CN1303217C - β－内酰胺环的制备方法及其应用 - Google Patents

β－内酰胺环的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及制备β-内酰胺环水溶液或悬液的方法及其应用。通过β-内酰胺化合物的酶法脱酰化方法制备β-内酰胺环水溶液或悬液，该化合物中含有的β-内酰胺环带有由酰氨键偶联的侧链，该脱酰化在水和有机溶剂的混合物中进行，并且产生β-内酰胺环和羧酸，在pH值在2到6之间进行而使得羧酸被原位萃取到有机溶剂中。

Description

β-内酰胺环的制备方法及其应用
本发明涉及β-内酰胺环水溶液或悬液的制备方法，由该方法获得的β-内酰胺环水溶液或悬液，以及用该水溶液或悬液以酶学方法制备β-内酰胺抗生素的方法。
EP0826776公开了生产含6-氨基青霉酸(6-APA)溶液的方法，该6-APA溶液可以直接用于合成反应，即不需后处理步骤。为得到该结果EP0826776的方法包含的第一个步骤是通过超滤纯化含有青霉素G的发酵液。在第二步中滤液中的青霉素由酶学方法转变成含6-APA、苯乙酸和无机盐的溶液。进行该酶学转变的方式是使得青霉素快速转变。在第三步中酶学转变的产物经过一系列树脂柱而分离。该方法得到6-APA溶液，可以直接用于酶法制备氨苄青霉素或羟氨苄青霉素类青霉素，或者可以由此结晶6-APA。并且形成苯乙酸溶液和固体废物流。
EP0826776所述方法的缺点是它非常耗费劳力。
根据本发明的方法提供所述途径的另一种情况。
为得到该结果，本方法的特点为在pH2-6之间对β-内酰胺化合物进行酶法脱酰化，该β-内酰胺化合物含有β-内酰胺环，其上带有由酰胺键偶联的侧链；且该脱酰化在水和有机溶剂的混合物中进行并产生β-内酰胺环和羧酸。通过使用水和有机溶剂的混合物可以在原位将羧酸萃取到有机溶剂中。萃取到有机溶剂中的羧酸量可能变化且例如为脱酰化中形成的羧酸量的60％。优选，至少70％，更优选至少90％，且更优选至少95％的羧酸被有机溶剂萃取。
更优选，羧酸几乎完全被萃取，更优选羧酸完全被有机溶液萃取。
根据本发明的方法的优点是它可以导致不含任何无机盐的β-内酰胺环水溶液或悬液。
优选根据本发明方法中的酶法脱酰化在pH大于等于3.5时进行。该pH优选小于等于5。
在本发明中，酶法脱酰化理解为将侧链从β-内酰胺化合物上以酶法去除，该β-内酰胺化合物含有β-内酰胺环，其上带有由酰氨键偶联的侧链。该侧链以羧酸形式释放。
酶法脱酰化反应为本领域技术人员所知。原则上，能够去除β-内酰胺化合物侧链的任何酶都可以用于本发明的方法。适于脱酰化反应的酶例如已知为青霉素酰基转移酶或青霉素酰胺酶。这些酶分类为E.C.3.5.1.11。这些酶分离自例如微生物，如真菌和细菌。生产青霉素酰基转移酶的生物有例如：醋杆菌属、气杆菌属、产碱杆菌属、Aphanocladium、芽孢杆菌属、头孢属、埃希氏杆菌属、黄杆菌属、克吕沃尔氏菌属、枝动菌属、精朊杆菌属、假单孢菌属和黄单孢菌属。
例如能够将7-β-羧基丁酰氨基-头孢菌酸(cephalosporanic acid)转变为7-氨基头孢菌酸和戊二酸的酶也适用。该酶获自假单孢菌属。
优选该酶以固定化形式应用。
适合应用于脱酰化反应的β-内酰胺化合物例如为根据式(1)的β-内酰胺化合物：
其中
Figure C0181484400052
R0是-H；
R1是侧链；
R2是-H，-CH3，-Cl，-CH＝CH2，-CH＝C(CH3)H。
如本领域所知，式(1)的结构是β-内酰胺环的典型。然而各变量的含义不限于式(I)所给出的。
优选，脱酰化的起始物是β-内酰胺化合物，其中R1是
Figure C0181484400061
如果根据式(I)的β-内酰胺化合物用于脱酰化反应，就形成根据式(II)的羧酸：
R1-OH                   (II)
适用于根据本发明的方法的β-内酰胺化合物为例如青霉素G(PenG)、7-苯乙酰氨基-去乙酰基-头孢茵酸和N-己二酰-7-氨基去乙酰基头孢茵酸。这些化合物通常由发酵方法生产。优选青霉素G用作β-内酰胺化合物。当在根据本发明的方法中应用Pen G时，得到6-APA水溶液或悬液。如果应用7-苯乙酰氨基-去乙酰基-头孢茵酸或N-己二酰-7-氨基去乙酰基头孢茵酸时，得到7-ADCA水溶液或悬液。
多种有机溶剂可用于根据本发明的方法。然而，有机溶剂同水混合以后必须能够形成可以分离的两相。适合的有机溶剂是对羧酸比对β-内酰胺化合物显示更大亲和力的有机溶剂。可以通过在该羧酸的pKa范围内的pH进行脱酰化来方便的确定适当的溶剂。好的溶剂使得存在该有机溶剂时β-内酰胺化合物向β-内酰胺环和羧酸的转变高于相同pH下该β-内酰胺化合物在水中的转变。
β-内酰胺化合物的分配定义为β-内酰胺化合物在有机溶剂中的浓度除以β-内酰胺化合物在水相中的浓度。羧酸的分配定义为羧酸在有机相的浓度除以羧酸在水相中的浓度。有机溶剂优选为在羧酸pKa范围内的pH下产生低β-内酰胺化合物分配和高羧酸分配的溶剂，这样在β-内酰胺化合物的酶法脱酰化中羧酸在有机相和水相中如此分配而使水相富含β-内酰胺化合物并缺乏羧酸，而有机相缺乏β-内酰胺化合物并富含羧酸。也即，优选的溶剂导致有机相中β-内酰胺化合物浓度小于羧酸浓度，而水相中β-内酰胺化合物浓度大于羧酸浓度。
pKa范围内的pH为例如具有在pKa-2到pKa+2之间的pH。
优选，在确定适合的溶剂时，pH等于pKa-1或pKa+1。
更优选，所用有机溶剂有利于脱酰化反应的高产率并且有利于从水相向有机溶剂萃取β-内酰胺化合物。非极性溶剂不适用于本发明的方法。适合的溶剂例如为：乙酸酯，醇，酮，酯和醚。优选C1-C6乙酸酯，C1-C6醇。优选，所用溶剂为以工业规模应用的常用溶剂。优选，使用非卤代的溶剂。在根据本发明的方法中β-内酰胺化合物为青霉素G时非常适合的溶剂是例如正丁基乙酸酯和甲基叔丁基醚(MTBE)。
β-内酰胺化合物的游离酸在有机溶剂中的溶液可获自将β-内酰胺化合物的游离酸溶解在有机溶剂中或者将β-内酰胺化合物的盐溶解在水中，然后酸化并向溶剂萃取，或者萃取酸化的发酵液或酸化的含β-内酰胺化合物的发酵液滤液。
在优选的实施方案中，该方法通过将在有机溶剂中含β-内酰胺化合物游离酸的溶液接触酶在水中的溶液或悬液来实施，由此在pH范围2-6将β-内酰胺化合物以酶学方法转变成β-内酰胺环和羧酸，并由此形成富含羧酸的有机相和富含β-内酰胺环的水相，这些相可以分别回收。水和有机层的分离为本领域所知。
富含β-内酰胺环而缺乏羧酸的水相可以直接用于以后的反应。
优选的后继反应是酶促偶联反应，其中在酶的协助下将侧链前体偶联于β-内酰胺环。酶促偶联反应已知并叙述于例如WO29/01601和WO99/20786。
已知存在羧酸是酶促偶联反应中的问题，因为羧酸的存在通常对已知的偶联反应的酶的活性和选择性有不良影响。这在欧洲专利申请EP-A-0734452中有叙述。通常当存在的羧酸量大时，羧酸的负面影响更大。因此，由酶法脱酰化得到的反应混合物除非经过纯化步骤，否则不适于用在后继酶促反应中。
本发明也涉及由根据本发明的方法获得的β-内酰胺环的水溶液或悬液。
这些水溶液或悬液很适于直接应用于酶法制备β-内酰胺抗生素的方法。
β-内酰胺抗生素为本领域技术人员所知，并记述于例如Kirk-Othmer化学技术百科全书(第三版，第二卷，871-915页，John Wiley& Sons，纽约)。优选，β-内酰胺抗生素是根据式(I)的化合物，其中侧链R1同脱酰化中所用β-内酰胺化合物的R1不同。
根据本发明的方法的优点是相比于已有方法β-内酰胺环的损失可以很大地减少，因为β-内酰胺环不需要从水相中分离出来。已知方法涉及相当程度的β-内酰胺环损失，因为，分离环以后，由于β-内酰胺环在水中相当高的溶解性而使得相当量的β-内酰胺环留在水相中。分离β-内酰胺环之后仍含有一些β-内酰胺环的水相一般称为母液(ML)。根据本发明的方法允许β-内酰胺环的损失受到限制。优选，损失减少至少5％，更优选β-内酰胺环损失减少至少10％，损失百分比通过用母液中的β-内酰胺环的摩尔数除以脱酰化反应中所用的β-内酰胺化合物的摩尔数并将商乘以100％而计算得到。
国际申请WO98/48039公开了方法，其中6-APA溶液通过从发酵液向有机溶剂萃取N-取代的青霉素并接着将N-取代的青霉素再萃取回水中并再用青霉素酰基转移酶处理水相而得到，该方法中通过对N-取代的青霉素酶法脱酰化而形成6-APA和苯乙酸。然而，在该反应中，水相pH由于形成苯乙酸而下降。这对酶法脱酰化反应的平衡不利。由于这个原因，在WO98/48039的方法中用氨水或碱性水溶液辅助将pH值维持在使酶法脱酰化反应的平衡处于产物一侧。酶法脱酰化以后，可以从水相中分离6-APA和/或苯乙酸。
已知方法的缺点是在酶法脱酰化以后苯乙酸仍存在于反应混合物中。而且，已知水解Pen G的方法产生6-APA溶液或悬液，其中存在无机盐。本发明的目标是提供没有这个缺点的方法。提供导致形成更少无机盐副产品的方法也是本发明的目的。
已知存在无机盐对合成抗生素有不利影响。获得自Pen G脱酰化反应而未经分离和重新溶解6-APA或者未经应用纯化技术的6-APA溶液或悬液因此较不适于用作酶法合成β-内酰胺抗生素的起始物。
在根据本发明的方法的优选的实施方案中，该方法如此进行，而使后来没有无机盐形成。这可以通过将例如Pen G游离酸用作起始物，而同时在酶法脱酰化反应中不改正pH或者通过将Pen G游离酸用作起始物而用不导致无机盐形成的碱改正pH。相应的，在优选实施方案中根据本发明的方法在存在至少一种选自下组的化合物时实施：苯基甘氨酸或羟苯基甘氨酸的酯或酰胺，优选D-(-)-对羟苯基甘氨酸甲酯(HPGM)，D-(-)苯基甘氨酸甲酯(PGM)，D-(-)-对羟苯基甘氨酰胺(HPGA)和D-(-)苯基甘氨酰胺(PGA)。当用其他β-内酰胺化合物代替Pen G时，该方法也阻止无机盐的形成。
在根据本发明的方法的实施方案中，在酶法脱酰化反应中β-内酰胺环沉淀。可以例如通过使用高浓度的Pen G实现沉淀。在优选的实施方案中，将Pen G在有机溶剂中的溶液接触水和酶这样形成具有产物6-APA的浓度和pH，优选在6-APA的等电点范围，这时6-APA沉淀。6-APA沉淀导致脱酰化反应更高程度的转化，因为6-APA产物从溶液中析出。可以与所述对6-APA相同的方式沉淀7-ADCA。
根据本发明的方法的优点是相比于现有方法β-内酰胺环的损失可以很大地降低，因为不需要从水相中分离该环。因此根据本发明的方法可以导致比现有方法更高的效率。而且，产生更少作为不必要的副产品的无机盐。在现有方法中形成的盐对环境造成负担。
有机溶剂中的β-内酰胺化合物的溶液或悬液同含酶的水溶液或悬液可以多种方式相互接触，例如以分批过程，以并流方式或以对流过程。在本申请中，分批过程理解为在一个容器中混合有机相和水相然后再分离，并且不再加入新的水或有机溶剂的方法。在本申请中，并流方法理解为上述分批过程之后水相同新的有机溶剂混合并分离一或多次，由此酶可以同水相流走，或者上述分批过程之后有机相同新的水和新的酶混合。
优选根据本发明的方法以并流方式进行。这对获得比在分批过程中更纯的产品有利。更优选根据本发明的方法以对流过程进行。这可以图1所示流程实施。在图1中对流原理显示为用Pen G脱酰化，但是当选择不同的β-内酰胺化合物时，相同的原则也适用。在该方法中使用了混合器和澄清器。
混合器理解为在其中混合水和有机溶剂的容器。澄清器理解为反应混合物在其中分成两相，水相和有机相；或者在其中将混合物分成两相的容器。
图1中的底层(BL)为水相，上层(UL)为有机相。
m指示向其中引入有机溶剂中的Pen G的混合器同从对流反应体系中去除有机溶剂中的羧酸(PAA)的澄清器之间放置的混合器和澄清器的数目。
n指示在引入有机溶剂的混合器和引入有机溶剂中的Pen G的澄清器和混合器之间的混合器和在其中用有机溶剂洗涤水层的澄清器的数目。洗涤操作进行的越多，终产物越纯；终产物越纯，产量越高。这个原则为本领域技术人员所知。
图1：用对流原理从水/有机溶剂中的PenG制备6-APA的流程图
Figure C0181484400111
5 BL：底层
  UL：上层
  m，n：0，1，2，...
在图1中，酶可以同水-起引入到系统中，与水共流并与6-APA共存。另一种情况是在所有的混合器中存在固定化的酶。在这种情况，混合器中需要有设备将酶保持在混合器中，例如保持固定化酶的滤片。
6-APA可以溶解在水底层而流过系统。在此过程中6-APA可能沉淀。沉淀的6-APA由水底层带走，该水中的产物流就是6-APA悬液。这可以通过例如过滤有机相而保留6-APA来实现，或者通过离心反应混合物，然后带有沉淀6-APA的水相和有机相可以分开。
固定化的酶可以同沉淀的6-APA一样由水相带走。
如果使用固定化的酶及沉淀的6-APA，可以选择把酶留在混合器中。6-APA和酶可以用例如6-APA可以通过而固定的酶不能通过的筛进行分离。
对流过程的优点是该过程导致该方法的更高效率，这意味着比分批过程得到更多更纯的β-内酰胺环。在本文中，“更纯”意为在得到的粗β-内酰胺环的量中存在更少的β-内酰胺化合物和羧酸。
在根据本发明的方法的实施方案中，其中6-APA在酶法脱酰化的过程中结晶，这对脱酰化反应有利，在对流或并流方式中固体6-APA随水相被带走是有利的。
本发明还涉及有根据本发明的方法得到的6-APA或7-ADCA的水溶液或悬液。
本发明还涉及通过将侧链前体同β-内酰胺环反应而酶法制备β-内酰胺抗生素的方法，其特征为所用的β-内酰胺环源自根据本发明的水溶液或悬液，即，直接使用水溶液或悬液，不需从中分离β-内酰胺环并且水溶液或悬液不需经过处理过程。
在优选的实施方案中，用不含盐的溶液或悬液酶法制备β-内酰胺抗生素。
要到达那样的结果，包含以下步骤的方法：酶法脱酰化β-内酰胺化合物，该化合物含有通过酰胺键与之相连的β-内酰胺环，而且该脱酰化在水和有机溶剂的混合物中进行，且该脱酰化产生β-内酰胺环和羧酸，在pH2到6之间进行，这样羧酸几乎完全原位萃取到有机溶剂中，由此，形成有机相的有机溶剂与水相分离，由此含β-内酰胺环的水相接触侧链前体和催化侧链前体与环偶联的酶。在此实施方案中，优选大于90％，更优选95％和更优选99％的羧酸被有机溶剂萃取。
使用更多混合器和澄清器，就会有更多羧酸被萃取。萃取也可通过选用好的溶剂及通过使用优化的pH而进行优化。
所有本领域已知的侧链前体都可用于酶法制备抗生素。优选，侧链前体定义为β-内酰胺抗生素中侧链的酯或酰胺。更优选，所用侧链前体是D-苯基甘氨酸或D-对-羟苯基甘氨酸的酯或酰胺或者，更优选，甲酯，乙酯，正丙酯或羟乙酯。
可以用任何适于该反应的酶将侧链前体偶联于环上，如来自类别E.C.3.5.1.11的青霉素酰基转移酶或来自类别E.C.3.1.1.43的α-氨基酸酯水解酶。这些酶记述于例如WO98/48038。可用根据本发明的方法制备的抗生素为例如氨苄青霉素，羟氨苄青霉素，头孢羟氨苄，头孢氨苄，头孢拉定(cefradin)，头孢罗齐和头孢氯。
实施例
缩写
6-APA        ＝6-氨基青霉酸
Pen G        ＝青霉素G
7-ADCA       ＝7-氨基脱酰基头孢茵酸
MTBE         ＝甲基叔丁基醚
HPGM         ＝D-(-)-对羟基苯基甘氨酸甲酯
PGM          ＝D-(-)-苯基甘氨酸甲酯
HPGA         ＝D-(-)-对羟基苯基甘氨酰胺
PGA          ＝D-(-)-苯基甘氨酸酰胺
Pen酰基转移酶＝青霉素酰基转移酶
原材料
Pen酰基转移酶得自大肠杆茵，ATCC11105，如国际专利申请WO97/04086所述。
固定化的Pen酰基转移酶如欧洲专利申请EP-A-0222462所述获得。白明胶和壳聚糖用作凝胶化剂。戊二醛用作交联剂。
确定IU(国际单位)的方法
1单位是在标准条件下1分钟内转化1微摩尔Pen G所需活性。标准条件是pH等于8，温度28℃，10％的Pen G钾盐水溶液(质量％)，50mM磷酸钾缓冲液，滴定法用NaOH作标准溶液。
实施例1
在100ml水和100ml甲基叔丁基醚的混合物中溶解3.7克(10mmol)的Pen G钾盐。在室温用硫酸辅助将混合物pH调至2.6。分层。向有机层加入100ml水(95ml，HPLC分析显示该溶液含9.7mmolPen G)。向混合物中加入1.36克(7.5mmol)的D-对羟基苯基甘氨酸甲酯(HPGM)。那时水层的pH接近4.5。接着，加入具有4200单位活性的固定化的青霉素酰基转移酶。在室温搅拌该混合物3小时。搅拌以后，水层的pH接近4.8。接着，通过HPLC确定Pen G，苯乙酸，6-APA和HPGM在两相中的浓度。HPLC分析结果示于表1。
表1
  层   体积(ml)   [Pen G](mM)   [苯乙酸](mM)   [6-APA](mM)   [HPGM](mMm)   Pen G(mmol)   苯乙酸(mmol)   6-APA(mmol)   HPGM(mmol)
  水   115   23.1   14.0   42.1   52.5   2.7   1.6   4.8   6.0
  MTBE   65   6.2   68.4   0.0   0.0   0.4   4.4   0.0   0.0
4.8mmol的6-APA对应于相对所用Pen G钾盐的量(摩尔)48％的效率。
MTBE代表甲基叔丁基醚。
实施例2
在20ml水和20ml乙酸正丁酯的混合物中溶解1.86克(5mmol)的Pen G钾盐。在室温用6M硫酸辅助将混合物pH调至2.6。分层。向有机层加入30ml乙酸正丁酯和50ml水。向混合物中加入0.36克(2.0mmol)HPGM。接着，加入具有2100单位活性的固定化的青霉素酰基转移酶。搅拌1小时后，水层的pH接近4.4。在室温搅拌混合物5.5小时。接着，通过HPLC确定Pen G，苯乙酸，6-APA和HPGM在两相中的浓度。HPLC分析结果示于表2。
表2
  层   [Pen G](mM)   [苯乙酸](mM)   [6-APA](mM)   [HPGM](mMm)
  水   16.1   4.5   49.5   37.5
  乙酸正丁酯   13.7   43.6   N.d   0.0
N.d：未确定
50ml水中49.5mM的6-APA对应于相对于所用Pen G钾盐的量(摩尔)50％的产率。
实施例3
在250ml水和250ml乙酸正丁酯的混合物中溶解9.3克(25mmol)的Pen G钾盐。在室温用6M硫酸辅助将混合物pH调至2.6。分层。向有机层加入50ml水和具有10500单位活性的固定化的青霉素酰基转移酶。在室温搅拌混合物16小时，此间pH从2.7升至3.5且形成白色沉淀。用孔径100微米的筛子过滤反应混合物；水/乙酸正丁酯中的固定化酶不能通过筛子而白色产物可以通过筛子。将滤液转移至分液漏斗分层。底层用玻璃滤器过滤，白色产物留在滤器上。将澄清的滤液加向筛子上的固定化酶上，筛子含有白色产物的痕迹，再过滤筛子的滤液，并重复该步直到白色产物跟固定化的酶分离。最后，将上层也经玻璃滤器过滤。将分离的产品，即，滤器上的白色产物干燥并分析。该产物(4.14g)含97.4％的6-APA，相当于18.6mmol的6-APA。相对于所用Pen G钾盐的量(摩尔)的效率为75％。水层含4mmol(2％)的6-APA。
实施例4
在250ml水和250ml甲基叔丁基醚的混合物中溶解14克(37.5mmol)的Pen G钾盐。在室温用6M硫酸辅助将混合物pH调至2.6。分层。HPLC分析显示有机层(238ml)含35.2mmol的Pen G。水层含0.7mmol的Pen G。
向有机层加入250ml水。向混合物中加入0.91克(5.0mmol)的HPGM。接着，加入13000单位活性的固定化的青霉素酰基转移酶。那时水层的pH接近3.7。在室温搅拌混合物，50分钟后出现白色沉淀。规律的间隔用HPLC测量Pen G，苯乙酸，6-APA和HPGM在两相中的浓度，以及水层的pH(见表3)。过滤两层的样品用以分析，确定所述溶解的化合物的浓度。
表3
时间(分钟)     pH     相     [Pen G](mM)     [苯乙酸](mM)     [6-APA](mM)     [HPGM](mM)
    8     3.72     水     22.8     1.3     31.9     19.3
    MTBE     93.7     38.2     0.0     0.0
    30     3.81     水     18.3     2.9     61.5     18.2
    MTBE     57.4     76.5     1.9     0.0
    60     3.90     水     16.4     3.8     49.0     18.2
    MTBE     41.6     94.9     0.0     0.0
    120     4.00     水     14.0     5.0     37.4     18.8
    MTBE     26.6     113.2     0.0     0.0
    331     4.15     水     11.5     6.3     31.0     19.3
    MTBE     16.4     128.7     0.0     0.0
5小时40分钟以后用孔径100微米的筛子过滤反应混合物。固定化的酶不能通过筛子，而固体，白色产物同有机和水相可以。将不含固定化酶的混合物转移到分液漏斗中，排出底层并用玻璃滤器过滤，白色产物留在滤器上。将滤液加向固定化酶(含有微量固体产物)，并先通过筛子，再通过滤器过滤。重复此步一定次数使得存在于固定化酶中的白色产物被冲向玻璃滤器。最后，分液漏斗中的顶层也经过玻璃滤器。滤液分层。干燥白色固体产物。有5种产物流份：
◆向甲基叔丁基醚(MTBE)萃取Pen G以后的水层
◆带有粘的反应混合物的固定化酶
◆过滤的水层，210ml
◆过滤的MTBE层，85ml(部分MTBE在过滤中蒸发)
◆干燥的固体，4.4g(6-APA含量95.8％，Pen G含量1.9％)
在400ml水中搅拌带有粘的反应混合物的固定化酶，用1M的NaOH溶液将pH调到pH7并在室温搅拌。取样混合物并分析损失。也分析其他生产流份。结果陈述于表4
表4
生产流份 Pen G(mmol)  PAA(mmol)  6-APA(mmol)  HPGM(mmol)
萃取后水层 0.7
固定化的酶(稀释并调pH到pH＝7) 0.1  4.3  5.1  0.0
过滤后的水层 2.7  3.2  5.4  3.8
过滤后的MTBE层 2.4  20.1  0.0  0.0
分离的产物 0.2  0.0  19.5  0.0
在过滤后的水层中6-APA的百分比+分离的产物相对于所用PenG钾盐是66％([5.4+19.5]/37.5)
实施例5
在250ml水和250ml甲基叔丁基醚的混合物中溶解14克(37.5mmol)的Pen G钾盐。在室温用6M硫酸辅助将混合物pH调至2.6。分层。HPLC分析显示有机层(238m1)含35.2mmol的Pen G。水层含0.7mmol的Pen G。
向有机层加入250ml水。向混合物中加入0.91克(5.0mmol)的HPGM。接着，加入13000单位活性的固定化的青霉素酰基转移酶。那时水层的pH接近3.7。在室温搅拌混合物，50分钟后出现白色沉淀。-共在室温搅拌2小时又10分钟。用HPLC测量Pen G，苯乙酸，6-APA和HPGM在两相中的浓度，以及水层的pH(见表5)。过滤两层的样品用以分析，确定所述溶解的化合物的浓度。
表5
  时间分钟   pH   相   [Pen G](mM)   [苯乙酸](mM)   [6-APA](mM)   [HPGM](mM)
  132   4.05   水   14.0   5.1   39.3   18.8
  MTBE   24.4   122.1   0.0   0.0
然后将混合物转移到分液漏斗分层为含白色固体产物和少量固定化酶的有机层和含白色固体产物和大量固定化酶的水层。
向水层加入250ml的MTBE并在室温搅拌混合物。向有机层加入250ml水和4000单位活性的固定化酶，并在室温搅拌混合物。用HPLC测量Pen G，苯乙酸，6-APA和HPGM在两种混合物的两相中的浓度，以及水层的pH(见表6)。过滤两层的样品用以分析，确定所述溶解的化合物的浓度。
表6
 混合物   加入新鲜相以后的时间(分钟)   PH   相   [Pen G](mM)   [苯乙酸](mM)   [6-APA](mM)   [HPGM](mM)
 水层+新鲜的MTBE   8   4.50   水   7.5   0.6   34.7   18.8
  MTBE   4.3   8.1   0.0   0.0
  192   4.94   水   3.2   2.2   24.5   18.8
  MTBE   0.6   15.4   0.0   0.0
 MTBE层+新鲜的水和酶   14   3.86   水   3.8   5.1   16.2   0.0
  MTBE   14.2   136.8   0.0   0.0
  156   3.90   水   3.5   5.9   16.6   0.0
  MTBE   10.5   146.3   0.0   0.0
表6中的结果显示将含固定化酶的水层同新鲜的MTBE混合导致Pen G向6-APA和苯乙酸转变而进一步进展。混合MTBE层和新鲜的水+固定化酶保证Pen G向6-APA和苯乙酸的转变也进一步进展。只要对流步骤数量足够，结合图1所示对流原理，这样就保证Pen G向6-APA和FA的转变将几乎完全。
制备α氨基酸酯水解酶
如在T.Takeshi ao.，J.Am.Chem.Soc.，944035(1972)中所述，培养生物巴斯德氏醋杆茵(Acetobacter pesteurianus)(ATCC6033)。用Membralox 20nm膜过滤收获细胞。用MC-4APV Gaulin均质器以600bar将滞留物均质化。将10％的dicalite 4108加入混合物并用Schule filter press(KuKME800/VI So VE(EX)-2)过滤去除细胞碎片。用50kD DDS膜浓缩滤液。向无细胞的提取物中加入硫酸铵至其浓度为243g每升。将混合物同疏水树脂(Phenyl Sepharose)混合并搅拌过夜。将混合物装柱并弃掉第一流份。用194，146，97，49和0克硫酸铵每升的溶液洗脱。向洗出液中加入硫酸铵至浓度为243g/l。离心形成的沉淀并用20mM的含243克硫酸铵每升的tris缓冲液(pH)洗涤。在含0.5g/l牛血清白蛋白(BSA)的20mM磷酸缓冲液(pH＝6.0)中溶解沉淀。用阳离子交换剂层析(SP Sepharose)进行进一步纯化。将溶解的沉淀稀释并转移到阳离子交换剂上。用线性梯度(以100％20mM磷酸缓冲液+0.5g/l BSA开始，以80％洗脱20mM磷酸缓冲液+0.5g/l BSA和20％20mM磷酸缓冲液+含1M NaCl的0.5g/l BSA结束)洗脱。分部收集洗脱液并按照如下方法测试活性：向流份的部分中加入固体6-APA和固体HPGM(在混合物中浓度[6-APA]＝[HPGM]＝50mM)。通过加入固体HPGM将混合物的pH保持在pH＝6.0-6.4。HPLC显示在含α氨基酸酯水解酶的流份中存在羟氨苄青霉素。含α氨基酸酯水解酶的流份可通过透析方法(Pierce slide analyzer透析膜，10000MWCO)除盐。
实施例7
在50ml水中用l.08g的6-APA和0.91g的HPGM制备溶液。向0.25ml这种溶液中加入0.2ml含按实施例1所述得到的酶(经透析去盐)及0.05ml下述溶液中的一种。在20℃混合该混合物并测量pH。反应中，加入HPGM使pH保持在6.0到6.4之间。在反应过程中取样并分析6-APA，HPGM，羟氨苄青霉素和HPG。
配制下列溶液：
6.8ml水中加0.2g的NaCl
3.1ml水中加0.10g的硫酸铵
5ml水中加0.17g的FA，用氨水调pH至6.2
8.5ml水中加0.73g的Pen G钾盐。
每个反应60分钟后反应物和产物的浓度见下(见表7)
表7
  加入   [6-APA](mM)   [HPGM](mM) [羟氨苄青霉素](mM)   [HPG](mM)   [羟氨苄青霉素]/[HPG]   [羟氨苄青霉素]+[HPG](mM)
  0.05ml水   26.0   27.6   24.2   14.5   1.7   38.7
  0.05ml NaCl溶液   32.4   34.9   20.6   18.8   1.1   39.4
  0.05ml(NH4)2SO4溶液   40.8   44.4   12.3   21.1   0.6   33.4
  0.005ml FA溶液和0.045ml水   25.9   28.3   21.1   15.7   1.3   36.8
  0.01ml FA溶液和0.04ml水   26.2   32.8   21.4   17.0   1.3   38.4
  0.05ml FA溶液   36.3   38.5   14.4   19.0   0.8   33.4
  0.01ml Pen G P溶液和0.04ml水   25.3   27.0   22.8   18.2   1.3   41.0
  0.05ml Pen G P溶液   38.8   31.9   15.6   19.1   0.8   34.7

Claims (15)

1.制备β-内酰胺环水溶液或悬液的方法，其中β-内酰胺化合物的酶法脱酸化反应在pH值在2到6之间进行，而该β-内酰胺化合物所含的β-内酰环带有由酰胺键偶联的侧链，其酶法脱酰化在能够形成两相的水和有机溶剂的混合物中进行产生β-内酰胺环和羧酸，其中所述有机溶剂选自由乙酸酯、醇、酮、酯和醚组成的组。
2.根据权利要求1的方法，其特征为β-内酰胺化合物是青霉素G。
3.根据权利要求1或2的方法，其包括步骤：将在有机溶剂中的β-内酰胺化合物游离酸的溶液接触pH值范围2到6的青霉素酰基转移酶的水溶液或悬液，并导致有机相富集羧酸而水相富集β-内酰胺环，这些相可以分别回收。
4.根据权利要求1的方法，其特征为酶法脱酰化反应在pH值在3.5到5之间进行。
5.根据权利要求1的方法，其特征为在酶法脱酰化反应中存在HPGM，HPGA，PGM或PGA。
6.根据权利要求1的方法，其特征为乙酸丁酯或甲基叔丁基醚用作有机溶剂。
7.根据权利要求1的方法，其特征为对有机相和水相应用对流原理来进行酶法脱酰化。
8.根据权利要求1的方法，其特征为进行该方法使得在酶法脱酰化中6-APA结晶。
9.根据权利要求1的方法，其特征为酶是固定化的。
10.根据权利要求1的方法，其特征为过程中不加入无机酸或无机碱。
11.由根据权利要求10的方法得到的β-内酰胺环水溶液或悬液，其不含任何无机盐。
12.通过将β-内酰胺环同侧链前体反应酶法制备抗生素的方法，其特征为使用根据权利要求1的方法制得的β-内酰胺环的水溶液或悬液。
13.酶法制备抗生素的方法，其中酶法脱酰化β-内酰胺化合物的反应在水和有机溶剂的混合物中进行并且产生β-内酰胺环和羧酸，其中β-内酰胺化合物所含β-内酰胺环带有由酰胺键偶联的侧链，该方法中脱酰化反应在pH值在2到6之间进行而使得羧酸被原位萃取到有机溶剂中，而含β-内酰胺环的水相接触侧链前体和催化该侧链前体同β-内酰胺环偶联的酶。
14.酶法制备抗生素的方法，其中酶法脱酰化β-内酰胺化合物的反应在水和有机溶剂的混合物中进行并且产生β-内酰胺环和羧酸，其中β-内酰胺化合物所含β-内酰胺环带有由酰胺键偶联的侧链，该方法中脱酰化反应在pH值在2到6之间进行而使得95％的羧酸被原位萃取到有机溶剂中，而含β-内酰胺环的水相接触侧链前体和催化该侧链前体同β-内酰胺环偶联的酶。
15.根据权利要求14的酶法制备抗生素的方法，其中脱酰化反应在pH值在2到6之间进行而使得99％的羧酸被原位萃取到有机溶剂中。
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