NO750383L - - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører en ny fremgangsmåte til frem-

stilling av 7-amino-A^-cefem-derivater, som kan anvendes som mellom-produkt for syntese av antimikrobielle virksomme stoffer.

Det er allerede blitt kjent at man får 7-amino-cefalosporansyre, f.eks. ved spaltning av cefalosporin C med kulturer av forskjellige mikroorganismer (sammenlign f.eks. US-patent nr. 3.239.

394) eller ved kjemisk spaltning etter forskjellige metoder (sammen-

lign f.eks. DAS.1.176.147, DOS 1.145.615 eller US-patent.nr.

3.272.809). Desacetoksy-cefalosporin C kan.etter katalytisk reduk-

sjon (sammenlign US-patent nr. 3^124.576) omdannes analogt i 7-amino-desacetoksy-cefalosporansyre. Fra DOS 2.212.276 er det også kjent en fremgangsmåte til enzymatisk spaltning av 7-f e nok sy ac et amid o-desacetoksy-cefalosporansyre til 7~amino-desacetoksy-cefalosporari-

syre ved hjelp av et adsorptivt bundet enzym fra Bacillus megaterium B 400. Flere fremgangsmåter til spaltning av penicillinet ved hjelp

av kovalent til vannuoppløselig bærer bundet penicillinacylase er likeledes kjent (sammenlign DOS 1.907-365, 1.917-057 og 2.215-687).

Det er funnet at man får 7-amino-A^-cefem-derivater med formel

hvori

R betyr hydrogen, hydroksyl, amino, cyano,

-0-C0-NH2, -s_c-@H2)nJ hvori n betyr et helt tall

S

fra "4 til 6, -O-CO-R^ -NH-CO-R<1>, -S-CS-O-R<1>, hvori R<1>betyr alkyl med 1 til 4 karbonatomer eller hvori R betyr -S-Het eller Het, idet

Het betyr en 5- eller 6-leddet heteroaromatisk ring, som eventuelt kan ha en'positiv ladning og

X betyr hydrogen eller symbolet av en negativ ladning, hvis resten R inneholder en positiv ladning,

når forbindelser med formel

hvori

R og X har overnevnte betydning og

R betyr en eventuelt % ringen med anno, hydroksy eller alkyl med 1 til 3 karbonatomer substituert fenyl-, fenoksy-, 2-tienyl eller 2-furylring og

R^ betyr hydrogen, amino, hydroksy eller alkyl med

1 til 3 karbonatomer,

eller deres salter med uorganiske eller organiske baser, bringes i berøring med penicillinacylase, som er bundet kovalent til i vann oppløselige bærere, eventuelt i en i et vannuoppløselig bærematerial innesluttet form og isolerer det dannede 7-amino-A^-cefem-derivat med formel I. - På overraskende måte spalter den kovalent til vannopp-løselig bærer bundede penicillinacylase forbindelsene med formel II praktisk talt i samme hastighet som tilsvarende penicilliner.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen har en rekke fordeler i forhold til de kjente fremgangsmåter til fremstilling av forbindelser med formel r. Mens f.eks. enzymer fra cellekulturer bare kan anvendes en- gang er det mulig å adskille den vannoppløselige bærerbundne penicillinacylase ved ultrafiltrering og anvende igjen. Videre kan man, hvis ønsket, fra de vannoppløselige enzymtilbered-ninger også få vannoppløselige penicillinacylasetilberedninger ved at man inneslutter kovalent til vannoppløselige bærere bundet penicillinacylase i et vannuoppløselig bærematerial, f.eks. ved forkapsling eller inneslutning i polymere. Disse vannuoppløselige tilberedninger kan i mange tilfeller anvendes på gunstig måte. Ved fremgangsmåten' ifølge oppfinnelsen fåes forbindelsene med formel I i meget god renhet og høye utbytter ved enkel teknikk. I forhold til anvendelsen av et bare adsorptivt bundet enzym (sammenlign DOS 2.212.276) har

anvendelsen ifølge oppfinnelsen av de kovalent bundede vannoppløse-lige penicillinac.ylasetilberedninger den fordel at. enzymet forblir

fast bundet også ved anvendelse av høye konsentrasjoner av cefalosporin-substrat med formel II, hvorved det fremkommer en i forhold til andre fremgangsmåter betraktelig øket økonomi. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er således en berikelse av teknikken.

Anvender man f.eks. 7~fenyl-acetamido-desacetoksy-cefalosporansyre som utgangs stoff, så kan reaksjonsforløpet gjengis med følgende formelskjerna:

De som utgangsstoffer anvendte forbindelser er generelt

definert med overnevnte formel II.

Alkyl R1 betyr rettlinjet eller forgrenet alkyl med

1 til 4, fortrinnsvis 1 eller 2 karbonatomer. Eksempelvis skal det nevnes metyl, etyl, n- og i-propyl.

n .betyr fortrinnsvis 4 eller 5.

Den 5_ eller 6-leddede heteroaromatiske ringHet inneholder fortrinnsvis 1 til 3, spesielt 1 eller 2 like eller forskjellige heteroatomer. Som heteroatomer står oksygen, svovel 'eller nitrogen. Som eksempel skal det nevnes furyl, tienyl, pyrazolyl, imidazolyl, 1,2,3- og 1,2,4-triazolyl, oksazolyl, isoksazolyl, ti.a- zolyl, isotiazolyl, 1,2,3-, 1,3,4-, 1,2,4-,og 1,2,5-oksadiazolyl, azepinyl, pyrrolyl, isopyrrolyl, pyridyl, pyridinium, pyridazinyl, pyrimidinyl og pyrazinyl.''

Den heteroaromatiske ring Het kan være substituert med I til 3, fortrinnsvis 1 eller 2 alkylgrupper med fortrinnsvis 1 til 3 karbonatomer, idet eksempelvis skal nevnes metyl og etyl.

Alkyl i definisjonen av betyr rettlinjet eller forgrenet alkyl med 1 til 4, spesielt 1 eller 2 karbonatomer, som metyl, etyl og n- og i-propyl.

Som salter av forbindelser med formel II med uorganiske eller organiske baser, som kan anvendes for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen skal det nevnes alkali saltene, som natrium- og kalium-salter, jordalkalisalter, som kalsiumsalter, ammoniumsalter samt saltene, som dannes med alifatiske, aralifatiske eller aromatiske aminer. Eksempelvis skal det anføres de primære, sekundære og tertiære alkylaminer som inneholder 1 til 4 karbonatomer pr. alkyl-gruppe og hvor alkylgruppen kan være substituert med hydroksygruppen, f.eks. etylamin, trietylamin, hydroksyetylamin, cykliske aminer, f.eks. pyridin, piperidin, morfolin, piperazin og N^metylpiperazin.

De ifølge oppfinnelsen anvendbare forbindelser med formel II er allerede kjent og kan fåes etter kjente fremgangsmåter (sammenlign f.eks. B.E.H.. Flynn, Cephalosporins and Penicillins, Chemistry and Biplbgy, Academic■Press, New York, 1972).

Som (for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen spesielt foretrukkede) eksempler på forbindelser med formel II skal nevnes:

Av disse forbindelser er for anvendelsen ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ' forbindelsene d) til g) spesielt foretrukket.

Penicillinacylase, som'er bundet kovalent til vannopp-løselig bærer kan være av forskjellig opprinnelse.

Penicillinacylasen (Enzyme Comission 3.5.1.11) kan utvinnes av tallrike mikroorganismer etter generelt kjente metoder (sammenlign f.eks. også DOS 1.907-365.og 2.217-745), f.eks. fra bakterier, spesielt Escherichia coli, Erwinia eller actinomyceter, som Streptomyces, Micromonospora, Norcardia eller sopp, som Fusarium

og gjør. Spesielt foretrakkes penicillinacylase fra Escherichia coli, f.eks. fra en Escherichia coli-stamme, som ble deponert under ATCC

11 105. Isoleringen av penicillinacylase fra.Escherichia coli fore-går f.eks. ifølge DOS 2.217-745 ved at man innstiller et råekstrakt av Escherichia coli-celler, som ved siden av penicillinacylase dessuten inneholder celleopphopninger av Escherichia coli-celler, til en pH-verdi fra 3,5 til 5,5, fortrinnsvis 5,0 og sentrifugerer ekstraktet, deretter behandler'den overstående dannede klare oppløsning av penicillinacylasen med aluminiumsilikater, fortrinn-vis bentonit, ad-ski.ller'adsorbatet på kjent måte og eluerer f.eks. med 0,1-1,0-molar oppløsning av natrium- eller kaliumacetat ved ca. pH 8,5.

Den derved dannede anrikede klare oppløsning av penicillinacylase kan eventuelt vidererense.s kromatografisk på makroporøse ioneutvekslere, f.eks. sulfoetyl-cellulose,

Som vannoppløselig bærer, tivortil penicillinacylasen

kan bindes kovalent kommer det på tale mange vannoppløselige polymere forbindelser. Fortrinnsvis kan det som polymer bærer' praktisk talt anvendes alle polysakkarider. Som eksempler hertil skal det fremfor alt nevnes: Dekstran, i vann oppløselige stivelse, laevan samt karboksymetylcellulose. Spesielt foretrekkes dekstran og stivelse. Som polysakkarider kommer det fortrinnsvis på tale slike med en molekylvekt fra ca. 5000 til ca. 1000.000, spesielt 10.000

til 800.000.

Fremstillingen av den ifølge oppfinnelsen anvendbare kovalent til i vann oppløselige bærere bundede penicillinacylase under anvendelse av polysakkarider kan foretas på følgende måte: Ved anvendelsen av polysakkarider som vannoppløselig, polymer bærer omsetter man disse polysakkarider i første rekke for-

i

trinnsvis med et halogencyanid. Deretter omsettes den herved dannede aktive mellomforbindelse, eventuelt etter dens isolering med penicillinacylase (sammenlign DOS 1.768.512 tilsvarende US-patent nr.3.645.852).

Reaksjonsforløpet for denne to-trinnsreaksjon (dannelsen av en aktiv mellomforbindelse under binding av penicillinacylase til den polymere bærer)(kan gjengis ved følgende formelskjema: idet X kan være en NH-gruppe eller oksygen,

betyr en del

av den polymere bærer (polysakkarid) og H^N-protein betyr penicillinacylasen.

Som halogeneyan kommer det på tale jod-, klor- og brom-

cyan, spesielt bromcyan.

Som fortynnings- resp. oppløsningsmiddel anvendes såvel

i 1. trinn (omsetning av polysakkarid med halogencyan) som også i annet trinn (omsetning av mellomforbindelsen med.penicillinacylase)

i

fortrinnsvis vann.

Pr. gram polysakkarid anvendes ved anvendelse av dekstran fortrinnsvis ca. 5 til ca. 250, spesielt 10 til 200 mg halogencyan og ved anvendelse av stivelse fortrinnsvis ca. 50 til ca. 500, spesielt 80 til 200 mg halogencyan.

Reaksjjonstemperaturene ligger ved begge trinn mellom

ca. 0 og ca. 50°C, fortrinnsvis mellom 10 og 2.5°C Omsetningene kan gjennomføres ved normaltrykk, men også ved forhøyet trykk, fortrinnsvis ved normaltrykk.

Ved fremstilling av penicillinacylasetilberedning

holder man reaksjonsmediet ved tilsetning av en base, eksempelvis natronlut i området på pH 8 - 13, fortrinnsvis ved pH 11,0. Halo-gencyanets omsetning med polysakkaridet er i mange tilfeller avsluttet etter 10 - 20 minutter. Oppløsningen av den av polysakkarid og halogencyanet dannede aktive mellomforbindelse skal for omsetning med penicillinacylasen ikke inneholde fritt halogencyan. Omsetningen bør foregå så hurtig som mulig, da det reaksjonsdyktige derivat av den polymere lett inaktiveres på grunn av hydrolyse. Før omsetningen med penicillinacylasen innstilles pH-verdien av oppløsningen, som inneholder det aktive polymerderivat, fortrinnsvis til ca. 8,5.

Etter tilsetning av penicillinacylase omrører man ved ca. 0 til ca. 50°C, fortrinnsvis 5 til 10°C. Det høymolekylære enzymderivat kan deretter adskilles på vanlig måte, eksempelvis ved ultrafiltrering fra nativt, ikke omsatt enzym med membraner som er ugjennomtrengelig for enzym-polymer-tilberedningene. I tilfellet anvendelse av dekstran med en molekylvekt på 500.000 kan det f.eks. anvendes membraner som er ugjennomtrengelige for stoffer med en molekylvekt på mer enn 100.000.

Forholdet mellom polysakkarid, halogencyan og penicillinacylase kan varieres innen vide grenser. Med sikkerhet oppnås en •fullstendig omsetning av enzymet, når det pr. vektdel enzymprotein minst anvendes 5 vektdeler polysakkarid.

Det. har vist seg at mengdeforholdet mellom halogencyan og polysakkarid betraktelig kan påvirke holdbarheten av enzymderivatet. Således inaktiveres den native penicillinacylase i vandig oppløsning ved pH 7,8 og 45°C i løpet av 24 timer inntil 95%. Under samme betingelser gir bærebunden vannoppløselig penicillinacylase som eksempelvis blir koplet til dekstran av molekylvekt 500.000 i løpet av 24 timer bare'47% av aktiviteten, når det pr. gram dekstran anvendes 17 mg bromcyan. Anvendes imidlertid pr. gram dekstran 80 mg bromcyan, så nedsetter enzymaktiviteten seg i løpet av 24 timer bare rundt 5%• Derved er det overraskende at ved samme koplingsutbytte kan ved økning av halogencyanmengden stabiliteten av den vannoppløselige bærerbundne penicillinacylase betraktelig økes. Muligens oppstår ved økning av mengden av halogencyan mellom bærermolekylet og énzym-molekylet mere kovalente bindinger. Derved kunne tertiærstrukturen av enzymet stabiliseres desto mer som det er dannet kovalente bindinger mellom bærer og enzym. Den mengdemessige anvendelse av halogencyan er imidlertid begrenset, da på grunn av tverrfornettelse kan oppstå tungt oppløselige og/eller uoppløselige enzymderivater. Således er det ikke å anbefale, ved anvendelse av polysakkarider,

f.eks. av dekstran, med molekylvekt på omtrent 500.000 pr.gram å anvende mer enn 150 mg halogencyan, f.eks. bromcyan.

Anvendes imidlertid en polysakkarid, f.eks. dekstran

med en mindre molekylvekt, f.eks. på 20.000, så kan man uten videre pr. gram polysakkarid la det. reagere mer enn 3.00 mg halogencyan, f.eks. bromcyan. Imidlertid nedsettes ved anvendelse av bærere med mindre molekylvekt enzymets stabilitet.

Også med stivelse som vannoppløselig bærer lar det seg fremstille overordentelige.stabile derivater av penicillinacylase.. Enzymderivatets stabilitet er likeledes avhengig av anvendelsen av halogencyan. Fortrinnsvis lar man det pr. gram stivelse minst reagere 150 mg halogencyan, f.eks. bromcyan.

Den hver gang mest gunstige molekylvekt av bærer og

type og mengde av halogencyanet samt av penicillinacylase.n er lett å fastslå av enhver fagmann.

Til gjennomføring av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen (omdannelsen av forbindelser med formel II i forbindelse med formel I) kan penicillinacylase, som er bundet kovalent til den vannoppløse-lige bærer anvendes direkte, altså uten ytterligere endring eller,

også innesluttet i et vannuoppløselig bærematerial, f.eks. kapsler, polymere av forskjelligste type.eller spesielt foretrukket spinnes i fibre (sammenlign DOS 1.932.426 tilsvarende US-patent nr. 3.715.277).

Inneslutningen av det kovalent til i vann oppløselige bærer bundet enzym kan herved i motsetning foregå til det fri ikke kovalente bundede enzym uten merkbart aktivitetstap.

Den i vannoppløselige bærer kovalent bundede penicillinacylase kan sdm allerede nevnt spinnes i henhold til metoden i DOS 1.932.426, tilsvarende US-patent 3.715-277 til fibre. Enzymtilbered-ningen dispergeres f.eks. hertil ved hjelp av en emulgator og spinnes i våtspinnefremgangsmåte eller i tørrspinne fremgangsmåte i polymerisater til fiberaktige strukturer. Som polymerisater kommer det her-, ved på tale polymerisater og blandingspolymerisater av de forskjelligste typer som cellulodederivater, spesielt cel.lulosetriacetat.

En til dekstran med molekylvekt 500.000 bundet penicillinacylase kan eksempelvis innpolymeriseres i utbytter på 60% av den opprinnelige enzymaktivitet ifølge litteraturkjente fremgangsmåter (H. Nilson, R. Mosbach, K. Mosbach, Biochim. Biophys. Acta 268 (1972), 253-256). -Herved kan spesielt fordelaktig den kovalent t-il en vannoppløselig bærer bundet penicillinacylase, eksempelvis innpolymeriseres i et av akrylamid ; N,N'-metylen-bisakrylamid og N,N,N',N'-tetrametyletylendiamin dannet kopolymerisat på vanlig måte. I kon-trollforsøk med nativ, altså ikke kovalent til en bærer bundet penicillinacylase forble det etter innpolymerisering etter samme forsøksbetingelse bare dannet 10% av den opprinnelige tilstedevær-ende enziymaktivitet. Det innpolymeriserte bærerbundne enzym viser seg også etter gjentatt anvendelse som overordentelig stabil til fremstilling av forbindelser av typen I. Det innpolymeriserte enzymderivat muliggjør en hurtig og enkel adskillelse fra reaksjorismediet da polymerisatet kan fremstilles i kornstørrelse på mer enn 1 mm i diameter. De nye stoffer har en sterk enzymatisk virkning, hvori-gjennom de i høy grad er egnet.

Vanligvis gjennomføres enzymatiske spaltninger for fremstilling av forbindelser med formel I ved hjelp av en kovalent til en vannoppløselig bærer bundet penicillinacylase, som eventuelt er innesluttet i et vannuoppløselig, polymert bærematerial i fortynnede oppløsninger, som fortrinnsvis inneholder ca. 1 til ca. 20, spesielt 3 til 6% (vekt) av forbindelsene med formel II. Før sluttproduktets isolering er det hensiktsmessig å fordampe ca. 50% eller mere av det som fortynningsmiddel anvendte vann. Da den ifølge oppfinnelsen anvendbare bærerbundne penicillinacylase >også muliggjør spaltninger ved høyere substratkonsentrasjoner må tilsvarende merinnsatsen av- utgangsstoff mindre vann fordampes. Anvendelsen ifølge oppfinnelsen av de vannoppløselige derivater av penicillinacylase til fremstilling av forbindelser med formel I er derfor meget økonomisk, idet det med hensyn til gjenarwendbarhet av enzymderivatet og utbyttet av

i

forbindelsene med, formel I er av mindre betydning, om det vannopp-løselige enzymderivat anvendes direkte i vandig oppløsning eller også i den uoppløselige form etter innpolymerisering eller inneslutning i polymere. ' .

Ved gjennomføring av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen oppløses eller suspenderes .forbindelsen som skal spaltes med formel II fortrinnsvis i vann eller en blanding av vann og inntil ca. 10 volum? av et organisk oppløsningsmiddel fortrinnsvis av et polart i vann blandbart organisk oppløsningsmiddel, fortrinnsvis lavere alkylalkoholer, som metanol og etanol, lavere alkylketoner, som aceton eller lavere dialkylformamider, som dimetylformamid.

Fortrinnsvis anvendes ca. 1 til ca. 20, spesielt 3 til

6 vektdeler av forbindelser med formel II.

Oppløsningen og/eller suspensjonen bringes i ønskelig form i berøring med det vannoppløselige enzymderivat. Eksempelvis kan enzymderivatet oppløses i vann eller være suspendert i oppløs-ningen etter innes.lutningen i en polymer.

Omsetningen (spaltning av forbindelser med formel II

til forbindelser med formel I) foretas ved ca. 20 til ca. M5°0, fortrinnsvis ved 35 til 40°C.

For nøytralisering av den ved reaksjonen avspaltede acylrest er det hensiktsmessig med en stadig overvåkning og innstil-ling av pH-verdien. pH-verdien bør under reaksjonen holdes på en verdi på fortrinns.vis pH 6 til 9, spesielt pH 7,5 til 8,5. Dette kan hvis nødvendig foregå ved tilsetningen av en base til reaksjonsblandingen. Som base kan det hertil praktisk talt anvendes.alle uorganiske og organiske baser, som tert.-natriumfosfat, alkalihydrok-syder, alkalikarbonater og hydrogenkarbonat, jordalkalikarbonater og jordalkalihydroksyder, ammoniakk, primære, sekundære og tertiære' alifatiske og aromatiske aminer samt heterocykliske baser. Eksempelvis skal det nevnes natrium- og kaliumhydroksyd,'natrium- og kalium-karbonat, natrium- og kaliumhydrogenkarbonat, etylamin, metyletylamin, trietylamin, mono-, di- pg trihydroksyetylamin, .anilin, pyridin og piperidin. Av forbruket av base sees lett reaksjonshastigheteh samt reaksjonsavs lutningen.

Reaksjonshastigheten avhenger fremfor alt av forholdet av mengden av til disposisjon stående penicillinacylasederivat til mengden av anvendt forbindelse med formel II og av den spesifikke aktivitet av den anvendte 'kovalent bundne penicillinacylase.

rien spesifikke aktivitet av penicillinacylasen angis

i enheter/ml oppløsning eller enheter/g fuktigvekt. 1 enhet er definert som den penicillinacylase-aktivitet, som i løpet av 1 minutt hydrolyserer en mikromol penicillin G ved 37°C og pH 7,8 til 6-amino-penicillansyre og fenyleddiksyre.

Til fullstendig spaltning av 1 kg 7-fenylacetamido-desacetoksy-cefalosporansyre i løpet av 2 timer kreves f.eks. ca. 120.000 enheter vannoppløselig bærerbunden penicillinacylase. Ved lengre spaltningstider kreves tilsvarende mindre penicillinacylase. De hver gang gunstigste mengdeforhold og reaksjonstider kan lett bestemmes av enhver fagmann.

Etter avsluttet spaltningsreaksjon adskilles det vann-oppløselige penicillinacylasederivat ved ultrafiltrering og kan med en gang anvendes for ytterligere spaltningsblandinger. Det ble det vannoppløselige, kovalent bundne enzymderivat innkapslet, innpoly-merisert eller ifølge DOS 1.;932.426, tilsvarende US-patent nr. 3.715.277 spunnet i fibre, så kan det adskilles spesielt enkelt ved filtrering, dekantering eller sentrifugering.

Til ultrafiltrering anvendes spesielt fordelaktig handelsvanlige moduler med membraner som er im<p>ermeable for molekyler med molekylvekt på mer enn 20.000 inntil ca. 100.000.

Fra den for den eventuelle penicillinacylase-tilberedning befridde klare oppløsning isoleres den dannede forbindelse med formel I etter generelt vanlige fremgangsmåter. Vanlige fremgangsmåter er f.eks. utfelling med uorganisk mineralsyre, f .eks. saltsyre, svovelsyre ,. fosforsyre eller organiske karboksylsyrer, f.eks. lavere alkyl-karboksylsyrer som eddiksyre ved det isoelektriske punkt' eller også ved de vanlige,kromatografiske fremgangsmåter som tynnsjikt- eller søylekromatografi.

Det er i mange tilfeller også fordelaktig, før utfelling av de' dannede forbindelser med formel I å fjerne den avspaltede•acyl-rest ved svakt sur pH med et organisk, i vann ikke blandbart oppløs-ningsmiddel, som eddiksyreetylester, metylisobutylketon eller iso-butylacetat ved ekstrahering. Ekstraheringen gjennomføres fortrinns-' vis under pH 6,0. Da imidlertid ved lavere pH-verdier oppløselig- heten av forbindelsene med formel I avtar i vann, må det eventuelt før surgjøring fortynnes med vann. Videre kan det også være fordelaktig for å oppnå gode utbytter å konsentrere de vandige oppløs-ninger før utfelling av produktet i vakuum.

Det .utfelte resp. ved kromatografi dannede produkt kan renses etter vanlige metoder.. Det kan f.eks. for fullstendig fjerning av avspaltet rest vaskes med et egnet oppløsningsmiddel, f.eks. butylacetat eller aceton og tørkes i vakuum, idet det umiddelbart fåes den rene forbindelse med formel I.

Forbindelsen som kan fåes ifølge oppfinnelsen med formel I kan etter generelt kjente metoder, f.eks. ved acylering ved 7-aminogruppen omdannes i verdifulle antimikrobielle virksomme stoffer (sammenlign f.eks. E.H. Flynn, Cephalosporins and Penicillins,

Chemistry and,Biology, Academic Press, New York, 1972).

De ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvendte penicillinacylase-tilberedninger kan på grunn av deres store stabilitet anvendes over et lengre tidsrom mange ganger, hvorved deres anvendelse i spesiell grad er økonomisk fordelaktig.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen skal forklares ved hjelp av noen eksempler:

E ksempel 1.

a) 5 g dekstran 500 med en omtrentelig molekylvekt på 500.000 "oppløses i 165 ml vann og innstilles med 2 N natronlut på

pH 11,0. Ved en temperatur på 20°C tilsetter man under omrøring.

85 mg bromcyan og holder oppløsningens pH-verdi med 2 N NaOH ved 11,0. 10 minutter etter tilsetning av bromcyanet innstilles oppløs-ningen med 2 N saltsyre til pH 8,5 og blandes med 170 ml av en vandig oppløsning av 550 .mg penicillinacylase (enzymatisk aktivitet 7S3E/mg). Oppløsningen.omrøres 16 timer i kjølerom ved 4°C. Etter ultrafiltrering kan det i filtratet påvises noen enzymaktivitet.

Koplingen med bæreren forløper deretter fullstendig. Utbyttet av enzymatisk aktivitet utgjør 98%, referert til utgangsaktivitet.

Etter frysetørkning bibeholdes enzymaktiviteten fullstendig.

b) 5 g dekstran 500 med en omtrentelig molekylvekt på 500.000 oppløses i.165 ml vann og innstilles med 2 N natronlut på

pH 11,0. Ved en temperatur på'.20°C tilsetter man under omrøring.

400 mg bromcyan og holder oppløsningens pH-verdi med 2 N natronlut ved 11,'0. 20 minutter etter tilsetning av bromcyan innstilles oppløs-ningen med 2 N saltsyre til pH 8,5 og blandes med 170 ml av en vandig

oppløsning av 550 mg penicillinacylase- (enzymatisk aktivitet 7,3 E/mg). Oppløsningen omrøres 16 timer i kjølerom ved 4°C. Enzymet bindes under disse betingelser fullstendig til bæreren. Utbyttet av enzymatisk aktivitet utgjør 96%, referert til utgangsaktivitet.

Eksempel 2.

a) 5 g dekstran 20 med en omtrentelig molekylvekt på 20.000 omsettes som angitt i eksempel lb) med 400 mg bromcyan og deretter

med 550 mg penicillinacylase. Utbyttet av enzymatisk aktivitet utgjør etter omsetningen 96%, referert til utgangsaktivitet.

b) 5 g dekstran 20 omsettes som angitt i eksempel lb) med 800 mg bromcyan og deretter med 550 mg penicillinacylase. Utbyttet av enzymatisk aktivitet utgjør etter omsetningen 87%, referert til utgangsaktiviteten. c) 5 g dekstran 60 med en omtrentelig molekylvekt på 60.000 omsettes som angitt i eksempel lb) med 400 mg bromcyan og deretter med 550 mg penicillinacylase. Utbyttet av enzymatisk aktivitet ut-gjør etter omsetningen 99%, referert til utgangsaktiviteten. Eksempel 3-a) 5 g oppløselig stivelse ifølge Zulkowsky (f.eks. handels-preparatet fra Firma E. Merck/Darmstadt) oppløses i .1.65 ml vann og

innstilles med 2 N natronlut til pH 11,0. Ved en temperatur på 20°C tilsetter man under.omrøring 400 mg bromcyan og holder oppløsningens pH-verd!i med 2 N NaOH ved 11,0. 20 minutter etter bromcyanets tilsetning innstilles oppløsningen med 2 N saltsyre til pH 8,5 og blandes med 170 ml av en vandig oppløsning av 550 mg penicillinacylase (enzymatisk aktivitet 7,3 E/mg). Oppløsningen omrøres 16 timer i kjølerom ved 4°C. Etter omsetningen utgjorde utbyttet av enzymaktivitet 98%, referert til utgangsaktivitet.. Den kovalent til stivelse bundne penicillinacylase lar seg frysetørke uten aktivitetstap. Utbytte 6,2 g med en enzymatisk aktivitet på 0,65 E/mg.

b) 103 g oppløselig stivelse ifølge Zulkowsky (f.eks. handels-preparatet fra Firma E. Merck/Darmstadt) oppløses i 1250 ml vann

og innstilles med 2 N natronlut til pH 11,0. Ved en temperatur på 20°C tilsetter man under omrøring 16,8 g bromcyan og holder oppløs-' ningens pH-verdi med 2 N NaOH ved 11,0. 20 minutter etter tilset-, ning av bromcyanet innstilles oppløsningen ved 2 N saltsyre til pH 8,5 og blandes med 2060 ml av en vandig oppløsning av 10,3- g penicillinacylase (enzymatisk aktivitet 11,9 E/mg). Oppløsningen omrøres 16 timer i kjølerom ved 4°C. Etter omsetningen utgjør den

samlede enzymaktivitet 94,5%, referert til utgangsaktivitet. Eksempel 4.

2,9 g kovalent til stivelse bundet penicillinacylase med en aktivitet på 650 E/g,- fremstillet ifølge eksempel 3a), oppløses i 600 ml 0,05 molar trietanolamin-saltsyre-puffer pH 7,0. Til opp-løsningen haes 85,5 g akrylamid, 4,5- g N,N'-metylen-bisakrylamid og 5 ml av en vandig oppløsning av 2,5 g ammoniuperoksyddisulfat (oppløsning A).

I en trehalset kolbe med røreverk haes 2900 ml toluen, 1100 ml kloroform, 5 ml N,N,N',N'-tetrametyletylendiamin og 10 ml av en emulgator, avkjøles til 4°C og omrøres ved et dreietall på

250 omdreininger pr. minutt. Under nitrogen-beskyttelsesgass lar man over en dryppetrakt oppløsning A dryppe inn i reaksjonskaret, omrører i 30 .minutter og frasuger polymerisatet. Det ettervaskes to ganger med hver gang 1 liter toluen og 2 liter 0,5 molar natriumkloridoppløsning. I polymerisatet er det inneholdt 6j>% av den opprinnelige aktivitet av penicillinacylase.

Eksempel 5-

Spaltning av forbindelser med formel II:

20 m mol av -den forbindelse med formel II som skal spaltes oppløses i 200 ml vann (eventuelt ved tilsetning av natronlut) ved pH 7,5. Til den i-en ved 37°C termostatisert kar omrørt

■oppløsning har man 150 ml av den ifølge eksempel lb fremstilte oppløsning med en samlet aktivitet på 1500 E til dekstranbundet penicillinacylase.

Under reaksjonen holdes pH-verdien ved tilsetning av

0,5 molar NaOH ved hjelp av en pH-stat på pH 7,8 konstant. Avslut-ningen av NaOH-tilsetninger viser avslutning av reaksjonen. Etter avsluttet reaksjon filtreres oppløsningen gjennom et ultrafilter inntil et restvolum på 30 ml. Til den- gjenblivende oppløsning lar man 100 ml vann filtrere igjen inntil 30 ml, gjentar denne vaskeprosess ennu en gang og inndamper de sammenfattede permeater i vakuum ved- 30°C inntil 100 ml.

Den konsentrerte oppløsning blandes med 50 ml butylacetat og den dannede forbindelse med formel I utfelles ved tilsetning av 5 N saltsyre inntil isoelektrisk punkt på 3,7. Etter 2-3 timers henstand av prøven i kjøleskap frafiltreres, det krystallinske produkt, vaskes med hver gang 100 ml vann og aceton og tørkes i vakuum.

Innholdsbestemmelsen av produktet foregikk ved fotome-trisk bestemmelse av frigjort 7-aminogruppe på kjent måte etter reaksjon med p-dimetylaminobenzaldehyd i en modifikasjon av metoden av Svotek (tsjekkisk patent nr. 116.959 fra 1965).

Ekstinksjonen ved 415 nm ble sammenlignet med standard-kurver for ren 7-aminocefalosporansyre og 7-amino-desacetoksy-cefalosporansyre.

Dessuten ble produktets identitet påvist ved irifrarød-og H-kjerneresonans-spektret og ved papirkromatografi i systemet butanol:iseddik:vann (12:3=5) påvist. På denne måte ble følgende omsetninger gjennomført:

Eksempel 5 a).

Utgangsfo rbindelse:

9,08 g 7"(2-tienyl)-acetamido-cefalosporansyre (natriumsalt). Reaksjonsvarighet: 85 minutter.

Sluttprodukt: 7-aminocefalosporansyre.

Utbytte,: 5,30 g (90% av det teoretiske), renhet: 97%. Rf: 0,27 (ingen desacety1-7-aminocefalosporansyre med Rf 0,10). Eksempel 5 b).

Utgangs forbi ndelse:

8,70 g 7-(2-tienyl)-acetamido-3--yridiniummetyl-A^-cefem-4-karboksylat. Sluttprodukt: 7-amino-3-pyridiniummetyl-A^-cefem-4-karboksylat. Reaksjonstid: 75 minutter.

Rf: 0,05. L

På grunn av pyridinringen i molekylet kan produktet av denne reaksjon ikke isoleres ved utfelling ved det isoelektriske punkt. Fullstendigheten av omsetningen og produktets identitet ble påvist papirkromatografisk.

Eksempel 5c) .

Utgangs forbindelse:

7,01 g 7_fenoksyacetamido-desacetoksy-cefalosporansyre. Sluttprodukt: 7-amino-desacetoksycefalosporansyre. Utbytte: 3,38 g (78% av det teoretiske), renhet: 97%. Smeltepunkt: . 238-240°C. (under spaltning).

Eksempel 5d).

Utgangs forbindelser:

6,99 g 7-(a-amino-fenylacetyl)-desacetoksycefalosporansyre. Sluttprodukt: 7-amino-desacetoksycefalosporansyre.

i

Utbytte': 3,66 g (84% av det teoretiske), renhet: 97%. Eksempel 6.

500 g fenylacetamido-desacetoksycefalosporansyre (renhet 98%) settes til 20 liter av en oppløsning av stivelsesbunden penicillinacylase, som inneholder en samlet aktivitet på 115-000 enheter. Reaksjonsblandingen holdes under omrøring ved tilsetning av trietylamin konstant ved pH 7,8 ± 0,2. Reaksjonstemperaturen skal utgjøre 38°C. Etter 65 minutter opptas ikke mere trietylamin. - . Oppløsningen filtreres gjennom et papirfilter og ultrafiltreres i

en Labormodul under anvendelse'av 10 membraner, som er permeable for-molekyler, inntil en molekylvekt på 20.000 ved et driftstrykk på.

12 kg/cm 2 inntil et restvolum på 1000 ml. Retenatet, som foruten

den utskilte stivelsesbundne penicillinacylase blant amtet- dessuten inneholder resterende 7-aminodesacetoksycefalosporansyre, fortynnes 3 ganger i rekkefølge med hver gang 1000 ml vann og ultrafiltreres

hver gang igjen, til et restvolum på 1000 ml. Fra de sammenfattede ultrafiltratet isoleres de dannede 7-aminodesacetoksycefalosporansyre etter generelt vanlige, f.eks. følgende fremgangsmåte:

Ultrafiltratet innbefattende vaskevann innstilles med

5 N saltsyre til.pH 5,5 og . ekstraheres to ganger med hver gang 5 1 i-butylacetat. Den.vandige fase innstilles på pH 7,0 og inndampes i vakuum ved 30°C inntil 8 liter. Fra konsentratet utfelles ved tilsetning av 5 N saltsyre 7-aminocefalosporansyre ved det isoelektriske punkt ved pH 3,7. Etter 2-3 timers henstand frasuges produktet etterlat pH-verdien ble kontrollert 'og eventuelt etterstillet til pH 3,7 og ettervaskes med hver gang 1000 ml vann og aceton. Det .tørkes i vakuum ved 40°C. Utbytte 306 g (94% av det.teoretiske), renhet 97%.

På samme måte ble samme stivelsesbundne penicillinacylase anvendt etter hverandre 25 ganger uten at det opptrådte noe merkbart aktivitetstap.

Utbyttet av 25 spaltninger utgjorde herved gjennomsnitt-lig 93,5% av det teoretiske.-

Eksempel 7-

20 g (60 m mol) 7_fenylacetamido-desacetoksycefalosporansyre suspenderes i 500 ml vann og oppløses ved tilsetning av trietylamin inntil pH-verdi på 7,8. Man oppvarmer til 37°C og tilsetter 80 ml av den ifølge eksempel lb) fremstilte enzymoppløsning med en samlet aktivitet på 800 E. Ved tilsetning av trietylamin holdes pH-verdien under spaltninger ved 7,8 ± 0,3- Etter 6 timer er reaksjonen avsluttet. Reaksjonsotlandingen filtreres gjennom et ultrafilter inntil et restvolum på 50 ml, den gjenblivende oppløsning fortynnes • med 100 ml -ann og inndampes igjen til 50 ml ved ultrafiltrering. Denne vaskeprosess gjentas ennu en gang. Alle permeater sammenfattes og inndampes i vakuum ved 30°C inntil 400 ml.

Etter tilsetning av 200 ml metylisobutylketbn innstilles med 12 N saltsyre til pH 3,7 og den utkrystalliserte 7-aminodesacet-oksy-cefalosporansyre fra.suges etter 1 times henstand og vaskes med litt vann og med litt vann/metylisobutylketon og aceton.

Utbytte: 11,9.g (92,5% av det teoretiske), renhet: 98%. Smeltepunkt: 238-240°C-(spaltning).

Eksempel 8..

1

20 g (60 m mol) 7-fenylacetamido-desacetoksycefalosporansyre suspenderes i 350 ml vann og oppløses .ved tilsetning av trietylamin inntil pH-verdi på 7,8. Man oppvarmer til 37°C og tilsetter den ifølge eksempel 4- fremstilte innpolymeriserte kovalente stivelse bundne penicillinacylase med en samlet aktivitet på 1120 enheter..

Ved tilsetning av trietylamin'holdes reaksjonsblandingen under spalt-ningen ved pH 7,8 ± 0,3. Etter 5 timer er reaksjonen avsluttet.

Det innpolymeriserte penicillinacylasederivat frafiltreres og vaskes ut med" litt vann. Til filtratet innbefattende vaskevannet haes 200 ml metylisobutylketon og 12 N saltsyre inntil pH 3,7- Etter 1 timers henstand ved 5°C etterinnstilles pH-verdien likeledes med en saltsyre til pH 3,7, den utkrystalliserte 7-aminodesacetoksycefalosporansyre suges fra og ettervaskes med litt vann og aceton.

Utbytte: 12,1 g (94% av det teoretiske). Renhet: 97,5%.

Smeltepunkt: 238-240°C under spaltning.

Eksempel 9-

Den for fremstillingen av enzymderivatet nødvendige penicillinacylase: a) Et råekstrakt, som inneholder penicillinacylase utvinnes idet man dyrker Escherichia coli etter den i tysk patent nr. 1.111. 778 omtalte fremgangsmåte, konsentrerer kulturen ved sentrifugering til et slam.og oppslutter cellen etter kjente mekaniske fremgangsmåter eventuelt under tilsetning av 3% metylisobutylketon. b) 6l0 liter" av en således dannet råekstrakt inneholder 5,2'. 10 enheter, fortynnes med avionisert vann til 2100 liter, innstilles med svovelsyre til pH 5,0 og sentrifugeres. I det klare overstående finner man 5,7 . 10 E med en spesifikk aktivitet på. 1,7 E/mg.

Claims (1)

1. Under ette.rinnstilling av pH til 550 innrøres 13»8 kg bentonit og adskilles etter 30 minutter i en gjennomløpssentrifuge. Den adskilte,bentonit elueres med 90 liter 0,5 molar natriumacetat-oppløsning pH 8,0 og frafiltreres. Det fåes 92,5 liter, innehold-ende 4-,5 . ld^ enheter (86% av det teoretiske) med en spesifikk aktivitet av penicillinacylase på 6,5 E/mg. P_a_t_e_n_t _k_r_a_v_ j_ 1., Fremgangsmåte til fremstilling av 7-amino-A 3-cefem-derivater med formel.

   hvori R betyr hydrogen, hydroksyl, amino, cyano, -0-CO-NHp, -S-C-nT£hp) hvori n betyr et helt tall. S fra 4 til 6, -0-CO-R<1>, -NH-CO-R<1>, -S-CS-O-R<1>, hvori R<1>betyr alkyl med 1 til 4 karbonatomer og hvori R betyr -S-Het eller j Het, idet Het betyr en 5- eller 6-leddet heteroaromatisk ring, som eventuelt kan ha en positiv ladning og X betyr hydrogen eller symbolet av en negativ ladning, hvis resten R inneholder en positiv ladning,karakterisertvedat forbindelser med formel

   hvori R og X har overnevnte betydning og R 2 ' betyr en eventuelt i . ringen med amino, hydroksy eller alkyl med 1 til 3 karbonatomer substituert fenyl-, fenoksy-, 2-tienyl- eller 2-furylring ogR^ betyr hydrogen, amino, hydroksy eller alkyl. med 1 ■til 3 karbonatomer, eller deres salter med uorganiske eller organiske baser, bringes i ■berøring med penicillinacylase, som er.bundet kovalent til en i vann oppløselig .bærer, eventuelt en i et vannuoppløselig bærematerial innesluttet form og isolerer det dannede 7-amino-A 3-cefem-derivat. ' 3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert3 ■ 2 ' ved at R, R og X betyr hydrogen og R betyr fenyl. 3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at R, R^ 3 og X betyr hydrogen og R 2 fenoksy. 4. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at R betyr -O-COCH^, R<2>betyr fenoksy og R5 og X betyr hydrogen. 5. Fremgangsmåte ifølge' krav 1,karakterisertved at R betyr -O-CO-CH-^, R<2>betyr fenyl og R5 og X betyr hydrogen. 6. Fremgangsmåte ifølge krav 1 til 5,karakterisert vedat penicillinacylasen er kovalent bundet til et polysakkarid. 7. Fremgangsmåte ifølge krav 1 til 6,karakterisert vedat penicillinacylasen er kovalent bundet til stivelse. 8. Fremgangsmåte ifølge krav 1 til 6,karakterisert vedat penicillinacylasen er kovalent bundet til dekstran. 9. Fremgangsmåte ifølge krav 1 til 8,karakterisert vedat den kovalent til en i vann oppløselig bærer bundne penicillinacylase er innesluttet i ett i vann uoppløselig bærematerial.