DE2409569A1 - Verfahren zur herstellung von 7-aminodelta hoch 3 -cephem-derivaten - Google Patents

Description

Bayer Aktiengesellschaft

Zentralbereich Patente, Marken und Lizenzen

, 509 Leverkusen. Bayerwerk

^S/As ... 2 7. FEB. 1974

Verfahren zur Herstellung von 7-Amino-/\ -oephem-Derivaten

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur

i; s- λ;

Herstellung von 7-Amino-jLA -cephem-Derivatea, die als Zwischenprodukte für die Synthese von antimikrobiellen Wirk-, stoffen verwendet werden können.

Es ist bereits bekanntgeworden, daß man 7-Amino-cephalosporansäure z.B. durch die Spaltung von Cephalosporin C mit Kulturen von verschiedenen Mikroorganismen (vgl. z.B. US-Patentschrift 3 2J9 394) oder durch chemische Spaltung nach verschiedenen Methoden (vgl. z.B. deutsche Auslegeschrift

1 176 14-7, deutsche Offenlegungsscnrift 1 145.615 -oder US-Patentschrift 3 272 809) erhält. Desacetoxy-cephalosporin C kann nach katalytischer Reduktion (vgl.^US-Patentschrift 3 124 576) analog in 7-Amino-desacetoxy-cephalosporansäure umgewandelt werden. Aus der deutschen Offenlegungsschrift

2 212 276 ist auch ein Verfahren zur enzymatischen Spaltung von 7-Phenoxyacetamido-desacetoxy-cephalosporansäure zu 7-Amino-desacetoxy-cepnalosporansäure mit Hilfe eines adsorptiv gebundenen Enzyms aus Bacillus megaterium B 400 bekannt. Mehrere.Verfahren -zur Spaltung von Penicillinen mit Hilfe von kovalent an wasserunlösliche Träger gebundene Penicillinacylase sind ebenfalls bekanntgeworden (vgl. deutsche Offenlegungsscnrif ten 1 907 365, 1 917 057 und 2 215 637).

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Es wurde gefunden, daß man 7-Απχηο-Δ. -cephem-Derivate der Formel

- Ott (iti' ^r¹TJ

KjU. 'n^Ü Uüp

C Ή ^C-CH₀-R

(f ^ OH ^d

COOX

'in welcher

R für Wasserstoff; Hydroxyl; Amino; Cyano;

-0-CO-IIH₂; -S-C-Ii(CHp)_n , worin η eine ganze

Zahl von 4 bis 6 bedeutet; -O-CO-R¹, -NH-CO-R¹, -S-CS-O-R¹, worin R¹ Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet; steht oder in welcher R für -S-Het oder Het steht, wobei Het ein 5- oder 6-gliedriger heteroaromatischer Ring bedeutet, der gegebenenfalls eine positive Ladung tragen kann; und

X für Wasserstoff oder für das Symbol -einer

negativen Ladung steht, falls der Rest R eine positive Ladung enthält,

erhält, wenn man Verbindungen der Pormel

R² - CH - CO - KH - CK CH"''' CH₀

I₃ Il t ²

0 ^CH'

- ι

; coox

Le A 15 577 -Z-

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in welcher

R und X die oben angegebene Bedeutung haben und

2
R für einen gegebenenfalls in Ring durch

Amino, Hydroxy oder Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen substituierten Phenyl-, Phenoxy-, 2-Ihienyl oder 2-Furyl-Ring steht und

R · für 'Wasserstoff, Amino, Hydroxy oder Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen steht,

oder deren Salze mit anorganischen oder organischen Baaen, mit Penicillinacylase, welche kovalent an in Wasser lösliche Träger gebunden ist, gegebenenfalls in einer in einem wasserunlöslichen Trägermaterial eingeschlossenen Form, in Berührung bringt und das erhaltene 7-Απιίηο-Δ -cephem-Derivat der formel I -isoliert. .

In überraschender Weise spaltet die kovalent an wasserlösliche Träger gebundene Penicillinacylase die '/erbindungen der Formel II praktisch in gleicher Geschwindigkeit wie entsprechende Penicilline.

Das erfindungsgemäße Verfahren weist eine Reihe von Vorteilen gegenüber den bekannten Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I auf. Y/ährend z.B. Enzyme aus Zellkulturen nur einmal verwendet werden können, ist es möglich, die wasserlösliche trägergebundene Penicillinacylase durch Ultrafiltration abzutrennen und wiederholt zu verwenden. Weiterhin kann man gewünschtenfalls aus den wässerlöslichen Enzymzube- .

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•γ.

.reitungen auch wasserunlösliche Penicillinacylasezubereitungen dadurch erhalten, daß man kovalent an wasserlösliche Träger gebundene Penicillinacylase in ein wasserunlösliches Trägermaterial einschließt, z.B. durch Verkapseln oder Einschluß in Polymere. Diese wasserunlöslichen Zubereitungen können in vielen Fällen in günstiger Weise verwendet werden. Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Verbindungen der Formel I in sehr guter Reinheit und hohen Ausbeuten bei sehr geringem technischen Aufwand erhalten. Gegenüber der Verwendung eines nur adsorptiv gebundenen Enzyms (vgl. deutsche Offenlegungsschrift 2 212 276) hat der erfindungsgemäße Einsatz der kovalent gebundenen wasserlöslichen Penicillinacylasezubereitungen den Vorteil, daß das Enzym auch bei Vorwendung hoher Konzentrationen des Cephalosporin-Substrats der Formel II fest gebunden bleibt, wodurch sich eine gegenüber anderen Verfahren erheblich gesteigerte Wirtschaftlichkeit ergibt. Das erfindungsgemäße Verfahren stellt somit eine Bereicherung der Technik dar.

Verwendet man z.B. T-Phenyl-acetamido-desacetoxy-cephalosporansäure als Ausgangsstoff, so kann der Reaktionsablauf durch das folgende Formelschema wiedergegeben werden:

CH₀-CO-NH-CH CH^ CH₀

² Il I ²

COOH

Le A 15 577 . - 4 -

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— Λ ^)-CH₂-COOH

(an wasserlöslichen Träger gebundene Penicillinacylase/fLjO)

H₀N-CH-CH'

² I I ο

,C-CH₃

Die als Ausgangsstoffe eingesetzten Verbindungen sind durch die obige Formel II allgemein definiert.

Alkyl S bedeutet gcradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 4, vorzugsweise 1 oder 2 Kohlenstoffatomen. Beispielhaft seien Methyl, Äthyl, n- und i-Propyl genannt." ■

η steht vorzugsweise für 4 oder 5·

Der 5- oder 6-gliedrige heteroaromatische Hing Het enthält vorzugsweise 1 bis 3, insbesondere 1 oder 2 gleiche oder verschiedene Heteroatome. Als Heteroatome stehen Sauerstoff, Schwefel oder Stickstoff. Als Beispiele seien Puryl, Thionyl, Pyrazolyl, Imidazolyl, 1,2,3- und 1,2,4-Triazolyl, Oxazolyl, Isoxazolyl, Thiazolyl, Isothiazolyl, 1,2,3—τ 1,3,4—, 1,2,4- und 1,2,5-Oxadiazolyl, Azepinyl, Pyrrolyl, Isopyrrolyl, Pyridyl, Pyridinium, Pyridazinyl, Pyrimidinyl und Pyrazinyl genannt, ·

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-Ii

Der heteroaromatische Ring Het kann durch 1 bis 3, vorzugsweise 1 oder 2 Alkylgruppen mit vorzugsweise 1 bis 3 Kohlenstoffatomen substituiert sein, wobei beispielhaft Methyl und Äthyl -genannt seien.

Alkyl in der Defination von R_? bedeutet geradkettiges oder verzweigtes Alkyl ait 1 bis 4-, insbesondere 1 oder 2 Kohlenstoffatomen, wie Methyl, Äthyl und n- und i-Propyl.

Als Salze der'· Verbindungen der Formel II mit anorganischen oder organischen Basen, welche für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden können, seien die Alkalisalze, wie xlatriuin- und Kaliumsalze, Erdalkalisalze, wie Calciumsalze, Ammoniumsalze sowie die Salze, welche mit aliphatischen, araliphatischen oder aromatischen Aminen gebildet werden, genannt. Beispielhaft seien die primären, sekundären und tertiären Alkylamine, welche 1 bis 4 Kohlenstoffatome je Alkylgruppe enthalten und in welchen die Alkylgruppen durch Hydroxygruppen substituiert sein können, z.B. Äthyläm-in, Triäthylamin, Hydroxyäthylamin, cyclische Amine, z.B. Pyridin, Piperidin, Morpholin, Piperazin und N-Methylpiperazin aufgeführt.

I3ie erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen der Formel II sind bereits bekannt und können nach bekannten Verfahren erhalten werden (vgl. z.B. E. H. Flynn, Cephalosporins and Penicillins, Chemistry and Biology, Academic Press, New York, 1972).

Als (für das erfindungsgemäße Verfahren besonders bevorzugte) Beispiele von Verbindungen der Formel II seien genannt:

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R-CH-CO-HN

>Ί ΓΤ /*¥ rT ^^

H- CH

^x₂

IT

!00X

a) -OCOCH, ' Π Ι

I I H-

c) H

NH₂ H

d) ' H

H '

e) H

f) -0-CO-CH

0-

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— 7 —

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2 ³

R IT R X

*3

h) -0-CO-CH, Γ VS- ^NH9 ^H

Von diesen Verbindungen sind für die Verwendung beim erfindungsgemäßen Verfahren die Verbindungen d) bis g) ganz besonders bevorzugt.

Die Penicillinacylase, welche !covalent an wasserlösliche Träger gebunden ist, kann von verschiedenster Herkunft sein.

Die Penicillinacylase (Enzyme Comission 3·5-1·11)"kann aus zahlreichen Mikroorganismen nach allgemein bekannten Methoden (vgl. z.B. auch deutsche Offenlegungsschriften 1 907 und 2 217 74-5) gewonnen werden, z.B. aus Bakterien, insbesondere Escherichia coli, Erwinia, oder Actinomyceten, wie Streptomyces, Micromonospora, Norcardia oder Pilzen, wie Fusarium und Hefen. Besonders bevorzugt wird Penicillinacylase aus Escherichia coli, z.B. aus einem Escherichia coli— Stamm, welcher unter ATCG 11 105 hinterlegt wurde. Die Isolierung von Penicillinacylase aus Escherichia coli geschieht z.B. gemäß der deutschen Offenlegungsschrift 2 217 745 dadurch, daß man einen Rohextrakt.aus Escherichia coli-Zellen, der neben Penicillinacylase noch Zelltrümmer der Escherichia coli-Zellen enthält, auf einen pH-Wert yon 3?5 bis 5>5> vor-

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zugsweise 5>O, einstellt und den Extrakt zentrifugiert, anschließend die als Überstand erhaltene klare Lösung der Penicillinacylase mit Aluminium-Silikaten, vorzugsweise Benton.it,·" behandelt, das Adsorbat in bekannter Weise abtrennt und z.B. mit einer 0,1-1 ,0-molaren Lösung von Natrium- oder Kaliumacetat bei etwa pH 8,5 eluiert.

Die dabei erhaltene angereicherte klare Lösung der Penicillinacyl^se kann gegebenenfalls an makroporösen Ionenaustauschern z.B¹. SuIfoäthyl-Cellulose, chromatographisch >veitergereinigt werden.

Als Vv'asserlösliche Träger, an welche die Penicillinacylase kovalent gebunden werden kann, kommen sehr viele wasserlösliche polymere Verbindungen in Präge. Bevorzugt können als polymere Träger praktisch alle Polysaccharide verwendet werden. Als Beispiele seien hierzu vor allem genannt: Dextran, in Wasser lösliche Stärke, Laevan sowie Carboxymethylcellulose. Besonders bevorzugt sind Dextran und Stärke'.' .Als Polysaccharide kommen vorzugsweise solche mit einem Molekulargewicht von etwa 5000 bis etwa 1000 000, insbesondere 10 bis 800 000 in Frage.

Die Herstellung der erfindungsgemäß verwendbaren kovalent an in Wasser löslichen Trägern gebundenen Penicillinacylase unter Verwendung von Polysacchariden kann wie folgt vorgenommen werden:

Bei der Verwendung von Polysacchariden als wasserlösliche, polymere Träger setzt man disse"Polysaccharide zunächst bevorzugt mit einem Halogencyanid um..Anschließend wird die hierbei gebildete aktive Zwischenvefbindung gegebenenfalls

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nach ihrer Isolierung mit der Penicillinacylase umgesetzt, (vgl. Deutsche Offenlegungsschrift 1 768 512, entsprechend der US-Patentschrift Kr. 3 645 852).

Der Reaktionsablauf dieser 2-stufigen fieaktion (Bildung einer aktiven Zwischenverbindung und Bindung der Penicillinacylase an den polymeren Träger) kann durch das folgende üOrmelschema wiedergegeben werden:

—OH -OH

BrCIi "

—0

— 0^J

^vc=KH

-0-C-KH-Prοtein

-OH OH

OH

wobei X eine KH-frruppe oder Sauerstoff sein kann —I 1

einen Teil des polymeren Trägers (Polysaccharid) darstellt und HpK-Protein die Penicillinacylase bedeutet.

Als Halogencyan kommen Jod-, Chlor- und Bromcyan, insbesondere Bromcyan in Präge.

Als Verdünnungs- bzw. Lösungsmittel wird sowohl in der 1. Stufe (Umsetzung von Polysaccharid mit Halogencyan) als auch in der 2. Stufe (Umsetzung der Zwischenverbindung mit Penicillinacylase) bevorzugt Wasser verwendet.

Je G-rammPolysaccharid werden bei der Verwendung von Dextran vorzugsweise etwa 5 bis etwa 250, insbesondere 10 bis 200 mg Halogencyan und bei der■Verwendung von Stärke vorzugsweise etv;a 50 bis etwa 500, insbesondere -80 bis 200 mg Halogencyan

eingesetzt.

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Die Reaktionstemperaturen liegen bei beiden Stufen zwischen etwa 0 und etwa 50°, vorzugsweise zwischen 10 und 25⁰C Die Umsetzungen können bei Normaldruck, .aber auch bei erhöhtem Druck, bevorzugt bei Normaldruck, durchgeführt werden.

Bei der Herstellung der Penicillinasezubereitung hält man das Reaktionsmedium durch Zugabe einer Base beispielsweise von Natronlauge im Bereich von pH 8 - 13> vorzugsweise bei pH 11,0. Die Umsetzung des Halogencyans mit dem Polysaccharid ist in vielen*Fällen nach 10-20 Minuten beendet. Die Lösung der aus dem Polysaccharid und dem Halogencyan gebildeten akti- · ven Zwischenverbindung soll zur Umsetzung mit der Penicillinacylase kein freies Halogencyan enthalten. Die Umsetzung sollte so bald wie möglich erfolgen, da das reaktionsfähige Derivat des Polymeren leicht infolge von Hydrolyse inaktiviert wird. Vor der Umsetzung mit der Penicillinacylase wird der pH-Wert der Lösung die das aktive Polymer-Derivat enthält vorzugsweise auf etwa 8,5 gestellt. Nach Zugabe der Penicillinacylase rührt man bei etwa 0 bis etwa 5O⁰C, vorzugsweise 5 bis iO°G. Das hochmolekulare Enzym-Derivat kann anschliessend in üblicher Weise beispielsweise durch Ultrafiltration vom nativen, nicht umgesetzten Enzym mit Membranen abgetrennt werden, welche für die Enzym-Polymer-Zubereitungen undurchlässig sind» In Falle der Verwendung von Dextran mit einem Molekulargewicht von 5 00 000 können z.B. Membrane eingesetzt werden, welche für Stoffe mit einem Molekulargewicht von mehr als 100 000 durchlässig sind.

Das Verhältnis von Polysaccharid, Halogencyan und Penicillinacylase kann in weiten Grenzen variiert werden. Mit Sicherheit wird eine vollständige Umsetzung des Enzyms erzielt, wenn pro Gewichtsteil Enzymprotein mindestens 5 Gevvichtsteile ·

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Polysaccharid verwendet werden.

Es hat sich gezeigt, daß das Mengenverhältnis von Halogencyan und Po-lysaccharid die Haltbarkeit des Enzym-Derivates erheblich beeinflussen kann. So wird die native Penicillinacylase in wäßriger Lösung bei pH 7,8 und 45°C innerhalb von 24 Stunden bis zu 95 i» inaktiviert. Unter gleichen Bedingungen verliert trägergebundene, wasserlösliche Penicillinacylase, die beispielsweise an Dextran vom Molekulargewicht 500 OuO gekuppelt wurde j in 24 Stunden nur 47 °ß> an Aktivität, wenn pro Gramm Dextran 17 mg Bromcyan eingesetzt werden. Werden aber pro Gramm Dextran 80 mg Bromcyan verwendet, so vermindert sich die Enzymaktivität in 24 Stunden nur um 5 i°> Dabei überrascht es, daß bei gleicher Kupplungsausbeute durch Erhöhung des Halogencyan-Anteils die Stabilität der wasserlöslichen, träccergebundenen Penicillinacylase erheblich gesteigert werden kann. Möglicherweise entstehen durch Erhöhung der Menge an Halognncyan zwischen Trägermolekül und Enzymmolekül mehr kovalente Bindungen. Dadurch könnte die Tertiärstruktur des Enzyms um so mehr stabilisiert werden, wie kovalente Bindungen zwischen Träger und Enzym entstanden sind. Der mengenmäßige- Einsatz an Halogencyan ist jedoch begrenzt, da infolge von Quervernetsungen schwerlösliche und/oder unlösliche Enzymderivate entstehen können. So ist es nicht empfehlenswert, bei Verwendung von Polysacchariden, z.B. von Dextran, mit einem Molekulargewicht von ungefähr 500.000 pro Gramm mehr als 150 rag Halogenacyan, z.B. Bromcyan, einzusetzen.

Wird aber ein Polysaccharid, z.B. Dextran, mit einem kleineren Molekulargewicht, 2.B. von 2U.000 verwendet, so kann man ohne weiteres pro Gramm Polyaccharid mehr· als 300 mg Halogencyan, z.B. Bromcyan, reagieren lassen. Jedoch wird bei Verwendung

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von Trägern mit kleineren Molekulargewichten die Stabilität des Enzyms vermindert.

Auch mit Stärke als wasserlöslichen Träger lassen sich außerordentlich stabile Derivate der Penicillinacylase herstellen. Die Stabilität des Enzymderivates ist hierbei ebenfalls von dem Einsatz an Halogencyan abhängig. Vorzugsweise läßt man pro Gramm Stärke mindestens 15ö mg Halogencyan, z.B. Bromcyan, reagierten.

Die jeweils günstigsten Molekulargewichte der Träger und Art und Menge der Halogencyane sowie der Penicillinacylase sind durch, jeden Fachmann leicht zu ermitteln.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens (Umwandlung der Verbindungen der Formel II in Verbindungen der Formel I) kann die Penicillinacylase, welche kovalent an den wasserlöslichen Träger gebunden ist, direkt, also ohne weitere Veränderung oder aber auch in ein wasserunlösliches Trägermaterial z.B. Kapseln, Polymere der verschiedensten Art, eingeschlossen oder besonders bevorzugt in Fasern versponnen' (vgl. Deutsche Offenlegungsschrift 1 932 426, entsprechend der US-Patentschrift Kr. 3 715 277), verwendet werden. Die Einschliessung der kovalent an die in Y/asser löslichen Träger kann hierbei im Gegensatz zu dem freien nicht kovalent gebundenen Enzym ohne merklicher Aktivitätsverluste geschehen.

Die an wasserlösliche Träger kovalent gebundene Penicillinacylase kann wie bereits erwähnt gemäß der Methode dor deutschen Offenlegungsschrift 1 932 426-, entsprechend der US-Patentschrift 3 715 277 in Fasern versponnen werden. Die En-

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zym-Zubereitung wird ζ.3. hierzu mit Hilfe eines Einulgators dispergiert und im Eaßverspinnverfahren oder im Trockenspinnverfahren in Polymerisaten zu faserigen Gebilden versponnen. Als Polymerisate kommen hierbei Polymerisate und Mischpolymerisate der verschiedensten Art in Jrage, wie Zellulosederivate, insbesondere Zellulosetriacetat.

Sine .an Dextran vom l£_olekulargewicht 500.000 gebundene Penicillinacylase kann beispielsweise in Ausbeuten von 60 i<> der ursprünglichen Enzymaktivität nach literaturbekannten Verfahren (H. Wilson, R. Mosbach, K. Mosbach, Bioehim. Biophys. Acta 26S (1972), 253-256) einpolymerisiert werden. Hierbei kann besonders vorteilhaft die kovalent an einen wasserlöslichen Träger gebundene Penicillinacylase zum Beispiel in ein aus Acrylamid; IT,F¹ -Methylen-bisacrylamid und K", 1ST,IT^r ,Έ*- Tetramethyläthylendiamin entstehendes Copolymerisat in üblicher Tr'eise einpolymerisiert werden. Im Kontrollversuch mit nativer, also nicht kovalent an einen Träger gebundener Penicillinacylase wurden naeh'Sinpolymerisieren unter gleichen Yersuchsbedingungen nur 10 fo der ursprünglich vorhandenen Enzyrnaktivität erhalten. 3as einpolymerisierte trägergebundene Snzym erwies sich auch nach wiederholten Einsätzen zur Herstellung von Verbindungen des Typs I als außerordentlich stabil. Das einpolynierisierte Enzymderivat erlaubt eine schnelle und einfache Abtrennung aus dem Heaktionsmedium, da das rolymorinat in Korngrößen von mehr als 1 mm im Durcnmesoer hergestellt werden kann. Die neuen Stoffe weisen eine starke ensymatische wirkung auf, durch die sie in hohem Maße geeignet sind.

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Üblicherweise werden enzymatische Spaltungen zur Herstellung von Verbindungen der Formel I mit Hilfe der kovalent an einem wasserlöslichen Träger gebundenen Penicillinacylase, welche gegebenenfalls in ein wasserunlösliches polymeres Trägermaterial eingeschlossen ist, in verdünnten, welche vorzugsweise etwa 1 bis etwa 20, insbesondere 3 bis 6 >*> (Gewicht) der Verbindungen der Formel II enthalten, Lösungen durchgeführt. Vor der 'Isolierung der Endprodukte ist es zweckmäßig ca. 50_rfo oder mehr des als Verdünnungsmittel verwendeten Wassers zu verdampfen. Da die erfindungsgemäß verwendbare trägergebundene Penicillinacylase auch Spaltungen bei höheren Substrat-Konzentrationen ermöglicht, muß entsprechend dem Mehreinsatz an .Ausgangsmaterial weniger Wasser verdamp,ft werden. Die erfindungsgemäße Verwendung der wasserlöslichen Derivate der Penicillinacylase zur Herstellung von Verbindungen der Formel I ist daher sehr wirtschaftlich, wobei es bezüglich der Wiederverwendbar^it des Enzymderivats und der Ausbeute an Verbindungen der Formel I von geringer Bedeutung ist, ob das wasserlösliche Enzymderivat direkt in wäßriger Lösung oder aber in der unlöslichen Form nach Einpolymerisieren oder Einschluß in Polymere verwendet wird.· .

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die zu spaltende Verbindung der Formel II vorzugsweise in Wasser oder einem Gemisch aus w'asser und bis zu etwa 10 ?° (Volumen) eines organischen Lösungsmittels vorzugsweise eines polaren in '//asser mischbaren organischen Lösungsmittels, bevorzugt niedere Alkylalkohole, wie Methanol und Äthanol, niedere Alkylketone, wie Aceton oder niedere Dialkylformamide, wie Dimethylformamid gelöst oder suspendiert.

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Vorzugsweise werden etwa 1 bis etwa 20, insbesondere 3 bits G-ewichtsteile der Verbindung der Formel II verwendet.

Die Lösung und/oder Suspension wird in beliebiger Form mit dem wasserlöslichen Enzynderivat in Berührung gebracht.. Zum Beispiel kann das Enzymderivat in Wasser gelöst oder nach 3inschlui3 in ein Polymeres in der Lo'suiig suspendiert sein.

Die Umsetzung (Spaltung von Verbindungen der Formel II zu Verbindungen der Formel I) wird bei etwa 20 bis etwa 45 C, vorzugsweise bei 35 bis 40 C vorgenommen.

Zur Neutralisation des bei der Reaktion abgespaltenen Acylrestes ist eine laufende Überwachung und Einstellung des pH-7/ertes zweckmäßig. Der pH-Wert sollte während der Reaktion auf einem 7/ert von vorzugsweise pH 6 bis 9> insbesondere pH 7,5 bis 3,5 gehalten werden. Dies kann, falls erforderlich, durch das Zugeben einer Base zum Reaktionsgemisch erfolgen. Als Basen können hierzu praktisch alle anorganische·und organische Basen verwendet werden, wie tert.-Natriumphosphat, Alkalihydroxide, Alkalicarbonate und Hydrogencarbcmate, Erdalkalicarbonate und Srdalkalihydroxide, Ammoniak, primäre, sekundäre und tertiäre aliphatische und aromatische Amine sowie heterocyclische Basen. Beispielhaft seien Natrium- und KaliumhydroxidjNatrium- und Kaliumcarbonat, Natrium- und Kaliumhydrogencarbonat, Galciumcarbonat, Äthylami-n, Methyläthylamin, Triäthylamin, Mono-, Di- und Trihydroxyäthylarain, Anilin, Pyridin und Piperidin genannt. Aus dem Verbrauch der ' Base sind die Reaktionsgeschwindigkeit sowie die Beendigung ,^! der Reaktion leicht ersichtlich. !

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A-

Die Reaktionsgeschwindigkeit hängt vor allem ab vorn Verhältnis der Menge an zur Verfügung stehendem Penicillinacylase-Derivat zur Menge der eingesetzten Verbindung der FormeI II und von der spezifischen Aktivität der eingesetzten kovalent gebundenen Penicillinacylaoe.

Die spezifische Aktivität der Penicillinacylase wird angegeben in Einheiten/ml Lösung oder Einheiten/g Feuehtgowicht. 1 Einheit ist definiert als die Penicillinacylase-Afctivitöt, die in einer Minute ein Llikromol Penicillin G- bei 37°C und pH 7,8 zu 6-Aminopenicillansäure und Phenylessigsäure hydrolysiert.

Zur vollständigen Spaltung von 1 kg 7-Phenylacetamido-desacetoxy-cephalosporansäure innerhalb von 2 Stunden werden z.3. etwa 120.000 Einheiten wasserlöslicher trägergebundener Penicillinacylase benötigt. Bei längeren Spaltungszeiten wird entsprechend weniger Penicillinacylase benötigt. Die jeweils günstigsten Mengenverhältnisse und Reaktionszeiten können durch jeden Fachmann leicht bestimmt werden.

Nach beendeter Spaltungsreaktion wird das wasserlösliche Penicillinacylase-Derivat durch Ultrafiltration abgetrennt und kann sofort für weitere Spaltungsansätze verwendet wer- den. Wurde das wasserlösliche, kovalent gebundene Enzymdcrivat verkapselt, einpolymerisiert oder gemäß der Deutschen Offenlegungsschrift 1 952 426, entsprechend der US-Patentschrift 3 715 277 in Pasern eingesponnen, so kann es besonders einfach durch Filtration, Dekantation oder Zentrifugation abgetrennt werden.

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Zur Ultrafiltration werden besonders vorteilhaft handelsübliche I£oäule mit Membranen verwendet, die für Moleküle mit Molekulargewichten von mehr als etwa 20.000 bis etwa 100.000 impermeabel sind.

Aus der von den jeweiligen Penicillinacylase-Zubereitungen befreiten klaren Lösung wird die gebildete Verbindung der Formel I nach allgemein üblichen Verfahren isoliert. Übliche Verfahren sind z.B. die Ausfällung mit anorganischen Mineralsäuren, z.B. Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure oder organischen Garbonsäuren z.B. niederen Alkylcarbonsäuren wie Essigsäure am isoelektrischen Punkt* oder aber durch die üblichen chromatographischen Verfahren, wie Dünnschicht— oder Säulenchromatographie.

Es ist in vielen Fällen auch vorteilhaft, vor der Ausfällung der gebildeten Verbindung der Formel I den abgespaltenen Acylrest bei schwach saurem pH mit einem organischen, in Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel wie Essigsäureäthylester, Iviethylisobutylketon oder iso-Butylacetat durch Extraktion zu entfernen. Die Extraktion wird bevorzugt unterhalb von pH 6,0 durchgeführt."Da aber bei niedrigeren pH-Werten die Löslichkeiten der Verbindungen der Formel I in Wasser abnehmen, muß eventuell vor dem Ansäuern mit Wasser verdünnt werden. Weiterhin kann es auch vorteilhaft sein, zur Erzielung guter Ausbeuten die wäßrigen Lösungen vor der Ausfällung des Produktes im Vakuum zu konzentrieren.

Da.s ausgefällte bzw. durch Chromatographie erhaltene Produkt kann nach üblichen Methoden gereinigt werden. Es kann z.B. zur vollständigen Entfernung des abgespaltenen Restes mit einem geeigneten Lösungsmittel, z.B". Butylacetat oder

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Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet werden, wobei unmittelbar die reine Verbindung der Porrnel I erhalten wird.

Die er'findungsgemäß erhältlichen Verbindungen der Formel I können nach allgemein bekannten Methoden, z.B. durch Acylierung an der 7-Aminogruppe in wertvolle antimikrobielle Wirkstoffe umgewandelt werden (vgl. z.B. E.H. F-lynn, Cephalosporins and Penicillins, Chemistry and Biology, Academic Press, New York, 1972).

Die beim erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Penicillinacylase-Zubereitungen können wegen ihrer großen Stabilität über einen längen Zeitraum viele Male verwendet werden, wodurch ihr Einsatz in besonderem Maße wirtschaftlich vorteilhaft ist.-

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•Das erfindungsgemäße Verfahren, sei anhand der folgenden Beispiele erläutert:

Beispiel 1

a) 5 g Dextran 500 mit einem ungefähren Molekulargewicht von 500.000 werden in 165 ml Wasser gelöst und mit 2 N Natronlauge auf pH 11,0 eingestellt. Bei einer Temperatur von 20 ergibt man unter Rühren 85 mg Bromcyan zu und hält den pH-Vvert dor Lösung mit 2 N NaOH bei 11,0. 10 Minuten nach Zufügen des Bromcyans wird die Lösung mit 2 N Salzsäure 'auf pH 3,5 gestellt und mit 170 ml einer wäßrigen Lösung von 550 mg Penicillinacylase (enzymatische Aktivität 7.3 S/mg) vermischt. Die Lösung wird 16 Stunden im Kühlraum bei 4°0 gerührt. Nach Ultrafiltration kann im Filtrat keine Enzymaktivität nachgewiesen werden. Die Kupplung mit dem Träger verläuft demnach vollständig. Die Ausbeute an enzymatischer Aktivität beträgt 98 fo, bezogen auf die Ausgangsaktivität. Nach Gefriertrocknung bleibt" die Enzymaktivität vollständig erhalten.

b) 5g Dextran 500 mit einem ungefähren Molekulargewicht von-500.000 werden in 155 ml Wasser gelöst und mit 2 N Natronlauge auf pH 11,0 eingestellt. Bei einer Temperatur von 2O⁰O gibt man unter Rührung 400 mg Bromcyan zu und hält den pH-v?ert der Lösung mit 2 N Natronlauge bei- 11,0. 20 Minuten nach Zufügen des Bromcyans wird die Lösung mit 2 N Salzsäure auf pH 8,5 gestellt und mit 170 ml einer wäßrigen Lösung von 550 ng Penicillinacylase (enzymatische Aktivität 7,3 S/mg) vermischt. Die Lösung wird 16 Stunden im Kühlraum bei 4 0 gerührt. Das Enzym wird unter diesen Bedingungen vollständig an den Träger- gebunden. Die Aus-

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beute an enzymatischer Aktivität beträgt 96 %, bezogen auf die Ausgangsaktivität.

Beispiel 2

a) 5 g Dextran 20 mit einem ungefähren Molekulargewicht von 20.000 werden wie in Beispiel 1b) angegeben mit 4Ö0 rag
Bromcyan und dann mit 550 mg Penicillinacylase urngesetzt. Die Ausbeute an enzymatischer Aktivität beträgt nach der Umsetzung 9'6 fo, bezogen auf die Ausgangsaktivität.

b) 5g Dextran 20 werden wie in Beispiel 1b) angegeben mit 800 mg Bromcyan und dann mit 550 mg Penicillinacylase
umgesetzt. Die Ausbeute an enzymatischer Aktivität beträgt nach der Umsetzung 87 7», bezogen auf die Ausgangsaktivität,

c) 5g Dextran 60 mit einem ungefähren Molekulargewicht von 60.000 werden wie in Beispiel 1b) angegeben mit 400 mg
Bromcyan und dann mit 550 mg Penicillinacylase umgesetzt. Die Ausbeute an enzymatischer Aktivität beträgt nach

der Umsetzung 99 /°, ,bezogen auf die Ausgangsaktivität.

Beispiel 3 · - .

a) 5 g lösliche Stärke nach Zulkowsky (z.B. das Handelspräparat der. Firma E. Merck/Darmstadt) werden in 165 nil
Wasser gelöst und mit■2 IT Natronlauge auf pH 11,0 eingestellt. Bei einer temperatur von 20 0 gibt man unter Rünren 400 .mg Bromcyan zu und hält den pH-»Vert der Losung mit

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UL.

2 F NaOH bei 11,0. 20 Minuten nach Zufügen des Bromcyans wird die Lösung mit 2 H Salzsäure auf pH 3,5 gestellt und mit 17-0 ml einer wäßrigen Lösung von 550 ng Penicillinacylase (enzymatische Aktivität 7,3 E/mg) vermischt. Die Lösung wird 16 Stunden im Kühlraum bei 4°0 gerührt: Fach der Umsetzung beträgt die Ausbeute an Enzymaktivität 93 fo, bezogen, auf die Ausgangsaktivität. Die !covalent an Stärke gebundene Penicillinacylase läßt sich ohne AktiYitätsverlust gefriertrocknen. Ausbeute 6,2 g mit einer enzymatischen Aktivität von 0,65 E/mg.

b) 103 g lösliche Stärke nach Zulkowsky (z.B. das Handelspräparat der Firme Ξ. Merck/Darmstadt) werden in 1250 ml Wasser gelöst und mit 2 IT Natronlauge auf pH 11,0 eingestellt. Bei einer Temperatur von 20⁰O fügt man unter Hühren 16,S g Bromcyan zu und hält den pH-Wert der Lösungmit 2 IT EaOH bei 11,0. 20 Minuten nach Zufügen des 3romcyans wird die Lösung mit 2 IT Salzsäure auf pH 8,5 gestellt und mit 2060 ml einer wäßrigen Lösung von 10,3 g Penicillinacylase (enzymatische Aktivität 11,9 S/mg) vermischt. Die Lösung wird 16 Stunden im Kühlraum bei 4 C gerührt. ITacn der Umsetzung beträgt die gesamte Enzymaktivität 94,5 i* bezogen auf die Ausgangsaktivität.

Beispiel 4

2,9 g kovalent an Stärke gebundene Penicillinacylase mit einer Aktivität von 650 E/ g, hergestellt gemäß Beispiel 3a), werden in 600 ml 0,05 m Triäthanolamin-Salzsäure Puffer pH 7,0 gelöst. Zur Lösung werden 85,5 g Acrylamid, 4,5 g Nyii'-Kethylen-bisacrylamid und 5 nil einer wäßrigen Lösung von 2,5 g Animoniumperoxidnuliat gegeben (Lösung A).

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In einem Dreihalskolben mit .Rührer werden 2900 ml Toluol, 1100 ml Chloroform, 5 ml Κ,ιΥ,Ιί',K-'-Tetramethyläthylendiamin und 10 ml eines Emulgators gegeben, auf 4 C abgekühlt·' und bei einer Drehzahl von 250 U/min gerührt. Unter Stickstoff-Schutzgas läßt man über einen Tropftrichter Lösung A in das Reaktionsgefäß eintropfen, rührt 30 Minuten und saugt das Polymerisat ab. Uachgewaschen wird zweimal mit je 1 1 Toluol und 2 Ltr. 0,5 πι Natriumchloridlösung. Im Polymerisat sind 63 i° der ursprünglichen Aktivität an Penicillinacylase enthalten.

Beispiel 5

Spaltung von Verbindungen der Formel II:

20 m Mol der zu spaltenden Verbindungen der Formel II werden in 200 ml Wasser (gegebenenfalls durch Zugabe von Katronlauge) bei pH 7,5 gelöst. Zu der in einem auf 37⁰C tnermostatisierten Gefäß gerührten Lösung gibt man 150-ml der nach Beispiel 1b hergestellten Lösung mit einer Gesamtaktivität von 1500 E an dextrangebundener Penicillinacylaso.

Yfährend der Reaktion wird der pH-Wert durch Zugabe von 0,5 m ITaOH mittels eines pH-Staten auf pH 7,8 konstant gehalten. Die Beendigung der NaOH-Zugabe zeigt das Ende der Reaktion an. Nach beendeter Reaktion wird die Lösung durch ein Ultrafilter bis auf ein Restvolumen von 30 ml filtriert,· Der zurückbleibenden Lösung fügt man 100 ml Wasser zu, filtriert erneut bis auf 30 ml, wiederholt diesen Waschvorgang noch einmal und engt die zusammengefaßten Permeate im Vakuum bei 3O⁰C bis auf 100 ml ein.

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Die konzentrierte iiösung wird mit 50 ml Butylacetat versetzt und die erhaltene Verbindung der Formel I durch Zugabe von 5 η Salzsäure bis zum isoelektrischen Punkt von 3,7 ausgefällt, Hach 2- 3-stündigem Stehen der Probe im Kühlschrank wird abfiltriert, das kristalline Produkt mit je 100 ml V/asser und Aceton gewaschen und iir. Vakuum getrocknet.

Die G-eh^ltsbestimmung der Produkte erfolgte durch photometrische Bestimmung der freigesetzten 7-Aminogruppe in bekannter v/eise nach Reaktion mit p-Dimethylaminobenzaldehyd in einer Abwandlung der Methode von Svotek (Ozech. Patent 116 959 (1965) ).

Die Extinktion bei 4-15 nm 'wurde mit Standard-Kurve η für reine 7-Aminocephalosporansäure und 7-Amino-desacetoxy-ccphalosporansäure verglichen.

Darüber hinaus wurde die Identität der Produkte durch Infrarot- und H-Kernresonanz-Spektren und durch Papierchromatographie im System Eutanol:Sisessig:Wasser (12:3:5)' nachgewiesen. Auf diese «eise wurden folgende Umsetzungen durchgeführt:

Beispiel 5 a)

COONa

ca₂ oc OD

COOH

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Ausgangsverbindung:

9,08 g 7-(2-Thienyl)-acetamido-cephalosporansäure (Katriumsalz).'

Reaktionsdauer: 85 Minuten Endprodukt: 7-Aminocephalosporansäure Ausbeute: 5,3ö g (90 # d.Ih.)> Reinheit: 97 $

Rf.: 0,27 (keine Desacetyl-7-aminocephalosporansäure mit Rf 0,10) · . ·

Beispiel 5b)

-CH₉GO-NH

Ausgangsverbindung:

8,70 g 7-(2-Thienyl)-acetamido-3-pyridiniummethyl-Z\-^J-ccphe!a-4-carboxylat

Endprodukt: 7-Amino-3-pyridiniummethyl-/\-^;)-cephem-4-carboxylat '

?Leaktionszeit: 75 Minuten

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Rf: 0,05

Infolge.des Pyridinringes ie Molekül kann das Produkt dieser Reaktion nicht durch Fällung an isoelektrischen Punkt isoliert werden. Die Vollständigkeit der Umsetzung und Identität des Produktes wurde papierchromatographisch nachgewiesen.

Beispiel 5c)

AjO-CH₂-CO-NH-

COOH

H₂IT-

0'

COOH

Ausgangsverbindung:

7,01 g 7-Phenoxyacetamido-desacetoxy-cephalosporansäure Endprodukt: 7-Amino-desacetoxycephalosporansäure Ausbeute: 3,33 g (78 ?i d.Th.), Reinheit: 97 & Fp: 238-24-O⁰C (Zers.)

Beispiel 5 d)

CH-GO-IiH-

,Xi₂

COCH

:ooh

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AusgangsVerbindung:

6,99 g 7-(cA-Amino-phenylacetyl)-desacetoxycephalosporansäure -^:'"

Endprodukt: 7-Amino-desacetoxycephalOsporansäure Ausbeute: 3,66 g (84 °ß> d.Th.), Reinheit: 97 1°

Beispiel· 6

COOH

500 g Phenylacetamido-desacetoxycephalosporansäure (Reinheit 98 io) werden zu 20 1 einer Lösung von stärkegebundener Peni— cillinacylase, die eine Gesamtaktivität von 115·000 Ε enthält, gegeben. Der Reaktionsansatz wird unter Rühren durch Zugabe von Triäthylamin konstant bei pH 7,8 - 0,2 gehalten. Die Reaktionstemperatur soll 38⁰C betragen. Nach 65 Minuten wird kein Triäthylamin mehr aufgenommen. Die Lösung wird durch ein Papierfilter filtriert und in einem Labormodul unter Verwendung von 10 Membranen welche permeabel sind für Moleküle bis zum Molekularge:>vicht von 20.000 bei einem Betriebs-, druck von 12 kg/cm bis auf ein Restvolumen von 1000 ml ultrafiltriert. Das Retentat, das außer der abgetrennten stärkegebundenen Penicillinacyla.ae u.a. noch restliche 7-AminOdesacetoxycephalosporansäure enthält, wird 3^aI nacheinander mit jeweils 1000 ml Wasser verdünnt und jedesmal erneut auf ein Restvolumen von 1000 ml ultrafiltriert. Aus

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den zusammengefaßten Ultrafiltraten wird die gebildete 7-Aminodesacfitoxycp'phalosporanijäure nach allgemein üblichen, z.B. folgendem '/erfahren, isoliert:

Das ültrafiltrat einschließlich Waschwasser wird mit 5 · η Salzsäure auf pH 5,5 gestellt unu zweimal mit jeweils 5 1 i-Butylacetat extrahiert. Die wäßrige Phase wird auf pH 7,0 gestellt und ia Vakuum "bei 30 C bis auf 8 1 eingeengt. Aus dem Konzentrat wird durch Zugabe von 5 η Salzsäure die 7-Aminocephalosporansäure am isoelektrischen Punkt bei pH 3,7 ausgefällt. Uacn 2- 3-stündigem Stehen wird das Produkt nachdem der pH-Wert kontrolliert und gegebenenfalls auf pH 3,7 nachgestellt wurde - abgesaugt und mit jeweils 1000 ml »Vasser und Aceton nachgewaschen. Getrocknet wird im Vakuum bei 40⁰C. Ausbeute 306 g (94 1° d.Th.), Reinheit 97 $>.

In der gleichen Weise wurde dieselbe stärkegebundene Penicillinacylase 25nial hintereinander»verwendet ohne daß ein . merklicher Aktivitätsverlust auftrat.

Die Ausbeute der 25 Spaltungen betrug hierbei im Mittel 93,5 /ό der Theorie.

Beispiel 7

0 OGH

COOH

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20 g (6OmMoI) 7-£henylacetamido-desacetoxycephalosporansäure werden in 500 ml nasser suspendiert und durch Zugabe von Triäthylamin bis zum pH--i ert von 7,8 gelöst. Man erwärmt auf 37°C und gibt SO ml der nach Beispiel 1b) hergestellten Enzymlösung mit einer Gesatntaktivität von 800 E au. Durch Zugabe von Triäthylamin wird der pH-Wert während der Spaltung bei 7,8 — 0,3 gehalten. Kach 6 Stunden ist die Reaktion beendet. Die Seaktionsmischung wird durch ein Ultrafilter bis aufsein Restvoluuien von 50 al filtriert, die zurückbleibende Lösung mit 100 ml V/asser verdünnt und erneut auf 50 ml durch Ultrafiltration eingeengt. Dieser vtaschvorgang wird noch einmal wiederholt. Alle Permeate werden zusammengefaßt und im Vakuum bei 3O⁰O bis auf 400 ml eingeengt.

Nach Zugabe von 200 ml ilethyiisobutylketon wird mit 12 η Salzsäure auf pH 3,7 gestellt und die auskristallisierte 7-Äminodesacetoxy-cephalosporansäure nach 1-ständigem Stehen abgesaugt und mit wenig V/asser und- mit wenig Wasser/Methylisobuty!keton und Aceton gewaschen.

Ausbeute: 11,9 g (92,5 1° d.Th.)? Reinheit: 98%.· Schmelzpunkt: 238-24O⁰O (Zers.)

Beispiel 8

OH₂-OO-KH

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. 30·

20 g (60 inMol) 7-Phenylacetamido-desacetoxycephalosporansäure werden in 350 nil Wasser suspendiert und durch Zugabe von Triethylamin "bis zum pH-V/ert von 7,8 gelöst. Man erwärmt auf 37 G und fügt die nach Beispiel 4 hergestellte einpolymerisierte kovalent an Stärke gebundene Penicillinacylase mit einer G-esaintaktivität von 1120 Einheiten zu. Durch Zugabe von Sriäthylamin wird die 5>aktionsmischung während der Spaltung bei pH 7,8 - 0,3 gehalten. Nach 5 Stunden ist die Reaktion beendet. Das einpolymerisierte Penicillinacylase-Derivat wird abfiltriert und mit wenig wasser ausgewaschen. Zum PiI-trat einschließlich dem i/aschwasser werden 200 ml Methylisobutylketon und 12 η Salzsäure bis zum pH von 3,7 gegeben. Nach 1-ständigem Stehen bei 5 G wird der pH-Wert gegebenenfalls mit Salzsäure auf pH 3,7 nachgestellt, die auskristallisierte 7-A;ninodesacetoxycephalosporansäure abgesaugt und mit wenig «asser und Aceton nachgewaschen.

Ausbeute: 12,1 g (94 % d.Th.). Reinheit: 97,5 %. Schmelzpunkt: 238-24O⁰O (Zers.).

Beispiel 9 ' ·

Herstellung der zur Herstellung des Enzymharzes benötigten Penicillinacylase:

a) Ein Kohextrakt, der Penicillinacylase enthält,' wird gewonnen, indem man Escherichia coli nach dem in der deutschen Patentschrift 1 111 778 beschriebenen Verfahren züchtet, die Kultur durcti Zentrifugation zu einen. Schlamm konzentriert und aie Zellen nach,-bekannten mechanischen Verfahren, gegebenenfalls unter Zusatz von 3 i° Iaetnylisobutyiketon aufschließt.

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b) 610 Liter eines so erhaltenen Rohextraktes', enthaltend 5,2- " .10° E, werden mit entionisiertem 'wasser auf 2100 Liter verdünnt, rn.it kchwefelsäure auf pH 5,0 eingestellt und zentrifugiert. Im klaren Überstand findet man 5-7 · 10 E rn.it einer spezifischen Aktivität von 1,7 E/rag.

Unter Nachstellen des pH auf 5,0 werden 13,8 kg Bentonit eingerührt und nach 30 min. in einer Durchlaufzentrifuge abgetrennt. Der abgetrennte Bentonit Vvird mit 90 Liter 0,5 M ifatriumacetat-Lösung pH 8,0 eluiert und abfiltriert. Erhalten werden 92,5 Liter, enthaltend 4,5 * 10 E (86 fo d.Th.) mit einer spezifischen Aktivität der Penicillinacylase von 6,5 E/ing.

In den Beispielen steht "d.Th." für "der Theorie".

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Claims (9)

1. Patentansprüche

   ). "Verfahren zur Herstellung von 7-Amino-/\ -cepheir.-Derivaten der Formel

   - ^CH-CH CH_Q
   Il I ²

   COOX

   in welcher

   R für Wasserstoff; Hydroxyl; Amino; Cyano;

   -0-CO-NH₂; -S-C-I[JpH₂)_n, worin η eine ganze

   Zahl von 4 bis 6 bedeutet;
   -0-CO-R¹, -KH-CO-R¹, -S-CS-O-R¹, worin R¹ Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet, steht oder in welcher R für -S-Het oder Het steht, wobei Het ein 5- oder 6-gliedriger heteroaromatischer Ring bedeutet, der gegebenenfalls eine positive ladung tragen kann; und

   X' für Wasserstoff oder für das Symbol einer

   negativen Ladung steht, falls der Rest R eine positive Ladung enthält,

   dadurch gekennzeichnet, daß man Verbindungen der formel

   Le A 15 577 - 32

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   R^CH-CO-NH-CH- CH^ ^XCH_O

   U ΐι ι ²

   R^ ,0— N^ y3-0H_o-R

   COOX

   in welcher

   Round X die oben angegebene Bedeutung haben und

   R für einen gegebenenfalls im Ring durch

   Amino,. Hydroxy oder Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen substituierten Phenyl-, Phenoxy-, 2-Thienyl- oder 2-Furyl-Ring steht und

   R für Wasserstoff, Amino, Hydroxy oder Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen steht,

   oder deren Salze mit anorganischen oder organischen Basen, mit Penicillinacylase, welche kovalent an einen in .Wasser löslichen Träger gebunden ist, gegebenenfalls in einer in einem wasserunlöslichen Trägermaterial eingeschlossenen Form, in Berührung bringt und das erhaltene 7-Amino-/A-cet>heTn-I)firivat isoliert.
2. 2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei

   R, R und X für Viasserstoff stehen und R² für Phenyl steht.
3. 3* Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei. R, R und X für V/asserstoff stehen und

   ρ
   R . für Phenoxy steht.

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4. 4. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei R für -O-COCH,, R für Phenoxy und R^ und X für Wasserstoff stehen.
5. 5. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei R für -O-CO-CKU,

   R für-Phenyl und R·^ und X für Wasserstoff stehen.
6. 6. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 5, wobei die Penicillinacylase kovalent an ein Polysaccharid gebunden ist.
7. 7. Verfanren gemäß den Ansprüchen 1 bis 6, wobei die Penicillinacylase kovalent an Stärke gebunden ist.
8. 8. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 6, wobei die Penicillinacylase kovalent an Dextran gebunden ist.
9. 9. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 8, wobei die kovalent an einen in Wasser löslichen Träger gebundene Penicillinacylase in ein in Wasser .unlösliches Trägermaterial eingeschlossen 1st.

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