am 9. Juli 1979 bei American Type Culture Collection, 12301 Parklaw Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, unter der Nr. ATCC 20544 hinterlegt worden. Based on these characteristic features and with reference to the literature references mentioned above, this strain was identified as Polyporus tuberaster (Fr.). This strain is on August 30, 1978 at the Fermentation Research Institute, Agency of Industriai Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, 1-3, Higashi 1-chome, Yatabe-machi Tsubuka-gun, Ibaraki-ken 305 Japan No. FERM-P 4641 and deposited on July 9, 1979 at American Type Culture Collection, 12301 Parklaw Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, under No. ATCC 20544.
Das erfindungsgemässe Verfahren besteht darin, dass man aus einem wässrigen Extrakt eines Fruchtkörpers und/oder eines Mycels eines Stammes, der ein antikarzinogenes Polysaccharid zu erzeugen vermag und zur Gattung Polyporus aus der Klasse der Basidiomycetes gehört, oder aus der filtrierten Brühe eines flüssigen Kulturmediums, in dem der besagte Stamm inkubiert worden ist, das Polysaccharid isoliert. The process according to the invention consists in that an aqueous extract of a fruiting body and / or a mycelium of a strain, which is capable of producing an anticarcinogenic polysaccharide and belongs to the genus Polyporus from the class of the Basidiomycetes, or from the filtered broth of a liquid culture medium, in to which the said strain has been incubated isolates the polysaccharide.
Das Sammeln eines solchen Fruchtkörpers in ausreichend grosser Menge ist in der Natur nicht leicht. Daher ist es von Vorteil, den Stamm zu impfen, um eine grosse Menge an Fruchtkörpern zu erhalten. Die Inkubation kann in der für die Inkubation von Pilzen der Klasse Basidiomycetes geeigneten Medien, z.B. auf Holzmehl oder Sägemehl, durchgeführt werden. So kann man beispielsweise 200 g Sägemehl, 100 g Reiskleie und 300 ml Wasser gründlich miteinander vermischen, um zu einem Kulturmedium zu gelangen, das man dann in einen geeigneten Behälter einfüllt und sterilisiert. Der getrennt davon in einem Schrägkulturmedium gezüchtete Stamm wird auf dem nach den obigen Angaben erhaltenen Kulturmedium in bekannter Weise bei 25 bis 27 ° C während ungefähr 1 Monat bis zum ausreichenden Wachstum des Mycéliums inkubiert. Das Kulturmedium wird hierauf mit Erde oder Sand bedeckt und während 1 oder 2 Monaten stehen gelassen, so dass der Fruchtkörper darauf wachsen kann. Der so gewachsene Fruchtkörper wird gesammelt und als Ausgangsmaterial für die vorliegende Erfindung verwendet. Collecting such a fruiting body in a sufficiently large amount is not easy in nature. It is therefore advantageous to vaccinate the stem to get a large amount of fruiting bodies. The incubation can be carried out in the media suitable for the incubation of fungi of the Basidiomycetes class, e.g. on wood flour or sawdust. For example, 200 g of sawdust, 100 g of rice bran and 300 ml of water can be mixed thoroughly to obtain a culture medium, which is then filled into a suitable container and sterilized. The strain grown separately in a slant culture medium is incubated on the culture medium obtained according to the above information in a known manner at 25 to 27 ° C. for about 1 month until the mycelium grows sufficiently. The culture medium is then covered with earth or sand and left to stand for 1 or 2 months so that the fruiting body can grow on it. The fruiting body thus grown is collected and used as the starting material for the present invention.
Das für die vorliegende Erfindung verwendbare Mycélium kann nach üblichen Züchtungsmethoden, z.B. als feste Kultur oder als flüssige Kultur, erhalten werden. Handelt es sich um eine feste Kultur, so kann sie beispielsweise ein Agar-, Gelatine-, Stärke-, Holzmehl-, Pulpe- oder ein anderes übliches festes Kulturmedium oder eine Kombination davon sein. Als flüssige Kultur kommt ein solches flüssiges Kulturmedium in Frage, welches verschiedene Nährstoffe enthält, wie sie für die Züchtung von Mikroorganismen bestens bekannt sind. So kann das flüssige Züchtungsmedium, eine Kohlenstoffquelle, z.B. Glucose, Maltose, Lactose, Saccharose, Stärke, Molassen usw., eine Stickstoffquelle organischer oder anorganischer Natur, z.B. Pepton, Hefe, Hefeextrakt, Maiskornflüssigkeit, Harnstoff, Ammoniumsalze usw., und ein oder mehrere organische und/oder anorganische Salze, wie z.B. Phosphate, Magnesiumsalze usw., enthalten. Gewünschtenfalls können auch andere für das Wachstum erforderliche Materialien, wie z.B. Vitamine, hinzugegeben werden. Diese für feste und flüssige Kulturmedien einzusetzenden Materialien sind an sich für die Züchtung von Pilzen durchweg bekannt, so dass diesbezüglich keine nähere Erläuterung an dieser Stelle erforderlich ist. Die Züchtung in flüssigem Medium kann in üblicher Weise, z.B. als ortsfeste Kultur, Schüttelkultur oder submerse Kultur, durchgeführt werden. Aus wirtschaftlichen und sonstigen Gründen ist eine flüssige Kultur und insbesondere die submerse Kultur günstiger als eine feste Kultur. The mycelium which can be used for the present invention can be grown by conventional breeding methods, e.g. as a solid culture or as a liquid culture. If it is a solid culture, it can be, for example, an agar, gelatin, starch, wood flour, pulp or another conventional solid culture medium or a combination thereof. Such a liquid culture medium, which contains various nutrients as are best known for the cultivation of microorganisms, is suitable as a liquid culture. Thus the liquid growth medium, a carbon source e.g. Glucose, maltose, lactose, sucrose, starch, molasses etc., a nitrogen source of organic or inorganic nature, e.g. Peptone, yeast, yeast extract, corn grain liquid, urea, ammonium salts, etc., and one or more organic and / or inorganic salts such as e.g. Phosphates, magnesium salts, etc. contain. If desired, other growth materials such as e.g. Vitamins to be added. These materials, which are to be used for solid and liquid culture media, are generally known per se for the cultivation of mushrooms, so that no further explanation is required here in this regard. Cultivation in liquid medium can be carried out in a conventional manner, e.g. as a fixed culture, shake culture or submerged culture. For economic and other reasons, a liquid culture and especially the submerged culture is cheaper than a solid culture.
Bei Durchführung der flüssigen Kultur mögen die folgenden Bedingungen zur Anwendung gelangen: When performing the liquid culture, the following conditions may apply:
5 5
10 10th
15 15
20 20th
25 25th
30 30th
35 35
40 40
45 45
50 50
55 55
60 60
65 65
3 3rd
642 681 642 681
Anfänglicher pH-Wert 2 bis 9 Initial pH 2 to 9
Inkubationstemperatur 15 bis 35 ° C Incubation temperature 15 to 35 ° C
Inkubationsperiode 2 bis 20 Tage Incubation period 2 to 20 days
Im Falle einer submersen Kultur muss das Medium unter Rühren bei 30 bis 500 Umdrehungen pro Minute mit 0,1 bis 2,0 L/L/Min belüftet werden. In the case of a submerged culture, the medium must be aerated at 0.1 to 2.0 L / L / min with stirring at 30 to 500 revolutions per minute.
Das in festem oder flüssigem Kulturmedium gewachsene Mycel wird in üblicher Weise gesammelt und dann als Ausgangsmaterial für die vorliegende Erfindung verwendet. The mycelium grown in solid or liquid culture medium is collected in a conventional manner and then used as the starting material for the present invention.
So kann man beispielsweise im Fall einer flüssigen Kultur das Mycel dadurch sammeln, dass man das entstandene flüssige Kulturmedium einem üblichen Trennvorgang, z.B. einer Zentrifugierung, einem Filtriervorgang usw., unterwirft. Das auf diese Weise erhaltene Filtrat wird als filtrierte Brühe bezeichnet, welche man ebenfalls als Ausgangsmaterial für die vorliegende Erfindung verwenden kann. For example, in the case of a liquid culture, the mycelium can be collected by subjecting the resulting liquid culture medium to a conventional separation process, e.g. centrifugation, filtration, etc. The filtrate obtained in this way is referred to as filtered broth, which can also be used as a starting material for the present invention.
Hierauf wird der in der obigen Weise gesammelte Fruchtkörper und/oder das so gesammelte Mycélium mit einem wässrigen Lösungsmittel extrahiert. Dabei kann man den Fruchtkörper und/oder das Mycel als solche direkt extrahieren. Gewünschtenfalls kann man den Fruchtkörper und/ oder das Mycel vor dem Extrahieren einer Vorbehandlung unterziehen, z.B. durch Waschen mit Wasser, Lufttrocknung, Verkleinern und Pulverisieren oder Extrahieren mit einem nichtpolaren Lösungsmittel. The fruit body and / or the mycelium collected in the above manner is then extracted with an aqueous solvent. The fruiting body and / or the mycelium as such can be extracted directly. If desired, the fruiting body and / or the mycelium can be pretreated before extraction, e.g. by washing with water, air drying, shrinking and pulverizing or extracting with a non-polar solvent.
Das für die Extraktion zu verwendende, wässrige Lösungsmittel besteht aus Wasser oder einer Mischung von Wasser und mindestens einem wasserlöslichen Material, wie z.B. einer Säure, Base, einem Salz oder einem organischen Lösungsmittel. The aqueous solvent to be used for the extraction consists of water or a mixture of water and at least one water-soluble material, e.g. an acid, base, salt or organic solvent.
Bei der Durchführung der Extraktion wird der vorbehandelte oder nicht vorbehandelte Fruchtkörper bzw. das Mycel mit dem wässrigen Lösungsmittel vermischt. Die Temperatur des Lösungsmittels ist nicht von besonderer Bedeutung, sollte aber unterhalb 120°C gehalten werden. Bevorzugte Temperaturbereiche liegen indessen zwischen 50 °C und 100°C. Die anzuwendende Temperatur wird den wirtschaftlichen Gegebenheiten angepasst werden. Die Extraktion erfolgt während genügend langer Zeit, um die gewünschte Extraktion zu bewirken. Im allgemeinen wird die Extraktionsdauer bei höherer Temperatur kürzer sein. Innerhalb des oben erwähnten bevorzugten Temperaturbereiches erfolgt die Extraktion vorzugsweise innerhalb von 30 Minuten bis 10 Stunden. Die Extraktion erfolgt vorzugsweise durch Schütteln in einem Behälter, welcher aus Glas oder aus mit Glas ausgefüttertem, emailliertem oder rostfreiem Stahl besteht. Die verwendete Menge kann ebenfalls innerhalb eines weiten Bereiches schwanken, liegt aber im allgemeinen bei der 10 bis lOOfachen Gewichtsmenge (bezogen auf Trockenbasis) des Fruchtkörpers und/oder des Mycels. Für die Extraktion verwendet man vorzugsweise einen pulverisierten Fruchtkörper bzw. pulverisiertes Mycel. Nach der Extraktion werden das Mycel bzw. der Fruchtkörper und andere feste Bestandteile in bekannter Weise, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentri-fugieren, aus dem wässrigen Extrakt beseitigt. Der wässrige Extrakt wird hierauf beispielsweise durch Vakuumverdampfen oder dergleichen eingeengt, und zwar im allgemeinen auf ein Drittel bis ein Zehntel des ursprünglichen Volumens. When performing the extraction, the pretreated or untreated fruit body or the mycelium is mixed with the aqueous solvent. The temperature of the solvent is not particularly important, but should be kept below 120 ° C. Preferred temperature ranges, however, are between 50 ° C and 100 ° C. The temperature to be used will be adapted to the economic circumstances. The extraction takes place for a sufficiently long time to effect the desired extraction. In general, the extraction time will be shorter at higher temperatures. Within the preferred temperature range mentioned above, the extraction is preferably carried out within 30 minutes to 10 hours. The extraction is preferably carried out by shaking in a container which consists of glass or of glass-lined, enamelled or stainless steel. The amount used can also vary within a wide range, but is generally 10 to 100 times the amount by weight (based on dry basis) of the fruiting body and / or the mycelium. A pulverized fruiting body or pulverized mycelium is preferably used for the extraction. After the extraction, the mycelium or the fruiting body and other solid constituents are removed from the aqueous extract in a known manner, for example by filtration or centrifugation. The aqueous extract is then concentrated, for example by vacuum evaporation or the like, generally to a third to a tenth of the original volume.
Der in dieser Weise erhaltene Extrakt wird hierauf in der weiter unten beschriebenen Weise gereinigt, wobei das gewünschte Polysaccharid ausgefällt und gewonnen werden kann. Die in der vorliegenden Beschreibung verwendete Bezeichnung «wässriger Extrakt» bedeutet ein Filtrat oder ein Zentrifugat, welches man nach dem Entfernen des Mycels und/oder des Fruchtkörpers und anderer fester Materialien aus dem Extrakt erhalten hat. The extract obtained in this way is then purified in the manner described below, and the desired polysaccharide can be precipitated and recovered. The term “aqueous extract” used in the present description means a filtrate or a centrifugate which has been obtained from the extract after the mycelium and / or the fruiting body and other solid materials have been removed.
Die filtrierte Brühe lässt sich vorzugsweise als solche für den nachstehend beschriebenen Reinigungsvorgang verwenden, wobei man die Ausfällung und Gewinnung des beabsichtigten Polysaccharids erzielt. Die in der vorliegenden Beschreibung verwendete Bezeichnung «filtrierte Brühe bzw. Filtrierbrühe» bedeutet ein Filtrat, welches die Wirksubstanz, d.h. das Polysaccharid, enthält und durch Entfernen des Mycels und der anderen festen Bestandteile aus der Kulturbrühe, d.h. dem Züchtungsmedium, erhalten wird, in welchem der Stamm in einem flüssigen Züchtungsmedium in der oben beschriebenen Weise inkubiert worden ist. Die Filtrierbrühe wird beispielsweise durch Verdampfen im Vakuum oder dergleichen eingeengt und kann dann weiter behandelt werden. Im allgemeinen wird man die filtrierte Brühe auf ein Drittel bis ein Zehntel des ursprünglichen Volumens einengen. Die so eingeengte, filtrierte Brühe wird hierauf gereinigt. The filtered broth can preferably be used as such for the purification process described below, whereby the intended polysaccharide is precipitated and recovered. The term "filtered broth or filter broth" used in the present description means a filtrate which contains the active substance, i.e. the polysaccharide, and by removing the mycelium and other solid components from the culture broth, i.e. the culture medium in which the strain has been incubated in a liquid culture medium in the manner described above. The filter broth is concentrated, for example, by evaporation in vacuo or the like and can then be treated further. In general, the filtered broth will be concentrated to a third to a tenth of the original volume. The filtered, concentrated broth is then cleaned.
Der wässrige Extrakt und die filtrierte Brühe können getrennt voneinander gereinigt werden. Man kann aber den wässrigen Extrakt und die Filtrierbrühe miteinander vereinigen und dann diese Mischung reinigen. The aqueous extract and the filtered broth can be cleaned separately. But you can combine the aqueous extract and the filter broth and then clean this mixture.
Die Reinigung kann nach einer der folgenden Methoden geschehen. Cleaning can be done using one of the following methods.
A. Ausfällung der gewünschten Substanz durch Zugabe eines hochpolaren organischen Lösungsmittels, wie z.B. A. Precipitation of the desired substance by adding a highly polar organic solvent, e.g.
einem niederen Alkohol oder Keton, z.B. Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol oder Aceton usw., oder durch Aussalzen durch Zugabe von wasserlöslichen anorganischen Salzen, wie z.B. Ammoniumsulfat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid usw. a lower alcohol or ketone, e.g. Methanol, ethanol, propanol, butanol or acetone etc., or by salting out by adding water-soluble inorganic salts such as e.g. Ammonium sulfate, sodium chloride, potassium chloride, etc.
B. Entfernen von Säuren, Ionen und niedermolekularen Substanzen durch Dialyse, Gelfiltrierung unter Verwendung von Dextran oder Polyacrylamidgel, wie z.B. Sephadex, Biogel usw., Ionenaustauschharzbehandlung unter Verwendung von beispielsweise verschiedenen, handelsüblichen Anionen-und Kationenaustauschharzen, wie Amberlite, Dowex, Duo-lite usw., Ultrafiltrierung oder eine Kombination davon, um auf diese Weise eine im wesentlichen reine Lösung zu erhalten, aus welcher die gewünschte Wirksubstanz gewonnen wird. B. Removal of acids, ions and low molecular weight substances by dialysis, gel filtration using dextran or polyacrylamide gel, e.g. Sephadex, Biogel, etc., ion exchange resin treatment using, for example, various commercially available anion and cation exchange resins such as Amberlite, Dowex, Duo-lite, etc., ultrafiltration or a combination thereof, so as to obtain a substantially pure solution from which the desired active substance is obtained.
C. Behandlung zwecks Entfernung freier Proteine, beispielsweise nach der Sevag-Methode, Trifluortrichlormethan-methode, Protease-Behandlung usw. C. Treatment for removal of free proteins, for example by the Sevag method, trifluorotrichloromethane method, protease treatment, etc.
Die vorgenannten drei Methoden sind bestens bekannt. Gewünschtenfalls kann man zwei oder mehrere davon kombinieren. Im allgemeinen wird der flüssige Extrakt bzw. die Filtrierbrühe nach dem Einengen einer Ionenaustauschharzbehandlung, Dialyse, Gelfiltrierung, Ultrafiltrierung oder einer Kombination dieser Massnahmen unterworfen, um eine Entfärbung, Entsäuerung und Entfernung der niedermolekularen Substanzen zu bewirken. Aus einer derart gereinigten Lösung kann man die gewünschte Wirksubstanz durch geeignete Massnahmen, beispielsweise durch Gefriertrocknung, gewinnen. Gewünschtenfalls kann man die obenerwähnte(n) Massnahme^) wiederholen, um das erwünschte Ausmass an Reinigung zu erzielen. The above three methods are well known. If desired, two or more of them can be combined. In general, the liquid extract or the filter broth, after being concentrated, is subjected to ion exchange resin treatment, dialysis, gel filtration, ultrafiltration or a combination of these measures in order to decolorize, deacidify and remove the low molecular weight substances. The desired active substance can be obtained from such a purified solution by suitable measures, for example by freeze-drying. If desired, the above-mentioned measure (s) can be repeated in order to achieve the desired degree of cleaning.
Die so erhaltene Substanz besitzt die folgenden Eigenschaften: The substance thus obtained has the following properties:
1. Die Substanz ist ein weisses oder gräulichweisses Pulver und nicht dialysierbar. 1. The substance is a white or grayish white powder and cannot be dialysed.
2. Molischreaktion und Anthronreaktion sind positiv 2. Molic reaction and anthrone reaction are positive
3. Jodreaktion, Elson-Morgan-Reaktion und Biuret-Reak-tion sind negativ. 3. Iodine reaction, Elson-Morgan reaction and biuret reaction are negative.
4. Ninhydrin-Reaktion ist schwach positiv oder negativ. 4. Ninhydrin reaction is weakly positive or negative.
5. Die Substanz ist in Wasser und in einer wässrigen Lösung einer Substanz, welche in Wasser löslich ist, z.B. 5. The substance is in water and in an aqueous solution of a substance which is soluble in water, e.g.
einem organischen Lösungsmittel, einer Säure, einem basischen Salz und dergleichen, löslich, hingegen in einem organischen Lösungsmittel, z.B. Petroläther, Äthyläther, Benzol, Aceton, Äthanol, Methanol usw., unlöslich. an organic solvent, an acid, a basic salt and the like, but on the other hand in an organic solvent, e.g. Petroleum ether, ethyl ether, benzene, acetone, ethanol, methanol etc., insoluble.
5 5
10 10th
15 15
20 20th
25 25th
30 30th
35 35
40 40
45 45
50 50
55 55
60 60
65 65
642 681 642 681
4 4th
6. Diese Substanz besitzt keinen scharfen Schmelzpunkt und verkohlt bei starkem Erhitzen. 6. This substance does not have a sharp melting point and chars when heated excessively.
7. Das durch Auflösen der Substanz in wässriger 0,1-n-Schwefelsäure und Erhitzen der 0,5 Gew.-% dieser Substanz enthaltenden Lösung während 5 Stunden auf 100°C erhaltene Hydrolysat enthält mindestens eine der folgenden Substanzen: Galactose, Glucose, Mannose, Fucose und Xylose, wobei je nach Reinigungsart und Reinigungsausmass verschiedene Zuckerarten anfallen können. 7. The hydrolyzate obtained by dissolving the substance in aqueous 0.1 N sulfuric acid and heating the solution containing 0.5% by weight of this substance for 5 hours at 100 ° C. contains at least one of the following substances: galactose, glucose, Mannose, fucose and xylose, with different types of sugar being produced depending on the type of cleaning and the extent of cleaning.
Aufgrund der obigen Eigenschaften kann diese Substanz als ein hochmolekulares Polysaccharid betrachtet werden, welches sich aus einem der obengenannten Zucker zusammensetzt und ein Molekulargewicht von 8000 oder mehr aufweist. Due to the above properties, this substance can be regarded as a high molecular polysaccharide composed of one of the above sugars and having a molecular weight of 8,000 or more.
Bezüglich der unter 2., 3. und 4. vorstehend erwähnten Reaktionen, siehe: For the reactions mentioned under 2., 3. and 4. above, see:
- H.R. Christen, Grundlagen der organischen Chemie, Verlag Sauerländer, Aarau (Schweiz) 1970, Seite 268/Ninhy-drin; - MR. Christians, Fundamentals of Organic Chemistry, Sauerländer Verlag, Aarau (Switzerland) 1970, page 268 / Ninhy-drin;
- L.F. Fieser und M. Fieser, Organic Chemistry, D.C. Heath and Co., Boston 1950, 2. Auflage, Seiten 437 und 460/Ninhydrin bzw. Biuret; - L.F. Fieser and M. Fieser, Organic Chemistry, D.C. Heath and Co., Boston 1950, 2nd edition, pages 437 and 460 / ninhydrin and biuret;
- G.A. Hill und L. Kelly, Organic Chemistry, The Blaki-ston Co., Philadelphia, Toronto 1945, Seiten 316,458,459, 480/Biuret, Ninhydrin, Molisch ; - G.A. Hill and L. Kelly, Organic Chemistry, The Blaki-ston Co., Philadelphia, Toronto 1945, pp. 316,458,459, 480 / Biuret, Ninhydrin, Molisch;
- E. Stahl, Dünnschichtchromatographie, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York 1967, Seiten 147, 312, 824, 834/Jodreaktion, Elson-Morgan; - E. Stahl, thin layer chromatography, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York 1967, pages 147, 312, 824, 834 / iodine reaction, Elson-Morgan;
- The Merck Index, Merck and Co. Inc., Rahway (NJ, USA) 1960, Seiten 86 und 721/Anthron bzw. Ninhydrin. - The Merck Index, Merck and Co. Inc., Rahway (NJ, USA) 1960, pages 86 and 721 / Anthron and Ninhydrin, respectively.
Anthron reagiert mit Glucose und ähnlichen Zuckern, bzw. mit Hydroxymethyl-furfural, und bildet dabei Farbstoffe der Formel: Anthron reacts with glucose and similar sugars or with hydroxymethyl furfural, thereby forming dyes of the formula:
CH CH
0 0
2-Desoxyzucker hingegen reagieren nicht [Pharm. Week-blad 88 (1953), 144]. In contrast, 2-deoxy sugar does not react [Pharm. Week-blad 88 (1953), 144].
Das erfindungsgemäss erhältliche Polysaccharid besitzt keine antimikrobielle Aktivität gegen Bakterien, Fungi und Hefen, wie z.B. Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Aspergillus niger, Candida albicans, usw. Somit ist diese Substanz grundverschieden von den antibakteriellen, krebsverhindernden Mitteln, wie sie aus den der Gattung Actinomycetes angehörenden Arten erhalten werden. The polysaccharide obtainable according to the invention has no antimicrobial activity against bacteria, fungi and yeasts, such as e.g. Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Aspergillus niger, Candida albicans, etc. Thus, this substance is fundamentally different from the antibacterial, cancer-preventing agents obtained from the species belonging to the genus Actinomycetes.
Das Polysaccharid zeigt keine Cytotoxizität und auch keine Nebenwirkungen, wie sie üblicherweise mit den bekannten Mitteln in Kauf genommen werden müssen, wie z.B. eine Abnahme der Zahl der Leukozyten, eine Anämie der Leber und anderer Organe, eine Atrophie der Milz, Körperverlust und Appetitlosigkeit. Die akute Toxizität (LDso) der Polysaccharide bei der Maus liegt bei intraperitonealer Injektion über 2500 mg/kg. The polysaccharide shows no cytotoxicity and no side effects, as they usually have to be accepted with the known means, e.g. a decrease in the number of leukocytes, anemia of the liver and other organs, atrophy of the spleen, loss of body and loss of appetite. The acute toxicity (LDso) of the polysaccharides in the mouse is over 2500 mg / kg with intraperitoneal injection.
Die erfindungsgemäss erhältlichen Polysaccharide besitzen eine antikarzinogene Wirkung. Diese antikarzinogene Aktivität wird durch den folgenden Test bestätigt. The polysaccharides obtainable according to the invention have an anticarcinogenic effect. This anticarcinogenic activity is confirmed by the following test.
Eine Maus vom IRC-JCL-Stamm mit einem Gewicht von 20 + 2 g wurde intraperitoneal mit festen Sarcoma-180-Krebszellen oder Ehrlich-Krebszellen inoculiert. Nach Ablauf einer Woche wurde eine ausreichende Zunahme der Ascitesflüssig- A mouse from the IRC-JCL strain with a weight of 20 + 2 g was inoculated intraperitoneally with solid Sarcoma 180 cancer cells or Ehrlich cancer cells. After a week, there was a sufficient increase in ascites fluid
keit bei der Maus beobachtet. Die vorhandenen Krebszellen wurden subkutan in die Achselhöhlen anderer Mäuse in einer Menge von 4000000 Zellen pro Maus transplantiert. Diese Mäuse wurden hierauf in verschiedene Gruppen aufgeteilt, wobei jede Gruppe aus acht Einzeltieren bestand. Der ersten Gruppe, nämlich der Kontrollgruppe, wurde lediglich Kochsalz verabreicht, während allen übrigen Tieren das Polysaccharid verabreicht wurde. Die erste Verabreichung der Kochsalzlösung oder des Polysaccharids erfolgte nach Ablauf von einem Tag nach der Transplantation, u.zw. intraperitoneal, während die nachfolgenden Verabreichungen in Abständen von jeweils einem Tag neunmal wiederholt wurden. Das in die Mäuse transplantierte feste Krebsgeschwür wurde beobachtet und 1 Tag nach der letzten Verabreichung, d.h. am zehnten Tag, wurde die durchschnittliche Körpergewichtszunahme gemessen. Dann wurden die Tiere seziert, um die Nebenwirkungen wahrzunehmen und das Tumorgewicht aus den Kontrolltieren und aus den mit Polysaccharid behandelten Tieren festzustellen. Die in den folgenden Tabellen wiedergegebene «Inhibitionsrate (IR)» wurde nach der folgenden Gleichung berechnet: observed in the mouse. The existing cancer cells were transplanted subcutaneously into the armpits of other mice in an amount of 4000000 cells per mouse. These mice were then divided into different groups, each group consisting of eight individual animals. The first group, namely the control group, was only given saline, while all the other animals were given the polysaccharide. The first administration of saline or polysaccharide was one day after the transplant, etc. intraperitoneally while the subsequent administrations were repeated nine times at one day intervals. The solid cancerous tumor transplanted into the mice was observed and 1 day after the last administration, i.e. on the tenth day, the average body weight gain was measured. The animals were then dissected to see the side effects and to determine the tumor weight from the control animals and from the animals treated with polysaccharide. The inhibition rate (IR) shown in the following tables was calculated using the following equation:
IR(%) = (C - T)/C x 100 IR (%) = (C - T) / C x 100
worin C ein durchschnittliches Gewicht der Tumore, welche aus jedem Tier der Kontrollgruppe entnommen wurde, und T das durchschnittliche Gewicht der Tumore, welche aus den mit Polysaccharid behandelten Mäusen entfernt worden war, bedeuten. where C is the average weight of the tumors taken from each animal in the control group and T is the average weight of the tumors removed from the mice treated with polysaccharide.
Dabei zeigte sich, dass die Polysaccharide eine starke antikarzinogene Aktivität gegen sowohl Sarcom-180-Krebs als auch Ehrlich-Karzinom besass. It was shown that the polysaccharides had a strong anticarcinogenic activity against both Sarcom 180 cancer and Ehrlich carcinoma.
Die Erfindung sei durch die folgenden Beispiele unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen erläutert, wobei die Fig. 1 und 2 die Infrarotspektren der Polysaccharide wiedergeben. The invention is illustrated by the following examples with reference to the accompanying drawings, in which FIGS. 1 and 2 show the infrared spectra of the polysaccharides.
Beispiel 1 example 1
Ein Stamm (FERM-P 4641, ATCC 20544) von Polyporus tuberaster (Fr.) wurde im folgenden flüssigen Kulturmedium inkubiert: A strain (FERM-P 4641, ATCC 20544) of Polyporus tuberaster (Fr.) was incubated in the following liquid culture medium:
Glucose 30 g Glucose 30 g
Polypepton 5 g Polypeptone 5 g
Hefeextrakt (Difco) 1 g primäres Kaliumphosphat 1 g Yeast extract (Difco) 1 g primary potassium phosphate 1 g
Magnesiumsulfat (7 H2O) 0,5 g Magnesium sulfate (7 H2O) 0.5 g
Wasser 1 Liter anfängliches pH 5,6-5,8 Water 1 liter initial pH 5.6-5.8
(ohne Einstellung) (without setting)
Die Inkubation erfolgte dadurch, dass man 100 ml des obigen Züchtungsmediums jeweils einem 500-ml-Erlenmeyer-kolben hinzugab. Die Kolben wurden mit Baumwolle verstopft und während 30 Minuten bei 120°C sterilisiert. Nach dem Kühlen wurde in üblicher Weise mit dem besagten Stamm inokuliert, welcher getrennt in einem Schrägkulturmedium, welches 2% Glucose, 0,5% Ebios und 1,5% Agar enthielt, gezüchtet worden war. Nach 7tägigem Schütteln bei 27 °C wurden die Kolbeninhalte für die nachträgliche Inkubation verwendet. 201 des in obiger Weise beschriebenen, flüssigen Kulturmediums wurden in einem 30 1 stahlfreien Fermentierbehälter während 30 Minuten bei 120°C sterilisiert und dann gekühlt. Hierauf wurde der oben erwähnte Kolbeninhalt dem Kulturmedium im besagten Fermentierbehälter zugegeben. Das Medium wurde unter Rühren (250 Umdrehungen pro Minute) während 3 Tagen bei 27 °C einer aeroben Inkubation unterworfen, wobei man mit 0,5 Liter/Liter/Min. The incubation was carried out by adding 100 ml of the above growth medium to a 500 ml Erlenmeyer flask. The flasks were plugged with cotton and sterilized at 120 ° C for 30 minutes. After cooling, inoculation was carried out in a conventional manner with the said strain, which had been grown separately in a slant culture medium which contained 2% glucose, 0.5% Ebios and 1.5% agar. After shaking at 27 ° C. for 7 days, the contents of the flask were used for the subsequent incubation. 201 of the liquid culture medium described above were sterilized in a 30 1 steel-free fermentation container for 30 minutes at 120 ° C. and then cooled. The contents of the flask mentioned above were then added to the culture medium in the fermentation tank. The medium was subjected to aerobic incubation with stirring (250 revolutions per minute) for 3 days at 27 ° C., with 0.5 liter / liter / min.
5 5
10 10th
15 15
20 20th
25 25th
30 30th
35 35
40 40
45 45
50 50
55 55
60 60
65 65
5 5
642 681 642 681
belüftete. Die so erhaltene Kulturbrühe wurde filtriert, wobei man 3000 g feuchtes Mycélium und 17 1 filtrierte Brühe erhielt. Das Mycélium wurde mit 1 Liter Wasser gewaschen und die Waschflüssigkeit der Filtrierbrühe hinzugegeben. Das gewaschene Mycel wurde mit 6 Liter Wasser vermischt und 5 die Mischung während 30 Minuten in einem geschlossenen Behälter auf 120°C erhitzt. Hierauf wurde das Gemisch auf Zimmertemperatur abkühlen gelassen und anschliessend filtriert und das Filtrat (flüssiger Extrakt) auf ein Volumen von 1 Liter eingeengt. Der eingeengte, flüssige Extrakt wurde mit 10 Wasser dialysiert und hierauf unter Gefrieren getrocknet, ventilated. The culture broth thus obtained was filtered to give 3000 g of moist mycelium and 17 l of filtered broth. The mycelium was washed with 1 liter of water and the washing liquid was added to the filter broth. The washed mycelium was mixed with 6 liters of water and the mixture was heated to 120 ° C. in a closed container for 30 minutes. The mixture was then allowed to cool to room temperature and then filtered and the filtrate (liquid extract) was concentrated to a volume of 1 liter. The concentrated liquid extract was dialyzed with 10 water and then dried with freezing,
wobei man 12,08 g einer gräulichweissen, pulverigen Substanz erhielt. Das Infrarotspektrum dieser Substanz (als KBr-Tablette) findet sich in Fig. 1. to obtain 12.08 g of a grayish-white, powdery substance. The infrared spectrum of this substance (as a KBr tablet) can be found in Fig. 1.
18 Liter der Filtrierbrühe wurden auf ein Volumen von 2 Liter eingeengt und mit Wasser dialysiert und tiefgefroren, wobei man 23,60 g einer schwachbräunlichen, pulverigen Substanz erhielt. 18 liters of the filter broth were concentrated to a volume of 2 liters and dialyzed with water and deep-frozen to obtain 23.60 g of a light brown powdery substance.
Bei der Hydrolyse in der oben beschriebenen Weise zeigte sich, dass jedes dieser Polysaccharide aus Galactose, Glucose, Mannose, Fucose und Xylose bestand. Hydrolysis in the manner described above showed that each of these polysaccharides consisted of galactose, glucose, mannose, fucose and xylose.
Die antikarzinogenen Wirkungen dieser Polysaccharid-Substanzen finden sich in den folgenden Tabellen 1 und 2. The anticarcinogenic effects of these polysaccharide substances can be found in Tables 1 and 2 below.
Tabelle 1 Table 1
Substanz aus dem Mycélium Substanz aus der Filtrierbrühe Substance from the mycelium Substance from the filter broth
Dosis Art der Vollständige IR Dosis Art der Vollständige IR Dose Type of Complete IR Dose Type of Complete IR
mg/kg/Tag Verabreichung Regression % mg/kg/Tag Verabreichung Regression % mg / kg / day administration regression% mg / kg / day administration regression%
5 ip 0/8 63,8 5 ip 0/8 63.8
25 ip 6/8 94,8 25 ip 6/8 94.8
125 ip 5/8 92,8 125 ip 5/8 92.8
5 ip 0/8 61,9 5 ip 0/8 61.9
25 ip 5/8 91,8 25 ip 5/8 91.8
125 ip 5/8 89,0 125 ip 5/8 89.0
Krebszellen: Sarcoma-180 4x 106 Zellen/Maus. Cancer cells: Sarcoma-180 4x 106 cells / mouse.
Tierstamm: ICR-ICL 20 g ± 2 g. Animal strain: ICR-ICL 20 g ± 2 g.
Behandlung: Nach Ablauf von 1 Tag nach der Transplantation intraperitoneal verabreicht (Kontrollversuch: Kochsalzlösung) 10 Mal. Treatment: Intraperitoneally administered 1 day after transplantation (control: saline) 10 times.
30 30th
Bestimmung: Das Gewicht des Tumors vom festen Typus. Inhibitionsrate (IR) = (C - T) / C x 100. C: durchschnittliches Gewicht der aus der Kontrollgruppe entfernten Tumore. Determination: The weight of the tumor of the fixed type. Inhibition rate (IR) = (C - T) / C x 100. C: average weight of the tumors removed from the control group.
T: durchschnittliches Gewicht der aus den mit Polysaccharid behandelten Mäusen entfernten Tumore. T: Average weight of tumors removed from polysaccharide-treated mice.
Tabelle 2 Table 2
Substanz aus dem Mycélium Substanz aus der Filtrierbrühe Substance from the mycelium Substance from the filter broth
Dosis Art der Vollständige IR Dosis Art der Vollständige IR Dose Type of Complete IR Dose Type of Complete IR
mg/kg/Tag Verabreichung Regression % mg/kg/Tag Verabreichung Regression % mg / kg / day administration regression% mg / kg / day administration regression%
5 25 125 5 25 125
IP ip ip IP ip ip
1/8 7/8 5/8 1/8 7/8 5/8
69,9 92,5 88,5 69.9 92.5 88.5
5 25 125 5 25 125
iP ip ip iP ip ip
1/8 7/8 5/8 1/8 7/8 5/8
67,3 92,3 87,2 67.3 92.3 87.2
Krebszelle: Ehrlich-Carcinom 4 x 106 Zellen/Maus. Stamm der Tiere, Behandlung und Bestimmung erfolgte wie in der Tabelle 1. Cancer cell: Ehrlich carcinoma 4 x 106 cells / mouse. Animal strain, treatment and determination was carried out as in Table 1.
Beispiel 2 Example 2
Ein Gemisch von 200 g Holzmehl, 100 g Reiskleie und 300 ml Wasser wurde gründlich miteinander vermischt, um ein Züchtungsmedium zu bilden, das dann in einen zylindrischen Behälter von Î5 cm Durchmesser und 20 cm Höhe, der aus einem synthetischen Harz bestand, eingetragen wurde. Das Züchtungsmedium wurde während 60 Minuten bei 120°C sterilisiert und dann auf Zimmertemperatur abkühlen gelassen. Der Stamm FERM-P 4641, ATCC 20544, welcher getrennt davon in einem Schrägkulturmedium in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 gezüchtet worden war, wurde auf das nach den obigen Angaben erhaltene Kulturmedium bei 26 °C während 1 Monat inkubiert, um ein ausreichendes Wachsen des Mycels zu erlauben. Hierauf wurde das Kulturmedium in Erde eingebettet und während 2 Monaten darin stehen gelassen. Dabei wuchs der Fruchtkörper des Stammes in der Erde. Die Ausbeute an Fruchtkörper lag pro Behälter bei ungefähr 180 g. A mixture of 200 g of wood flour, 100 g of rice bran and 300 ml of water was thoroughly mixed together to form a growth medium, which was then placed in a cylindrical container of 5 cm in diameter and 20 cm in height which was made of a synthetic resin. The growth medium was sterilized at 120 ° C for 60 minutes and then allowed to cool to room temperature. The strain FERM-P 4641, ATCC 20544, which had been grown separately in a slant culture medium in the same manner as in Example 1, was incubated on the culture medium obtained as described above at 26 ° C for 1 month to allow sufficient growth of the mycelium. The culture medium was then embedded in soil and left to stand for 2 months. The trunk's fruiting body grew in the ground. The yield of fruiting bodies per container was approximately 180 g.
Der so erhaltene Fruchtkörper wurde gesammelt, an der Luft getrocknet und pulverisiert. Dann wurden 100 g des so erhaltenen pulverigen Fruchtkörpers mit 3 1 Wasser gemischt und das Gemisch während 3 Stunden zum Sieden erhitzt. Hierauf wurde das Gemisch filtriert, wobei man einen feuch- The fruiting body thus obtained was collected, air dried and pulverized. Then 100 g of the powdery fruiting body thus obtained were mixed with 3 l of water and the mixture was heated to boiling for 3 hours. The mixture was then filtered, using a moist
45 45
ten Filterkuchen und ein Filtrat (flüssiger Extrakt) erhielt. Der feuchte Filterkuchen wurde erneut mit 3 1 Wasser versetzt, während 3 Stunden zum Sieden erhitzt und hierauf abfiltriert, wobei man ein Filtrat (flüssiger Extrakt) erhielt, so Beide Extrakte wurden miteinander vereinigt und auf ein Volumen von 1 Liter eingeengt. Der konzentrierte Extrakt wurde mit Wasser dialysiert und hierauf gefriergetrocknet, wobei man 5,40 g einer gräulichweissen, pulverigen Substanz (Polysaccharid) erhielt, welche sich aus Galactose, Glucose, ss Mannose, Fucose und Xylose zusammensetzte. Die antikarzinogene Wirkung dieser Substanz in bezug auf festes Sarcoma 180 betrug 95,5% (Dosis 25 mg/kg/Tag) und die vollständige Regression lag bei 7/8. ten filter cake and a filtrate (liquid extract) received. The moist filter cake was again mixed with 3 l of water, heated to boiling for 3 hours and then filtered off, giving a filtrate (liquid extract). Both extracts were combined and concentrated to a volume of 1 liter. The concentrated extract was dialyzed with water and then freeze-dried, yielding 5.40 g of a grayish-white, powdery substance (polysaccharide), which was composed of galactose, glucose, SS mannose, fucose and xylose. The anticarcinogenic effect of this substance on solid Sarcoma 180 was 95.5% (dose 25 mg / kg / day) and the complete regression was 7/8.
60 Beispiel 3 60 Example 3
Der Stamm FERM-P 4641, ATCC 20544 wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 in einem Fermentierbehälter inkubiert. Hierauf wurden 11 Liter der Filtrierbrühe in der gleichen Weise, wie sie oben beschrieben worden ist, berei-65 nigt. Die filtrierte Brühe wurde durch Vakuumverdampfen auf ein Volumen von 1,5 Liter eingeengt und das Konzentrat während 24 Stunden in fliessendem Wasser dialysiert. 1,6 Liter des Dialysats wurden durch Zugabe einer wässrigen The strain FERM-P 4641, ATCC 20544 was incubated in the same manner as in Example 1 in a fermentation container. Then 11 liters of the filter broth were cleaned in the same manner as described above. The filtered broth was concentrated to a volume of 1.5 liters by vacuum evaporation and the concentrate was dialyzed in running water for 24 hours. 1.6 liters of the dialysate was added by adding an aqueous
642 681 642 681
6 6
Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und dann mit DEAE Sephadex behandelt. Ein Teil der durch DEAE Sephadex geführten Flüssigkeit wurde durch Tiefkühlung getrocknet, wobei man ein Polysaccharidpulver (als Probe A-l bezeichnet) erhielt, welches gräulichweiss aus- 5 sah und aus Galactose, Glucose, Mannose, Fucose und Xylose bestand. Der Rest der besagten Flüssigkeit, nämlich 1,5 Liter, wurde mit 0,5 Liter Äthanol versetzt, wobei ein Niederschlag eintrat, welcher in 1 Liter Wasser gelöst wurde. Die so erhaltene Lösung wurde in fliessendem Wasser während 24 io Stunden dialysiert. Das Dialysat wurde mittels Salzsäure auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt und dann einer SP-Sepha-dex-Behandlung unterworfen. Die durch das SP-Sephadex geflossene Flüssigkeit wurde mit Äthanol versetzt, um eine 25%ige Alkoholkonzentration zu erhalten. Dabei erhielt man 15 einen Niederschlag, welcher in 1 Liter Wasser gelöst und erneut in fliessendem Wasser während 24 Stunden dialysiert wurde. Das Dialysat wurde durch Tiefkühlung getrocknet, wobei man 3,0 g einer festen Substanz (Polysaccharid) erhielt, welche in 1 Liter einer 0,3 molare Essigsäure und 0,3 molares 20 Natriumchlorid enthaltenden Lösung gegeben wurden; es bildete sich dabei ein Niederschlag. Das Gemisch wurde zentri-fugiert, wobei man eine feste Substanz und ein Filtrat erhielt. Das Filtrat wurde dialysiert und das Dialysat gefriergetrocknet, wobei man 0,18 g eines säurelöslichen Polysaccharidpul-vers (als Probe A-3 nachstehend bezeichnet) erhielt, welches eine schwach gräulichweisse Farbe aufwies und sich als Mannose, Fucose, Xylose und Galactose zusammensetzte. Sodium hydroxide solution adjusted to pH 8.0 and then treated with DEAE Sephadex. A portion of the liquid passed through DEAE Sephadex was dried by freezing to give a polysaccharide powder (referred to as Sample A-1) which looked greyish white and consisted of galactose, glucose, mannose, fucose and xylose. The rest of said liquid, namely 1.5 liters, was mixed with 0.5 liters of ethanol, with a precipitate occurring, which was dissolved in 1 liter of water. The solution thus obtained was dialyzed in running water for 24 hours. The dialysate was adjusted to pH 3.5 with hydrochloric acid and then subjected to an SP-Sepha-dex treatment. Ethanol was added to the liquid that flowed through the SP-Sephadex to obtain a 25% alcohol concentration. This gave 15 a precipitate, which was dissolved in 1 liter of water and dialyzed again in running water for 24 hours. The dialysate was dried by freezing to obtain 3.0 g of a solid substance (polysaccharide) which was put in 1 liter of a solution containing 0.3 molar acetic acid and 0.3 molar 20 sodium chloride; a precipitate formed. The mixture was centrifuged to obtain a solid substance and a filtrate. The filtrate was dialyzed and the dialysate freeze-dried to obtain 0.18 g of an acid-soluble polysaccharide powder (referred to as Sample A-3 below), which was a slightly greyish-white in color and composed of mannose, fucose, xylose and galactose.
Die beim Zentrifugieren erhaltene, feste Substanz wurde in 1 Liter Wasser gelöst und in fliessendem Wasser während 24 Stunden dialysiert. Das Dialysat wurde zentrifugiert, The solid substance obtained by centrifugation was dissolved in 1 liter of water and dialyzed in running water for 24 hours. The dialysate was centrifuged
wobei man ein Filtrat und einen festen Niederschlag erhielt. Das Filtrat wurde gefriergetrocknet, wobei man 1,27 g eines Polysaccharidpulvers (nachstehend als Probe A-4 bezeichnet) erhielt, welches schwach gräulichweiss aussieht und aus Glucose bestand. Der feste Niederschlag wurde gleichfalls gefriergetrocknet, wobei man ein in Alkali lösliches Polysaccharidpulver (nachstehend als Probe A-5 bezeichnet) erhielt, welches eine schwach gräulichweisse Farbe aufwies und sich aus Glucose, Mannose und Xylose zusammensetzte. to give a filtrate and a solid precipitate. The filtrate was freeze-dried to obtain 1.27 g of a polysaccharide powder (hereinafter referred to as Sample A-4) which looked slightly grayish white and was composed of glucose. The solid precipitate was also freeze-dried to obtain an alkali-soluble polysaccharide powder (hereinafter referred to as Sample A-5), which was a slightly greyish-white in color and was composed of glucose, mannose and xylose.
Das Infrarotspektrum der Probe A-4 findet sich in Fig. 2. The infrared spectrum of sample A-4 can be found in Fig. 2.
Die antikarzinogene Wirkung dieser Proben bei Mäusen war die folgende: The anticarcinogenic effects of these samples in mice were as follows:
Antikarzinogene Wirkung bei der Maus (Sarcoma-180) Anti-carcinogenic effects in mice (Sarcoma-180)
Krebszellen: Sarcoma-180 4x 106 Zellen/Maus. Cancer cells: Sarcoma-180 4x 106 cells / mouse.
Tierstamm: ICR-JCL 20 g ± 2 g. Animal strain: ICR-JCL 20 g ± 2 g.
Behandlung: Nach Ablauf von 1 Tag nach der Transplantation intraperitoneal verabreicht (Kontrollprobe: Kochsalzlösung 7 Mal). Treatment: Intraperitoneally administered 1 day after transplantation (control: saline 7 times).
Bestimmung: Gewicht des Tumors von fester Beschaffenheit. Determination: weight of the solid tumor.
25 25th
30 30th
35 35
IR (Inhibitionsrate). IR (inhibition rate).
IR = (C - T/C x 100. IR = (C - T / C x 100.
C: durchschnittliches Gewicht der aus der Kontrollgruppe entfernten Tumore. C: Average weight of tumors removed from the control group.
T: durchschnittliches Gewicht der aus einer mit Polysaccharid behandelten Gruppe entfernten Tumore. T: Average weight of tumors removed from a polysaccharide-treated group.
Pro Per
Dosis dose
Art der Type of
Vollstän Complete
Durchschnitt Blind- Average blind
IR IR
be mg/kg/ be mg / kg /
Verab dige Ad dige
± Standard probe ± standard sample
% %
Tag reichung Day handing
Repression repression
Dev. Dev.
A-l A-l
5 5
ÎP ÎP
3/8 3/8
0,41+0,42 0.41 + 0.42
2,29 ± 2.29 ±
1,0482,1 1.0482.1
50 50
ÌP ÌP
4/8 4/8
0,28 + 0,15 0.28 + 0.15
do. do.
87,8 87.8
A-3 A-3
2 2nd
ÌP ÌP
2/8 2/8
0,52 + 0,25 0.52 + 0.25
do. do.
77,3 77.3
20 20th
ÌP ÌP
3/8 3/8
0,41+0,27 0.41 + 0.27
do. do.
82,1 82.1
A-4 A-4
5 5
ip ip
6/8 6/8
0,20 + 0,19 0.20 + 0.19
do. do.
91,3 91.3
50 50
ÌP ÌP
1/8 1/8
0,54 + 0,32 0.54 + 0.32
do. do.
76,4 76.4
A-5 A-5
5 5
ÌP ÌP
4/8 4/8
0,27 + 0,21 0.27 + 0.21
do. do.
88,2 88.2
50 50
ÌP ÌP
3/8 3/8
0,40 + 0,38 0.40 + 0.38
do. do.
82,5 82.5
Antikarzinogene Aktivität bei der Maus (Ehrlichcarcinom) Krebszellen: Ehrlichcarcinom 4 x 106 Zellen/Maus Tierstamm: ICR-JCL 20 g ± 2 g Anticarcinogenic activity in mice (Ehrlich carcinoma) Cancer cells: Ehrlich carcinoma 4 x 106 cells / mouse Animal strain: ICR-JCL 20 g ± 2 g
Behandlung: Nach Ablauf von 1 Tag nach der Transplantation intraperitoneal verabreicht (Kontrollversuch mit Kochsalzlösung) 7 Mal Treatment: Intraperitoneally administered 1 day after transplantation (saline control) 7 times
Bestimmung: Gewicht des Tumors von fester Beschaffenheit Determination: weight of the solid tumor
IR (Inhibitionsverhältnis) = (C — T) / C x 100 C: durchschnittliches Gewicht der aus der Kontrollgruppe beseitigten Tumore IR (inhibition ratio) = (C - T) / C x 100 C: average weight of the tumors removed from the control group
T: durchschnittliches Gewicht der aus der mit Polysaccharid behandelten Gruppe entfernten Tumore T: Average weight of tumors removed from the polysaccharide treated group
45 45
Pro Per
Dosis dose
Art der Type of
Kom Com
Durchschnitt Blindver- IR Average blind- IR
be mg/kg/ be mg / kg /
Verab plette Admit plette
+ Standard such % + Standard search%
Tag reichung Day handing
Regression Regression
Dev. Dev.
A-3 A-3
0,169 0.169
ÌP ÌP
2/8 2/8
0,69 + 0,64 0.69 + 0.64
1,74 ±0,93 60,3 1.74 ± 0.93 60.3
1,690 1,690
ÌP ÌP
5/8 5/8
0,30 + 0,28 0.30 + 0.28
do. 82,8 do. 82.8
16,90 16.90
ÌP ÌP
3/8 3/8
0,51+0,46 0.51 + 0.46
do. 70,7 do. 70.7
A-4 A-4
0,2 0.2
ÌP ÌP
1/8 1/8
0,93 + 0,65 0.93 + 0.65
do. 46,6 do. 46.6
2,0 2.0
ÌP ÌP
5/8 5/8
0,20 ±0,19 0.20 ± 0.19
do. 88,5 do. 88.5
20,0 20.0
ÌP ÌP
7/8 7/8
0,13 + 0,17 0.13 + 0.17
do. 92,5 do. 92.5
A-5 A-5
0,2 0.2
ÌP ÌP
0/8 0/8
1,09 ±0,67 1.09 ± 0.67
do. 37,4 do. 37.4
2,0 2.0
ÌP ÌP
6/8 6/8
0,21 ±0,10 0.21 ± 0.10
do. 87,9 do. 87.9
20,0 20.0
ÌP ÌP
4/8 4/8
0,21+0,11 0.21 + 0.11
do. 87,9 do. 87.9
2 Blatt Zeichnungen 2 sheets of drawings
Claims (4)
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP11629078A JPS5542564A (en) | 1978-09-21 | 1978-09-21 | Production of antitumorigenic substance |
Publications (1)
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---|---|
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Family Applications (1)
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---|---|---|---|
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---|---|---|---|---|
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PL | Patent ceased |