NO750383L

NO750383L -

Info

Publication number: NO750383L
Application number: NO750383A
Authority: NO
Inventors: F Hueper
Original assignee: Bayer Ag
Priority date: 1974-02-28
Filing date: 1975-02-06
Publication date: 1975-08-29
Also published as: DE2409569A1; KE2992A; DE2409569C2; JPS50123888A; DD117073A5; IE41134B1; SE7502230L; FR2262667B1; ES435151A1; JPS5724118B2; CS185675B2; GB1454975A; HK67179A; AU7855275A; BE825999A; FR2262667A1; FI750557A; AT338974B; IL46698A0; LU71925A1

Description

Oppfinnelsen vedrører en ny fremgangsmåte til frem- The invention relates to a new method for

stilling av 7-amino-A^-cefem-derivater, som kan anvendes som mellom-produkt for syntese av antimikrobielle virksomme stoffer. position of 7-amino-A^-cephem derivatives, which can be used as an intermediate for the synthesis of antimicrobial active substances.

Det er allerede blitt kjent at man får 7-amino-cefalosporansyre, f.eks. ved spaltning av cefalosporin C med kulturer av forskjellige mikroorganismer (sammenlign f.eks. US-patent nr. 3.239. It has already become known that 7-amino-cephalosporanic acid is obtained, e.g. by cleavage of cephalosporin C with cultures of various microorganisms (compare e.g. US patent no. 3,239.

394) eller ved kjemisk spaltning etter forskjellige metoder (sammen- 394) or by chemical cleavage using different methods (combination

lign f.eks. DAS.1.176.147, DOS 1.145.615 eller US-patent.nr. equal to e.g. DAS.1,176,147, DOS 1,145,615 or US patent no.

3.272.809). Desacetoksy-cefalosporin C kan.etter katalytisk reduk- 3,272,809). Desacetoxy-cephalosporin C can.after catalytic reduction

sjon (sammenlign US-patent nr. 3^124.576) omdannes analogt i 7-amino-desacetoksy-cefalosporansyre. Fra DOS 2.212.276 er det også kjent en fremgangsmåte til enzymatisk spaltning av 7-f e nok sy ac et amid o-desacetoksy-cefalosporansyre til 7~amino-desacetoksy-cefalosporari- tion (compare US Patent No. 3^124,576) is converted analogously into 7-amino-desacetoxy-cephalosporanic acid. From DOS 2,212,276, a method is also known for the enzymatic cleavage of 7-f e no sy ac et amide o-desacetoxy-cephalosporanic acid to 7~amino-desacetoxy-cephalosporari-

syre ved hjelp av et adsorptivt bundet enzym fra Bacillus megaterium B 400. Flere fremgangsmåter til spaltning av penicillinet ved hjelp acid using an adsorptively bound enzyme from Bacillus megaterium B 400. Several methods for splitting the penicillin using

av kovalent til vannuoppløselig bærer bundet penicillinacylase er likeledes kjent (sammenlign DOS 1.907-365, 1.917-057 og 2.215-687). of covalently to water-insoluble carrier bound penicillin acylase are likewise known (compare DOS 1,907-365, 1,917-057 and 2,215-687).

Det er funnet at man får 7-amino-A^-cefem-derivater med formel It has been found that 7-amino-A^-cephem derivatives of the formula are obtained

hvori in which

R betyr hydrogen, hydroksyl, amino, cyano, R means hydrogen, hydroxyl, amino, cyano,

-0-C0-NH2, -s_c-@H2)nJ hvori n betyr et helt tall -0-C0-NH2, -s_c-@H2)nJ where n means an integer

S S

fra "4 til 6, -O-CO-R^ -NH-CO-R<1>, -S-CS-O-R<1>, hvori R<1>betyr alkyl med 1 til 4 karbonatomer eller hvori R betyr -S-Het eller Het, idet from "4 to 6, -O-CO-R^ -NH-CO-R<1>, -S-CS-O-R<1>, in which R<1> is alkyl of 1 to 4 carbon atoms or in which R is - S-Het or Het, idet

Het betyr en 5- eller 6-leddet heteroaromatisk ring, som eventuelt kan ha en'positiv ladning og Het means a 5- or 6-membered heteroaromatic ring, which may optionally have a positive charge and

X betyr hydrogen eller symbolet av en negativ ladning, hvis resten R inneholder en positiv ladning, X means hydrogen or the symbol of a negative charge, if the residue R contains a positive charge,

når forbindelser med formel when compounds with formula

hvori in which

R og X har overnevnte betydning og R and X have the above meaning and

R betyr en eventuelt % ringen med anno, hydroksy eller alkyl med 1 til 3 karbonatomer substituert fenyl-, fenoksy-, 2-tienyl eller 2-furylring og R means an optionally % ring with anno, hydroxy or alkyl with 1 to 3 carbon atoms substituted phenyl, phenoxy, 2-thienyl or 2-furyl ring and

R^ betyr hydrogen, amino, hydroksy eller alkyl med R 1 means hydrogen, amino, hydroxy or alkyl with

1 til 3 karbonatomer, 1 to 3 carbon atoms,

eller deres salter med uorganiske eller organiske baser, bringes i berøring med penicillinacylase, som er bundet kovalent til i vann oppløselige bærere, eventuelt i en i et vannuoppløselig bærematerial innesluttet form og isolerer det dannede 7-amino-A^-cefem-derivat med formel I. - På overraskende måte spalter den kovalent til vannopp-løselig bærer bundede penicillinacylase forbindelsene med formel II praktisk talt i samme hastighet som tilsvarende penicilliner. or their salts with inorganic or organic bases, is brought into contact with penicillin acylase, which is bound covalently to water-soluble carriers, possibly in a form enclosed in a water-insoluble carrier material and isolates the formed 7-amino-A^-cephem derivative of formula I. - Surprisingly, the covalently bound to water-soluble support penicillin acylase cleaves the compounds of formula II practically at the same rate as corresponding penicillins.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen har en rekke fordeler i forhold til de kjente fremgangsmåter til fremstilling av forbindelser med formel r. Mens f.eks. enzymer fra cellekulturer bare kan anvendes en- gang er det mulig å adskille den vannoppløselige bærerbundne penicillinacylase ved ultrafiltrering og anvende igjen. Videre kan man, hvis ønsket, fra de vannoppløselige enzymtilbered-ninger også få vannoppløselige penicillinacylasetilberedninger ved at man inneslutter kovalent til vannoppløselige bærere bundet penicillinacylase i et vannuoppløselig bærematerial, f.eks. ved forkapsling eller inneslutning i polymere. Disse vannuoppløselige tilberedninger kan i mange tilfeller anvendes på gunstig måte. Ved fremgangsmåten' ifølge oppfinnelsen fåes forbindelsene med formel I i meget god renhet og høye utbytter ved enkel teknikk. I forhold til anvendelsen av et bare adsorptivt bundet enzym (sammenlign DOS 2.212.276) har The method according to the invention has a number of advantages compared to the known methods for preparing compounds of formula r. While e.g. enzymes from cell cultures can only be used once, it is possible to separate the water-soluble carrier-bound penicillin acylase by ultrafiltration and use it again. Furthermore, if desired, water-soluble penicillin acylase preparations can also be obtained from the water-soluble enzyme preparations by enclosing penicillin acylase covalently bound to water-soluble carriers in a water-insoluble carrier material, e.g. by encapsulation or encapsulation in polymers. These water-insoluble preparations can in many cases be used advantageously. In the method according to the invention, the compounds of formula I are obtained in very good purity and high yields by simple technique. In relation to the use of a merely adsorptively bound enzyme (compare DOS 2,212,276) has

anvendelsen ifølge oppfinnelsen av de kovalent bundede vannoppløse-lige penicillinac.ylasetilberedninger den fordel at. enzymet forblir the use according to the invention of the covalently bound water-soluble penicillin ac.ylase preparations has the advantage that. the enzyme remains

fast bundet også ved anvendelse av høye konsentrasjoner av cefalosporin-substrat med formel II, hvorved det fremkommer en i forhold til andre fremgangsmåter betraktelig øket økonomi. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er således en berikelse av teknikken. firmly bound also when using high concentrations of cephalosporin substrate with formula II, which results in considerably increased economy compared to other methods. The method according to the invention is thus an enrichment of the technique.

Anvender man f.eks. 7~fenyl-acetamido-desacetoksy-cefalosporansyre som utgangs stoff, så kan reaksjonsforløpet gjengis med følgende formelskjerna: If you use e.g. 7~phenyl-acetamido-desacetoxy-cephalosporanic acid as starting material, then the course of the reaction can be reproduced with the following formula core:

De som utgangsstoffer anvendte forbindelser er generelt The compounds used as starting materials are general

definert med overnevnte formel II. defined by the above-mentioned formula II.

Alkyl R1 betyr rettlinjet eller forgrenet alkyl med Alkyl R1 means straight or branched alkyl with

1 til 4, fortrinnsvis 1 eller 2 karbonatomer. Eksempelvis skal det nevnes metyl, etyl, n- og i-propyl. 1 to 4, preferably 1 or 2 carbon atoms. Examples include methyl, ethyl, n- and i-propyl.

n .betyr fortrinnsvis 4 eller 5. n .means preferably 4 or 5.

Den 5_ eller 6-leddede heteroaromatiske ringHet inneholder fortrinnsvis 1 til 3, spesielt 1 eller 2 like eller forskjellige heteroatomer. Som heteroatomer står oksygen, svovel 'eller nitrogen. Som eksempel skal det nevnes furyl, tienyl, pyrazolyl, imidazolyl, 1,2,3- og 1,2,4-triazolyl, oksazolyl, isoksazolyl, ti.a- zolyl, isotiazolyl, 1,2,3-, 1,3,4-, 1,2,4-,og 1,2,5-oksadiazolyl, azepinyl, pyrrolyl, isopyrrolyl, pyridyl, pyridinium, pyridazinyl, pyrimidinyl og pyrazinyl.'' The 5- or 6-membered heteroaromatic ring Het preferably contains 1 to 3, especially 1 or 2 identical or different heteroatoms. Heteroatoms are oxygen, sulfur or nitrogen. Examples include furyl, thienyl, pyrazolyl, imidazolyl, 1,2,3- and 1,2,4-triazolyl, oxazolyl, isoxazolyl, thi.azolyl, isothiazolyl, 1,2,3-, 1,3 ,4-, 1,2,4- and 1,2,5-oxadiazolyl, azepinyl, pyrrolyl, isopyrrolyl, pyridyl, pyridinium, pyridazinyl, pyrimidinyl and pyrazinyl.''

Den heteroaromatiske ring Het kan være substituert med I til 3, fortrinnsvis 1 eller 2 alkylgrupper med fortrinnsvis 1 til 3 karbonatomer, idet eksempelvis skal nevnes metyl og etyl. The heteroaromatic ring Het can be substituted with 1 to 3, preferably 1 or 2 alkyl groups with preferably 1 to 3 carbon atoms, examples being methyl and ethyl.

Alkyl i definisjonen av betyr rettlinjet eller forgrenet alkyl med 1 til 4, spesielt 1 eller 2 karbonatomer, som metyl, etyl og n- og i-propyl. Alkyl in the definition of means straight or branched alkyl having 1 to 4, especially 1 or 2 carbon atoms, such as methyl, ethyl and n- and i-propyl.

Som salter av forbindelser med formel II med uorganiske eller organiske baser, som kan anvendes for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen skal det nevnes alkali saltene, som natrium- og kalium-salter, jordalkalisalter, som kalsiumsalter, ammoniumsalter samt saltene, som dannes med alifatiske, aralifatiske eller aromatiske aminer. Eksempelvis skal det anføres de primære, sekundære og tertiære alkylaminer som inneholder 1 til 4 karbonatomer pr. alkyl-gruppe og hvor alkylgruppen kan være substituert med hydroksygruppen, f.eks. etylamin, trietylamin, hydroksyetylamin, cykliske aminer, f.eks. pyridin, piperidin, morfolin, piperazin og N^metylpiperazin. As salts of compounds of formula II with inorganic or organic bases, which can be used for the method according to the invention, mention must be made of the alkali salts, such as sodium and potassium salts, alkaline earth salts, such as calcium salts, ammonium salts and the salts, which are formed with aliphatic, araliphatic or aromatic amines. For example, the primary, secondary and tertiary alkylamines containing 1 to 4 carbon atoms per alkyl group and where the alkyl group can be substituted with the hydroxy group, e.g. ethylamine, triethylamine, hydroxyethylamine, cyclic amines, e.g. pyridine, piperidine, morpholine, piperazine and N-methylpiperazine.

De ifølge oppfinnelsen anvendbare forbindelser med formel II er allerede kjent og kan fåes etter kjente fremgangsmåter (sammenlign f.eks. B.E.H.. Flynn, Cephalosporins and Penicillins, Chemistry and Biplbgy, Academic■Press, New York, 1972). The compounds of formula II which can be used according to the invention are already known and can be obtained by known methods (compare, for example, B.E.H.. Flynn, Cephalosporins and Penicillins, Chemistry and Biplbgy, Academic■Press, New York, 1972).

Som (for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen spesielt foretrukkede) eksempler på forbindelser med formel II skal nevnes: As (for the method according to the invention particularly preferred) examples of compounds with formula II should be mentioned:

Av disse forbindelser er for anvendelsen ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ' forbindelsene d) til g) spesielt foretrukket. Of these compounds, compounds d) to g) are particularly preferred for use in the method according to the invention.

Penicillinacylase, som'er bundet kovalent til vannopp-løselig bærer kan være av forskjellig opprinnelse. Penicillin acylase, which is bound covalently to water-soluble carrier can be of different origin.

Penicillinacylasen (Enzyme Comission 3.5.1.11) kan utvinnes av tallrike mikroorganismer etter generelt kjente metoder (sammenlign f.eks. også DOS 1.907-365.og 2.217-745), f.eks. fra bakterier, spesielt Escherichia coli, Erwinia eller actinomyceter, som Streptomyces, Micromonospora, Norcardia eller sopp, som Fusarium The penicillin acylase (Enzyme Commission 3.5.1.11) can be recovered from numerous microorganisms by generally known methods (compare e.g. also DOS 1.907-365.and 2.217-745), e.g. from bacteria, especially Escherichia coli, Erwinia or actinomycetes, such as Streptomyces, Micromonospora, Norcardia or fungi, such as Fusarium

og gjør. Spesielt foretrakkes penicillinacylase fra Escherichia coli, f.eks. fra en Escherichia coli-stamme, som ble deponert under ATCC and do. Particularly preferred is penicillin acylase from Escherichia coli, e.g. from an Escherichia coli strain, which was deposited with the ATCC

11 105. Isoleringen av penicillinacylase fra.Escherichia coli fore-går f.eks. ifølge DOS 2.217-745 ved at man innstiller et råekstrakt av Escherichia coli-celler, som ved siden av penicillinacylase dessuten inneholder celleopphopninger av Escherichia coli-celler, til en pH-verdi fra 3,5 til 5,5, fortrinnsvis 5,0 og sentrifugerer ekstraktet, deretter behandler'den overstående dannede klare oppløsning av penicillinacylasen med aluminiumsilikater, fortrinn-vis bentonit, ad-ski.ller'adsorbatet på kjent måte og eluerer f.eks. med 0,1-1,0-molar oppløsning av natrium- eller kaliumacetat ved ca. pH 8,5. 11 105. The isolation of penicillin acylase from Escherichia coli takes place e.g. according to DOS 2,217-745 by adjusting a crude extract of Escherichia coli cells, which besides penicillin acylase also contains cell accumulations of Escherichia coli cells, to a pH value of from 3.5 to 5.5, preferably 5.0 and centrifuges the extract, then treats the resulting clear solution of the penicillin acylase with aluminum silicates, preferably bentonite, separates the adsorbate in a known manner and elutes e.g. with 0.1-1.0 molar solution of sodium or potassium acetate at approx. pH 8.5.

Den derved dannede anrikede klare oppløsning av penicillinacylase kan eventuelt vidererense.s kromatografisk på makroporøse ioneutvekslere, f.eks. sulfoetyl-cellulose, The resulting enriched clear solution of penicillin acylase can optionally be further purified chromatographically on macroporous ion exchangers, e.g. sulfoethyl cellulose,

Som vannoppløselig bærer, tivortil penicillinacylasen As a water-soluble carrier, tivortil the penicillin acylase

kan bindes kovalent kommer det på tale mange vannoppløselige polymere forbindelser. Fortrinnsvis kan det som polymer bærer' praktisk talt anvendes alle polysakkarider. Som eksempler hertil skal det fremfor alt nevnes: Dekstran, i vann oppløselige stivelse, laevan samt karboksymetylcellulose. Spesielt foretrekkes dekstran og stivelse. Som polysakkarider kommer det fortrinnsvis på tale slike med en molekylvekt fra ca. 5000 til ca. 1000.000, spesielt 10.000 can be bonded covalently, many water-soluble polymeric compounds are involved. Preferably, practically all polysaccharides can be used as the polymer carrier. As examples of this, the following should be mentioned above all: Dextran, water-soluble starch, laevan and carboxymethyl cellulose. Dextran and starch are particularly preferred. Polysaccharides are preferably those with a molecular weight of approx. 5000 to approx. 1000,000, especially 10,000

til 800.000. to 800,000.

Fremstillingen av den ifølge oppfinnelsen anvendbare kovalent til i vann oppløselige bærere bundede penicillinacylase under anvendelse av polysakkarider kan foretas på følgende måte: Ved anvendelsen av polysakkarider som vannoppløselig, polymer bærer omsetter man disse polysakkarider i første rekke for- The production of the penicillin acylase that can be used according to the invention covalently bound to water-soluble carriers using polysaccharides can be carried out in the following way: When using polysaccharides as a water-soluble polymer carrier, these polysaccharides are primarily converted into

i in

trinnsvis med et halogencyanid. Deretter omsettes den herved dannede aktive mellomforbindelse, eventuelt etter dens isolering med penicillinacylase (sammenlign DOS 1.768.512 tilsvarende US-patent nr.3.645.852). stepwise with a halocyanide. The active intermediate thus formed is then reacted, possibly after its isolation with penicillin acylase (compare DOS 1,768,512 corresponding to US patent no. 3,645,852).

Reaksjonsforløpet for denne to-trinnsreaksjon (dannelsen av en aktiv mellomforbindelse under binding av penicillinacylase til den polymere bærer)(kan gjengis ved følgende formelskjema: idet X kan være en NH-gruppe eller oksygen, The reaction sequence for this two-step reaction (the formation of an active intermediate during the binding of penicillin acylase to the polymeric carrier) can be represented by the following formula: where X can be an NH group or oxygen,

betyr en del means a lot

av den polymere bærer (polysakkarid) og H^N-protein betyr penicillinacylasen. of the polymeric carrier (polysaccharide) and H^N protein means the penicillin acylase.

Som halogeneyan kommer det på tale jod-, klor- og brom- As halogens, we are talking about iodine, chlorine and bromine

cyan, spesielt bromcyan. cyan, especially cyan bromide.

Som fortynnings- resp. oppløsningsmiddel anvendes såvel As a dilution or solvent is used as well

i 1. trinn (omsetning av polysakkarid med halogencyan) som også i annet trinn (omsetning av mellomforbindelsen med.penicillinacylase) in the 1st step (reaction of polysaccharide with halogen cyan) as also in the second step (reaction of the intermediate compound with penicillin acylase)

i in

fortrinnsvis vann. preferably water.

Pr. gram polysakkarid anvendes ved anvendelse av dekstran fortrinnsvis ca. 5 til ca. 250, spesielt 10 til 200 mg halogencyan og ved anvendelse av stivelse fortrinnsvis ca. 50 til ca. 500, spesielt 80 til 200 mg halogencyan. When using dextran, preferably approx. 5 to approx. 250, especially 10 to 200 mg of halogen cyan and when using starch preferably approx. 50 to approx. 500, especially 80 to 200 mg of halogen cyan.

Reaksjjonstemperaturene ligger ved begge trinn mellom The reaction temperatures at both stages lie in between

ca. 0 og ca. 50°C, fortrinnsvis mellom 10 og 2.5°C Omsetningene kan gjennomføres ved normaltrykk, men også ved forhøyet trykk, fortrinnsvis ved normaltrykk. about. 0 and approx. 50°C, preferably between 10 and 2.5°C The reactions can be carried out at normal pressure, but also at elevated pressure, preferably at normal pressure.

Ved fremstilling av penicillinacylasetilberedning In the preparation of penicillin acylase preparation

holder man reaksjonsmediet ved tilsetning av en base, eksempelvis natronlut i området på pH 8 - 13, fortrinnsvis ved pH 11,0. Halo-gencyanets omsetning med polysakkaridet er i mange tilfeller avsluttet etter 10 - 20 minutter. Oppløsningen av den av polysakkarid og halogencyanet dannede aktive mellomforbindelse skal for omsetning med penicillinacylasen ikke inneholde fritt halogencyan. Omsetningen bør foregå så hurtig som mulig, da det reaksjonsdyktige derivat av den polymere lett inaktiveres på grunn av hydrolyse. Før omsetningen med penicillinacylasen innstilles pH-verdien av oppløsningen, som inneholder det aktive polymerderivat, fortrinnsvis til ca. 8,5. if you keep the reaction medium by adding a base, for example caustic soda in the range of pH 8 - 13, preferably at pH 11.0. The reaction of the halo-gentiane with the polysaccharide is in many cases finished after 10 - 20 minutes. The solution of the active intermediate compound formed by the polysaccharide and the halogen cyanide must not contain free halogen cyanide for reaction with the penicillin acylase. The reaction should take place as quickly as possible, as the reactive derivative of the polymer is easily inactivated due to hydrolysis. Before the reaction with the penicillin acylase, the pH value of the solution, which contains the active polymer derivative, is preferably adjusted to approx. 8.5.

Etter tilsetning av penicillinacylase omrører man ved ca. 0 til ca. 50°C, fortrinnsvis 5 til 10°C. Det høymolekylære enzymderivat kan deretter adskilles på vanlig måte, eksempelvis ved ultrafiltrering fra nativt, ikke omsatt enzym med membraner som er ugjennomtrengelig for enzym-polymer-tilberedningene. I tilfellet anvendelse av dekstran med en molekylvekt på 500.000 kan det f.eks. anvendes membraner som er ugjennomtrengelige for stoffer med en molekylvekt på mer enn 100.000. After adding penicillin acylase, stir at approx. 0 to approx. 50°C, preferably 5 to 10°C. The high-molecular-weight enzyme derivative can then be separated in the usual way, for example by ultrafiltration from native, unreacted enzyme with membranes that are impermeable to the enzyme-polymer preparations. In the case of using dextran with a molecular weight of 500,000, it can e.g. membranes are used that are impermeable to substances with a molecular weight of more than 100,000.

Forholdet mellom polysakkarid, halogencyan og penicillinacylase kan varieres innen vide grenser. Med sikkerhet oppnås en •fullstendig omsetning av enzymet, når det pr. vektdel enzymprotein minst anvendes 5 vektdeler polysakkarid. The ratio between polysaccharide, halogen cyan and penicillin acylase can be varied within wide limits. With certainty, a •complete conversion of the enzyme is achieved, when per part by weight of enzyme protein at least 5 parts by weight of polysaccharide are used.

Det. har vist seg at mengdeforholdet mellom halogencyan og polysakkarid betraktelig kan påvirke holdbarheten av enzymderivatet. Således inaktiveres den native penicillinacylase i vandig oppløsning ved pH 7,8 og 45°C i løpet av 24 timer inntil 95%. Under samme betingelser gir bærebunden vannoppløselig penicillinacylase som eksempelvis blir koplet til dekstran av molekylvekt 500.000 i løpet av 24 timer bare'47% av aktiviteten, når det pr. gram dekstran anvendes 17 mg bromcyan. Anvendes imidlertid pr. gram dekstran 80 mg bromcyan, så nedsetter enzymaktiviteten seg i løpet av 24 timer bare rundt 5%• Derved er det overraskende at ved samme koplingsutbytte kan ved økning av halogencyanmengden stabiliteten av den vannoppløselige bærerbundne penicillinacylase betraktelig økes. Muligens oppstår ved økning av mengden av halogencyan mellom bærermolekylet og énzym-molekylet mere kovalente bindinger. Derved kunne tertiærstrukturen av enzymet stabiliseres desto mer som det er dannet kovalente bindinger mellom bærer og enzym. Den mengdemessige anvendelse av halogencyan er imidlertid begrenset, da på grunn av tverrfornettelse kan oppstå tungt oppløselige og/eller uoppløselige enzymderivater. Således er det ikke å anbefale, ved anvendelse av polysakkarider, The. it has been shown that the quantity ratio between halogen cyan and polysaccharide can considerably affect the shelf life of the enzyme derivative. Thus, the native penicillin acylase is inactivated in aqueous solution at pH 7.8 and 45°C within 24 hours by up to 95%. Under the same conditions, the carrier gives water-soluble penicillin acylase which, for example, is coupled to dextran of molecular weight 500,000 within 24 hours only'47% of the activity, when per gram of dextran, 17 mg of cyanogen bromide is used. However, used per gram dextran 80 mg cyanogen bromide, then the enzyme activity decreases within 24 hours by only around 5%• Thereby it is surprising that with the same coupling yield, by increasing the amount of halogen cyanogen, the stability of the water-soluble carrier-bound penicillin acylase can be considerably increased. Possibly, by increasing the amount of halogen cyan between the carrier molecule and the enzyme molecule, more covalent bonds occur. Thereby, the tertiary structure of the enzyme could be stabilized all the more as covalent bonds have been formed between carrier and enzyme. However, the quantitative use of halogen cyan is limited, as due to cross-linking, poorly soluble and/or insoluble enzyme derivatives can occur. Thus, it is not recommended, when using polysaccharides,

f.eks. av dekstran, med molekylvekt på omtrent 500.000 pr.gram å anvende mer enn 150 mg halogencyan, f.eks. bromcyan. e.g. of dextran, with a molecular weight of approximately 500,000 per gram to use more than 150 mg of halogen cyan, e.g. cyan bromide.

Anvendes imidlertid en polysakkarid, f.eks. dekstran However, if a polysaccharide is used, e.g. dextran

med en mindre molekylvekt, f.eks. på 20.000, så kan man uten videre pr. gram polysakkarid la det. reagere mer enn 3.00 mg halogencyan, f.eks. bromcyan. Imidlertid nedsettes ved anvendelse av bærere med mindre molekylvekt enzymets stabilitet. with a lower molecular weight, e.g. of 20,000, then you can without further ado per grams of polysaccharide let it. react more than 3.00 mg halogen cyan, e.g. cyan bromide. However, when using carriers with a smaller molecular weight, the stability of the enzyme is reduced.

Også med stivelse som vannoppløselig bærer lar det seg fremstille overordentelige.stabile derivater av penicillinacylase.. Enzymderivatets stabilitet er likeledes avhengig av anvendelsen av halogencyan. Fortrinnsvis lar man det pr. gram stivelse minst reagere 150 mg halogencyan, f.eks. bromcyan. Even with starch as a water-soluble carrier, extremely stable derivatives of penicillin acylase can be produced. The stability of the enzyme derivative is also dependent on the use of halogen cyan. Preferably, you let it per gram starch at least react 150 mg halogen cyan, e.g. cyan bromide.

Den hver gang mest gunstige molekylvekt av bærer og The each time most favorable molecular weight of carrier and

type og mengde av halogencyanet samt av penicillinacylase.n er lett å fastslå av enhver fagmann. type and quantity of the halogen cyanide and of penicillin acylase.n is easily determined by any person skilled in the art.

Til gjennomføring av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen (omdannelsen av forbindelser med formel II i forbindelse med formel I) kan penicillinacylase, som er bundet kovalent til den vannoppløse-lige bærer anvendes direkte, altså uten ytterligere endring eller, For carrying out the method according to the invention (the conversion of compounds of formula II in connection with formula I), penicillin acylase, which is bound covalently to the water-soluble carrier, can be used directly, i.e. without further modification or,

også innesluttet i et vannuoppløselig bærematerial, f.eks. kapsler, polymere av forskjelligste type.eller spesielt foretrukket spinnes i fibre (sammenlign DOS 1.932.426 tilsvarende US-patent nr. 3.715.277). also enclosed in a water-insoluble carrier material, e.g. capsules, polymers of various types, or especially preferably spun into fibers (compare DOS 1,932,426 corresponding to US patent no. 3,715,277).

Inneslutningen av det kovalent til i vann oppløselige bærer bundet enzym kan herved i motsetning foregå til det fri ikke kovalente bundede enzym uten merkbart aktivitetstap. In contrast to the free, non-covalently bound enzyme, the entrapment of the enzyme bound covalently to the water-soluble carrier can thereby take place without appreciable loss of activity.

Den i vannoppløselige bærer kovalent bundede penicillinacylase kan sdm allerede nevnt spinnes i henhold til metoden i DOS 1.932.426, tilsvarende US-patent 3.715-277 til fibre. Enzymtilbered-ningen dispergeres f.eks. hertil ved hjelp av en emulgator og spinnes i våtspinnefremgangsmåte eller i tørrspinne fremgangsmåte i polymerisater til fiberaktige strukturer. Som polymerisater kommer det her-, ved på tale polymerisater og blandingspolymerisater av de forskjelligste typer som cellulodederivater, spesielt cel.lulosetriacetat. The penicillin acylase covalently bound in a water-soluble carrier can, as already mentioned, be spun according to the method in DOS 1,932,426, corresponding to US patent 3,715-277 for fibers. The enzyme preparation is dispersed, e.g. to this end with the help of an emulsifier and spun in a wet-spinning process or in a dry-spinning process in polymers into fibrous structures. Polymers here include polymers and mixed polymers of various types such as cellulose derivatives, especially cellulose triacetate.

En til dekstran med molekylvekt 500.000 bundet penicillinacylase kan eksempelvis innpolymeriseres i utbytter på 60% av den opprinnelige enzymaktivitet ifølge litteraturkjente fremgangsmåter (H. Nilson, R. Mosbach, K. Mosbach, Biochim. Biophys. Acta 268 (1972), 253-256). -Herved kan spesielt fordelaktig den kovalent t-il en vannoppløselig bærer bundet penicillinacylase, eksempelvis innpolymeriseres i et av akrylamid ; N,N'-metylen-bisakrylamid og N,N,N',N'-tetrametyletylendiamin dannet kopolymerisat på vanlig måte. I kon-trollforsøk med nativ, altså ikke kovalent til en bærer bundet penicillinacylase forble det etter innpolymerisering etter samme forsøksbetingelse bare dannet 10% av den opprinnelige tilstedevær-ende enziymaktivitet. Det innpolymeriserte bærerbundne enzym viser seg også etter gjentatt anvendelse som overordentelig stabil til fremstilling av forbindelser av typen I. Det innpolymeriserte enzymderivat muliggjør en hurtig og enkel adskillelse fra reaksjorismediet da polymerisatet kan fremstilles i kornstørrelse på mer enn 1 mm i diameter. De nye stoffer har en sterk enzymatisk virkning, hvori-gjennom de i høy grad er egnet. Penicillin acylase bound to dextran with a molecular weight of 500,000 can, for example, be polymerized in yields of 60% of the original enzyme activity according to methods known in the literature (H. Nilson, R. Mosbach, K. Mosbach, Biochim. Biophys. Acta 268 (1972), 253-256) . - Hereby, the penicillin acylase covalently bound to a water-soluble carrier can, for example, be polymerized into one of acrylamide; N,N'-methylene-bisacrylamide and N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine formed copolymer in the usual way. In control experiments with native, i.e. not covalently bound to a carrier, penicillin acylase, only 10% of the originally present enzyme activity remained after polymerization under the same experimental conditions. The polymerized carrier-bound enzyme also proves, after repeated use, to be extremely stable for the production of compounds of type I. The polymerized enzyme derivative enables quick and easy separation from the reaction medium as the polymerizate can be produced in a grain size of more than 1 mm in diameter. The new substances have a strong enzymatic effect, through which they are highly suitable.

Vanligvis gjennomføres enzymatiske spaltninger for fremstilling av forbindelser med formel I ved hjelp av en kovalent til en vannoppløselig bærer bundet penicillinacylase, som eventuelt er innesluttet i et vannuoppløselig, polymert bærematerial i fortynnede oppløsninger, som fortrinnsvis inneholder ca. 1 til ca. 20, spesielt 3 til 6% (vekt) av forbindelsene med formel II. Før sluttproduktets isolering er det hensiktsmessig å fordampe ca. 50% eller mere av det som fortynningsmiddel anvendte vann. Da den ifølge oppfinnelsen anvendbare bærerbundne penicillinacylase >også muliggjør spaltninger ved høyere substratkonsentrasjoner må tilsvarende merinnsatsen av- utgangsstoff mindre vann fordampes. Anvendelsen ifølge oppfinnelsen av de vannoppløselige derivater av penicillinacylase til fremstilling av forbindelser med formel I er derfor meget økonomisk, idet det med hensyn til gjenarwendbarhet av enzymderivatet og utbyttet av Usually, enzymatic cleavages for the production of compounds of formula I are carried out by means of a penicillin acylase covalently bound to a water-soluble carrier, which is optionally enclosed in a water-insoluble, polymeric carrier material in dilute solutions, which preferably contain approx. 1 to approx. 20, especially 3 to 6% (by weight) of the compounds of formula II. Before the final product's insulation, it is appropriate to evaporate approx. 50% or more of the diluent used is water. As the carrier-bound penicillin acylase applicable according to the invention also enables cleavages at higher substrate concentrations, corresponding to the additional input of starting material less water must be evaporated. The use according to the invention of the water-soluble derivatives of penicillin acylase for the preparation of compounds of formula I is therefore very economical, since with regard to the recyclability of the enzyme derivative and the yield of

i in

forbindelsene med, formel I er av mindre betydning, om det vannopp-løselige enzymderivat anvendes direkte i vandig oppløsning eller også i den uoppløselige form etter innpolymerisering eller inneslutning i polymere. ' . the compounds with formula I are of minor importance, whether the water-soluble enzyme derivative is used directly in aqueous solution or also in the insoluble form after polymerization or inclusion in polymers. ' .

Ved gjennomføring av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen oppløses eller suspenderes .forbindelsen som skal spaltes med formel II fortrinnsvis i vann eller en blanding av vann og inntil ca. 10 volum? av et organisk oppløsningsmiddel fortrinnsvis av et polart i vann blandbart organisk oppløsningsmiddel, fortrinnsvis lavere alkylalkoholer, som metanol og etanol, lavere alkylketoner, som aceton eller lavere dialkylformamider, som dimetylformamid. When carrying out the method according to the invention, the compound to be cleaved with formula II is preferably dissolved or suspended in water or a mixture of water and up to approx. 10 volume? of an organic solvent, preferably of a polar water-miscible organic solvent, preferably lower alkyl alcohols, such as methanol and ethanol, lower alkyl ketones, such as acetone or lower dialkyl formamides, such as dimethylformamide.

Fortrinnsvis anvendes ca. 1 til ca. 20, spesielt 3 til Preferably, approx. 1 to approx. 20, especially 3 more

6 vektdeler av forbindelser med formel II. 6 parts by weight of compounds of formula II.

Oppløsningen og/eller suspensjonen bringes i ønskelig form i berøring med det vannoppløselige enzymderivat. Eksempelvis kan enzymderivatet oppløses i vann eller være suspendert i oppløs-ningen etter innes.lutningen i en polymer. The solution and/or suspension is brought into contact with the water-soluble enzyme derivative in the desired form. For example, the enzyme derivative can be dissolved in water or be suspended in the solution after encapsulation in a polymer.

Omsetningen (spaltning av forbindelser med formel II The turnover (cleavage of compounds with formula II

til forbindelser med formel I) foretas ved ca. 20 til ca. M5°0, fortrinnsvis ved 35 til 40°C. to compounds of formula I) is carried out at approx. 20 to approx. M5°0, preferably at 35 to 40°C.

For nøytralisering av den ved reaksjonen avspaltede acylrest er det hensiktsmessig med en stadig overvåkning og innstil-ling av pH-verdien. pH-verdien bør under reaksjonen holdes på en verdi på fortrinns.vis pH 6 til 9, spesielt pH 7,5 til 8,5. Dette kan hvis nødvendig foregå ved tilsetningen av en base til reaksjonsblandingen. Som base kan det hertil praktisk talt anvendes.alle uorganiske og organiske baser, som tert.-natriumfosfat, alkalihydrok-syder, alkalikarbonater og hydrogenkarbonat, jordalkalikarbonater og jordalkalihydroksyder, ammoniakk, primære, sekundære og tertiære' alifatiske og aromatiske aminer samt heterocykliske baser. Eksempelvis skal det nevnes natrium- og kaliumhydroksyd,'natrium- og kalium-karbonat, natrium- og kaliumhydrogenkarbonat, etylamin, metyletylamin, trietylamin, mono-, di- pg trihydroksyetylamin, .anilin, pyridin og piperidin. Av forbruket av base sees lett reaksjonshastigheteh samt reaksjonsavs lutningen. For neutralization of the acyl residue split off during the reaction, it is appropriate to constantly monitor and adjust the pH value. During the reaction, the pH value should preferably be kept at a value of pH 6 to 9, especially pH 7.5 to 8.5. If necessary, this can be done by adding a base to the reaction mixture. As a base, practically all inorganic and organic bases can be used, such as tert.-sodium phosphate, alkali hydroxides, alkali carbonates and hydrogen carbonate, alkaline earth carbonates and alkaline earth hydroxides, ammonia, primary, secondary and tertiary' aliphatic and aromatic amines as well as heterocyclic bases. Examples include sodium and potassium hydroxide, sodium and potassium carbonate, sodium and potassium hydrogen carbonate, ethylamine, methylethylamine, triethylamine, mono-, di- and trihydroxyethylamine, aniline, pyridine and piperidine. From the consumption of base, the reaction rate and the slope of the reaction are easily seen.

Reaksjonshastigheten avhenger fremfor alt av forholdet av mengden av til disposisjon stående penicillinacylasederivat til mengden av anvendt forbindelse med formel II og av den spesifikke aktivitet av den anvendte 'kovalent bundne penicillinacylase. The reaction rate depends above all on the ratio of the amount of available penicillin acylase derivative to the amount of compound of formula II used and on the specific activity of the covalently bound penicillin acylase used.

rien spesifikke aktivitet av penicillinacylasen angis The specific activity of the penicillin acylase is indicated

i enheter/ml oppløsning eller enheter/g fuktigvekt. 1 enhet er definert som den penicillinacylase-aktivitet, som i løpet av 1 minutt hydrolyserer en mikromol penicillin G ved 37°C og pH 7,8 til 6-amino-penicillansyre og fenyleddiksyre. in units/ml solution or units/g wet weight. 1 unit is defined as the penicillin acylase activity which hydrolyzes one micromole of penicillin G at 37°C and pH 7.8 to 6-amino-penicillanic acid and phenylacetic acid within 1 minute.

Til fullstendig spaltning av 1 kg 7-fenylacetamido-desacetoksy-cefalosporansyre i løpet av 2 timer kreves f.eks. ca. 120.000 enheter vannoppløselig bærerbunden penicillinacylase. Ved lengre spaltningstider kreves tilsvarende mindre penicillinacylase. De hver gang gunstigste mengdeforhold og reaksjonstider kan lett bestemmes av enhver fagmann. To completely decompose 1 kg of 7-phenylacetamido-desacetoxy-cephalosporanic acid within 2 hours, e.g. about. 120,000 units of water-soluble carrier-bound penicillin acylase. For longer cleavage times, correspondingly less penicillin acylase is required. The most favorable quantity ratios and reaction times can be easily determined by any person skilled in the art.

Etter avsluttet spaltningsreaksjon adskilles det vann-oppløselige penicillinacylasederivat ved ultrafiltrering og kan med en gang anvendes for ytterligere spaltningsblandinger. Det ble det vannoppløselige, kovalent bundne enzymderivat innkapslet, innpoly-merisert eller ifølge DOS 1.;932.426, tilsvarende US-patent nr. 3.715.277 spunnet i fibre, så kan det adskilles spesielt enkelt ved filtrering, dekantering eller sentrifugering. After completion of the cleavage reaction, the water-soluble penicillin acylase derivative is separated by ultrafiltration and can be used immediately for further cleavage mixtures. If the water-soluble, covalently bound enzyme derivative is encapsulated, polymerized or according to DOS 1.;932,426, corresponding to US patent no. 3,715,277 spun into fibers, it can be separated particularly easily by filtration, decantation or centrifugation.

Til ultrafiltrering anvendes spesielt fordelaktig handelsvanlige moduler med membraner som er im<p>ermeable for molekyler med molekylvekt på mer enn 20.000 inntil ca. 100.000. Commercially available modules with membranes that are im<p>ermeable for molecules with a molecular weight of more than 20,000 up to approx. 100,000.

Fra den for den eventuelle penicillinacylase-tilberedning befridde klare oppløsning isoleres den dannede forbindelse med formel I etter generelt vanlige fremgangsmåter. Vanlige fremgangsmåter er f.eks. utfelling med uorganisk mineralsyre, f .eks. saltsyre, svovelsyre ,. fosforsyre eller organiske karboksylsyrer, f.eks. lavere alkyl-karboksylsyrer som eddiksyre ved det isoelektriske punkt' eller også ved de vanlige,kromatografiske fremgangsmåter som tynnsjikt- eller søylekromatografi. From the clear solution liberated for the possible penicillin acylase preparation, the compound of formula I formed is isolated according to generally customary methods. Common methods are e.g. precipitation with inorganic mineral acid, e.g. hydrochloric acid, sulfuric acid,. phosphoric acid or organic carboxylic acids, e.g. lower alkyl carboxylic acids such as acetic acid at the isoelectric point' or also by the usual chromatographic methods such as thin layer or column chromatography.

Det er i mange tilfeller også fordelaktig, før utfelling av de' dannede forbindelser med formel I å fjerne den avspaltede•acyl-rest ved svakt sur pH med et organisk, i vann ikke blandbart oppløs-ningsmiddel, som eddiksyreetylester, metylisobutylketon eller iso-butylacetat ved ekstrahering. Ekstraheringen gjennomføres fortrinns-' vis under pH 6,0. Da imidlertid ved lavere pH-verdier oppløselig- heten av forbindelsene med formel I avtar i vann, må det eventuelt før surgjøring fortynnes med vann. Videre kan det også være fordelaktig for å oppnå gode utbytter å konsentrere de vandige oppløs-ninger før utfelling av produktet i vakuum. In many cases, it is also advantageous, before precipitation of the formed compounds of formula I, to remove the cleaved acyl residue at slightly acidic pH with an organic, water-immiscible solvent, such as acetic acid ethyl ester, methyl isobutyl ketone or isobutyl acetate by extraction. The extraction is preferably carried out below pH 6.0. Since, however, at lower pH values the solubility of the compounds of formula I decreases in water, it must possibly be diluted with water before acidification. Furthermore, it can also be advantageous to achieve good yields to concentrate the aqueous solutions before precipitation of the product in a vacuum.

Det .utfelte resp. ved kromatografi dannede produkt kan renses etter vanlige metoder.. Det kan f.eks. for fullstendig fjerning av avspaltet rest vaskes med et egnet oppløsningsmiddel, f.eks. butylacetat eller aceton og tørkes i vakuum, idet det umiddelbart fåes den rene forbindelse med formel I. The .precipitated resp. products formed by chromatography can be purified according to usual methods.. It can e.g. for complete removal of cleaved residue, wash with a suitable solvent, e.g. butyl acetate or acetone and dried in a vacuum, the pure compound of formula I being immediately obtained.

Forbindelsen som kan fåes ifølge oppfinnelsen med formel I kan etter generelt kjente metoder, f.eks. ved acylering ved 7-aminogruppen omdannes i verdifulle antimikrobielle virksomme stoffer (sammenlign f.eks. E.H. Flynn, Cephalosporins and Penicillins, The compound which can be obtained according to the invention with formula I can according to generally known methods, e.g. by acylation at the 7-amino group is converted into valuable antimicrobial active substances (compare e.g. E.H. Flynn, Cephalosporins and Penicillins,

Chemistry and,Biology, Academic Press, New York, 1972). Chemistry and Biology, Academic Press, New York, 1972).

De ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvendte penicillinacylase-tilberedninger kan på grunn av deres store stabilitet anvendes over et lengre tidsrom mange ganger, hvorved deres anvendelse i spesiell grad er økonomisk fordelaktig. Due to their great stability, the penicillin acylase preparations used in the method according to the invention can be used many times over a longer period of time, whereby their use is particularly economically advantageous.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen skal forklares ved hjelp av noen eksempler: The method according to the invention will be explained with the help of some examples:

E ksempel 1. Example 1.

a) 5 g dekstran 500 med en omtrentelig molekylvekt på 500.000 "oppløses i 165 ml vann og innstilles med 2 N natronlut på a) Dissolve 5 g of dextran 500 with an approximate molecular weight of 500,000 in 165 ml of water and adjust with 2 N caustic soda on

pH 11,0. Ved en temperatur på 20°C tilsetter man under omrøring. pH 11.0. At a temperature of 20°C, add while stirring.

85 mg bromcyan og holder oppløsningens pH-verdi med 2 N NaOH ved 11,0. 10 minutter etter tilsetning av bromcyanet innstilles oppløs-ningen med 2 N saltsyre til pH 8,5 og blandes med 170 ml av en vandig oppløsning av 550 .mg penicillinacylase (enzymatisk aktivitet 7S3E/mg). Oppløsningen.omrøres 16 timer i kjølerom ved 4°C. Etter ultrafiltrering kan det i filtratet påvises noen enzymaktivitet. 85 mg of cyanogen bromide and maintains the pH of the solution with 2 N NaOH at 11.0. 10 minutes after the addition of the cyanogen bromide, the solution is adjusted to pH 8.5 with 2 N hydrochloric acid and mixed with 170 ml of an aqueous solution of 550 mg penicillin acylase (enzymatic activity 7S3E/mg). The solution is stirred for 16 hours in a cold room at 4°C. After ultrafiltration, some enzyme activity can be detected in the filtrate.

Koplingen med bæreren forløper deretter fullstendig. Utbyttet av enzymatisk aktivitet utgjør 98%, referert til utgangsaktivitet. The coupling with the carrier then proceeds completely. The yield of enzymatic activity amounts to 98%, referred to initial activity.

Etter frysetørkning bibeholdes enzymaktiviteten fullstendig. After freeze-drying, the enzyme activity is completely retained.

b) 5 g dekstran 500 med en omtrentelig molekylvekt på 500.000 oppløses i.165 ml vann og innstilles med 2 N natronlut på b) Dissolve 5 g of dextran 500 with an approximate molecular weight of 500,000 in 165 ml of water and adjust with 2 N caustic soda on

pH 11,0. Ved en temperatur på'.20°C tilsetter man under omrøring. pH 11.0. At a temperature of 20°C, add while stirring.

400 mg bromcyan og holder oppløsningens pH-verdi med 2 N natronlut ved 11,'0. 20 minutter etter tilsetning av bromcyan innstilles oppløs-ningen med 2 N saltsyre til pH 8,5 og blandes med 170 ml av en vandig 400 mg of cyanogen bromide and maintains the pH value of the solution with 2 N caustic soda at 11.0. 20 minutes after the addition of cyanogen bromide, the solution is adjusted with 2 N hydrochloric acid to pH 8.5 and mixed with 170 ml of an aqueous

oppløsning av 550 mg penicillinacylase- (enzymatisk aktivitet 7,3 E/mg). Oppløsningen omrøres 16 timer i kjølerom ved 4°C. Enzymet bindes under disse betingelser fullstendig til bæreren. Utbyttet av enzymatisk aktivitet utgjør 96%, referert til utgangsaktivitet. solution of 550 mg of penicillin acylase (enzymatic activity 7.3 U/mg). The solution is stirred for 16 hours in a cold room at 4°C. Under these conditions, the enzyme binds completely to the carrier. The yield of enzymatic activity amounts to 96%, referred to initial activity.

Eksempel 2. Example 2.

a) 5 g dekstran 20 med en omtrentelig molekylvekt på 20.000 omsettes som angitt i eksempel lb) med 400 mg bromcyan og deretter a) 5 g of dextran 20 with an approximate molecular weight of 20,000 are reacted as indicated in example lb) with 400 mg of cyanogen bromide and then

med 550 mg penicillinacylase. Utbyttet av enzymatisk aktivitet utgjør etter omsetningen 96%, referert til utgangsaktivitet. with 550 mg of penicillin acylase. The yield of enzymatic activity after conversion amounts to 96%, referred to initial activity.

b) 5 g dekstran 20 omsettes som angitt i eksempel lb) med 800 mg bromcyan og deretter med 550 mg penicillinacylase. Utbyttet av enzymatisk aktivitet utgjør etter omsetningen 87%, referert til utgangsaktiviteten. c) 5 g dekstran 60 med en omtrentelig molekylvekt på 60.000 omsettes som angitt i eksempel lb) med 400 mg bromcyan og deretter med 550 mg penicillinacylase. Utbyttet av enzymatisk aktivitet ut-gjør etter omsetningen 99%, referert til utgangsaktiviteten. Eksempel 3-a) 5 g oppløselig stivelse ifølge Zulkowsky (f.eks. handels-preparatet fra Firma E. Merck/Darmstadt) oppløses i .1.65 ml vann og b) 5 g of dextran 20 is reacted as indicated in example lb) with 800 mg of cyanogen bromide and then with 550 mg of penicillin acylase. The yield of enzymatic activity after turnover amounts to 87%, referred to the initial activity. c) 5 g of dextran 60 with an approximate molecular weight of 60,000 is reacted as indicated in example lb) with 400 mg of cyanogen bromide and then with 550 mg of penicillin acylase. The yield of enzymatic activity after turnover is 99%, referred to the starting activity. Example 3-a) Dissolve 5 g of soluble starch according to Zulkowsky (e.g. the commercial preparation from Firma E. Merck/Darmstadt) in 1.65 ml of water and

innstilles med 2 N natronlut til pH 11,0. Ved en temperatur på 20°C tilsetter man under.omrøring 400 mg bromcyan og holder oppløsningens pH-verd!i med 2 N NaOH ved 11,0. 20 minutter etter bromcyanets tilsetning innstilles oppløsningen med 2 N saltsyre til pH 8,5 og blandes med 170 ml av en vandig oppløsning av 550 mg penicillinacylase (enzymatisk aktivitet 7,3 E/mg). Oppløsningen omrøres 16 timer i kjølerom ved 4°C. Etter omsetningen utgjorde utbyttet av enzymaktivitet 98%, referert til utgangsaktivitet.. Den kovalent til stivelse bundne penicillinacylase lar seg frysetørke uten aktivitetstap. Utbytte 6,2 g med en enzymatisk aktivitet på 0,65 E/mg. adjusted with 2 N caustic soda to pH 11.0. At a temperature of 20°C, 400 mg of cyanogen bromide is added with stirring and the pH of the solution is maintained at 11.0 with 2 N NaOH. 20 minutes after the addition of the cyanogen bromide, the solution is adjusted to pH 8.5 with 2 N hydrochloric acid and mixed with 170 ml of an aqueous solution of 550 mg of penicillin acylase (enzymatic activity 7.3 U/mg). The solution is stirred for 16 hours in a cold room at 4°C. After the conversion, the yield of enzyme activity was 98%, referred to starting activity. The penicillin acylase covalently bound to starch can be freeze-dried without loss of activity. Yield 6.2 g with an enzymatic activity of 0.65 U/mg.

b) 103 g oppløselig stivelse ifølge Zulkowsky (f.eks. handels-preparatet fra Firma E. Merck/Darmstadt) oppløses i 1250 ml vann b) Dissolve 103 g of soluble starch according to Zulkowsky (e.g. the commercial preparation from Firma E. Merck/Darmstadt) in 1250 ml of water

og innstilles med 2 N natronlut til pH 11,0. Ved en temperatur på 20°C tilsetter man under omrøring 16,8 g bromcyan og holder oppløs-' ningens pH-verdi med 2 N NaOH ved 11,0. 20 minutter etter tilset-, ning av bromcyanet innstilles oppløsningen ved 2 N saltsyre til pH 8,5 og blandes med 2060 ml av en vandig oppløsning av 10,3- g penicillinacylase (enzymatisk aktivitet 11,9 E/mg). Oppløsningen omrøres 16 timer i kjølerom ved 4°C. Etter omsetningen utgjør den and adjusted with 2 N caustic soda to pH 11.0. At a temperature of 20°C, 16.8 g of cyanogen bromide are added with stirring and the pH of the solution is maintained at 11.0 with 2 N NaOH. 20 minutes after the addition of the cyanogen bromide, the solution is adjusted with 2 N hydrochloric acid to pH 8.5 and mixed with 2060 ml of an aqueous solution of 10.3 g of penicillin acylase (enzymatic activity 11.9 U/mg). The solution is stirred for 16 hours in a cold room at 4°C. After turnover, it amounts to

samlede enzymaktivitet 94,5%, referert til utgangsaktivitet. Eksempel 4. overall enzyme activity 94.5%, referred to initial activity. Example 4.

2,9 g kovalent til stivelse bundet penicillinacylase med en aktivitet på 650 E/g,- fremstillet ifølge eksempel 3a), oppløses i 600 ml 0,05 molar trietanolamin-saltsyre-puffer pH 7,0. Til opp-løsningen haes 85,5 g akrylamid, 4,5- g N,N'-metylen-bisakrylamid og 5 ml av en vandig oppløsning av 2,5 g ammoniuperoksyddisulfat (oppløsning A). 2.9 g of penicillin acylase covalently bound to starch with an activity of 650 U/g, prepared according to example 3a), are dissolved in 600 ml of 0.05 molar triethanolamine-hydrochloric acid buffer pH 7.0. 85.5 g of acrylamide, 4.5 g of N,N'-methylene bisacrylamide and 5 ml of an aqueous solution of 2.5 g of ammonium peroxide disulphate (solution A) are added to the solution.

I en trehalset kolbe med røreverk haes 2900 ml toluen, 1100 ml kloroform, 5 ml N,N,N',N'-tetrametyletylendiamin og 10 ml av en emulgator, avkjøles til 4°C og omrøres ved et dreietall på In a three-necked flask with a stirrer, add 2900 ml of toluene, 1100 ml of chloroform, 5 ml of N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine and 10 ml of an emulsifier, cool to 4°C and stir at a speed of

250 omdreininger pr. minutt. Under nitrogen-beskyttelsesgass lar man over en dryppetrakt oppløsning A dryppe inn i reaksjonskaret, omrører i 30 .minutter og frasuger polymerisatet. Det ettervaskes to ganger med hver gang 1 liter toluen og 2 liter 0,5 molar natriumkloridoppløsning. I polymerisatet er det inneholdt 6j>% av den opprinnelige aktivitet av penicillinacylase. 250 revolutions per minute. Under nitrogen protective gas, solution A is allowed to drip into the reaction vessel via a dropping funnel, stirred for 30 minutes and the polymerizate is sucked off. It is washed twice with each time 1 liter of toluene and 2 liters of 0.5 molar sodium chloride solution. The polymerizate contains 6% of the original activity of penicillin acylase.

Eksempel 5- Example 5-

Spaltning av forbindelser med formel II: Cleavage of compounds of formula II:

20 m mol av -den forbindelse med formel II som skal spaltes oppløses i 200 ml vann (eventuelt ved tilsetning av natronlut) ved pH 7,5. Til den i-en ved 37°C termostatisert kar omrørt Dissolve 20 m mol of the compound of formula II to be cleaved in 200 ml of water (possibly with the addition of caustic soda) at pH 7.5. To that i at 37°C thermostatic vessel stirred

■oppløsning har man 150 ml av den ifølge eksempel lb fremstilte oppløsning med en samlet aktivitet på 1500 E til dekstranbundet penicillinacylase. solution, one has 150 ml of the solution prepared according to example 1b with a total activity of 1500 U for dextran-bound penicillin acylase.

Under reaksjonen holdes pH-verdien ved tilsetning av During the reaction, the pH value is maintained by the addition of

0,5 molar NaOH ved hjelp av en pH-stat på pH 7,8 konstant. Avslut-ningen av NaOH-tilsetninger viser avslutning av reaksjonen. Etter avsluttet reaksjon filtreres oppløsningen gjennom et ultrafilter inntil et restvolum på 30 ml. Til den- gjenblivende oppløsning lar man 100 ml vann filtrere igjen inntil 30 ml, gjentar denne vaskeprosess ennu en gang og inndamper de sammenfattede permeater i vakuum ved- 30°C inntil 100 ml. 0.5 molar NaOH using a pH stat of pH 7.8 constant. The end of NaOH additions shows the end of the reaction. After completion of the reaction, the solution is filtered through an ultrafilter until a residual volume of 30 ml. For the remaining solution, 100 ml of water is filtered again up to 30 ml, this washing process is repeated once more and the combined permeates are evaporated in vacuum at 30°C up to 100 ml.

Den konsentrerte oppløsning blandes med 50 ml butylacetat og den dannede forbindelse med formel I utfelles ved tilsetning av 5 N saltsyre inntil isoelektrisk punkt på 3,7. Etter 2-3 timers henstand av prøven i kjøleskap frafiltreres, det krystallinske produkt, vaskes med hver gang 100 ml vann og aceton og tørkes i vakuum. The concentrated solution is mixed with 50 ml of butyl acetate and the formed compound of formula I is precipitated by the addition of 5 N hydrochloric acid up to an isoelectric point of 3.7. After the sample has stood for 2-3 hours in a refrigerator, the crystalline product is filtered off, washed each time with 100 ml of water and acetone and dried in a vacuum.

Innholdsbestemmelsen av produktet foregikk ved fotome-trisk bestemmelse av frigjort 7-aminogruppe på kjent måte etter reaksjon med p-dimetylaminobenzaldehyd i en modifikasjon av metoden av Svotek (tsjekkisk patent nr. 116.959 fra 1965). The determination of the content of the product took place by photometric determination of liberated 7-amino group in a known manner after reaction with p-dimethylaminobenzaldehyde in a modification of the method by Svotek (Czech patent no. 116,959 from 1965).

Ekstinksjonen ved 415 nm ble sammenlignet med standard-kurver for ren 7-aminocefalosporansyre og 7-amino-desacetoksy-cefalosporansyre. The extinction at 415 nm was compared with standard curves for pure 7-aminocephalosporanic acid and 7-amino-desacetoxy-cephalosporanic acid.

Dessuten ble produktets identitet påvist ved irifrarød-og H-kjerneresonans-spektret og ved papirkromatografi i systemet butanol:iseddik:vann (12:3=5) påvist. På denne måte ble følgende omsetninger gjennomført: In addition, the identity of the product was demonstrated by the infrared and H nuclear resonance spectrum and by paper chromatography in the system butanol:glacial acetic acid:water (12:3=5). In this way, the following transactions were carried out:

Eksempel 5 a). Example 5 a).

Utgangsfo rbindelse: Output connection:

9,08 g 7"(2-tienyl)-acetamido-cefalosporansyre (natriumsalt). Reaksjonsvarighet: 85 minutter. 9.08 g 7"(2-thienyl)-acetamido-cephalosporanic acid (sodium salt). Reaction time: 85 minutes.

Sluttprodukt: 7-aminocefalosporansyre. End product: 7-aminocephalosporanic acid.

Utbytte,: 5,30 g (90% av det teoretiske), renhet: 97%. Rf: 0,27 (ingen desacety1-7-aminocefalosporansyre med Rf 0,10). Eksempel 5 b). Yield: 5.30 g (90% of theoretical), purity: 97%. Rf: 0.27 (no desacety1-7-aminocephalosporanic acid with Rf 0.10). Example 5 b).

Utgangs forbi ndelse: Output pass nde:

8,70 g 7-(2-tienyl)-acetamido-3--yridiniummetyl-A^-cefem-4-karboksylat. Sluttprodukt: 7-amino-3-pyridiniummetyl-A^-cefem-4-karboksylat. Reaksjonstid: 75 minutter. 8.70 g of 7-(2-thienyl)-acetamido-3-yridinium methyl N-cephem-4-carboxylate. End product: 7-amino-3-pyridinium methyl N-cephem-4-carboxylate. Reaction time: 75 minutes.

Rf: 0,05. L Rf: 0.05. L

På grunn av pyridinringen i molekylet kan produktet av denne reaksjon ikke isoleres ved utfelling ved det isoelektriske punkt. Fullstendigheten av omsetningen og produktets identitet ble påvist papirkromatografisk. Because of the pyridine ring in the molecule, the product of this reaction cannot be isolated by precipitation at the isoelectric point. The completeness of the turnover and the identity of the product was demonstrated by paper chromatography.

Eksempel 5c) . Example 5c).

Utgangs forbindelse: Output connection:

7,01 g 7_fenoksyacetamido-desacetoksy-cefalosporansyre. Sluttprodukt: 7-amino-desacetoksycefalosporansyre. Utbytte: 3,38 g (78% av det teoretiske), renhet: 97%. Smeltepunkt: . 238-240°C. (under spaltning). 7.01 g of 7_phenoxyacetamido-desacetoxy-cephalosporanic acid. End product: 7-amino-desacetoxycephalosporanic acid. Yield: 3.38 g (78% of theoretical), purity: 97%. Melting point: . 238-240°C. (under cleavage).

Eksempel 5d). Example 5d).

Utgangs forbindelser: Output connections:

6,99 g 7-(a-amino-fenylacetyl)-desacetoksycefalosporansyre. Sluttprodukt: 7-amino-desacetoksycefalosporansyre. 6.99 g of 7-(α-amino-phenylacetyl)-desacetoxycephalosporanic acid. End product: 7-amino-desacetoxycephalosporanic acid.

i in

Utbytte': 3,66 g (84% av det teoretiske), renhet: 97%. Eksempel 6. Yield': 3.66 g (84% of theoretical), purity: 97%. Example 6.

500 g fenylacetamido-desacetoksycefalosporansyre (renhet 98%) settes til 20 liter av en oppløsning av stivelsesbunden penicillinacylase, som inneholder en samlet aktivitet på 115-000 enheter. Reaksjonsblandingen holdes under omrøring ved tilsetning av trietylamin konstant ved pH 7,8 ± 0,2. Reaksjonstemperaturen skal utgjøre 38°C. Etter 65 minutter opptas ikke mere trietylamin. - . Oppløsningen filtreres gjennom et papirfilter og ultrafiltreres i 500 g of phenylacetamido-desacetoxycephalosporanic acid (purity 98%) is added to 20 liters of a solution of starch-bound penicillin acylase, which contains a total activity of 115,000 units. The reaction mixture is kept under stirring by the addition of triethylamine at a constant pH of 7.8 ± 0.2. The reaction temperature must be 38°C. After 65 minutes no more triethylamine is absorbed. - . The solution is filtered through a paper filter and ultrafiltered in

en Labormodul under anvendelse'av 10 membraner, som er permeable for-molekyler, inntil en molekylvekt på 20.000 ved et driftstrykk på. a Laboratory module using 10 membranes, which are permeable for molecules, up to a molecular weight of 20,000 at an operating pressure of

12 kg/cm 2 inntil et restvolum på 1000 ml. Retenatet, som foruten 12 kg/cm 2 up to a residual volume of 1000 ml. The retainer, as besides

den utskilte stivelsesbundne penicillinacylase blant amtet- dessuten inneholder resterende 7-aminodesacetoksycefalosporansyre, fortynnes 3 ganger i rekkefølge med hver gang 1000 ml vann og ultrafiltreres the secreted starch-bound penicillin acylase among the county- also contains residual 7-aminodesacetoxycephalosporanic acid, diluted 3 times in succession with each time 1000 ml of water and ultrafiltered

hver gang igjen, til et restvolum på 1000 ml. Fra de sammenfattede ultrafiltratet isoleres de dannede 7-aminodesacetoksycefalosporansyre etter generelt vanlige, f.eks. følgende fremgangsmåte: each time again, to a residual volume of 1000 ml. From the combined ultrafiltrate, the 7-aminodesacetoxycephalosporanic acid formed is isolated according to generally accepted methods, e.g. the following procedure:

Ultrafiltratet innbefattende vaskevann innstilles med Wash water including the ultrafiltrate is added

5 N saltsyre til.pH 5,5 og . ekstraheres to ganger med hver gang 5 1 i-butylacetat. Den.vandige fase innstilles på pH 7,0 og inndampes i vakuum ved 30°C inntil 8 liter. Fra konsentratet utfelles ved tilsetning av 5 N saltsyre 7-aminocefalosporansyre ved det isoelektriske punkt ved pH 3,7. Etter 2-3 timers henstand frasuges produktet etterlat pH-verdien ble kontrollert 'og eventuelt etterstillet til pH 3,7 og ettervaskes med hver gang 1000 ml vann og aceton. Det .tørkes i vakuum ved 40°C. Utbytte 306 g (94% av det.teoretiske), renhet 97%. 5 N hydrochloric acid to pH 5.5 and . is extracted twice with each time 5 1 of i-butyl acetate. The aqueous phase is adjusted to pH 7.0 and evaporated in vacuum at 30°C up to 8 litres. From the concentrate, 7-aminocephalosporanic acid is precipitated by the addition of 5 N hydrochloric acid at the isoelectric point at pH 3.7. After a period of 2-3 hours, the product is suctioned off, the pH value was checked and possibly adjusted to pH 3.7 and washed with 1000 ml of water and acetone each time. It is dried in vacuum at 40°C. Yield 306 g (94% of theoretical), purity 97%.

På samme måte ble samme stivelsesbundne penicillinacylase anvendt etter hverandre 25 ganger uten at det opptrådte noe merkbart aktivitetstap. Similarly, the same starch-bound penicillin acylase was used consecutively 25 times without any noticeable loss of activity occurring.

Utbyttet av 25 spaltninger utgjorde herved gjennomsnitt-lig 93,5% av det teoretiske.- The yield of 25 cleavages thus amounted to an average of 93.5% of the theoretical.

Eksempel 7- Example 7-

20 g (60 m mol) 7_fenylacetamido-desacetoksycefalosporansyre suspenderes i 500 ml vann og oppløses ved tilsetning av trietylamin inntil pH-verdi på 7,8. Man oppvarmer til 37°C og tilsetter 80 ml av den ifølge eksempel lb) fremstilte enzymoppløsning med en samlet aktivitet på 800 E. Ved tilsetning av trietylamin holdes pH-verdien under spaltninger ved 7,8 ± 0,3- Etter 6 timer er reaksjonen avsluttet. Reaksjonsotlandingen filtreres gjennom et ultrafilter inntil et restvolum på 50 ml, den gjenblivende oppløsning fortynnes • med 100 ml -ann og inndampes igjen til 50 ml ved ultrafiltrering. Denne vaskeprosess gjentas ennu en gang. Alle permeater sammenfattes og inndampes i vakuum ved 30°C inntil 400 ml. 20 g (60 m mol) of 7-phenylacetamido-desacetoxycephalosporanic acid are suspended in 500 ml of water and dissolved by the addition of triethylamine until a pH value of 7.8. It is heated to 37°C and 80 ml of the enzyme solution prepared according to example 1b) with a total activity of 800 E is added. By adding triethylamine, the pH value during cleavages is kept at 7.8 ± 0.3 - After 6 hours, the reaction is concluded. The reaction mixture is filtered through an ultrafilter until a residual volume of 50 ml, the remaining solution is diluted • with 100 ml -ann and evaporated again to 50 ml by ultrafiltration. This washing process is repeated once more. All permeates are combined and evaporated in vacuum at 30°C up to 400 ml.

Etter tilsetning av 200 ml metylisobutylketbn innstilles med 12 N saltsyre til pH 3,7 og den utkrystalliserte 7-aminodesacet-oksy-cefalosporansyre fra.suges etter 1 times henstand og vaskes med litt vann og med litt vann/metylisobutylketon og aceton. After adding 200 ml of methyl isobutyl ketone, the pH is adjusted to 3.7 with 12 N hydrochloric acid and the crystallized 7-aminodesacetoxy-cephalosporanic acid is sucked off after 1 hour's rest and washed with a little water and with a little water/methyl isobutyl ketone and acetone.

Utbytte: 11,9.g (92,5% av det teoretiske), renhet: 98%. Smeltepunkt: 238-240°C-(spaltning). Yield: 11.9 g (92.5% of theory), purity: 98%. Melting point: 238-240°C (decomposition).

Eksempel 8.. Example 8..

1 1

20 g (60 m mol) 7-fenylacetamido-desacetoksycefalosporansyre suspenderes i 350 ml vann og oppløses .ved tilsetning av trietylamin inntil pH-verdi på 7,8. Man oppvarmer til 37°C og tilsetter den ifølge eksempel 4- fremstilte innpolymeriserte kovalente stivelse bundne penicillinacylase med en samlet aktivitet på 1120 enheter.. 20 g (60 m mol) of 7-phenylacetamido-desacetoxycephalosporanic acid are suspended in 350 ml of water and dissolved by the addition of triethylamine until a pH value of 7.8. It is heated to 37°C and the penicillin acylase prepared according to example 4, covalently bound to starch, is added, with a total activity of 1120 units.

Ved tilsetning av trietylamin'holdes reaksjonsblandingen under spalt-ningen ved pH 7,8 ± 0,3. Etter 5 timer er reaksjonen avsluttet. By adding triethylamine, the reaction mixture during the cleavage is kept at pH 7.8 ± 0.3. After 5 hours the reaction is complete.

Det innpolymeriserte penicillinacylasederivat frafiltreres og vaskes ut med" litt vann. Til filtratet innbefattende vaskevannet haes 200 ml metylisobutylketon og 12 N saltsyre inntil pH 3,7- Etter 1 timers henstand ved 5°C etterinnstilles pH-verdien likeledes med en saltsyre til pH 3,7, den utkrystalliserte 7-aminodesacetoksycefalosporansyre suges fra og ettervaskes med litt vann og aceton. The polymerized penicillin acylase derivative is filtered off and washed out with a little water. To the filtrate including the wash water, add 200 ml of methyl isobutyl ketone and 12 N hydrochloric acid until pH 3.7. 7, the crystallized 7-aminodesacetoxycephalosporanic acid is sucked off and washed with a little water and acetone.

Utbytte: 12,1 g (94% av det teoretiske). Renhet: 97,5%. Yield: 12.1 g (94% of theoretical). Purity: 97.5%.

Smeltepunkt: 238-240°C under spaltning. Melting point: 238-240°C during decomposition.

Eksempel 9- Example 9-

Den for fremstillingen av enzymderivatet nødvendige penicillinacylase: a) Et råekstrakt, som inneholder penicillinacylase utvinnes idet man dyrker Escherichia coli etter den i tysk patent nr. 1.111. 778 omtalte fremgangsmåte, konsentrerer kulturen ved sentrifugering til et slam.og oppslutter cellen etter kjente mekaniske fremgangsmåter eventuelt under tilsetning av 3% metylisobutylketon. b) 6l0 liter" av en således dannet råekstrakt inneholder 5,2'. 10 enheter, fortynnes med avionisert vann til 2100 liter, innstilles med svovelsyre til pH 5,0 og sentrifugeres. I det klare overstående finner man 5,7 . 10 E med en spesifikk aktivitet på. 1,7 E/mg. The penicillin acylase required for the production of the enzyme derivative: a) A crude extract containing penicillin acylase is obtained by cultivating Escherichia coli according to German patent no. 1,111. 778 mentioned method, the culture is concentrated by centrifugation into a slurry and the cell is engulfed according to known mechanical methods, possibly with the addition of 3% methyl isobutyl ketone. b) 6l0 liters" of a crude extract thus formed contains 5.2'. 10 units, diluted with deionized water to 2100 liters, adjusted with sulfuric acid to pH 5.0 and centrifuged. In the clear supernatant one finds 5.7 . 10 E with a specific activity of 1.7 U/mg.

Claims

While adjusting the pH to 550, 13.8 kg of bentonite is stirred in and separated after 30 minutes in a through-flow centrifuge. The separated bentonite is eluted with 90 liters of 0.5 molar sodium acetate solution pH 8.0 and filtered off. 92.5 liters are obtained, containing 4-.5 . ld^ units (86% of theoretical) with a specific activity of penicillin acylase of 6.5 U/mg. P_a_t_e_n_t _k_r_a_v_ j_ 1., Process for the preparation of 7-amino-A 3-cephem derivatives with formula.

in which R means hydrogen, hydroxyl, amino, cyano, -0-CO-NHp, -S-C-nT£hp) in which n means an integer. S from 4 to 6, -0-CO-R<1>, -NH-CO-R<1>, -S-CS-O-R<1>, in which R<1> is alkyl with 1 to 4 carbon atoms and in which R means -S-Het or j Het, where Het means a 5- or 6-membered heteroaromatic ring, which may optionally have a positive charge and X means hydrogen or the symbol of a negative charge, if the residue R contains a positive charge, characterized by compounds with formula

in which R and X have the above meaning and R 2 'means an optionally i . the ring with amino, hydroxy or alkyl with 1 to 3 carbon atoms substituted phenyl, phenoxy, 2-thienyl or 2-furyl ring and R 1 means hydrogen, amino, hydroxy or alkyl. with 1 ■to 3 carbon atoms, or their salts with inorganic or organic bases, are brought in ■contact with penicillin acylase, which is covalently bound to a water-soluble carrier, possibly a form enclosed in a water-insoluble carrier material, and isolates the 7-amino-A 3-cephem derivative formed. ' 3. Process according to claim 1, characterized 3 ■ 2 ' in that R, R and X mean hydrogen and R means phenyl. 3. Process according to claim 1, characterized in that R, R 3 and X mean hydrogen and R 2 phenoxy. 4. Process according to claim 1, characterized in that R means -O-COCH^, R<2> means phenoxy and R5 and X means hydrogen. 5. Process according to claim 1, characterized in that R means -O-CO-CH-^, R<2> means phenyl and R5 and X means hydrogen. 6. Method according to claims 1 to 5, characterized in that the penicillin acylase is covalently bound to a polysaccharide. 7. Method according to claims 1 to 6, characterized in that the penicillin acylase is covalently bound to starch. 8. Method according to claims 1 to 6, characterized in that the penicillin acylase is covalently bound to dextran. 9. Method according to claims 1 to 8, characterized in that the penicillin acylase covalently bound to a water-soluble carrier is enclosed in a water-insoluble carrier material.