KR20010034700A - 세팔로스포린을 발효성 제조하기 위한 신규한 방법 - Google Patents

세팔로스포린을 발효성 제조하기 위한 신규한 방법 Download PDF

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Abstract

화학식 I의 N-치환된 세팔로스포란산 화합물(여기에서, R2는 아디필 (1,4-디카복시부탄), 석시닐, 글루타릴, 아디필, 피멜릴, 수베릴, 2-(카복시에틸티오)아세틸, 3-(카복시에틸티오)프로피오닐, 고급 알킬 포화 및 고급 알킬 불포화 디카복실산으로 이루어진 군으로부터 선택된다)을, 화학식 I의 화합물 이외에 6-아미노페니실란산(6-APA) 및 임의로 하나 이상의 N-치환된 페니실란산 화합물을 포함하는 착체 혼합물로부터 회수하는 방법이 제공되며, 이는 다음 단계를 포함한다: (a) 착체 혼합물을 pH 6.5 이하로 산성화하고, 혼합물을 이러한 pH 이하로 10 내지 150℃의 온도에서 유지시키고/거나, (b) 착체 혼합물을 이산화탄소 공급원과 접촉시키고, (c) 화학식 I의 세팔로스포란산 화합물을 단계 (a) 및/또는 (b) 후에 수득된 혼합물로부터 회수한다.

Description

세팔로스포린을 발효성 제조하기 위한 신규한 방법{Novel process for the fermentative production of cephalosporin}
세팔로스포린을 제조하는 반합성 경로는 발효 산물(예: 페니실린 G, 페니실린 V 및 세팔로스포린 C)로부터 출발하며, 이들은, 예를 들어, 문헌에 기술된 방법으로 상응하는 β-락탐 핵으로 전환된다[참조: K. Matsumoto, Bioprocess, Techn., 16, (1993), 67-88, J.G. Shewale ＆ H. Sivaraman, Process Biochemistry, August 1989, 146-154, T.A. Savidge, Biotechnology of Industrial Antibiotics (Ed. E.J. Vandamme) Marcel Dekker, New York, 1984; J.G. Shewale et al., Process Biochemistry International, June 1990, 97-103]. 수득된 β-락탐 핵은 계속해서, 특히 EP 제0 339 751호, JP-A-제53005185호 및 CH-A-제640 240호에 기술된 바와 같이, 적합한 측쇄와의 커플링에 의해 바람직한 항생제로 전환된다. 측쇄 및 β-락탐 핵의 상이한 조합을 제조하여, 각종 페니실린 및 세팔로스포린 항생제를 수득할 수 있다.
7-아미노 데스아세톡시 세팔로스포란산(7-ADCA) 및 7-아미노세팔로스포론산(7-ACA)은 약제 산업에서 사용되는 항생제를 제조하기 위해 가장 중요한 중간체인 것으로 공지되어 있다.
7-ADCA는, 예를 들어, 7-아미노 데스아세톡시 세팔로스포란산 및 페닐 아세트산을 생성하는 페닐아세틸데스아세톡시 세팔로스포란산의 화학적 또는 효소성 분해(탈아실화)에 의해 수득된다.
페닐아세틸데스아세톡시 세팔로스포란산은 일반적으로 페니실린 G로부터 생산되는 페니실린 G 설폭사이드의 화학적 처리에 의해 제조된다. 이러한 제조 방법에서, 다량의 화학물질이 목적하는 반응이 일어나는 것을 보장하기 위해서 필요하다. 이는 고가이며 폐기물 처리시에 상당한 부담을 준다. 또한, 공정의 총 수율은 그다지 높지 않다.
화학 공정의 일부 단점을 극복하기 위해서, 발효 방법이 7-ADCA, 7-아미노 데스아세틸 세팔로스포란산(7-ADAC) 및 7-ACA의 제조에 대해 기술되었으며, 이는 전사유전자로부터 "익스팬다제(expandase)"로도 공지된 데스아세톡시세팔로스포란산 신테타제(DAOCS)를 발현시킬 수 있는 재조합 Penicillium chrysogenum 균주에 의한 N-치환된 β-락탐, 예를 들어, 아디필-7-ADCA, 아디필-7-ADAC 또는 아디필-7-ACA의 발효성 제조를 포함한다(EP 제0 532 341호, EP 제0 540 210호, WO 93/08287, WO 95/04148). 익스팬다제는 특정한 N-아실화 페니실란산의 5원환의 팽창을 처리하여 상응하는 N-아실화 데스아세톡시세팔로스포란산을 생산한다.
경제적으로 가장 중요한 비아실화 세팔로스포린(예: 7-ADCA, 7-ADAC 및 7-ACA)을 수득하기 위해서, 아실기는 적합한 아실라제를 사용하여 효소성 제거한다.
화학적 또는 효소성 생산된 페니실란산 및 세팔로스포란산을 회수하는 공지된 방법은 N-치환된 β-락탐 중간체 및 탈아실화 아미노-β-락탐의 회수에 유용하지 않다. 상기에서 언급된 발효성 생산된 세팔로스포린 화합물을 회수하는 주요 문제는 육즙 또는 배양 여액의 복잡성이다. 육즙은 일반적으로 많은 페니실란산, 예를 들어, 알파-아미노아디필-6-페니실란산, 알파-하이드록시아디필-6-페니실란산, 6-아미노페니실란산(6-APA), 알파-아미노아디필- 및 하이드록시아디필-7-ADCA를 포함하는 각종 세팔로스포란산 및 많은 단백질 물질을 포함한다. 공지된 회수 방법은 순도에 의한 세팔로스포란산 생성물의 허용되는 품질을 제공하지 않는다. 탈아실화에 있어서, 이는 감소된 효소 반감기, 느린 생물전환 속도, 생물 전환 후에 비싼 회수 비용 및/또는 허용되지 않는 오염물질 수준에 의한 문제를 야기한다. 또한, 탈아실화 후, 이러한 불순물은 목적하는 명세의 목적하는 탈아실화 세팔로스포린 화합물의 회수를 방지하거나 적어도 방해한다.
발명의 개요
본 발명은
(a) 화학식 I의 화합물 이외에 6-아미노페니실란산(6-APA) 및 임의로 하나 이상의 N-치환된 β-락탐 화합물을 포함하는 착체 혼합물을 pH 6.5 이하로 산성화하고, 혼합물을 이러한 pH 이하로 10 내지 150℃의 온도에서 유지시키고/거나,
(b) 착체 혼합물을 이산화탄소 공급원과 접촉시키고,
(c) 화학식 I의 세팔로스포란산 화합물을 단계 (a) 및/또는 (b) 후에 수득된 혼합물로부터 회수하는 단계를 포함하여, 착체 혼합물로부터 화학식 I의 세팔로스포란산 화합물을 회수하는 방법을 제공한다.
상기 식에서,
R0는 수소 또는 C1-3알콕시이고,
Y는 CH2, 산소, 황 또는 황의 산화 형태이고,
R1은 수소; 하이드록시; 할로겐; 하이드록시, 할로겐, 아릴, 알콕시(탄소수 1 내지 3) 또는 아실에 의해 임의로 치환된, 포화된 또는 불포화, 직쇄 또는 측쇄 알킬(탄소수 1 내지 5; 하나 이상의 헤테로원자에 의해 임의로 치환된다); 하이드록시 또는 할로겐에 의해 임의로 치환된 알콕시(탄소수 1 내지 3, 하나 이상의 헤테로원자에 의해 임의로 치환된다); 하이드록시, 할로겐, 아미노에 의해 임의로 치환된 탄소수 3 내지 8의 사이클로알킬; 아릴; 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택된 기이고,
R2는 아디필 (1,4-디카복시부탄), 석시닐, 글루타릴, 아디필, 피멜릴, 수베릴, 2-(카복시에틸티오)아세틸, 3-(카복시에틸티오)프로피오닐, 고급 알킬 포화된 및 고급 알킬 불포화 디카복실산으로 이루어진 군로부터 선택된다.
바람직하게는 단계(a)에서 온도는 약 50 내지 약 130℃, 바람직하게는 70 내지 120℃에서 10초 내지 약 1주동안 유지되고, pH는 pH 4.5 이하에서 유지된다. 바람직한 방법에 따라서, 화학식 I의 화합물은 이의 가능한 미생물을 발효에 의해 생산되었으며, 착체 혼합물은 육즙, 배양 여액 또는 발효 후에 육즙으로부터 유도될 수 있는 배양액이다.
화학식 I의 바람직한 화합물은 아디필-7-ADCA, 아디필-7-ADAC 및 아디필-7-ACA로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 양태에 따라서, 단계(c)는 단계(a) 및/또는 (b) 후에 수득된 혼합물을 크로마토그래피하여, 바람직하게는 흡착 크로마토그래피하여, 더욱 바람직하게는 소수성 상호작용 크로마토그래피하여 수행한다.
본 발명의 다른 양태에 따라서, 화학식 I에 따른 세팔로스포린 화합물을 회수하는 방법에서 크로마토그래피의 용도는 흡착 크로마토그래피에 의해, 더욱 바람직하게는 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해, 더욱 더 바람직하게는 모의 이동상 기술을 사용하여 제공된다.
본 발명의 또다른 양태에 따라서,
R0, Y 및 R1이 다음과 같고, R2는 아디필 (1,4-디카복시부탄), 석시닐, 글루타릴, 아디필, 피멜릴, 수베릴, 2-(카복시에틸티오)아세틸, 3-(카복시에틸티오)프로피오닐, 고급 알킬 포화된 및 고급 알킬 불포화 디카복실산으로 이루어진 군로부터 선택되는 화학식 I에 따른 화합물을 제조하고;
화학식 I의 화합물을 탈아실화하여 화학식 II에 따른 화합물을 포함하는 전환 용액을 수득하는 단계를 포함하여, 화학식 II의 화합물을 제조하는 방법이 제공된다.
상기 식에서,
R0는 수소 또는 C1-3알콕시이고,
Y는 CH2, 산소, 황 또는 황의 산화 형태이고,
R1은 수소; 하이드록시; 할로겐; 하이드록시, 할로겐, 아릴, 알콕시(탄소수 1 내지 3) 또는 아실에 의해 임의로 치환된, 포화된 또는 불포화, 직쇄 또는 측쇄 알킬(탄소수 1 내지 5; 하나 이상의 헤테로원자에 의해 임의로 치환된다); 하이드록시 또는 할로겐에 의해 임의로 치환된 알콕시(탄소수 1 내지 3, 하나 이상의 헤테로원자에 의해 임의로 치환된다); 하이드록시, 할로겐, 아미노에 의해 임의로 치환된 탄소수 3 내지 8의 사이클로알킬; 아릴; 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택된 기이다.
전환 용액은 바람직하게는 R2로 지시된 분해된 측쇄를 추가로 포함한다.
바람직한 양태에 따라서, 방법은 용액으로부터 결정화, 바람직하게는 활성탄 또는 흡착제 수지와 같은 선택된 제제로 용액을 처리하기 전에 및/또는 후에(조 결정의 가용화 후에, 즉 결정화에 의해) 화학식 II의 화합물을 회수하는 추가 단계를 포함한다. 본 발명의 다른 양태에 따라서 결정화 및/또는 재결정화 동안 또는 전에 용매, 예를 들어, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 이소부탄올, n-부탄올 또는 아세톤 또는 언급된 제제의 조합을 첨가한다. 바람직한 흡착제 수지는 XAD16(CAS No. 102419-63-8), XAD1600(CAS No. 153796-66-8) 및 HP20(CAS No. 55353-13-4)으로부터 선택된다. 본 발명에 따라서 6-아미노페니실란산(6-APA) 수준이 화학식 II의 화합물에 대해서 10ppm 이하인 방법이 바람직하다. 다른 양태에 따라서, 탈아실화 후에 용액을 처리하여 R2로 나타나는 분해된 측쇄를 적어도 일부 제거하는 방법이 제공된다. 이 단계는 화학식 II의 화합물의 결정화 및 가용화(즉, 재결정화) 후에 수행하거나 반복할 수 있다. 또한, 분해된 측쇄의 제거는 결정화 또는 재결정화 후에 수득된 모액에 대해 수행할 수 있다.
따라서, 분해된 측쇄를 적어도 일부 제거하는 처리 다음에 조 결정의 가용화하고 화학식 II의 화합물을 재결정시키는 방법이 제공된다.
바람직하게는 분해된 측쇄를 제거하는 처리는 전환 용액 또는 모액을 또는 둘다 5 이하, 바람직하게는 4 이하, 더욱 바람직하게는 3 가까운 또는 3 이하의 pH에서 막 여과시킴을 특징으로 한다. 따라서, 디카복실산 및 β-락탐 항생제를 포함하는 혼합물로부터 디카복실산을 제거하는 막 여과의 용도가 제공된다. 혼합물은 바람직하게는 화학식 II의 화합물의 결정화 후에 수득된 모액이거나, 화학식 I의 화합물의 탈아실화 후에 수득된 혼합물이다. 막 여과는 바람직하게는 약 5 이하의 pH에서, 바람직하게는 pH 4 이하에서, 더욱 더 바람직하게는 pH 3 이하에서 나노여과에 의해 일어난다. 본 발명의 다른 양태에 따라서, 측쇄 R2가 전환 혼합물로부터 결정화 또는 재결정화에 의해 적어도 일부 제거되는 방법이 제공된다. 본 발명의 또다른 양태에 따라서, 전환 혼합물을 3 미만의 pH로 산성화한 다음에, 이 혼합물을 유기 용매(예: 아세트산아밀, 아세트산부틸, 아세트산에틸, 메틸 이소부틸 케톤, 사이클로헥산온, 이소부탄올 또는 n-부탄올)와 접촉시켜 전환 혼합물로부터 측쇄 R2를 적어도 일부 제거하는 방법이 제공된다.
본 발명은 세팔로스포린 및 세팔로스포린 유도체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 세팔로스포린 및 다른 β-락탐 화합물의 착체 혼합물로부터 세팔로스포린 및 이의 유도체의 회수에 관한 것이다. 본 발명은 또한, β-락탐 화합물 및 측쇄의 혼합물로부터 탈아실화 세팔로스포린의 회수, 예를 들어, 효소성 측쇄 제거에 의해 수득가능한 것에 관한 것이다.
본 발명은
(a) 화학식 I의 화합물 이외에 6-아미노페니실란산(6-APA) 및 임의로 하나 이상의 N-치환된 페니실란산 화합물을 포함하는 착체 혼합물을 pH 6.5 이하로 산성화하고, 혼합물을 이러한 pH 이하로 10 내지 150℃의 온도에서 유지시키고/거나,
(b) 착체 혼합물을 이산화탄소 공급원과 접촉시키고,
(c) 화학식 I의 세팔로스포란산 화합물을 단계 (a) 및/또는 (b) 후에 수득된 혼합물로부터 회수하는 단계를 포함하여, 착체 혼합물로부터 화학식 I의 세팔로스포란산 화합물을 회수하는 방법에 관한 것이다.
(화학식 I)
상기 식에서,
R0는 수소 또는 C1-3알콕시이고,
Y는 CH2, 산소, 황 또는 황의 산화 형태이고,
R1은 수소; 하이드록시; 할로겐; 하이드록시, 할로겐, 아릴, 알콕시(탄소수 1 내지 3) 또는 아실에 의해 임의로 치환된, 포화된 또는 불포화, 직쇄 또는 측쇄 알킬(탄소수 1 내지 5; 하나 이상의 헤테로원자에 의해 임의로 치환된다); 하이드록시 또는 할로겐에 의해 임의로 치환된 알콕시(탄소수 1 내지 3, 하나 이상의 헤테로원자에 의해 임의로 치환된다); 하이드록시, 할로겐, 아미노에 의해 임의로 치환된 탄소수 3 내지 8의 사이클로알킬; 아릴; 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택된 기이고,
R2는 아디필 (1,4-디카복시부탄), 석시닐, 글루타릴, 아디필, 피멜릴, 수베릴, 2-(카복시에틸티오)아세틸, 3-(카복시에틸티오)프로피오닐, 고급 알킬 포화된 및 고급 알킬 불포화 디카복실산으로 이루어진 군로부터 선택된다.
본 발명은 또한, 화학식 II의 세팔로스포린을 제조하는 방법에 관한 것이다.
(화학식 II)
상기 식에서,
R0는 수소 또는 C1-3알콕시이고,
Y는 CH2, 산소, 황 또는 황의 산화 형태이고,
R1은 수소; 하이드록시; 할로겐; 하이드록시, 할로겐, 아릴, 알콕시(탄소수 1 내지 3) 또는 아실에 의해 임의로 치환된, 포화된 또는 불포화, 직쇄 또는 측쇄 알킬(탄소수 1 내지 5; 하나 이상의 헤테로원자에 의해 임의로 치환된다); 하이드록시 또는 할로겐에 의해 임의로 치환된 알콕시(탄소수 1 내지 3, 하나 이상의 헤테로원자에 의해 임의로 치환된다); 하이드록시, 할로겐, 아미노에 의해 임의로 치환된 탄소수 3 내지 8의 사이클로알킬; 아릴; 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택된 기이다.
화학식 I에 따른 화합물은 본원에서 정의된 바와 같은 착체 혼합물을 생성하는 일련의 단계에 의해 제조될 수 있으며, 이로부터 화학식 I에 따른 화합물의 회수가 달성된다. 명세서 및 청구의 범위를 위해서, 착체 혼합물은 N-치환된 세팔로스포린 화합물 및 치환된 또는 비치환 β-락탐 화합물을 포함하는 혼합물로서 정의된다.
화학식 II의 화합물은 다음 일련의 단계에 의해 수득된다:
(a) 화학식 I의 화합물을 회수하고, 바람직하게는 정제시키고,
(b) 바람직하게 정제된 화학식 I의 화합물을 탈아실화하여 화학식 II의 화합물을 포함하는 용액(전환 용액)을 수득하고,
(c) 화학식 II의 화합물을 회수하고, 바람직하게는 정제시킨다.
N-치환된 세팔로스포란산을 발효성 생산하는 장애물 중의 하나는 바람직하지 않은 오염 β-락탐 성분, 예를 들어, N-치환된 6-아미노 페니실란산의 존재이다. 본 발명의 한 양태에 따라서, 이들 오염물은 육즙 또는 육즙의 여액 또는 생물량 분리 기술을 사용하여 육즙으로부터 유도된 액체를, 바람직하게는 상승된 온도를 수반하는 산성화 조건하에 배양하여 현저하게 감소시킬 수 있음이 밝혀졌다. 육즙은 6.5 미만의 pH로, 바람직하게는 4.5 미만의 pH로 낮추어, 하나 이상의 공지된 산, 예를 들어, 황산, 염산 또는 질산 또는 이들의 조합을 사용하여 산성화한다. 작업 온도는 20 내지 150℃, 바람직하게는 70 내지 120℃의 범위이다. 이러한 조건에서 체류 시간은 (150℃에서) 수초 또는 (20℃에서) 수일, 바람직하게는 10초 내지 60분의 범위이다. pH/온도 처리는 화학식 II의 화합물에 대해서 인자 100, 바람직하게는 1000, 더욱 바람직하게는 1,000,000의 N-치환된 6-APA 감소를 제공하는 기간동안 바람직하게 수행된다. 이 단계는 생물량 분리 전후에 수행될 수 있으며, 뱃치식으로 또는 연속식으로 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따라서, 오염된 페니실린 성분, 예를 들어, N-치환된 6-APA는 육즙, 육즙의 여액, 용출액, 전환 용액 또는 화학식 I에 따른 용해된 오염 세팔로스포린을 대표적으로 pH 5 내지 7에서 이산화탄소와 접촉시켜 현저하게 감소된다. 이산화탄소는 용액에 적당한 방식으로, 예를 들어, 고체 또는 기체 형태 또는 탄산염 이온의 용액으로서 첨가할 수 있다. 용액은 10 내지 60℃, 바람직하게는 20 내지 40℃의 온도에서 CO2공급원과 접촉시키며, 여기에서 용액은 분자 CO2로 4 내지 10시간동안 포화된다. 페니실린 성분을 감소시킨 후, 화학식 I에 따른 세팔로스포린의 정제는 상기에서 언급한 바와 같이 수득될 수 있다.
본원에서 정의된 착체 혼합물은 어떠한 기원도 함유할 수 있지만, 바람직하게는, 생산을 일으키는 조건하에 발효 후에 수득된 배양 육즙 또는 배양 여액, 화학식 I의 화합물의 7-N-아실화 변형을 생산할 수 있는 미생물이며, 여기에서 아실기는 세팔로스포린 생합성 경로에서 환-팽창 효소(데스아세톡시세팔로스포린 신테타제 - DAOCS - 또는 데스아세틸세팔로스포린 신테타제 DACS로 종종 언급되는 이관능성 익스팬다제/하이드록실라제)를 지지하는 아실기일 수 있다. 화학식 I에 따른 7-N 아실-치환된 화합물을 생체내에서 제조하는 생물공정은 WO 93/05158(아디필-7-ADCA); WO 93/08287(아디필-7-ADAC 및 아디필-7-ACA), WO 95/04148(2-(카복시에틸티오)아세틸-7-ADCA), WO 95/04149(3-(카복시에틸티오)프로피오닐-7-ADCA 및 고급 알킬 포화된 또는 불포화 디카복실산)에 기술되어 있다. 이들 PCT 출원의 해당 부분은 본원에서 참고로 인용된다. 바람직한 아실기는 일반적으로 디카복실산이며, 예를 들어, 아디필 (1,4-디카복시부탄), 2-(카복시에틸티오)아세틸, 3-(카복시에틸티오)프로피오닐, 무콘산 등이다. 적합한 숙주 미생물은 Penicillium chrysogeum 및 Acremonium chrysogenum을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 이관능성 익스팬다제/하이드록실라제를 포함하여 적합한 익스팬다제의 공급원은 Streptomyces clavuligerus 및 Acremonium chrysogenum을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 유전학적으로 숙주 세포를 개질시키는 데에 사용될 수 있는, 형질전환, 형질전환된 세포의 선택 및 사상 진균에 대한 발현 조절요소에 대한 방법은 β-락탐 생산(사상) 진균의 재조합 DNA 기술 분야에 익히 공지되어 있다.
바람직하게는, 육즙을 산성화 및 임의의 온도 증가 전에 적합한 수단, 예를 들어, 막 여과, 진공 여과, 한외여과 또는 이의 병용에 의한 여과와 같은 생물량 분리에 먼저 적용한다. 생물량 분리의 다른 수단이 마찬가지로 적합하다.
pH 감소 단계 및 임의의 온도 단계 후에, 화학식 I에 따른 회수된 화합물은 바람직하게는 추가 정제에 적용하여 바람직하지 않은 β-락탐 성분, 특히 바람직하지 않은 N-치환된 세팔로스포린 및 페니실린을 적어도 일부 제거한다. 추가 정제는 유기 용매를 사용하는 추출에 의해 수행할 수 있다. 추출의 경우에, 추출물을 세척하고, N-치환된 세팔로스포린을 유기 상으로부터 수성 상으로 역 추출하고, 수성 상을 제거하는 것이 유리하다고 밝혀졌다. 추출 유기 용매는 아세트산아밀, 아세트산부틸, 아세트산에틸, 메틸 이소부틸 케톤, 사이클로헥산온, 이소-부탄올 또는 n-부탄올 등으로부터 선택될 수 있다. 공정에서 바람직한 정제 단계는 유기 용매를 사용하는 추출보다는, N-치환된 세팔로스포린의 정제에 대한 크로마토그래피의 사용이다. 크로마토그래피의 잇점은 폐기 문제 및 오염 문제를 유발할 뿐만 아니라 최종 생성물의 순도를 개선시키는 용매의 부재에 있다. 이온 교환 크로마토그래피 또는 흡착 크로마토그래피가 바람직하며, 더욱 바람직하게는 소수성 상호작용 크로마토그래피이다. 여액은 흡착제를 사용하는 크로마토그래피에 적용한다. 흡착제는 활성탄, 예를 들어, Norit CG-1 또는 Cecarbon GAC 40; 흡착제 수지, 예를 들어, 스티렌-디비닐벤젠 공중합반응물, 예를 들어, Mitsubishi Kasei Coropration으로부터의, Dianion HP 20(CAS No. 55353-13-4), Dianion HP 21(CAS No. 92529-04-9), Dianion SP 207(CAS No. 98225-81-1) 또는 Dianion SP825 또는 Rohm and Haas로 부터의 Amberlite XAD 1180(CAS No. 97396-56-0), Amberlite XAD 1600(CAS No. 153796-66-8) 또는 Amberlite XAD16(CAS No.102419-63-8) 또는 TosoHaas로부터의 Amberchrom CG 161(CAS No. 131688-63-6)을 포함하며; 바람직하게는 XAD 16 또는 XAD 1600이다.
N-치환된 세팔로스포린을 흡착시키기 전에, 착체 혼합물의 pH를 하나 이상의 공지된 산, 예를 들어, 황산, 염산 또는 질산 또는 이들의 조합에 의해서 1.0 내지 5.0으로, 바람직하게는 2.5 내지 3.5로 조절한다. 처리 온도는 0 내지 50℃, 바람직하게는 5 내지 25℃의 범위이다. 처리 압력은 0 내지 1.0MPa 초과압력의 범위이다.
바람직하지 않은 β-락탐 성분, 특히 바람직하지 않은 N-치환된 세팔로스포린, 예를 들어, 알파-아미노아디필세팔로스포란산은 또한, 흡착제상에 흡착되지만, 목적하는 N-치환된 세팔로스포린으로 대체된다.
흡착시킨 후, 물로 세척하여 바람직하지 않은 β-락탐 성분을 흡착제 사이의 공극 용적으로부터 제거하고 약하게 결합된 바람직하지 않은 β-락탐 성분을 흡착제로부터 탈착시킨다. 물은 하나 이상의 공지된 산, 예를 들어, 황산, 염산 또는 질산 또는 이들의 조합에 의해 pH 1.0으로 낮추어 산성화할 수 있다. 삼투압을 증가시키기 위해서, 염을 물에 첨가할 수 있다. 처리 온도는 0 내지 50℃, 바람직하게는 20 내지 40℃에서이다. 처리 압력은 0 내지 1.0MPa 초과압력의 범위이다.
용출은 적합한 완충제, 예를 들어, 아세테이트, 인산염, 탄산염, 중탄산염 또는 아디프산염을 사용하여 수행할 수 있지만, 묽은 유기 용매(예: 아세톤, 이소프로판올) 또는 묽은 염기(예: 암모늄, 부식제)도 사용할 수 있다. 작업 온도는 0 내지 80℃, 바람직하게는 10 내지 40℃의 범위이다. 처리 압력은 0 내지 1.0MPa 초과압력의 범위이다.
흡착제의 재생은 일반적으로 적용되는 방법, 예를 들어, 묽은 염기, 묽은 산을 사용하거나 수혼화성 용매(예: 아세톤, 메탄올, 에탄올 또는 이소-프로판올) 또는 이들의 조합을 사용하여 수행할 수 있다. 임의로 100℃이하로 가열을 수행할 수 있다.
재생 액체는 물로 세척하여 제거할 수 있다. 물은 하나 이상의 공지된 산, 예를 들어, 황산, 염산 또는 질산 또는 이들의 조합에 의해서 pH 1.0으로 낮추어 산성화할 수 있다. 크로마토그래피 단계는 몇가지 유형의 장치에서, 예를 들어, 단일 컬럼에서 수행할 수 있지만, 모의 이동 베드 기술을 적용할 수 있다. 이러한 모의 이동 베드 기술에 대해서, 몇가지 유형의 장치를 이용할 수 있으며, 예를 들어, U.S. Filter로부터의 ADSEP 시스템, Advanced Separation Technology로부터의 ISEP/CSEP 시스템, 예를 들어, Applexion으로부터의 'merry-go-around' 시스템 또는 Universal Oil Products Company(UOP)로부터의 SORBEX 시스템이다.
또는, 완충제는 나노여과에 의해 용출액으로부터 제거할 수 있다. 이러한 막 여과에서 막의 특성은 목적하는 N-치환된 세팔로스포린에 대한 높은 보유도 및 완충제에 대한 낮은 보유도를 나타낸다. 임의로 농축 단계는 적합한 농축(예: 진공 증발, 역삼투, 나노여과, 또는 크로마토그래피 또는 추출 후에 나노여과)에 의해 적용된다.
회수된 N-아실화 화합물은 이어서 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 사용하여 탈아실화시킨다. 바람직한 방법은 적합한 디카복실레이트 아실라제를 사용하는 효소성 탈아실화이다. 야생형 또는 돌연변이된 많은 적합한 아실라제가 다음을 포함하여 당해 분야에 공지되어 있지만, 이로 제한되지 않는다: Bacillus(EP 제0 525 861호; EP 제0 415 846호), Pseudomonas(EP 제0 482 844호; EP 제0 525 861호; EP 제0 475 652호; EP 제0 663 445호), Achromobacter(EP 제0 525 861호), Alcaligenes faecalis(EP 제0 638 649호), Acinetobacter(EP 제0 469 919호), Arthrobacter(EP 제0 283 218호), Escherichia coli(US 제3,945,888호), Kluyvera citroohila, Proteus rettgeri(US 제3,915,798호) 등. 디카복실레이트 아실라제는 바람직하게는 Pseudomonas SE83 또는 SY-77로부터의 것이다. 임의로, 아실라제는 WO 91/16435, WO 97/20053, WO 97/40175에 기술된 바와 같이, 기질에 대한 친화성을 증가시키거나 변화시키는 돌연변이 형태일 수 있다. 본 발명에 따르는 N-아실화 세팔로스포린 화합물을 탈아실화시키는 방법은 미국 특허 제5,677,141호에 기술된 바와 같이, 아실라제를 생산할 수 있는 미생물과 기질을 접촉시키는 방법에 의한 것이다.
아실라제는 당해 분야에 익히 공지된 것과 같은 기술을 사용하여, 막(EP 제0 243 404호) 또는 자유 유동성 담체(예: 글루타르알데히드 기제 담체 또는 아자-락톤 중합체(EP 제0 730 035호))상에 고정될 수 있다(US 제3,930,949호). 미국 특허 제5, 521,068호에 기술된 바와 같이, 생산물(투과물)로부터 반응 혼합물(보유물)을 분리하는 막을 사용하는 비-고정 아실라제가 또한 고려된다. 공정은 뱃치식 또는 (반)연속식일 수 있으며, 이는 모두 익히 공지되어 있고 본 발명에 중요하지 않다. 효소성 탈아실화 반응은 일반적으로 교반 탱크 반응기에서, 바람직하게는 불활성, 체 플레이트의 존재하에 또는 부재하에 수행하여 반응 생산물로부터 고정 효소를 용이하게 분리한다. pH는 일반적으로 반응 동안에 조절되어 어떠한 종류의 염기(예: 암모늄, 부식제, 탄산염, 중탄산염)에 의해서도 (디카복실) 측쇄 제거의 결과로서 pH 변화를 보상한다. pH는 반응기에서 및/또는 반응기상의 순환 루프에서 조절될 수 있다. 다른 파라미터, 예를 들어, 온도, 탈아실화 생성물 또는 측쇄 농도 등이 또한, 반응 속도 및/또는 평형에 대한 이러한 파라미터의 효과를 고려하여 조절될 수 있다.
설파이트(S2O5 2-, HSO3-, SO3 2-), EDTA, 디티오트레이톨(DTT)과 같은 추가의 안정화제를 탈아실화 전에 및/또는 탈아실화 동안에 첨가할 수 있다.
일반적으로, 화학식 I의 탈아실화 세팔로스포린 화합물은 계속해서 단계의 적합한 병용을 사용하여 회수한다. 임의로 농축 단계는 진공 증발, 역삼투, 나노여과, 또는 결정화 전에 나노여과와 같은 수단에 의해 적용할 수 있다. 임의로 수혼화성 용매를 첨가할 수 있다. 임의로, 결정화 전에 용액은 활성탄 또는 흡착제 수지로 처리하여 정제할 수 있다. 임의로, 결정화 전에 측쇄는 수성 상을 산성화하고, 측쇄를 추출 유기 용매로 추출하고, 상을 분리함을 특징으로 하여 제거할 수 있다. 추출 유기 용매는 아세트산아밀, 아세트산부틸, 아세트산에틸, 메틸 이소부틸 케톤, 사이클로헥산온, 이소-부탄올, n-부탄올 등으로부터 선택될 수 있다.
생성물은 수득된 수성 상으로부터 여러 방법으로 결정화할 수 있다. 가장 바람직한 처리 방식은 수용액을 중화시고, 이어서 하나 이상의 공지된 산(예: H2SO4, HCl, HNO3또는 이들의 조합)을 사용하여 1 내지 6 단계로 pH를 3 내지 5로 낮추어 저하시키는 것이다. 이는 바람직하게는 일련의 상호연결된 1 내지 6개의 연속적으로 작동되는 결정기 세트를 사용하는 연속 방식으로 수행한다. 또한, 뱃치식 결정화, 반연속식 결정화 또는 일치 결정화를 적용할 수 있다. 상기와 동일한 방법으로 직접, 제1 중화의 부재하에 결정화를 수행할 수 있다. 본 발명의 한 양태에 따라서, 수혼화성 용매(예: 메탄올, 에탄올, 이소-프로판올, n-부탄올, 아세톤 등)를 첨가하여 화학식 II에 따른 세팔로스포린의 품질을 개선시킬 수 있음이 밝혀졌다. 임의로, 결정화 전에 화학식 II에 따른 화합물의 품질을 개선시키기 위해서, 용액을 활성탄에 의해 또는 흡착제 수지에 의해 처리할 수 있다.
화학식 II에 따른 세팔로스포린의 품질은 임의로 흡착제 수지, 활성탄 및/또는 에탄올 및/또는 아세테이트로 처리한 후에, 결정화에 의해 추가로 개선시킬 수 있음이 밝혀졌다. 이는 화학식 II에 따른 세팔로스포린을 0.5 내지 10.0, 바람직하게는 7.5 내지 8.5 범위의 pH에서 용해시키고 생성물을 결정화시킴을 특징으로 한다. 생성물은 여러 방법으로 결정화할 수 있다. 가장 바람직한 처리 방식은 수용액을 중화시킨 다음에, 이어서 하나 이상의 공지된 산(예: H2SO4, HCl, HNO3또는 이들의 조합)을 사용하여 1 내지 6 단계에서의 pH를 3 내지 5로 낮추어 저하시키는 것이다. 이는 일련의 상호연결된 1 내지 6개의 연속적으로 작동되는 결정기 세트를 사용하는 연속 방식으로 수행할 수 있다. 또한, 뱃치식 결정화, 반연속식 결정화 또는 일치 결정화를 적용할 수 있다. 본 발명의 한 양태에 따라서, 수혼화성 용매(예: 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 아세톤, 이소-부탄올 및 n-부탄올)를 첨가하여 화학식 II에 따른 세팔로스포린의 품질을 개선시킬 수 있음이 밝혀졌다.
또한, 화학식 II에 따른 세팔로스포린의 품질은 전환 용액 및/또는 화학식 II에 따른 용해된 세팔로스포린의 용액을 흡착제로 처리하여 개선시킬 수 있음이 밝혀졌다. 흡착제는 활성탄, 예를 들어, Norit Ultra SX; 또는 흡착제 수지, 예를 들어, 스티렌-디비닐벤젠 공중합반응물, 예를 들어, Mitsubishi Kasei Coropration으로부터의 Dianion HP 20(CAS No. 55353-13-4), Dianion HP 21(CAS No. 92529-04-9), 또는 Dianion SP 207(CAS No. 98225-81-1) 또는 Rohm and Haas로부터의 Amerlite XAD 1180(CAS No. 97396-56-0), Amerlite XAD 1600(CAS No. 153796-66-8) 또는 Amerlite XAD 16(CAS No. 102419-63-8) 또는 TosoHaas로부터의 Amerlite CG 161(CAS No. 131688-63-6)을 포함하며; 바람직하게는 XAD 16, XAD 1600 또는 HP20이다.
결정은 여과 또는 원심분리에 의해 분리하고, 통상적인 연속식 또는 뱃치식 건조기에서 건조시킨다. 결정은 어떠한 종류의 밀(예: 볼 밀, 제트 밀 등)에 의해서도 분쇄될 수 있다.
임의로 수혼화성 용매는 결정화 동안에 첨가할 수 있다. 용해시킨 후, 용액은 활성탄 또는 흡착제 수지로 처리할 수 있다.
이 방법은 이전에 언급된, 현재 공지된 방법보다 우수한 총 수율 및 생성물 품질을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따라서, 전환 용액 또는 모액(화학식 II에 따른 화합물의 결정화 후에 수득된 액체)으로부터 아디프산을 제거하고 회수하는 방법이 제공된다. 아디프산은 유리하게는 막 여과를 낮은 pH, 예를 들어, pH 5 이하, 바람직하게는 pH 4 이하, 더욱 바람직하게는 pH 3 이하 또는 pH 3 가까이에서 사용하여 분리할 수 있음이 밝혀졌다. 본 발명에 따라서 여과가 역삼투에 의해 수행되는 양태가 바람직하다.
원료를 절약하는 이외에, 이렇게 수행하는 잇점은 이렇게 처리된 용액의 결정화시에 순도 및/또는 수율에 있다.
본 발명은 다음의 비제한 실시예에 의해 추가로 예시된다.
실험
특히 6-APA, 아디필-6-APA 및 알파-아미노-아디필-7-세팔로스포란산을 바람직하지 않은 오염물로서 포함하는, 착체 혼합물로서 아디필-7-ADCA를 포함하는 발효 육즙은 1993년 3월 18일자로 공개된 국제 특허 출원 WO 93/05158에 기술된 바와 같이, Streptomyces clavuligerus로부터의 익스팬다제(데스아세톡시세팔로스포린 C 신테타제)로 형질전환된 Penicillium chrysogenum 균주를 발효시켜 수득한다.
형질전환된 Penicillium 균주를 본원에서 참고로 인용된, WO 93/05158의 실시예 1에 기술된 바와 같이 배양하였다.
발효한 지 5 내지 7일 후, 육즙은 회수 실험에 의해 취하였다.
이러한 착제 혼합물은 또한, 6-아미노페니실란산, 아디필-6-아미노페니실란산, 알파-아미노아디필-6-아미노페니실란산, 아디필-7-아미노데스아세톡시세팔로스포란산 및 알파-아미노아디필-7-세팔로스포란산의 수성 혼합물을 제조하여 모의실험할 수 있다.
실시예 1
pH/열-처리
본 실시예는 착체 혼합물로부터 바람직하지 않은 β-락탐 성분의 제거시에 pH-처리, 바람직하게는 pH + 상승된 온도 처리의 병용의 잇점을 나타낸다.
아디필-7-ADCA 및 페니실란산의 착체 혼합물 및 세팔로스포란산 오염물을 함유하는, Penicillium chrysogenum의 발효로부터의 육즙(실험 참고)을 여과한다. 합친 여액의 총 용적이 최초 육즙 용적의 약 2배가 될 때까지, 농축물을 공정수로 세척한다. 다음 실험이 수행되었다:
A. 여액 부분을 pH 3.5로 산성화하고, 70℃ 이하로 가열하고, 30분 후에 40℃로 냉각시킨다.
B. 투과물 부분을 pH 2.7로 산성화하고, 110℃ 이하로 가열하고, 4분 후에 25℃로 냉각시킨다; 또는
C. 투과물 부분을 pH 3.0으로 산성화하고, 추가로 처리하지 않는다.
다음에, 예비처리된 용액을 후 처리하여 화학식 II에 따른 화합물; 7-ADCA를 수득한다.
흡착 크로마토그래피
3가지 용액(A 내지 C)을 Seitz K100 여과기상에서 여과시키고, 이후에 용액을 pH 3.0에서 1.6L의 XAD-1600 수지로 충전된 컬럼상에서 펌핑한 다음에, 수지를 물 4.8L로 세척하고, 0.2M 중탄산염 용액으로 용출시켰다. 제1 용출 분획(1.1L)을 취하여 폐기한다. 제2 분획(3.2L)을 수집하고 분석한다. 수지를 부식제 및 아세톤으로 세척하여 정제하고, 산성화된 물로 다시 조건조절한다.
농축
용출물을 20 내지 30℃ 진공(5 내지 10mmHg)에서, L당 40g 아디필-7-ADCA의 농도가 수득될 때까지 농축시켰다.
효소성 탈아실화
계속해서, 아디필-7-ADCA를 다음과 같이 아실라제로 처리한다. 1L의 용출물에, 메타중아황산나트륨 1g, 20mM EDTA 및 (Pseudomonas SE83 디카복실레이트 아실라제를 포함하는) 고정 아실라제 100g을 첨가하였다. 30℃에서, 용액을 2시간동안 교반하였다. pH는 4N 수산화나트륨을 사용하여 8.5에서 유지하였다. 고정 아실라제 및 액체는 유리 소결된 여과기를 사용하여 분리하였다.
7-ADCA의 결정화
7-아미노 데스아세톡시 세팔로스포란산(7-ADCA)은 pH를 교반하에, 30℃의 온도에서 3.6으로 저하시켜 침전시키고, 45분내에 용액의 pH는 6N 황산을 사용하여 3.6으로 저하시켰다. 20℃로 냉각시킨 후, 결정을 유리 소결된 여과기상에서 분리시키고, 물로 세척하고, 35℃에서 건조시켰다.
7-ADCA 결정의 분할
7-ADCA는 암모니아를 사용하여 용해시켰다. 이의 끝에 7-ADCA 15g을 물 255ml에 현탁시켰다. 7-ADCA는 4N 수산화암모늄을 사용하여 7.5 내지 8.5의 pH에서 용해시켰다. 유리 소결된 여과기상에서 여과시킨 후, 물을 첨가하여 용액 300ml를 수득하였다.
흡착제 수지로의 처리
용액을 흡착제 수지로 처리하였다. 45분내에 용액을 15ml의 XAD1600상에서 펌핑하였다. 이어서, 물 75ml를 수지상에서 펌핑하여 용액 375ml를 수득하였다.
재결정
7-ADCA는 pH를 교반하에, 30℃의 온도에서 3.6으로 저하시켜 침전시키고, 45분내에 pH는 6N 황산을 사용하여 3.6으로 저하시켰다. 20℃로 냉각시킨 후, 결정을 유리 소결된 여과기상에서 분리시키고, 물로 세척하고, 35℃에서 건조시켰다.
이렇게 생성된 7-ADCA는 6-APA 감소에 의해 우수한 결과를 나타낸다(6-APA 비는 7-ADCA에 대한 것이다).
실험 1A, 1B 및 1C의 결과
실험 6-아미노 페니실란산 함량(ppm)
1A ＜10
1B ＜10
1C 950
명백하게, pH/온도 처리에 의해 아디필-7-ADCA 제조의 6-아미노페니실란산 오염 수준이 감소된다.
pH, 처리 온도 및 시간 사이의 관계는 10-6의 6-아미노페니실란산의 고정된 감소율에 대해 측정되었다(표 1b).
6-APA 감소율 pH 온도(C) 시간(S) 시간(min) 시간(h)
10-6 3 25 35050 584 9.74
10-6 3 50 3057 50.9 0.85
10-6 3 75 378 6.3 0.11
10-6 3 100 62 1.0 0.02
10-6 4 25 148857 2481 41.35
10-6 4 50 12982 216.4 3.61
10-6 4 75 1607 26.8 0.45
10-6 4 100 263 4.4 0.07
실시예 2
흡착 크로마토그래피
본 실시예는 (a) 흡착 크로마토그래피를 사용하는 경우, 컬럼의 부하도의 효과(2A 내지 2D), (b) 용출 전에 상이한 양의 물을 사용하여 컬럼을 세척하는 효과(2E 내지 2G), (c) 아디필-7-ADCA의 정제에 대한 피이드의 pH의 효과(2H 내지 2J)를 나타낸다. 흡착 크로마토그래피가 모의 이동 베드 방식으로 수행되는 양태는 실험 2K로서 제공된다.
육즙을 실시예 1A에 기술된 바와 같이 예비처리한다. 이어서, 아디필-7-아미노-데스아세톡시 세팔로스포란산은, 용액을 1.6L의 XAD 1600 수지로 충전된 컬럼상에서 펌핑함으로써 흡착 크로마토그래피하여 정제시키고, 여러 양의 물로 세척하고(2A 내지 2D 및 2H 내지 2K: 4.8L; 2E 내지 2F: 표 2b 참고), 0.2M 중탄산염 용액으로 용출시켰다. 제1 용출 분획(1.1L)를 취하여 폐기한다. 제2 분획(3.2L)을 수집하고 분석한다. 수지는 부식제 및 아세톤으로 세척하여 정제시키고, 산성화된 물로 다시 조건조절한다. 공정 조건의 많은 변화가 적용되었다(표 2 참고). 감소율은 다음과 같이 계산된다: (comp-i피이드/comp-l피이드)/(comp-i용출/comp-l용출).
표 2a. 실험 2의 결과
실험 피이드 용출(g) 감소율(-) comp 1(ppm)
comp1(g) comp2(g) comp3(g) comp1(g) comp2(g) comp3(g) comp2(g) comp3(g)
2A 34 3.3 9.3 30 3.1 5.9 1 1
2B 80 5.9 18.5 70 0.5 0.09 10 173 ＜6
2C 127 10.5 32.8 76 0.3 0.07 24 301 19
2D 255 18.2 59.4 67 0.1 0.03 38 501 30
comp 1: 아디필-7-ADCAcomp 2: 알파-하이드록시아디필-7-ADCAcomp 3: 알파-아미노아디필-7-ADCAcomp 4: comp 1에 대한 6-APA 함량
이들 결과는 용출액에서 화합물 2 및 3의 환원에 대한 컬럼의 과부하의 긍정적 효과를 명백하게 나타낸다.
표 2b. 실험 2의 결과
실험 피이드 세척액 용출 감소율(-)
comp1(g) comp2(g) comp3(g) (1) comp1(g) comp2(g) comp3(g) comp2 comp3
2E 85 6.6 14.0 1.6 81 2.1 1.2 3 11
2F 74 6.4 12.6 4.8 71 1.1 0.13 6 94
2G 75 5.8 13.0 7.3 68 0.5 0.1 12 122
comp 1: 아디필-7-ADCAcomp 2: 알파-하이드록시아디필-7-ADCAcomp 3: 알파-아미노아디필-7-ADCA
실시예 2b는 중탄산나트륨으로 용출시키기 전에, 바람직하지 않은 세팔로스포린 화합물의 환원에 대한, 연장된 세척의 긍정적 효과를 나타낸다.
상기 실시예는 바람직하지 않은 7-N-아실화 세팔로스포린 화합물의 환원에 대한, 결정화가 수행되는 pH의 효과를 나타낸다. H2SO4가 산으로서 사용되었다.
본 실시예는 소위 모의 이동 베드 기술에 따라서 수행되는 kg 규모의 흡착 크로마토그래피의 사용을 예시한다. 기술은 추가로 용이하게 스케일을 증가시킬 수 있다.
이렇게 처리된 분획 2A 내지 2K를 아실라제로 처리하여 실시예 1에 기술된 바와 같은 7-ADCA를 제조하였다. 실시예 3에 예시된 바와 같이, 우수한 전환 결과가 수득되었다.
실시예 3
효소성 전환
본 실시예는 아디필-7-ADCA를 7-ADCA로 효소성 전환시킨 결과를 예시한다. 아디필-7-ADCA는 실시예 2K에 기술된 바와 같이 회수하였다(실시예 1A, 흡착 크로마토그래피에 따른 pH 처리는 과부하 및 세척에 의해 최적화되었다). 전환은 실시예 1에 기술된 바와 같이, 표 3에 지시된 pH에서 수행하였다. 실험 A 내지 E는 상이한 뱃치를 나타낸다.
표 3
실험 기질comp 1(mmol) 기질comp 2(mmol) pH(-) 생성물스트림 comp 1(mmol) 생성물스트림 comp 1(mmol)
A 69.7 2.2 8.5 1.1 68.6
B 144.2 2.4 8.5 5.9 143.3
C 181.4 2.3 8.5 13.5 174.5
D 113.1 1.7 8 5.4 108.7
E 113.4 3.1 9 1.2 112.2
comp 1: 아디필-7-ADCAcomp 2: 7-ADCA
전환률 및 수율은, 아디필-7-ADCA를 비처리에 비해서 pH/온도 단계를 사용하여 예비처리하는 경우, 우수하다. 크로마토그래피를 사용하는 추가 정제는 순도를 추가로 개선시킨다(표에는 나타나지 않음).
실시예 4
조 결정화
육즙을 pH/열 처리하고(실시예 1), 이는 실시예 2에 기술된 바와 같이 흡착 크로마토그래피하여 아디필-7-ADCA가 풍부하게 만든다. 이어서, 전환은 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행하였다.
전환 용액(탈아실화 후에 수득된 용액)을 역삼투를 사용하여 농축시켜 농도를 증가시켰다. 용액 부분을 취하고, 7-ADCA는 pH를 3.6, 4 또는 5로 저하시켜 결정화시켰다(표 4a 참고).
표 4a 조 결정화
실험 용액중의 comp 1 pH(-) 분리, 세척 및건조 후의 생성물(g) 생성물 중의comp 1(%)
A 49.5 3.6 48.9 97.5
B 49.5 4 48.7 97.4
C 49.5 5 48.2 98
comp 1: 7-ADCA
결정화는 시험되는 모든 pH에서 만족스러웠다. 다음 실험에서 pH는 3.6이었다. 용액을 농축시키는 효과가 예시된다.
표 4b 조 결정화
실험 용액중의 comp 1(g) 분리, 세척 및건조 후의 생성물(g) 생성물 중의comp 1(%)
D 15.5 14.8 94.3
E 36.1 35.7 95.3
F 49.5 48.9 97.5
comp 1: 7-ADCA
명백하게, 결정화 후에 순도 및 수율에 대한, 전환 용액 중의 7-ADCA의 농도의 효과가 있다.
다음 실시예는 생성물 품질에 대한 상이한 흡착제의 효과를 예시한다(용액의 색상 및 투명도).
표 4c 조 결정화
실험 용액중의 comp 1(g) 처리 용액중의 comp 1(%) 425㎚에서 용액중의 색상(-) HCl중의 투명도(EBC)
G 25 HP20 97.2 0.16 3.6
H 25 HP20(2시간) 97.8 0.11 2.4
I 25 IRA67 97.2 0.18 6
J 25 IRA67+HP20 97.7 0.1 0.8
K 25 없음 96.3 0.39 7.3
comp 1: 7-ADCA
실시예 5
용해된 7-아미노 데스아세톡시 세팔로스포란산의 처리
본 실시예는 결정화하기 전에, 7-ADCA 용액을 상이한 흡착제 수지로 처리한 후에 7-ADCA의 투명도 및 색상에 대한 효과를 나타낸다. 7-ADCA을 포함하는 용액은 실시예 2K에 기술된 바와 같이 제조한다(사용되는 흡착 크로마토그래피 컬럼은 XAD-1600 수지이다).
표 5
실험 용해된 comp 1(g) 처리 425㎚에서 용액중의 색상(-) HCl중의 투명도(EBC)
A 40 -- 0.18 4.2
B 40 XAD16 0.05 1.8
C 40 HP20 n.d. 0.5
D 40 XAD1600 0.09 0.5
E 25 n.d. 3.6
F 25 +1% EtOH 0.11 0.6
G 50 +3% EtOH 0.18 0.9
H 50 +2% Coal 0.04 n.d.
I 50 0.17 1.4
J 50 +5% Coal 0.03 0.8
comp 1: 7-아미노 데스아세톡시 세팔로스포란산
실시예 6
n-부탄올로의 추출을 사용하는 아디필-7-ADCA의 회수
아디필-7-ADCA를 포함하는 육즙은 실시예 1에 기술된 바와 같이 처리한다.
산성화한 후, 아디필-ADCA 부분을 흡착 크로마토그래피하여 정제한다. 용액을 XAD 16 수지로 충전된 컬럼상에서 펌핑하고, 물로 세척하고, 0.2M 아세테이트 용액으로 용출시킨다. 아디필 데스아세톡시 세팔로스포란산 함량이 낮은 제1 용출 분획을 취하여 폐기한다. 제2 분획을 수집한다. 수지는 부식제 및 아세톤을 사용하여 세척함으로써 정제시키고, 산성화된 물로 다시 조건조절한다.
아디필-7-ADCA 부분을 추출에 의해 정제시킨 다음에, 추출물을 체척하고, N-치환된 세팔로스포린을 유기 상으로부터 수성 상으로 역 추출하고, 수성 상을 제거한다; 추출 유기 용매는 n-부탄올이다.
아디필-7-ADCA를 고정 아실라제로 처리하여 7-아미노 데스아세톡시 세팔로스포란산(7-ADCA)을 제조한다. 7-ADCA 부분은 pH를 저하시켜 분리한다. 아디필 데스아세톡시 세팔로스포란산은 부식제를 사용하여 용해시켰다. 7-아미노 데스아세톡시 세팔로스포란산은 pH를 저하시켜 분리하였다.
7-아미노 데스아세톡시 세팔로스포란산 수용액 부분을 산성화하고, 측쇄를 추출 유기 용매로 추출한 다음에, 상을 분리한다; 추출 유기 용매는 n-부탄올이었다.
최종적으로 결정 케이크를 여과하고, 세척하고 건조시켰다.
표 6
실험 설명 생성물중의 comp 1 (%) 425㎚에서 용액중의 색상(-) HCl중의 투명도(EBC)
A 추출/추출/결정화 98.3 0.13 2.4
B 크로마토그래피/추출/결정화 98.9 0.09 1.5
C 크로마토그래피/결정화 97.6 0.12 -
D 크로마토그래피/결정화/재결정 98.7 0.05 1.1
comp 1: 7-아미노 데스아세톡시 세팔로스포란산
단일 추출을 사용하는 결과는 표에 나타나지 않지만, 순도는 재결정하지 않아도 크로마토그래피를 사용하는 경우보다 훨씬 나쁘다. 크로마토그래피 및 재결정을 병용하거나 크로마토그래피 및 추출을 병용하면 최상의 결과가 수득된다.
실시예 7
7-ADCA 결정화 모액으로부터 아디프산의 회수
7-ADCA 결정화 모액은 실시예 4에 기술된 바와 같이 수득된다. 아디프산은 HPLC를 사용하여 측정한다: 9μm 양이온 겔(Biorad)로 충전되고, 65℃에서 0.2M H2SO4수용액으로 용출되는 Aminex HPX-87H 컬럼, 300mm x 7.8mm, RI Waters 410 굴절계를 사용하여 검출. 다음에 주어진 실시예에서, 최적 수율이 아닌 최적 순도가 수득된다.
실시예 7A
산성화를 사용하는 아디프산의 회수
20℃에서, 7-ADCA 결정화 모액(250ml, 13.6g/L 아디프산)의 pH는 12M H2SO4수용액을 사용하여 0.7로 저하시켰다. 0℃에서 16시간 후, 결정화는 검출되지 못했다. pH는 6M KOH 수용액을 사용하여 3.4로 상승시켰다. 수득된 결정을 여과시킴으로써 회수하여 물질 7.7g을 수득하고, 이는 추가로 분석되지 않는 염 및 아디프산의 혼합물이었다.
실시예 7B
산성화 및 농축을 사용하는 아디프산의 회수
20℃에서, 7-ADCA 결정화 모액(500ml, 9.4g/L 아디프산)의 pH는 12M H2SO4수용액을 사용하여 1.5로 저하시키고, 감압하에 40℃에서 농축시켜 점착성 혼합물을 수득하고, 이를 여과시켜 분리하고 건조시켜 순도가 53%인 아디프산 6.9g을 수득하였다(수율 78%).
실시예 7C
Nanomax 50 막에 의한 역삼투를 사용하는 아디프산의 회수
20℃에서, 7-ADCA 결정화 모액(500ml, 9.4 내지 18.2g/L 아디프산, 표 참고)의 pH는 6M KOH 수용액 또는 12M H2SO4수용액을 사용하여 표에서 언급된 값으로 조절하였다. 수득된 용액은 Millipore로부터의 Nanomax 50 막을 사용하여 역삼투를 수행하였다. 질소 기체를 사용하여, 30bar의 압력을 적용하여 여액 및 보유물을 수득하였으며, 여기에서 아디프산의 양은 HPLC를 사용하여 측정하였다. 대부분의 경우에, 결정화가 시작될 때까지 감압하에 농축시킨 다음에, 생성물을 여과시키고 건조시키는 것으로 이루어진 후처리 방법을 적용하였다.
표 7
pH 아디프산(g/l) 보유도(%) 투과물 용적(ml) 후처리 후의 수율(g) 후처리 후의 순도(%)
출발물질 투과물 보유물
1.5 13.6 11.0 14.8 26 400 4.4 96
2.0 18.2 13.1 20.8 37 260 2.4 99
3.0 9.4 6.7 8.7 23 360 1.9 97
7.2 13.6 5.3 31.9 83 400 비-후처리 비-후처리
실시예 7D
pH 2.0에서 DK U19F 막에 의한 역삼투를 사용하는 아디프산의 회수
7-ADCA 결정화 모액(100L, 25.0g/L 아디프산)의 pH는 12M H2SO4수용액 2.9L를 사용하여 2.0으로 저하시켰다. 수득된 용액은 Hydro Air Research로부터의 2.5m2막 여과 단위 P2-B200에서 DK U19F 막을 사용하여 물 57L로 역삼투를 수행하였다. 30bar의 압력에서 8.8L/m2/h의 평균 유속에 도달하여 표에 요약된 결과를 수득하였다.
표 8
성분 농도 (g/l) 보유도(%)
출발물질 투과물 보유물
아디프산 25.0 11.6 17.8 35
7-ADCA 0.72 ＜0.01 0.72 ＞99
아디필-7-ADCA 1.51 ＜0.03 1.54 ＞98

Claims (25)

  1. (a) 화학식 I의 화합물 이외에 6-아미노페니실란산(6-APA) 및 임의로 하나 이상의 N-치환된 β-락탐 화합물을 포함하는 착체 혼합물을 pH 6.5 이하로 산성화하고, 혼합물을 상기 pH 이하로 10 내지 150℃의 온도에서 유지시키고/거나,
    (b) 착체 혼합물을 이산화탄소 공급원과 접촉시키고,
    (c) 화학식 I의 세팔로스포란산 화합물을 단계 (a) 및/또는 (b) 후에 수득된 혼합물로부터 회수하는 단계를 포함하는, 착체 혼합물로부터 화학식 I의 N-치환된 세팔로스포란산 화합물을 회수하는 방법.
    (화학식 I)
    상기 식에서,
    R0는 수소 또는 C1-3알콕시이고,
    Y는 CH2, 산소, 황 또는 황의 산화 형태이고,
    R1은 수소; 하이드록시; 할로겐; 하이드록시, 할로겐, 아릴, 알콕시(탄소수 1 내지 3) 또는 아실에 의해 임의로 치환된, 포화 또는 불포화, 직쇄 또는 측쇄 알킬(탄소수 1 내지 5; 하나 이상의 헤테로원자에 의해 임의로 치환된다); 하이드록시 또는 할로겐에 의해 임의로 치환된 알콕시(탄소수 1 내지 3, 하나 이상의 헤테로원자에 의해 임의로 치환된다); 하이드록시, 할로겐, 아미노에 의해 임의로 치환된 탄소수 3 내지 8의 사이클로알킬; 아릴; 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택된 기이고,
    R2는 아디필 (1,4-디카복시부탄), 석시닐, 글루타릴, 아디필, 피멜릴, 수베릴, 2-(카복시에틸티오)아세틸, 3-(카복시에틸티오)프로피오닐, 고급 알킬 포화 및 고급 알킬 불포화 디카복실산으로 이루어진 군로부터 선택된다.
  2. 제 1 항에 있어서, 단계(a)에서 온도가 약 50 내지 약 130℃, 바람직하게는 70 내지 120℃에서, 10초 내지 약 1일동안 유지되고, pH가 4.5 이하에서 유지됨을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 화합물이 이의 가능한 미생물의 발효에 의해 제조되고, 착제 혼합물은 육즙, 배양 여액 또는 발효 후에 육즙으로부터 유도될 수 있는 배양액임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중의 어느 한 항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 아디필-7-ADCA, 아디필-7-ADAC 및 아디필-7-ACA로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계(c)가 단계 (a) 및/또는 (b) 후에 수득된 혼합물을 크로마토그래피하여 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 크로마토그래피가 흡착 크로마토그래피, 더욱 바람직하게는 소수성 상호작용 크로마토그래피임을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에서 화학식 I에 따른 N-치환된 세팔로스포린 화합물의 회수 방법에서 크로마토그래피의 용도.
  8. 제 7 항에 있어서, 크로마토그래피가 흡착 크로마토그래피, 바람직하게는 소수성 상호작용 크로마토그래피임을 특징으로 하는 용도.
  9. 제 8 항에 있어서, 크로마토그래피가 모의 이동 베드 기술을 사용하여 수행됨을 특징으로 하는 용도.
  10. 제 1 항 내지 제 6 항 중의 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 화학식 I에 따른 화합물을 제조하고,
    화학식 I의 화합물을 탈아실화하여 화학식 II에 따른 화합물을 포함하는 전환 용액을 수득하는 단계를 포함하는, 화학식 II의 화합물을 제조하는 방법.
    (화학식 II)
    상기 식에서,
    R0는 수소 또는 C1-3알콕시이고,
    Y는 CH2, 산소, 황 또는 황의 산화 형태이고,
    R1은 수소; 하이드록시; 할로겐; 하이드록시, 할로겐, 아릴, 알콕시(탄소수 1 내지 3) 또는 아실에 의해 임의로 치환된, 포화 또는 불포화, 직쇄 또는 측쇄 알킬(탄소수 1 내지 5; 하나 이상의 헤테로원자에 의해 임의로 치환된다); 하이드록시 또는 할로겐에 의해 임의로 치환된 알콕시(탄소수 1 내지 3, 하나 이상의 헤테로원자에 의해 임의로 치환된다); 하이드록시, 할로겐, 아미노에 의해 임의로 치환된 탄소수 3 내지 8의 사이클로알킬; 아릴; 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택된 기이다.
  11. 제 10 항에 있어서, 전환 용액이 R2로 지시되는 분해된 측쇄를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 10 항에 있어서, 탈아실화가 디카복실 아실라제를 사용하여 효소로 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 10 항 내지 제 12 항 중의 어느 한 항에 있어서, 용액으로부터 재결정에 의해 화학식 II의 화합물을 회수하는 추가 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 결정화에 선행되어 흡착제 수지, 활성탄, 메탄올, 에탄올, (이소)프로판올, 이소부탄올, n-부탄올, 아세톤 또는 언급된 제제의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 제제로 용액을 처리함을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 하나 이상의 흡착제 수지가 XAD16, XAD1600 및 HP20으로부터 선택되어 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 6-아미노페니실란산(6-APA) 수준이 화학식 II의 화합물에 대해서 10ppm 이하임을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 탈아실화 다음에 용액을 처리하여 R2로 나타나는 분해된 측쇄를 적어도 일부 제거함을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 분해된 측쇄를 적어도 일부 제거하는 처리가 결정화 후에 수득된 모액에 대해 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 분해된 측쇄를 적어도 일부 제거하는 상기 처리에 조 결정의 가용화 및 화학식 II의 화합물의 재결정이 후속됨을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 18 항에 있어서, 결정화가 흡착제 수지, 활성탄, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 이소부탄올, n-부탄올, 아세톤 또는 이들 언급된 제제의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 제제로 용액을 처리함을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 17 항 내지 제 20 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 처리가 전환 용액 또는 모액을 5 이하, 바람직하게는 4 이하, 더욱 바람직하게는 3 가까운 또는 3 이하의 pH에서 막 여과시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  22. 디카복실산 및 β-락탐 항생제를 포함하는 혼합물로부터 디카복실산을 제거하는 막 여과의 용도.
  23. 제 22 항에 있어서, 혼합물이 화학식 II의 화합물의 결정화 후에 수득된 모액임을 특징으로 하는 용도.
  24. 제 22 항 또는 제 23 항에 있어서, 여과가 약 5 이하의 pH, 바람직하게는 4 이하의 pH에서 일어남을 특징으로 하는 용도.
  25. 제 22 항 내지 제 24 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 여과가 pH 3 이하에서 나노여과에 의함을 특징으로 하는 용도.
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