CN1295575A - 发酵生产头孢菌素的新方法 - Google Patents

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Abstract

一种从除通式(Ⅰ)的化合物外还含有6－氨基青霉烷酸(6－APA)和任选一种或多种N－取代青霉烷酸化合物的复杂混合物回收通式(Ⅰ)的N－取代头孢霉烷酸化合物的方法,其中,R2选自:已二酰(1,4－二羧基丁烷)、丁二酰、戊二酰、已二酰、庚二酰、辛二酰、2－(羧基乙硫基)乙酰、3－(羧基乙硫基)丙酰、高级烷基饱和的和高级烷基不饱和的二羧酸,该方法包括如下步骤:(a)酸化所述复杂混合物至低于6.5的pH并将低于所述pH的混合物保持在10℃和150℃之间的温度;和/或(b)将所述复杂混合物与二氧化碳源接触;以及(c)从步骤(a)和/或(b)之后获得的混合物回收式(Ⅰ)的头孢霉烷酸化合物。

Description

发酵生产头孢菌素的新方法
本发明涉及一种制备头孢菌素类和头孢菌素衍生物的方法。更具体地说，本发明涉及从头孢菌素类和其它β-内酰胺化合物的复杂混合物回收头孢菌素类及其衍生物。本发明还涉及从β-内酰胺化合物和侧链(例如可通过酶促侧链除去而获得的那些)的混合物回收脱酰头孢菌素类。
制备头孢菌素类的半合成途径大多始于发酵产物(例如青霉素G、青霉素V和头孢菌素C)，例如按下列文献中公开的方法将它们转化成相应的β-内酰胺环：K.Matsumoto，生物加工技术(Bioprocess.Techn.)，16，(1993)，67-88，J.G.Shewale＆H.Sivaraman，生物化学进展(Process Biochemistry)，1989年8月，146-154，T.A.Savidge，工业抗生素的生物技术(Biotechnology ofIndustrial Antibiotics)(编辑E.J.Vandamme)Marcel Dekker，NewYork，1984，或J.G.Shewale等，国际生物化学进展(ProcessBiochemistry International)，1990年6月，97-103。接着通过偶合到合适的侧链上而将获得的β-内酰胺环转化成所需的抗生素，正如尤其在EP 0 339 751、JP-A-53005185和CH-A-640 240中描述的那样。通过将侧链和β-内酰胺环进行不同的组合，可获得各种青霉素和头孢菌素抗生素。
已知，7-氨基去乙酸基头孢霉烷酸(7-amino desacetoxycephalosporanic acid)(7-ADCA)和7-氨基头孢噻嗪酸(7-aminocephalosporonic acid)(7-ACA)是生产制药工业中应用的抗生素的最重要中间体。
7-ADCA是例如通过化学法或酶法分裂(脱酰作用)苯乙酰去乙酸基头孢霉烷酸(生成7-氨基去乙酸基头孢霉烷酸和苯乙酸)而获得的。
苯乙酰去乙酸基头孢霉烷酸一般是通过化学法处理青霉素G亚砜(它是从青霉素G生成的)而生产的。在该生产方法中，需要大量化学试剂以保障所需反应的进行。这既昂贵又对废物处理构成沉重负担。此外，该方法的总产率不是很高。
为了克服化学法的某些缺点，已公开了生产7-ADCA、7-氨基去乙酰基头孢霉烷酸(7-ADAC)和7-ACA的发酵法，该方法涉及：通过能从转基因表达去乙酸基头孢霉烷酸合成酶(DAOCS，也被称为“扩展酶”)的重组产黄青霉(Penicillium chrysogenum)菌株发酵生产N-取代β-内酰胺(例如己二酰-7-ADCA、己二酰-7-ADAC或己二酰-7-ACA)(EP 0532 341、EP 0 540 210、WO 93/08287、WO 95/04148)。扩展酶负责某些N-酰化青霉烷酸的5元环扩展，于是生成相应的N-酰化去乙酸基头孢霉烷酸。
为了生产出经济上最重要的未酰化头孢菌素类(例如7-ADCA、7-ADAC和7-ACA)，用合适的酰基转移酶酶促除去酰基。
回收化学法或酶法生产的青霉烷酸和头孢霉烷酸的已知方法对N-取代β-内酰胺中间体和脱酰氨基-β-内酰胺的回收来说不是有效的。回收发酵法生产的上述头孢菌素化合物的主要问题是发酵液或培养物滤液的复杂性。发酵液通常包含各种青霉烷酸[例如α-氨基己二酰-6-青霉烷酸、α-羟基己二酰-6-青霉烷酸、6-氨基青霉烷酸(6-APA)]，各种头孢霉烷酸(包括α-氨基己二酰-和羟基己二酰-7-ADCA)和大量蛋白质类物质。已知的回收方法不能给出纯度上可接受品级的头孢霉烷酸产品。在脱酰作用中，这导致如下问题：酶半寿期的缩短、生物转化率的降低和生物转化后的回收费用更高和/或不可接受的污染物含量。此外，脱酰后，这类杂质妨碍或至少阻碍所要求技术规格的所需脱酰头孢菌素化合物的回收。
本发明提供了一种从除通式(Ⅰ)化合物外还含有6-氨基青霉烷酸(6-APA)和任选一种或多种N-取代β-内酰胺化合物的复杂混合物中回收通式(Ⅰ)的头孢霉烷酸化合物的方法：其中，●R0是氢或C1-3烷氧基；●Y是CH2、氧、硫或硫的氧化形式；●R1是选自下组的任一个基：
-氢，
-羟基，
-卤素，
-饱和的或不饱和的、直链的或支化的烷基(1～5个碳原子；任选被一个或多个杂原子替代)，任选被羟基、卤素、芳基、烷氧基(1～3个碳原子)或酰基取代；
-烷氧基(1～3个碳原子；任选被一个或多个杂原子替代)，任选被羟基或卤素取代；或者
-任选被羟基、卤素、氨基取代的环烷基(3～8个碳原子)；
-芳基；
-杂芳基；以及●R2选自：己二酰(1，4-二羧基丁烷)、丁二酰、戊二酰、己二酰、庚二酰(pimelyl)、辛二酰(suberyl)、2-(羧基乙硫基)乙酰、3-(羧基乙硫基)丙酰、高级烷基饱和的和高级烷基不饱和的二羧酸，该方法包括如下步骤：(a)酸化所述复杂混合物至低于6.5的pH并将低于所述pH的混合物保持在10℃和150℃之间的温度；和/或(b)将所述复杂混合物与二氧化碳源接触；以及(c)从步骤(a)和/或(b)之后获得的混合物回收式(Ⅰ)的头孢霉烷酸化合物。优选地，在步骤(a)中将温度保持在约50℃和约130℃之间(优选在70和120℃之间)达10秒～约1周，而pH则被保持在pH4.5或低于pH4.5。按一种优选的方法，已通过有能力的微生物的发酵生产了式(Ⅰ)的化合物，所述复杂混合物是发酵液、培养物滤液或可得自发酵后发酵液的任何培养液。
通式(Ⅰ)的优选化合物选自：己二酰-7-ADCA、己二酰-7-ADAC和己二酰-7-ACA。
按本发明的另一方面，这样进行步骤(c)：将步骤(a)和/或(b)之后获得的混合物进行色谱法(优选为吸附色谱法、更优选为疏水相互作用色谱法)处理。
按本发明的又一方面，提供了色谱法在回收式(Ⅰ)的头孢菌素化合物过程中的应用，优选通过吸附色谱法、更优选为疏水相互作用色谱法，进一步优选应用模拟移动床技术(Simulated Moving Bedtechnology)。
按本发明的又一方面，提供了一种制备式(Ⅱ)的化合物的方法：其中，●R0是氢或C1-3烷氧基；●Y是CH2、氧、硫或硫的氧化形式；●R1是选自下组的任一个基：
-氢，
-羟基，
-卤素，
-饱和的或不饱和的、直链的或支化的烷基(1～5个碳原子；任选被一个或多个杂原子替代)，任选被羟基、卤素、芳基、烷氧基(1～3个碳原子)或酰基取代；
-烷氧基(1～3个碳原子；任选被一个或多个杂原子替代)，任选被羟基或卤素取代；或者
-任选被羟基、卤素、氨基取代的环烷基(3～8个碳原子)；
-芳基；
-杂芳基；该方法包括如下步骤：制备式(Ⅰ)的化合物(其中，R0、Y和R1如上述定义，并且R2选自：己二酰(1，4-二羧基丁烷)、丁二酰、戊二酰、己二酰、庚二酰、辛二酰、2-(羧基乙硫基)乙酰、3-(羧基乙硫基)丙酰、高级烷基饱和的和高级烷基不饱和的二羧酸)；使式(Ⅰ)的化合物脱酰而获得包含式(Ⅱ)化合物的转化液。该转化液优选还包含分裂的侧链(表示为R2)。
按一个优选的实施方案，所述方法还包括通过结晶从溶液回收式(Ⅱ)化合物这一步骤，优选在此之前和/或之后(在加溶粗晶体即通过结晶之后)用选定的作用剂(例如活性炭或吸附树脂)处理溶液。按本发明的另一方面，在结晶和/或重结晶期间或之前添加一种溶剂，例如甲醇、乙醇、(异)丙醇、异丁醇、正丁醇或丙酮或者上述试剂任意的组合物。优选的吸附树脂选自：XAD16(CAS No.102419-63-8)、XAD1600(CAS No.153796-66-8)和HP20(CAS No.55353-13-4)。按本发明优选的是这一方法：其中，6-氨基青霉烷酸(6-APA)含量相对于式(Ⅱ)化合物为10ppm或更少。按另一方面，提供了一种方法，其中，在脱酰作用后，处理溶液而至少部分地除去以R2表示的分裂的侧链。可在式(Ⅱ)化合物的结晶和加溶(即重结晶)之后进行该步骤或重复该步骤。还可对结晶或重结晶之后获得的母液进行分裂的侧链的除去。
所以，提供了一种方法，其中，在所述处理而至少部分地除去分裂的侧链之后，接着加溶粗晶体和重结晶式(Ⅱ)的化合物。
优选地，所述处理而除去分裂的侧链包括：在低于5、优选低于4、更优选接近或低于3的pH下，将所述转化液或母液或者这二者进行膜式过滤。因此，提供了膜式过滤在从包含二羧酸和β-内酰胺抗生素的混合物除去二羧酸方面的应用。所述混合物优选是结晶式(Ⅱ)的化合物之后获得的母液或是式(Ⅰ)的化合物脱酰后获得的混合物。膜式过滤优选在约为5或更小的pH下、优选在pH 4或更小下进行，更优选在pH3或更低时通过超微过滤(nanofiltration)进行。按本发明的另一方面，提供了一种方法，其中，通过结晶和/或重结晶从转化混合物至少部分地除去了侧链R2。按本发明的又一方面，提供了一种方法，其中，侧链R2是这样从转化混合物至少部分地被除去的：将混合物酸化至低于3的pH，接着将该混合物与有机溶剂(例如乙酸戊酯、乙酸丁酯、乙酸乙酯、甲基异丁基酮、环己酮、异丁醇或正丁醇)接触。
本发明涉及一种从除通式(Ⅰ)化合物外还含有6-氨基青霉烷酸(6-APA)和任选一种或多种N-取代青霉烷酸化合物的复杂混合物中回收通式(Ⅰ)的头孢霉烷酸化合物的方法：其中，●R0是氢或C1-3烷氧基；●Y是CH2、氧、硫或硫的氧化形式；●R1是选自下组的任一个基：
-氢，
-羟基，
-卤素，
-饱和的或不饱和的、直链的或支化的烷基(1～5个碳原子；任选被一个或多个杂原子替代)，任选被羟基、卤素、芳基、烷氧基(1～3个碳原子)或酰基取代；
-烷氧基(1～3个碳原子；任选被一个或多个杂原子替代)，任选被羟基或卤素取代；或者
-任选被羟基、卤素、氨基取代的环烷基(3～8个碳原子)；
-芳基；
-杂芳基；以及●R2选自：己二酰(1，4-二羧基丁烷)、丁二酰、戊二酰、己二酰、庚二酰、辛二酰、2-(羧基乙硫基)乙酰、3-(羧基乙硫基)丙酰、高级烷基饱和的和高级烷基不饱和的二羧酸，该方法包括如下步骤：(a)酸化所述复杂混合物至低于6.5的pH并将低于所述pH的混合物保持在10℃和150℃之间的温度；和/或(b)将所述复杂混合物与二氧化碳源接触；以及(c)从步骤(a)和/或(b)之后获得的混合物回收式(Ⅰ)的头孢霉烷酸化合物。本发明进一步涉及一种制备具有通式(Ⅱ)的头孢菌素的方法：
Figure 9980455000121
其中，●R0是氢或C1-3烷氧基；●Y是CH2、氧、硫或硫的氧化形式；●R1是选自下组的任一个基：
-氢，
-羟基，
-卤素，
-饱和的或不饱和的、直链的或支化的烷基(1～5个碳原子；任选被一个或多个杂原子替代)，任选被羟基、卤素、芳基、烷氧基(1～3个碳原子)或酰基取代；
-烷氧基(1～3个碳原子；任选被一个或多个杂原子替代)，任选被羟基或卤素取代；或者
-任选被羟基、卤素、氨基取代的环烷基(3～8个碳原子)；
-芳基；
-杂芳基。
式(Ⅰ)的化合物可通过能生成本文定义的复杂混合物的任何系列步骤生产，从该复杂混合物实现式(Ⅰ)化合物的回收。对于说明书和权利要求书来说，“复杂混合物”定义为包含N-取代头孢菌素化合物和取代的或未取代的β-内酰胺化合物的混合物。
式(Ⅱ)的化合物是通过如下系列步骤获得的：(a)回收、优选纯化式(Ⅰ)的化合物；(b)将优选纯化的式(Ⅰ)化合物脱酰而获得包含式(Ⅱ)化合物的溶液(转化液)；以及(c)回收、优选纯化式(Ⅱ)的化合物。
发酵法生产N-取代头孢霉烷酸的障碍之一是存在不希望有的污染性β-内酰胺组分(例如N-取代6-氨基青霉烷酸)。按本发明的一个实施方案，已发现这些污染物可这样被显著减少：在酸化条件下(优选伴随高温)，将发酵液、发酵液的滤液或通过应用任何生物量分离技术从发酵液获得的液体保温。应用至少一种已知的酸(例如硫酸、盐酸或硝酸或其组合物)将发酵液酸化到低于6.5的pH(优选低于4.5)。操作温度在20～150℃的范围内，优选在70～120℃。在这些条件下的保留时间在数秒(150℃下)或数天(20℃下)的范围内，优选为10秒～60分钟。优选进行一段时间的pH/温度处理而提供N-取代6-APA相对于式(Ⅱ)化合物的降低倍数为100、优选为1000、更优选为1，000，000。可在生物量分离之前或之后进行该步骤，而且可分批地或连续地进行。
按本发明的另一实施方案，污染性青霉素组分(例如N-取代6-APA)是通过将发酵液、发酵液的滤液、洗脱液、转化液或溶解的式(Ⅰ)的污染性头孢菌素(通常在pH5～7时)与二氧化碳接触而显著地减少的。二氧化碳可被以任意合适的形式(例如固体或气体形式或作为碳酸根离子的溶液)加到溶液中。将溶液与CO2源在10～60℃(优选20～40℃)的温度下接触，其中，所述溶液被分子CO2饱和4～10小时。在减少青霉素组分后，可达到如前述那样的式1头孢菌素的纯化。
本文定义的复杂混合物可具有任意来源，但优选是在导致生产的条件下、通过能生产通式(Ⅰ)化合物的7-N-酰化形式的微生物发酵后获得的培养液或培养物滤液，其中所述酰基可以是在头孢菌素生物合成途径中支持环扩展酶(去乙酸基头孢菌素合成酶-DAOCS，或双官能扩展酶/羟化酶(有时被称为去乙酰基头孢菌素合成酶DACS))的任意酰基。体内生产式(Ⅰ)的7-N-酰基取代的化合物的生物过程被公开于：WO 93/05158(己二酰-7-ADCA)；WO 93/08287(己二酰-7-ADAC和己二酰-7-ACA)，WO 95/04148(2-(羧基乙硫基)乙酰-7-ADCA)，WO95/04149(3-(羧基乙硫基)丙酰-7-ADCA)和高级烷基饱和的或不饱和的二羧酸。这些PCT申请的相关部分被并入本文作参考。优选的酰基一般是二羧酸类，例如己二酰(1，4-二羧基丁烷)、2-(羧基乙硫基)乙酰、3-(羧基乙硫基)丙酰、粘康酸等。合适的宿主生物包括但不限于产黄青霉和产黄支顶孢(Acremonium chrysogenum)。合适的扩展酶(包括双官能扩展酶/羟化酶)源包括但不限于带小棒链霉菌(Streptomyces clavuligerus)和产黄支顶孢。转化的方法、转化细胞的选择和表示丝状真菌的调节因子(它们可被用于基因修饰宿主细胞)都是β-内酰胺生产(丝状)真菌的重组DNA技术领域中熟知的。
优选地，在酸化和任选升高温度之前，首先将发酵液进行生物量分离，例如通过任意合适的方法过滤，例如膜式过滤、真空过滤、超滤或其组合。生物量分离的任何其它方法也是合适的。
在pH-降低步骤和任选的温度步骤之后，回收的式(Ⅰ)化合物优选经历进一步纯化从而至少部分地除去不希望有的β-内酰胺组分，尤其是不希望有的N-取代头孢菌素和青霉素。所述进一步纯化可通过应用有机溶剂萃取而进行。就萃取来说，发现了有利的是：洗涤萃取液，从有机相将N-取代头孢菌素反萃取到水相，再反萃取水相。萃取有机溶剂可选自乙酸戊酯、乙酸丁酯、乙酸乙酯、甲基异丁基酮、环己酮、异丁醇或正丁醇等。在本方法中，优选的纯化步骤是应用色谱法纯化N-取代头孢菌素而不是应用有机溶剂萃取。色谱法的优点是不存在溶剂(溶剂引起废物问题和污染问题)，以及终产物纯度的改善。优选的是离子交换色谱法或吸附色谱法，更优选是疏水相互作用色谱法。应用吸附剂将滤液进行色谱处理。吸附剂包括：活性炭，例如Norit CG-1或Cecarbon GAC 40；或者吸附树脂，例如苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，诸如得自Mitsubishi Kasei Corporation的Dianion HP 20(CASNo.55353-13-4)、Dianion HP 21(CAS No.92529-04-9)、Dianion SP207(CAS No.98225-81-1)或Dianion SP 825或者得自Rohm和Haas的Amberlite XAD 1180(CAS No.97396-56-0)、Amberlite XAD1600(CAS No.153796-66-8)或Amberlite XAD 16(CAS No.102419-63-8)或者得自TosoHaas的Amberchrom CG 161(CAS No.131688-63-6)；优选为XAD 16或XAD 1600。
在吸附N-取代头孢菌素之前，通过一种或多种已知的酸(例如硫酸、盐酸或硝酸或其组合物)将所述复杂混合物调节至1.0～5.0(优选2.5～3.5)的pH。操作温度在0～50℃(优选在5～25℃)的范围内。操作压力在0～1.0MPa超压的范围内。
不希望有的β-内酰胺组分，尤其不希望有的N-取代头孢菌素(例如α-氨基己二酰头孢霉烷酸)也吸附在吸附剂上，但被需要的N-取代头孢菌素置换。
吸附后，采取用水洗涤以除去吸附剂之间空隙容积中不希望有的β-内酰胺组分，并从吸附剂解吸弱结合的、不希望有的β-内酰胺组分。可通过一种或多种已知的酸(例如硫酸、盐酸或硝酸或其组合)酸化所述水至1.0的pH。要增大渗透压，可以往水中添加盐。操作温度在0～50℃(优选在20～40℃)的范围内。操作压力在0～1.0MPa超压的范围内。
可用合适的缓冲剂(例如乙酸盐、磷酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐或己二酸盐)进行洗脱，但还可应用稀有机溶剂(例如丙酮、异丙醇)或稀碱(例如铵、苛性碱)。操作温度在0～80℃(优选在10～40℃)的范围内。操作压力在0～1.0MPa超压的范围内。
可通过任何常用方法进行吸附剂的再生，例如应用稀碱、稀酸，或者应用水混溶性溶剂(例如丙酮、甲醇、乙醇或异丙醇)或其组合。可以实施任选加热到100℃。
再生液体可通过用水洗涤除去。可通过一种或多种已知的酸(例如硫酸、盐酸或硝酸或其组合)酸化所述水至1.0的pH。可在数种装置中进行色谱处理步骤，例如以单一的柱，但还可应用模拟移动床技术。就该模拟移动床技术来说，有数种装置是可获得的，例如U.S.Filter的ADSEP系统、Advanced Separation Technology的ISEP/CSEP系统、例如Applexion的‘merry-go-around’系统或Universal Oil Products Company(UOP)的SORBEX系统。
还可通过超微过滤除去洗脱液中的缓冲剂。该膜式过滤中膜的特征表现为对需要的N-取代头孢菌素的高保留和对缓冲剂的低保留。任选通过任何合适的浓缩方法应用一个浓缩步骤，例如真空蒸发、反渗透、超微过滤或者色谱处理或萃取后的narofiltration。
接着应用本领域已知的任意合适方法将回收的N-酰化化合物脱酰。一个优选的方法是应用合适的二羧化酰基转移酶进行酶促脱酰作用。有很多合适的酰基转移酶(野生型或突变型)是本领域已知的，它们包括但不限于得自下列微生物的那些：芽孢杆菌属(Bacillus)(EP 0525 861；EP 0 405 846)，假单胞菌属(Pseudomonas)(EP 0 482 844；EP 0 525 861；EP 0 475 652；EP 0 663 445)，无色杆菌属(Achromobacter)(EP 0 525 861)，粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)(EP 0 638 649)，不动杆菌属(Acinetobacter)(EP 0 469919)，节杆菌属(Arthrobacter)(EP 0 283 218)，大肠埃希氏菌(Escherichia coli)(US 3，945，888)，嗜柠檬酸克吕沃尔氏菌(Kluyvera citrophila)，雷氏普罗威登斯菌(Proteus rettgeri)(US3，915，798)等。二羧化酰基转移酶优选得自假单胞菌属SE83或SY-77。该酰基转移酶任选可以是突变形式(如WO 91/16435、WO 97/20053、WO 97/40175中公开的那些)从而增大或改变对底物的亲和性。使本发明的N-酰化头孢菌素化合物脱酰的另一方法是通过将底物与能生产酰基转移酶的微生物接触(如美国专利No.5，677，141中公开的那样)。
可应用本领域熟知的技术将酰基转移酶固定(US 3，930，949)在膜(EP 0 243 404)或自由流动的载体(例如基于戊二醛的载体)或氮杂内酯聚合物(EP 0 730 035)上。非固定化酰基转移酶也是预期的，应用膜分离反应混合物(滞留物)与产物(渗透液)，例如美国专利No.5，521，068中公开的那样。该方法可以是分批的或(半)连续的，这是完全熟知的并且对本发明来说不是关键的。酶促脱酰反应通常在搅拌釜式反应器(具有或没有优选为惰性的筛板，从而容易分离固定化酶与反应产物)中进行。在反应过程中通常调节pH以补偿由于(二羧基)侧链被任意类别的碱(例如铵、苛性碱、碳酸盐、碳酸氢盐)除去引起的pH变化。可在反应器中和/或在反应器上方的循环回路(circulating loop)中调节pH。还可调节其它参数(例如温度、脱酰产物或侧链浓度等)，考虑到这些参数对反应速率和/或平衡的影响。
可在脱酰之前和/或脱酰过程中添加另外的稳定剂，例如亚硫酸根(S2O5 2-、HSO3 -、SO3 2-)、EDTA、二硫苏糖醇(dithiotreitol)(DTT)。
通常，接着应用任意合适的步骤组合回收通式(Ⅰ)的脱酰头孢菌素化合物。任选可采取浓缩步骤，通过例如真空蒸发、反渗透、超微过滤或者结晶前的narofiltration。任选可添加水混溶性溶剂。任选地，在结晶前可通过用活性炭或吸附树脂处理而纯化溶液。任选地，在结晶前可除去侧链，其特征在于，酸化水相，将侧链萃取到萃取有机溶剂并分离这两相。萃取有机溶剂可选自乙酸戊酯、乙酸丁酯、乙酸乙酯、甲基异丁基酮、环己酮、异丁醇、正丁醇等。
可用数种方法从形成的水相结晶产品。最优选的操作方法是：中和水溶液，接着应用一种或多种已知的酸(例如H2SO4、HCl、HNO3或其组合)分1～6步降低pH至pH3～5。这优选应用1～6个互连的一组连续操作的结晶器(按顺序)以连续方式进行。也可采取分批结晶、半连续结晶或协调结晶。可以按与上述相同的方法直接进行结晶而不需首先中和。按本发明的一个实施方案，发现了可添加水混溶性溶剂(例如甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、丙酮等)而改善式(Ⅱ)的头孢菌素的质量。任选地，在结晶前可通过用活性炭或用吸附树脂处理而改善式(Ⅱ)化合物的质量。
已发现了，任选在用吸附树脂、活性炭和/或乙醇和/或乙酸酯处理后，可通过重结晶进一步改善式(Ⅱ)的头孢菌素的质量。该处理的特征在于，在0.5～10.0范围内(优选在7.5～8.5之间)的pH下溶解式(Ⅱ)的头孢菌素，再使产物结晶。可以按数种方式使产物结晶。最优选的操作方法是：应用一种或多种已知的酸(例如H2SO4、HCl、HNO3或其组合)分1～6步降低pH至pH3～5。这可应用1～6个互连的一组连续操作的结晶器(按顺序)以连续方式进行。也可采取分批结晶、半连续结晶或协调结晶。按本发明的一个实施方案，发现了可添加水混溶性溶剂(例如甲醇、乙醇、(异)丙醇、丙酮、异丁醇和正丁醇)而改善式(Ⅱ)的头孢菌素的质量。
还发现了，可通过用吸附剂处理转化液和/或溶解的式(Ⅱ)头孢菌素的溶液而改善式(Ⅱ)的头孢菌素的质量。吸附剂包括：活性炭，例如Norit Ultra SX；或者吸附树脂，例如苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，诸如得自Mitsubishi Kasei Corporation的Dianion HP 20(CASNo.55353-13-4)、Dianion HP 21(CAS No.92529-04-9)或Dianion SP207(CAS No.98225-81-1)或者得自Rohm and Haas的Amberlite XAD1180(CAS No.97396-56-0)、Amberlite XAD 1600(CAS No.153796-66-8)或Amberlite XAD 16(CAS No.102419-63-8)或者得自TosoHaas的Amberchrom CG 161(CAS No.131688-63-6)；优选为XAD 16，XAD 1600或HP20。
晶体是通过过滤或离心分离的，再在常规连续式干燥机或分批干燥机中干燥。可通过任意类别的磨(例如球磨、射流磨等)研磨晶体。
任选可在结晶过程中添加水混溶性溶剂。溶解后，可用活性炭或吸附树脂处理溶液。
该操作将比前述目前已知的方法给出更好的总产率和产品质量。
按本发明的另一方面，提供了一种从转化液或母液(结晶式(Ⅱ)的化合物后获得的液体)除去和回收己二酸的方法。发现了，应用膜式过滤在低pH(例如低于pH5、优选低于pH4、更优选低于pH3，处于pH3或接近pH3)时可以有利地分离己二酸。按本发明优选的是这一实施方案：其中，通过反渗透进行过滤。
除了节省原料外，这样做的优点还在于这样处理的溶液结晶时的纯度和/或产率。
通过如下非限制性的实施例阐述了本发明。实验
如1993年3月18日公开的国际专利申请WO 93/05158中描述的那样，通过对用得自带小棒链霉菌的扩展酶(去乙酸基头孢菌素C合成酶)转化的产黄青霉菌株发酵而获得了一种作为复杂混合物的发酵液，它包含己二酰-7-ADCA，尤其包含作为不希望有的污染物的6-APA、己二酰-6-APA和α-氨基-己二酰-7-头孢霉烷酸。
按WO 93/05158(并入本文作参考)的实施例1中描述的那样培养所述转化的青霉属菌株。
发酵5～7天后，将发酵液用于回收实验。
还可通过配制下列化合物的水混合物而模拟该复杂混合物：6-氨基青霉烷酸、己二酰-6-氨基青霉烷酸、α-氨基己二酰-6-氨基青霉烷酸、己二酰-7-氨基去乙酸基头孢霉烷酸和α-氨基己二酰-7-头孢霉烷酸。
                        实施例1
                       pH/热-处理该实施例显示了pH处理(优选将pH处理与升温处理结合)对于从复杂混合物除去不希望有的β-内酰胺组分的优点。
将得自产黄青霉发酵的发酵液(见实验部分)过滤，所述发酵液包含己二酰-7-ADCA和青霉烷酸和头孢霉烷酸这些污染物的复杂混合物。应用生产用水洗涤该浓缩液直至合并的滤液总体积约为初始发酵液体积的2倍。进行了下列实验：A．将部分滤液酸化到pH=3.5；加热到70℃，30分钟后冷却到40℃；B．将部分渗透液酸化到pH=2.7；加热到110℃，4分钟后冷却到25℃；或者C．将部分渗透液酸化到pH=3.0并且未进一步处理。
将该预处理后的溶液进行如下处理而获得式(Ⅱ)的化合物；7-ADCA。吸附色谱法
在Seitz K100滤器上过滤三份溶液(A～C)，然后将pH为3.0的溶液泵送到填充了1.6升XAD-1600树脂的柱上；接着用4.8升水洗涤树脂，用0.2M碳酸氢盐溶液洗脱。取出第一次洗出液级分(1.1升)而弃去。收集第二次级分(3.2升)并分析。通过用苛性钠和丙酮洗涤而纯化树脂，再次用酸化的水调节。浓缩
在20～30℃真空(5～10mm Hg)下浓缩洗出液直至获得每升40克己二酰-7-ADCA的浓度。酶促脱酰
接着，用酰基转移酶按下述方法处理该己二酰-7-ADCA。往1升洗出液中添加1克焦亚硫酸钠、20mM EDTA和100g固定化酰基转移酶(包括假单胞菌属SE83二羧化酰基转移酶)。在30℃下将溶液搅拌两小时。用4N氢氧化钠将pH保持在8.5。应用玻璃烧结的滤器分离所述固定化酰基转移酶和液体。7-ADCA的结晶
在搅拌下、在30℃的温度下降低pH至3.6而使7-氨基去乙酸基头孢霉烷酸(7-ADCA)沉淀；在45分钟内，用6N硫酸使溶液的pH降低至3.6。冷却到20℃后，在玻璃烧结的滤器上分离晶体，用水洗涤，在35℃下干燥。溶解7-ADCA晶体
借助于氨溶解7-ADCA。为此，将15克7-ADCA悬浮于255ml水中。借助于4N氢氧化铵在7.5～8.5的pH下溶解7-ADCA。在玻璃烧结的滤器上过滤后，添加水而得300ml溶液。用吸附树脂处理
用吸附树脂处理了该溶液。在45分钟内，将该溶液泵送到15ml的XAD1600上。接着，将75ml水泵送到该树脂上而获得375ml溶液。重结晶
在搅拌下、在30℃的温度下降低pH至3.6而使7-ADCA沉淀；在45分钟内，用6N硫酸使pH降低至3.6。冷却到20℃后，在玻璃烧结的滤器上分离晶体，用水洗涤，在35℃下干燥。
从6-APA减少来看，这样生产的7-ADCA表现出良好的结果。(6-APA比值是相对于7-ADCA求算的)。
               表1a.实验1A、1B和1C的结果
    实验     6-氨基青霉烷酸含量(ppm)
    1A     ＜10
    1B     ＜10
    1C     950
显然，所述pH/温度处理减小了污染己二酰-7-ADCA制剂的6-氨基青霉烷酸的含量。
就恒定减少10-6的6-氨基青霉烷酸而测定了处理的pH、温度和时间之间的相互关系(表1b)。表1b
6-APA减少   pH    温度(C)    时间(s)     时间(min)     时间(h)
10-6     3     25    35050     584     9.74
10-6     3     50    3057     50.9     0.85
10-6     3     75    378     6.3     0.11
10-6     3     100    62     1.0     0.02
10-6     4     25   148857    2481     41.35
10-6     4     50   12982    216.4      3.61
10-6     4     75    1607    26.8      0.45
10-6     4     100     263     4.4      0.07
                         实施例2吸附色谱法
该实施例显示了：(a)当应用吸附色谱法时，柱的载荷度(2A～2D)、(b)在洗脱前用不同量的水洗涤柱(2E～2G)、(c)物料的pH对己二酰-7-ADCA的纯化的效果(2H～2J)。以模拟移动床方式进行吸附色谱处理的该实施方案作为“实验2K”给出。
按实施例1A中描述的那样预处理发酵液。接着，通过吸附色谱法纯化己二酰-7-氨基-去乙酸基头孢霉烷酸：将溶液泵送到装填了1.6升XAD-1600树脂的柱上，用不同量的水洗涤(2A～2D和2H～2K：4.8升；2E～2F：见表2b)，用0.2M碳酸氢盐溶液洗脱。取出第一次洗出液级分(1.1升)后弃去。收集第二次级分(3.2升)并分析。通过用苛性钠和丙酮洗涤而纯化树脂，再次用酸化的水调节。应用了数个处理条件的变量(见表2)。减少量按这样计算：(化合物-i物料/化合物-1物料)/(化合物-i洗出液/化合物-1洗出液)。
表2a．实验2的结果
实验     物料     洗出液(g)     减少(-) 化合物4(ppm)
   化合物1(g)    化合物2(g)    化合物3(g)    化合物1(g)    化合物2(g)    化合物3(g)    化合物2 化合物3
 2A     34  3．3  9．3     30     3．1     5．9     1     1
 2B     80  5．9  18．5     70     0．5     0．09     10     173     ＜6
 2C     127  10．5  32．8     76     0．3     0．07     24     301     19
 2D     255  18．2  59．4     67     0．1     0．03     38     501     30
化合物1：己二酰-7-ADCA化合物2：α-羟基己二酰-7-ADCA化合物3：α-氨基己二酰-7-ADCA化合物4：6-APA相对于化合物1的含量
这些结果清楚地表明将柱过载对洗出液中化合物2和3的减少的正性效果。
表2b．实验2的结果
实验     物料 洗涤     洗出液     减少(-)
   化合物1(g)    化合物2(g)    化合物3(g)     (1)    化合物1(g)    化合物2(g)    化合物3(g)    化合物2 化合物3
    2E     85  6．6  14．0  1．6  81  2．1  1．2     3     11
    2F     74  6．4  12．6  4．8  71  1．1  0．13     6     94
    2G     75  5．8  13．0  7．3  68  0．5  0．1     12     122
化合物1：己二酰-7-ADCA化合物2：α-羟基己二酰-7-ADCA化合物3：α-氨基己二酰-7-ADCA
实施例2b表明了在用碳酸氢钠洗脱前持续洗涤对减少不希望有的头孢菌素化合物的正性效果。表2c
实验     物料     洗出液     减少(-)
   化合物1(g)    化合物2(g)    化合物3(g)     pH(-)    化合物1(g)    化合物2(g)    化合物3(g)    化合物2    化合物3
    2H     79  8．4  22．2  2．5  83  0．6  0．09     15     248
    2I     80  5．9  18．5  2．9  70  0．5  0．09     10     183
    2J     83  8．2  21．7  3．5  62  0．5  0．14     12     118
化合物1：己二酰-7-ADCA化合物2：α-羟基己二酰-7-ADCA化合物3：α-氨基己二酰-7-ADCA
如上实施例表明了在进行结晶时pH对减少不希望有的7-N酰化头孢菌素化合物的效果。H2SO4被用作酸。
表2d．实验2的结果(在SMB系统中应用了30升树脂)
实验     物料     洗出液     减少(-)
化合物1(kg) 化合物2(kg) 化合物3(kg) 化合物4(kg) 化合物1(kg) 化合物2(kg) 化合物3(kg) 化合物4(kg) 化合物2 化合物3 化合物4
    2K  1．46  0．08  0．20  0．15  1．38  0．01  0．01  0．02     7     18     7
化合物1：己二酰-7-ADCA化合物2：α-羟基己二酰-7-ADCA化合物3：α-氨基己二酰-7-ADCA化合物4：己二酸
该实施例阐释了按所谓的模拟移动床技术在千克规模上进行的吸附色谱法的应用。该技术可以轻易地进一步放大。
如实施例1中描述的那样，用酰基转移酶处理这样处理过的级分2A～2K而生产7-ADCA。获得了优异的转化结果，如实施例3中所述。
                              实施例3酶促转化
该实施例阐述了酶促转化己二酰-7-ADCA至7-ADCA的结果。己二酰-7-ADCA是按实施例2K中公开的那样回收的(按实施例1A进行pH-处理，通过过载和洗涤将吸附色谱处理最佳化)。按实施例1中描述的那样、在表3中所示pH下进行转化。实施例A～E代表不同批次。
表3
实验     底物化合物1(mmol)     底物化合物2(mmol)     pH(-) 产品物流化合物1(mmol)     产品物流化合物2(mmol)
    A     69．7     2．2     8．5     1．1     68．6
    B     144．2     2．4     8．5     5．9     143．3
    C     181．4     2．3     8．5     13．5     174．5
    D     113．1     1．7     8     5．4     108．7
    E     113．4     3．1     9     1．2     112．2
化合物1：己二酰-7-ADCA化合物2：7-ADCA
当应用pH/温度步骤预处理己二酰-7-ADCA时，与未处理相比，转化率和产率都更优。应用色谱法进一步纯化导致纯度的进一步改善(表中未示出)。
                        实施例4粗结晶
将发酵液进行pH/热-处理(实施例1)，再通过如实施例2中描述的吸附色谱法富集己二酰-7-ADCA。接着，如实施例1中描述的那样进行转化。
用反渗透法浓缩转化液(脱酰后获得的溶液)而增大浓度。
取出一部分溶液，通过降低pH至pH 3.6、4或5使7-ADCA结晶(见表4a)。表4a.粗结晶
实验 溶液中的化合物1 pH(-) 分离、洗涤和干燥后的产品(g) 产品中的化合物1(%)
A 49.5 3.6 48.9 97.5
B 49.5 4 48.7 97.4
C 49.5 5 48.2 98
化合物1：7-ADCA
在全部测试的pH下的结晶都令人满意。在如下实验中，pH为3.6。阐释了浓缩溶液的效果。
表4b.粗结晶
实验 溶液中的化合物1(g) 分离、洗涤和干燥后的产品(g) 产品中的化合物1(%)
D 15.5 14.8 94.3
E 36.1 35.7 95.3
F 49.5 48.9 97.5
化合物1：7-ADCA
显然，转化液中7-ADCA的浓度对结晶后的纯度和产率都有影响。
如下实施例阐释了不同吸附剂对产品质量(溶液中的颜色和透明度)的影响。
表4c．粗结晶
实验 溶液中的化合物1(g)     处理 产品中的化合物1(％) 在425nm处溶液中的颜色(-) 在HCl中的透明度(EBC)
    G     25     HP20     97．2     0．16     3．6
    H     25     HP20(2倍)     97．8     0．11     2．4
    I     25     IRA67     97．2     0．18     6
    J     25  IRA67+HP20     97．7     0．1     0．8
    K     25     无     96．3     0．39     7．3
化合物1：7-ADCA
                         实施例5溶解的7-氨基去乙酸基头孢霉烷酸的处理该实施例显示了在结晶前用不同的吸附树脂处理7-ADCA溶液后对7-ADCA的透明度和颜色的影响。按实施例2K中公开的方法制备了含7-ADCA的溶液(应用的吸附色谱柱是XAD-1600树脂)。
表5
    实验   溶解的化合物1(g)     处理  在425nm处溶液中的颜色(-)   在HCl中的透明度(EBC)
    A     40      --     0．18     4．2
    B     40     XAD16     0．05     1．8
    C     40     HP20     未测出     0．5
    D     40  XAD1600     0．09     0．5
    E     25     未测出     3．6
    F     25 +1％ EtOH     0．11     0．6
    G     50 +3％ EtOH     0．18     0．9
    H     50 +2％ 炭     0．04     未测出
    I     50     0．17     1．4
    J     50 +5％ 炭     0．03     0．8
化合物1：7-氨基去乙酸基头孢霉烷酸
                        实施例6用正丁醇萃取回收己二酰-7-ADCA
按实施例1中描述的那样处理包含己二酰-7-ADCA的发酵液。
酸化后，通过吸附色谱法纯化一部分己二酰-ADCA。将该溶液泵送到填充了XAD-16树脂的柱上，用水洗涤，用0.2M乙酸盐溶液洗脱。取出含低含量的己二酰去乙酸基头孢霉烷酸的第一次洗出液级分后弃去。收集第二次级分。通过用苛性钠和丙酮洗涤而纯化树脂，再次用酸化的水调节。
这样纯化一部分己二酰-7-ADCA：萃取，接着洗涤萃取液，从有机相将N-取代头孢菌素反萃取到水相，再反萃取水相；萃取有机溶剂是正丁醇。
用固定化酰基转移酶处理己二酰-7-ADCA而生产7-氨基去乙酸基头孢霉烷酸(7-ADCA)。通过降低pH而分离一部分7-ADCA。借助于苛性钠溶解己二酰去乙酸基头孢霉烷酸。通过降低pH而分离7-氨基去乙酸基头孢霉烷酸。
酸化一部分7-氨基去乙酸基头孢霉烷酸水溶液，将所述侧链萃取到萃取有机溶剂中，再进行相分离；萃取有机溶剂是正丁醇。
最后，过滤晶体块，洗涤后干燥。
表6
实验     描述  产品中的化合物1(％) 在425nm处溶液中的颜色(-) 在HCl中的透明度(EBC)
    A 萃取／萃取／结晶     98．3     0．13     2．4
    B 色谱处理／萃取／结晶     98．9     0．09     1．5
    C 色谱处理／结晶     97．6     0．12       -
    D 色谱处理／结晶／重结晶     98．7     0．05     1．1
化合物1：7-氨基去乙酸基头孢霉烷酸
表中未给出采用单独萃取的结果，但纯度比采用色谱处理时(即使未重结晶)差得多。将色谱处理与重结晶组合或者将色谱处理与萃取组合产生最好的结果。
                      实施例7从7-ADCA结晶母液回收己二酸
7-ADCA结晶母液是按实施例4中描述的那样获得的。应用HPLC测定己二酸：Aminex HPX-87H柱，300mm×7.8mm，填充了9um阳离子凝胶(Biorad)，在65℃下用0.2M H2SO4水溶液洗脱，应用RI Waters 410折光计测定。在下文给出的实施例中，最优化旨在纯度，而不是产率。
                        实施例7A
                    采用酸化回收己二酸
在20℃下，用12M H2SO4水溶液将7-ADCA结晶母液(250ml，13.6g/l己二酸)的pH降到0.7。在0℃下16h后，未能检测出结晶。应用6M KOH水溶液使pH升高到3.4。通过过滤回收形成的晶体而给出7.7g物质(它是盐和己二酸的混合物，未对它进一步分析)。
                          实施例7B
                    采取酸化和浓缩回收己二酸
在20℃下，用12M H2SO4水溶液将7-ADCA结晶母液(500ml，9.4g/l己二酸)的pH降到1.5，接着在40℃减压下浓缩而给出一种粘性混合物，通过过滤分离该混合物，干燥后给出6.9g己二酸，纯度为53％(产率为78％)。
                          实施例7C
           应用Nanomax 50膜的反渗透作用回收己二酸
在20℃下，用6M KOH水溶液或12M H2SO4水溶液将7-ADCA结晶母液(500ml，9.4～18.2g/l己二酸，见袁)的pH调节到表中提到的值。应用得自Millipore的Nanomax 50膜将形成的溶液进行反渗透。借助于氮气，施加30巴的压力而得到滤液和滞留物，其中，采用HPLC测定己二酸的量。在大多数情况下，应用一种处理程序，它包括：在减压下浓缩直至结晶，接着过滤产物并干燥。
表7
    pH     己二酸(g／l)   保留(％) 渗透液体积(ml)   处理后的产量(g)   处理后的纯度(％)
    起始 渗透液 滞留物
    1．5     13．6     11．0     14．8     26     400     4．4     96
    2．0     18．2     13．1     20．8     37     260     2．4     99
    3．0     9．4     6．7     8．7     23     360     1．9     97
    7．2     13．6     5．3     31．9     83     400 未处理 未处理
                      实施例7D应用DK U19F膜的反渗透作用在pH 2.0下回收己二酸
用2.91的12M H2SO4水溶液将7-ADCA结晶母液(100 l，含25.0g/l己二酸)的pH降到2.0。用57 l水、应用DK U19F膜在2.5m2得自Hydro Air Research的膜式过滤装置P2-B200中将形成的溶液进行反渗透。在30巴的压力下，达到8.8 l/m2/h的平均流量，给出表中归纳的结果。
表8
组分 浓度(g/l) 保留(%)
起始 渗透液 滞留物
已二酸 25.0 11.6 17.8 35
7-ADCA 0.72 <0.01 0.72 ＞99
已二酸-7-ADCA 1.51 <0.03 1.54 ＞98

Claims (25)

1．一种从除通式(Ⅰ)化合物外还含有6-氨基青霉烷酸(6-APA)和任选一种或多种N-取代β-内酰胺化合物的复杂混合物中回收通式(Ⅰ)的N-取代头孢霉烷酸化合物的方法：其中，●R0是氢或C1-3烷氧基；●Y是CH2、氧、硫或硫的氧化形式；●R1是选自下组的任一个基：
-氢，
-羟基，
-卤素，
-饱和的或不饱和的、直链的或支化的烷基(1～5个碳原子；任选被一个或多个杂原子替代)，任选被羟基、卤素、芳基、烷氧基(1～3个碳原子)或酰基取代；
-烷氧基(1～3个碳原子；任选被一个或多个杂原子替代)，任选被羟基或卤素取代；或者
-任选被羟基、卤素、氨基取代的环烷基(3～8个碳原子)；
-芳基；
-杂芳基；以及●R2选自：己二酰(1，4-二羧基丁烷)、丁二酰、戊二酰、己二酰、庚二酰、辛二酰、2-(羧基乙硫基)乙酰、3-(羧基乙硫基)丙酰、高级烷基饱和的和高级烷基不饱和的二羧酸，该方法包括如下步骤：(a)酸化所述复杂混合物至低于6.5的pH并将低于所述pH的混合物保持在10℃和150℃之间的温度；和/或(b)将所述复杂混合物与二氧化碳源接触；以及(c)从步骤(a)和/或(b)之后获得的混合物回收式(Ⅰ)的头孢霉烷酸化合物。
2．权利要求1的方法，其中，在步骤(a)中将温度保持在约50℃和约130℃之间、优选在70和120℃之间达10秒～约1天，而pH则被保持在pH4.5或低于pH4.5。
3．权利要求1或2的方法，其中，所述化合物已通过能生产该化合物的微生物的发酵生产了，并且其中，所述复杂混合物是发酵液、培养物滤液或可得自发酵后的发酵液的任何培养液。
4．权利要求1～3任一项的方法，其中，所述通式化合物选自：己二酰-7-ADCA、己二酰-7-ADAC和己二酰-7-ACA。
5．前述权利要求任一项的方法，其中，这样进行步骤(c)：将步骤(a)和/或(b)之后获得的混合物进行色谱法处理。
6．权利要求5的方法，其中，所述色谱法是吸附色谱法，更优选是疏水相互作用色谱法。
7．色谱法在回收权利要求1中式(Ⅰ)的N-取代头孢菌素化合物的过程中的应用。
8．权利要求7的应用，其中，所述色谱法是吸附色谱法，优选是疏水相互作用色谱法。
9．权利要求8的应用，其中，所述色谱法是应用模拟移动床技术进行的。
10．一种制备式(Ⅱ)化合物的方法：其中，●R0是氢或C1-3烷氧基；●Y是CH2、氧、硫或硫的氧化形式；●R1是选自下组的任一个基：
-氢，
-羟基，
-卤素，
-饱和的或不饱和的、直链的或支化的烷基(1～5个碳原子；任选被一个或多个杂原子替代)，任选被羟基、卤素、芳基、烷氧基(1～3个碳原子)或酰基取代；
-烷氧基(1～3个碳原子；任选被一个或多个杂原子替代)，任选被羟基或卤素取代；或者
-任选被羟基、卤素、氨基取代的环烷基(3～8个碳原子)；
-芳基；
-杂芳基，该方法包括如下步骤：应用权利要求1～6任一项的方法制备式(Ⅰ)的化合物；使式(Ⅰ)的化合物脱酰而获得包含式(Ⅱ)化合物的转化液。
11．权利要求10的方法，其中，所述转化液进一步包含以R2表示的分裂侧链。
12．权利要求10的方法，其中，所述脱酰是应用二羧基酰基转移酶酶促进行的。
13．权利要求10～12任一项的方法，它包括该进一步的步骤：通过结晶从所述溶液回收式(Ⅱ)的化合物。
14．权利要求13的方法，其中，在所述结晶以前用选自下列的作用剂处理溶液：吸附树脂、活性炭、甲醇、乙醇、(异)丙醇、异丁醇、正丁醇、丙酮或者任意上述作用剂的组合物。
15．权利要求14的方法，其中，应用了至少一种选自下列的吸附树脂：XAD16、XAD1600和HP20。
16．权利要求10或11的方法，其中，6-氨基青霉烷酸(6-APA)含量相对于式(Ⅱ)化合物为10 ppm或更少。
17．权利要求11或12的方法，其中，在脱酰之后处理溶液而至少部分地除去由R2表示的分裂侧链。
18．权利要求17的方法，其中，至少部分地除去分裂侧链的处理是对结晶后获得的母液进行的。
19．权利要求18的方法，其中，所述至少部分地除去分裂侧链的处理之后接着进行粗晶体的加溶和式(Ⅱ)化合物的重结晶。
20．权利要求18的方法，其中，在结晶之前用选自下列的作用剂处理溶液：吸附树脂、活性炭、甲醇、乙醇、(异)丙醇、异丁醇、正丁醇和丙酮或者上述这些作用剂任意的组合。
21．权利要求17～20任一项的方法，其中，所述处理包括：将转化液或母液在低于5的pH、优选低于4的pH、更优选接近或低于3的pH下进行膜式过滤。
22．膜式过滤在从包含二羧酸和β-内酰胺抗生素的混合物中除去二羧酸方面的应用。
23．权利要求22的应用，其中，所述混合物是结晶式(Ⅱ)的化合物后获得的母液。
24．权利要求22或23的应用，其中，所述过滤是在大约5或更低的pH、优选在pH 4或更低pH下进行的。
25．权利要求22～24的应用，其中，所述过滤是在pH3或低于pH3时通过narofiltration进行的。
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